JP2013034481A - 抗ＴＮＦα抗体および使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＴＮＦα活性を阻害する抗ＴＮＦα抗体を中和することは、ＴＮＦα媒介性疾患の処置および／若しくは診断において有用であり、効果的な抗ＴＮＦα抗体を提供する。
【解決手段】インフリキシマブの改変抗体は、ＴＮＦαに結合しかつインフリキシマブより少ないマウス由来アミノ酸残基を有するＴＮＦα抗体となる。更に、ＴＮＦα抗体をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター、宿主細胞、組成物、ならびにＴＮＦα抗体の作成および使用方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、抗ＴＮＦα抗体および治療薬としてのそれらの使用に関する。

治療的タンパク質の有効性は、該治療的タンパク質に対する望ましくない免疫反応により制限され得る。モノクローナル抗体について、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を低下させるための試みにおいて多数の技術が開発された。一般に、これらのアプローチは、ヒトの遺伝情報を増大させる一方で最終抗体構築物中のマウスの遺伝情報を減少させることを目的とする。こうしたアプローチの例は、キメラ、ヒト化および完全にヒトのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。

キメラ抗体は、マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域およびヒトＩｇ定常領域のような異なる動物種に由来する領域を含有する。インフリキシマブ（商標名ＲＥＭＩＣＡＤＥ^（Ｒ）の下で販売される）は、ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）を特異的に結合するキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。インフリキシマブはヒト定常領域およびマウス可変領域を有する。インフリキシマブのＨ鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は１１９アミノ酸を有し；Ｌ鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は１０７アミノ酸を有する。特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

ＴＮＦαは多様な細胞により産生され得るが、しかし、活性化されたマクロファージがこの因子の最も豊富な供給源を構成する（非特許文献１）。ＴＮＦαは１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である（非特許文献２）。ＴＮＦαの膜結合型の２６ｋＤの前駆体もまた存在する（非特許文献３）。

ＴＮＦαは、好中球およびリンパ球の接着を増大させる血管内皮細胞上の凝血原活性を誘導すること、ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の遊離を刺激することのような、組織傷害をもたらす炎症前作用を引き起こす（非特許文献４；非特許文献５：非特許文献６）。

ＴＮＦα、および緊密に関連するサイトカインＴＮＦβ（リンホトキシンとしてもまた知られる）の多数の生物学的効果は、２種のＴＮＦ膜受容体すなわちｐ５５およびｐ７５受容体により媒介される（非特許文献７；非特許文献８）。タンパク質分解性切断により派生されるＴＮＦ受容体の細胞外ドメインはＴＮＦの機能を阻害する（非特許文献９）。ＴＮＦαは、感染、免疫障害、腫瘍性病変、自己免疫性病変、および移植片対宿主病変と関連する（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＴＮＦαの調節不全およびとりわけ過剰産生は、敗血症、脳性マラリア、ならびに、多発性硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデスおよびクローン病のような自己免疫疾患、ならびに癌を包含する多様なヒト疾患に関与している（非特許文献１３に総説される）。ＴＮＦαは、癌、感染性病変および他の異化状態における悪液質を媒介し得る（非特許文献１４に総説される）。

ＴＮＦα活性を阻害する抗ＴＮＦα抗体を中和することは、ＴＮＦα媒介性疾患の処置および／若しくは診断において有用である。インフリキシマブは、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬性関節炎および関節リウマチの処置に米国で承認されている。それは、多様な免疫性および自己免疫性病変の他の障害若しくは症状、ならびに全身性エリテマトーデス、サイロイドーシス（ｔｈｙｒｏｉｄｏｓｉｓ）、移植片対宿主病、強皮症、糖尿病、グ
レーヴズ病、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、播種性血管内凝固、アテローム硬化症および川崎病の病変のような炎症性疾患もまた効果的に処置し得る。特許文献５、特許文献６および特許文献７（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

インフリキシマブに対する抗体が若干の処置された患者で観察されたことが報告された（非特許文献１５；非特許文献１６）。従って、処置される患者での抗インフリキシマブ抗体の発生を潜在的に減少させるために、該分子中に存在するマウスアミノ配列の量を低下させることが望ましい。

米国特許第６，２７７，９６９号明細書 米国特許第６，２８４，４７１号明細書 米国特許第６，７９０，４４４号明細書 米国特許第６，８３５，８２３号明細書 米国特許第５，６５６，２７２号明細書 米国特許第５，６９８，１９５号明細書 米国特許第５，９１９，４５２号明細書

Ｖａｓｓａｌｌｉ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４１１−４５２（１９９２） Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６９５１−６９５４（１９８７） Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１９８８） Ｐｏｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０−１６８７（１９８６） Ｐｏｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９−３３２４（１９８７） Ｃａｍｕｓｓｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３９０−１４０４（１９８７） Ｈｏｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９） Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５３１−１５３６（１９９０） Ｋｏｈｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８３３１−８３３５（１９９０） Ｃｅｒａｍｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：２８−３１（１９８８） Ｏｌｉｆｆら、Ｃｅｌｌ ５０：５５５−５６３（１９８７） Ｐｉｇｕｅｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０−１２８９（１９８７） ＺｈａｎｇとＴｒａｃｅｙ、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｔｈｏｍｓｏｎ ＡＷ（編）．ｐｐ ５１７−５４８（１９９８） Ｔｒａｃｅｙら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８７：３２５−３３１（１９９０） Ｔａｒｇａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１０２９−１０３５（１９９７） Ｍａｉｎｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４１：１５５２−１５６３（１９９８）

本発明の一局面は、配列番号２に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。

本発明の別の局面は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９若しくは１９０に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。

本発明の別の局面は、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７若しくは３７８に示される配列、または相補配列を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４
０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９若しくは１９０に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。

［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全部の刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。一文字アミノ酸記号を当業者により理解されるとおりに本明細書で使用する。

本明細書で使用されるところの「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１種若しくはそれ以上のポリペプチドよりなるタンパク質を指す。本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原、ならびに、限定されるものでないが酵素的切断（例えばパパイン若しくはペプシン消化による）、ペプチド合成または組換え技術を挙げることができるいずれかの既知技術により提供されるそれらの生物学的に活性のフラグメント、領域若しくは誘導体と相互作用若しくは別の方法で会合することが可能である免疫グロブリンファミリーの１タンパク質を指す。抗体の生物学的に活性のフラグメント、領域の例は、限定されるものでないがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖを挙げることができる。これらのフラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠き、無傷の抗体より循環からより迅速に消失しかつより小さい非特異的組織結合を有し得る。「誘導体」という用語は、免疫グロブリン分子に機能的に似ている改変された抗体を包含する。例示的一改変は、細菌毒素のような細胞傷害性タンパク質の付加であり得る。

本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、抗体と相互作用することが可能である物質を指し、そして、本発明の情況でＴＮＦαであることを意味している。ＴＮＦαは可溶性ＴＮＦα若しくは膜結合ＴＮＦαでありうる。本明細書で使用されるところの「ＴＮＦα抗体」という用語は、ＴＮＦの部分を結合しかつＴＮＦ受容体へのＴＮＦαの結合を阻害することが可能な抗体を包含する。

本発明は、ＴＮＦαに結合しかつインフリキシマブより少ないマウス由来アミノ酸残基を有するＴＮＦα抗体を提供する。本発明は、ＴＮＦα抗体をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター、宿主細胞、組成物、ならびにＴＮＦα抗体の作成および使用方法もまた提供する。

ＴＮＦα抗体のポリペプチドおよび組成物
本発明は、全般として、式Ｉ（配列番号２）：
ＥＶＱＬＸ_５ＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＸ_２３ＡＳＸ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８ＦＳ ＮＨＸ_３３ＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥ ＩＲＳＫＳＸ_５６Ｘ_５７Ｘ_５８
ＡＴ Ｘ_６１ＹＡＥＳＶＫＧＲＦ ＩＩＳＲＤＸ_７６ＮＸ_７８Ｘ_７９Ｘ_８０ ＬＸ_８２ＬＥＭＮＳＬＫＴ ＥＤＴＡＥＹＹＣＡＸ_１００ ＮＹＹＧＳＴＸ_１０７ＤＹＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
（Ｉ）
式中、
Ｘ_５はＶ若しくはＴであり；Ｘ_２３はＡ若しくはＲであり；Ｘ_２６はＧ若しくはＱであり；Ｘ_２７はＦ若しくはＳであり；Ｘ_２８はＩ若しくはＴであり；Ｘ_３３はＷ若しくはＹであり；Ｘ_５６はＩ若しくはＳであり；Ｘ_５７はＮ若しくはＹであり；Ｘ_５８はＳ若しくはＧであり；Ｘ_６１はＨ若しくはＳであり；Ｘ_７６はＤ若しくはＧであり；Ｘ_７８はＫ若しくはＧであり；Ｘ_７９はＮ若しくはＴであり；Ｘ_８０はＳ若しくはＤであり；Ｘ_８２はＹ若しくはＴであり；Ｘ_１００はＲ若しくはＱであり；およびＸ_１０７はＹ若しくはＰである、
に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるＴＮＦα抗体に関する。

より具体的には、本発明は、ヒトで抗インフリキシマブ抗体を生成することがより少なくありそうである、ＴＮＦαに対する抗体に関する。

該ＴＮＦα抗体の可変領域は、枠組み領域においてヒト免疫グロブリン配列若しくはヒト免疫グロブリン生殖系列配列と有意の同一性を有する。ヒト免疫グロブリン配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のもののようなデータベースに見出し得る。ヒト免疫グロブリン生殖系列配列は、例えばｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／に見出し得る。例示的Ｈ鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９若しくは１９０に示される。例示的Ｌ鎖可変領域配列は、配列番号３８０に示される。

Ｈ鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のようなそれらのサブタイプを包含するヒトＨ鎖の既知のクラス若しくはアイソタイプのいずれにも由来し得る。Ｈ鎖アイソタイプは抗体の多様なエフェクター機能の原因であるため、Ｈ鎖定常領域の選択は、補体固定若しくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のような所望のエフェクター機能により導かれることができる。例示的一Ｈ鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３８２に示される。Ｌ鎖定常領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプκ若しくはλいずれかに由来し得る。例示的一Ｌ鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３８３に示される。

本発明のＴＮＦα抗体は、広範なアフィニティーでＴＮＦαを結合し得る。例示的ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブのアフィニティーに類似の若しくはそれより大きいアフィニティーでＴＮＦαを結合する。ＴＮＦαに対するＴＮＦα抗体のアフィニティーは、いずれかの適する方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ若しくはＫｉｎＥｘＡ器械類を使用する方法、ＥＬＩＳＡおよび競合結合アッセイを使用して実験で決定し得る。

本発明のＴＮＦα抗体は、ＴＮＦαとＴＮＦ受容体の間の相互作用を阻害若しくは低下させることが可能である。これらのＴＮＦα抗体は、細胞傷害性、有糸分裂誘発、サイトカイン誘導および接着分子の誘導のような広範なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴＮＦα活性を中和する。

本発明のＴＮＦα抗体は、多様な免疫性および自己免疫性病変ならびに炎症性疾患の障害若しくは症状を処置するのに有用である。ＴＮＦ関連の病変および疾患は、限定されるものでないが、以下、すなわち
（Ａ）全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、サイロイドーシス、移植片対宿主病、強皮症、糖尿病、グレーヴズ病などのような、急性および慢性の免疫性および自己免疫性病変；
（Ｂ）限定されるものでないが、（悪液質、自己免疫障害、ＡＩＤＳ認知症複合症および感染症のような続発症を包含する）ＡＩＤＳのような、急性若しくは慢性の細菌感染、急性および慢性の寄生虫および／または細菌、ウイルス若しくは真菌感染性疾患から生じる敗血症症候群、悪液質、循環虚脱およびショックを挙げることができる感染症；
（Ｃ）サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような慢性の炎症性病変、ならびに限定されるものでないが播種性血管内凝固、アテローム硬化症および川崎病の病変を挙げることができる血管の炎症性病変を包含する、慢性の炎症性病変および血管炎症性病変のような炎症性疾患；
（Ｄ）限定されるものでないが、多発性硬化症および急性横断性脊髄炎のような脱髄性疾患；皮質脊髄系の病変のような錐体外路および小脳の障害；基底核の障害若しくは小脳の障害；ハンチントン舞踏病および老人性舞踏病のような運動亢進性運動障害；ＣＮＳのドパミン受容体を阻害する薬物により誘発されるもののような薬物誘発性運動障害；パーキンソン病のような運動低下性運動障害；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変のような小脳および脊髄小脳障害；脊髄小脳変性（脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調、小脳皮質変性、多系統変性（メンセル、デジェリーヌ−トーマス、シャイ−ドレーガーおよびマシャド−ヨーゼフ）；ならびに全身障害（レフサム病、無β−リポ蛋白血症、運動失調、末梢血管拡張症およびミトコンドリアの多系統障害）；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎のような脱髄核（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｃｏｒｅ）障害；神経原性筋萎縮症（筋萎縮性側索硬化症、乳児の脊髄性筋萎縮症および若年性脊髄性筋萎縮症のような前角細胞変性）のような運動単位の障害；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レヴィー小体病；レヴィー小体型の老年認知症；ウェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール症；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性硬化性汎脳炎、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群；ならびにボクサー認知症、またはそれらのいずれかの部分集合を挙げることができる神経変性疾患；
（Ｅ）限定されるものでないが白血病（急性、慢性骨髄球性、慢性リンパ球性および／若しくは骨髄異形成症候群）；リンパ腫（ホジキン、および悪性リンパ腫（バーキットリンパ腫若しくは菌状息肉腫）のような非ホジキンリンパ腫））を挙げることができる、ＴＮＦ分泌性腫瘍を伴う悪性病変若しくはＴＮＦが関わる他の悪性病変；ならびに
（Ｆ）アルコール誘発性肝炎
を挙げることができる。

従って、本発明の別の局面は、最低１種のＴＮＦα抗体および当該技術分野で既知の製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる製薬学的組成物である。担体若しく
は希釈剤は、溶液、懸濁液、乳液、コロイド若しくは粉末であり得る。

本発明のＴＮＦα抗体は、治療的若しくは予防的有効量で製薬学的組成物として処方される。「有効量」という用語は、一般に、効果的な治療、すなわちそのための処置が探求された症状若しくは障害の部分的若しくは完全な緩和に必要な抗体の量を指す。上述された症状若しくは障害の発症の見込みを低下させることを意図している予防的処置が、有効な治療の定義内に包含される。

該組成物は、場合によっては、ＴＮＦ関連の病状若しくは疾患を処置するのに有用な最低１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物を含み得る。例えば、抗リウマチ薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、放射線療法、免疫抑制薬、ならびに多様な疾患および状態を処置するための細胞傷害性薬物との組合せを企図している。この点に関して、抗リウマチ薬は、オーラノフィン、アザチオプリン、クロロキン、Ｄ−ペニシラミン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ヒドロキシクロロキン、Ｍｙｏｃｒｉｓｉｎおよびスルファサルジン、メトトレキサートの最低１種であり得る。抗炎症薬は、ペンタサ、メサラジン、アサコール、リン酸コデイン、ベノリレート、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラクならびにインドメタシン、アスピリンおよびイブプロフェンの最低１種であり得る。

核酸、ベクターおよび細胞株
本発明の別の局面は、最低１種のＴＮＦα抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるか、それに相補的か、若しくはそれと有意の同一性を有する単離された核酸分子である。本発明の他の局面は、最低１種の単離されたＴＮＦα抗体をコードする核酸分子を含んでなる組換えベクター、ならびに該核酸分子からタンパク質を発現することが可能である細胞株および生物体を包含する。該核酸、発現ベクターおよび細胞株は、一般に、本発明のＴＮＦα抗体を製造するのに使用しうる。

一態様において、本発明の核酸組成物は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９若しくは１９０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。例示的核酸配列は、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８
、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７若しくは３７８に示されるポリヌクレオチドを含んでなる。

典型的には、本発明の核酸は、本発明のＴＮＦα抗体ポリペプチドの製造のための発現ベクターで使用される。本発明の範囲内のベクターは、ＣＭＶプロモーターに駆動されるベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４およびそれらの誘導体のようなウイルスプロモーターに駆動されるベクター、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクター、およびヒト免疫グロブリン遺伝子プロモーターのような哺乳動物遺伝子プロモーターにより駆動される発現ベクターを包含する真核生物発現のための必要な要素を提供する。他の例は、Ｔ７プロモーターに駆動されるベクター、例えばｐＥＴ４１、乳糖プロモーターに駆動されるベクター、およびアラビノース遺伝子プロモーターに駆動されるベクターのような原核生物発現ベクターを包含する。

本発明はＴＮＦα抗体を発現する細胞株にもまた関する。宿主細胞は原核生物若しくは真核生物細胞であり得る。例示的真核生物細胞は、限定されるものでないが、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞、若しくはそれらのいずれかの誘導体を挙げることができる哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０若しくはＣＨＯ細胞である。本発明の細胞株は最低１種のＴＮＦα抗体を安定に発現しうる。該細胞株は、当該技術分野で公知である安定若しくは一過性トランスフェクション手順により生成しうる。

本発明はさらに、ＴＮＦα抗体が検出可能な若しくは回収可能な量で発現される条件下で細胞株を培養することを含んでなる、最低１種のＴＮＦα抗体の発現方法を提供する。本発明は、ＴＮＦα抗体が検出可能な若しくは回収可能な量で発現されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの条件下で、ＴＮＦα抗体をコードする核酸を翻訳することを含んでなる、最低１種のＴＮＦα抗体の生成方法もまた提供する。本発明は、上の方法により製造されるＴＮＦα抗体もまた包含する。

ＴＮＦα抗体は、限定されるものでないがプロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互者王クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアトパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる公知の方法により回収かつ精製し得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もまた精製に使用し得る。

使用方法
該ＴＮＦα抗体は、とりわけ研究試薬および治療薬として有用である。一局面において
、本発明は、最低１種のＴＮＦα抗体をそれの必要な哺乳動物に提供することを含んでなる、ＴＮＦαとＴＮＦ受容体の間の相互作用の低下若しくは阻害方法に関する。ＴＮＦα抗体がＴＮＦαの生物学的活性を中和し、そして従ってＴＮＦαのアンタゴニストとして機能する。「アンタゴニスト」という用語は最も広範な意味で使用され、そして、ＴＮＦαの１種若しくはそれ以上の生物学的活性を直接若しくは間接的に部分的に若しくは完全に打ち消す、低下させる若しくは阻害することが可能である分子を包含する。

本発明は、さらに、治療上有効な量の最低１種のＴＮＦα抗体の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のＴＮＦα関連の状態若しくは疾患の症状の低下若しくはその処置方法を提供する。上述されたとおり、こうした組成物は、有効量の最低１種のＴＮＦα抗体および製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる。所定の治療（治癒的であろうと予防的であろうと）の有効量は、一般に、投与手段、標的部位および投与される他の薬剤を包含する多くの多様な因子に依存することができる。従って、処置用量は、安全性および有効性を至適化するように滴定される必要があることができる。

本発明の方法を使用する処置に適する状態および疾患は、限定されるものでないが、上で詳細に列挙されたところの多様な免疫障害、自己免疫性病変および炎症性疾患を挙げることができる。これらの方法は、場合によっては、該疾患を処置するのに使用されるいずれかの標準的治療との共投与若しくは併用療法をさらに含み得る。

投与様式は、製薬学的有効量の本発明のＴＮＦα抗体を宿主に送達するためのいかなる適する経路でもあり得る。例えば、ＴＮＦα抗体は、皮下、筋肉内、皮内、静脈内若しくは鼻内投与のような非経口投与、または当該技術分野で既知のいずれかの他の手段を介して送達し得る。

ＴＮＦα抗体Ｃ７（配列番号３）およびインフリキシマブ（配列番号１）のＶ_Ｈ領域のアライメントを示す。同一アミノ酸は「−」により示す。保存的アミノ酸変化は太字で示す。 Ｃ７（配列番号３８０）およびインフリキシマブ（配列番号３７９）のＶ_Ｌ領域のアライメントを示す。同一アミノ酸は「−」により示す。保存的アミノ酸変化は太字で示す。 Ｃ７およびインフリキシマブのＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。

本発明は以下の実施例を参照してさらに記述される。これらの実施例は単に本発明の局面を具体的に説明するためであり、そして本発明の制限として意図していない。

［実施例］

ＴＮＦα抗体の生成
Ｆａｂライブラリーを、インフリキシマブ配列および構造に基づく基準の組合せに基づき設計した。設計の目標は、ヒト免疫グロブリン配列に対する高い相同性をもつインフリキシマブの活性に少なくとも同等なＴＮＦα結合活性をもつ分子であった。例えば、ライブラリーメンバーの選択の１基準は、相同なヒト対照物とのＨおよびＬ鎖双方についての枠組みおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）中の配列の同一性若しくは類似性であった。ＮＣＢＩのヒト免疫グロブリンデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびヒト生殖系列免疫グロブリンデータベース（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を使用した。これらの基準に基づき、Ｖ_Ｈポリペプチドを、１７部位の１個若しく
は組合せでの置換を伴い設計した。これらのＶ_Ｈの組合せを、配列番号３８０に示されるアミノ酸配列（コードする核酸配列は配列番号３８１に示される）を有する一置換Ｖ_Ｌポリペプチドと組み合わせた。合成Ｆａｂ ＤＮＡライブラリーは米国特許第６，５２１，４２７号明細書に記述される方法に従って生成した。

ＦａｂライブラリーをｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ（カタログ番号Ｖ３６５−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローン化した。タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、そして固相ＥＬＩＳＡを使用してヒトＴＮＦαへのＦａｂ結合を評価した。簡潔には、９６ウェルプレートを、炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９．４中１μｇ／ｍｌのｒＨｕＴＮＦ−α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州カマリロ）で４℃で一夜被覆した。０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。洗浄した後に、アッセイ緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈した形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ライセートとともに、プレートを室温で２時間インキュベートした。多様な濃度のインフリキシマブ（０．５、１および２ｎｇ／ｍｌ）を、陽性抗ヒトκ Ｌ鎖ビオチン／抗ペンタヒスチジンビオチン対照として使用した。プレートを洗浄し、そして、アッセイ緩衝液で２０００倍希釈したビオチン結合ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅヤギ抗ヒトκ鎖（カタログ番号３１７８０、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）およびペンタヒスチジンビオチン複合物（カタログ番号３４４４０、ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）と室温で１時間インキュベートした。別の洗浄段階後に、アッセイ緩衝液で４０００倍希釈した１００μＬ／ウェルのストレプトアビジンＰＯＤ（カタログ番号１０８９１５３、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インジアナ州インジアナポリス）でプレートを室温で１時間プロービングした。プレートをさらに洗浄し、そしてその後３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、カタログ番号３４０２８、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と３０分間インキュベートした。基質の発色を１００μＬ／ウェルのＴＭＢ停止溶液（カタログ番号５０−８５−０５、ＫＰＬ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）の添加により停止し、そして、自動プレート分光光度計を介して吸光度を４５０ｎｍで測定した。

バックグラウンド値の最低２倍の光学密度値をもつ１８８クローンをさらに特徴付けした。これらのクローンのＶ_Ｈアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３ないし１９０に示す。Ｖ_Ｌアミノ酸配列は配列番号３８０に示す。簡潔には、タンパク質濃度を測定し、そしてＴＮＦα ＥＬＩＳＡでの滴定曲線を各クローンについて生成した。５０ｎｇ／ｍｌで開始する二検体での８点滴定により連続希釈曲線を生成した。クローンをそれらのＥＣ５０に従って等級付けした。選択したＦａｂクローンの可変領域を、インフリキシマブの定常領域を含む哺乳動物構築物にサブクローニングした。

ＴＮＦα抗体の配列分析
実施例１で記述されたとおり選択した新規ＴＮＦα抗体の１種（Ｃ７）のＶ_Ｈ領域（配列番号３）の枠組み部分は、ヒト生殖系列配列（ＶＨ３ ３−７２およびＪＨ４）に同一である。図１に示されるとおり、インフリキシマブに比較した場合、枠組み領域中の８３アミノ酸のうち６１個が同一である。異なる２３位置のうち、それらの１４個（太字で示される）は保存的アミノ酸変化である。

同様に、Ｃ７のＶ_Ｌ領域の枠組み部分はヒト生殖系列配列（Ｖｋ１ Ａ１０およびＪｋ３）に同一である。図２に示されるとおり、インフリキシマブに比較した場合、枠組み領域中の８０アミノ酸のうち６３個が同一である。異なる１７位置のうち、それらの１３個（太字で示される）は保存的アミノ酸変化である。

抗体Ｃ７のＴＮＦαへの結合
完全長抗体を、ＴＮＦα結合を確認するため、実施例１に記述されたところの固相ＥＬＩＳＡ結合アッセイで使用した。図３は、Ｃ７のＥＬＩＳＡ滴定曲線がインフリキシマブのものに匹敵することを示す。

Ｃ７を、ＴＮＦαへのＣ７およびインフリキシマブの結合定数を比較するためのＢｉａｃｏｒｅアッセイでもまた使用した。該結果（示されない）は、ＴＮＦαへのＣ７の結合アフィニティー（Ｋ_Ｄ＝７０ｐＭ）がインフリキシマブのもの（Ｋ_Ｄ＝１７０ｐＭ）より２倍以上より高いことを示した。

本発明によれば、商標名ＲＥＭＩＣＡＤＥ^（Ｒ）の下で販売されているインフリキシマブの望ましくない免疫反応の低減した改変抗ＴＮＦα抗体が提供される。したがって、少なくとも医薬製造産業で利用できる。

Claims (3)

1. 配列番号３に示される配列を有するポリペプチドおよび配列番号３８０に示される配列を有するポリペプチドを含んでなる抗ＴＮＦα抗体。
2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
3. 有効量の請求項１に記載の抗ＴＮＦα抗体、および製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。

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