JP2013007759A - Method for immobilizing protein to carrier, carrier with immobilized protein, and measurement reagent of test substance using carrier with immobilized protein - Google Patents

Method for immobilizing protein to carrier, carrier with immobilized protein, and measurement reagent of test substance using carrier with immobilized protein Download PDF

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Yoshinori Higashi
義則 東
Yuki Nakamura
雄樹 中村
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for expressing protein having a signal sequence in a base sequence of a gene at a state of having the signal sequence and immobilizing the protein having the signal sequence to a carrier, the carrier to which the protein in which secretory protein having the signal sequence in the base sequence of the gene is expressed at the state of having the signal sequence is immobilized by the method, and a measurement reagent of a test substance using the carrier.SOLUTION: There is provided a method for immobilizing protein for expressing the protein having a signal sequence in a base sequence of a gene at a state of having the signal sequence, and immobilizing the protein having the signal sequence to the carrier, the carrier to which the protein in which the protein having the signal sequence in the base sequence of the gene is expressed at the state of having the signal sequence is immobilized, and a measurement reagent of a test substance containing the carrier to which the protein in which the protein having the signal sequence in the base sequence of the gene is expressed at the state of having the signal sequence is immobilized.

Description

本発明は、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させ、このタンパク質を担体に固定化する方法、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質を固定化した担体、及び遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質を固定化した担体を用いた被検物質の測定試薬に関する。
本発明は、臨床検査、免疫学、及び医学などの生命科学分野、分析化学などの化学分野、食品衛生分野、並びに環境衛生分野等において有用なものである。
The present invention relates to a method for expressing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having the signal sequence and immobilizing the protein on a carrier, a protein having a signal sequence in the base sequence of the gene as a signal sequence A test substance using a carrier in which a protein expressed in a state having a signal is immobilized, and a carrier in which a protein having a signal sequence in a base sequence of a gene is expressed in a state having a signal sequence is immobilized It relates to the measurement reagent.
The present invention is useful in the field of life science such as clinical examination, immunology, and medicine, the field of chemistry such as analytical chemistry, the field of food hygiene, and the field of environmental health.

タンパク質の固定化方法には、共有結合法及び架橋法等の化学的結合法、並びに物理的吸着法等が知られている。
これらの固定化方法のうち、共有結合法は担体からのタンパク質の脱離が極めて少ないという利点をもつが、担体に対するタンパク質の固定化量が比較的少なく、固定化する際の化学反応によってタンパク質が変性したり、タンパク質の生理学的活性の低下が起こりやすい。また、架橋法は多量のタンパク質を必要とする上効率が悪く、固定化する際にタンパク質の生理学的活性の低下が起こりやすい。
これに対して物理的吸着法は、操作が簡便で短時間にタンパク質を担体に固定化できることや、担体に対してタンパク質を均一に固定化できること、担体に対するタンパク質の固定化量が比較的多いことなどから、一般的に広く利用されている。
Known protein immobilization methods include chemical bonding methods such as covalent bonding methods and crosslinking methods, and physical adsorption methods.
Among these immobilization methods, the covalent bond method has the advantage that protein detachment from the carrier is extremely small. However, the amount of protein immobilized on the carrier is relatively small, and the protein is immobilized by a chemical reaction during immobilization. It tends to denature or decrease the physiological activity of the protein. In addition, the cross-linking method requires a large amount of protein and is not efficient, and the physiological activity of the protein is likely to be lowered during immobilization.
On the other hand, the physical adsorption method is easy to operate and can immobilize the protein on the carrier in a short time, can evenly immobilize the protein on the carrier, and has a relatively large amount of protein immobilized on the carrier. In general, it is widely used.

一方、被検物質に対する特異的結合物質であるタンパク質を固定化した担体を使用して、試料中の被検物質を測定する測定方法、又は測定試薬が繁用されている。例えば、抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法及び測定試薬は種々のものが知られている。
これは、試料中に含まれる被検物質と、この被検物質に対する特異的結合物質との結合の有無、又は結合の量を測ることにより、試料中に含まれる被検物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量(濃度)の測定〔定量測定〕を行うものである。
例えば、抗原と抗体の間の抗原抗体反応(免疫反応、免疫学的反応)を利用した免疫学的測定方法(免疫学的測定試薬)においては、ラテックス粒子を担体として使用するラテックス比濁測定方法(測定試薬);ラテックス粒子、有機高分子粒子、無機粒子、金属粒子、若しくは赤血球などを担体として使用する間接凝集反応測定方法(測定試薬);マイクロタイタープレート、ビーズ、粒子、試験管、若しくは容器などを担体として使用する酵素免疫測定法、発光免疫測定法などの標識免疫測定法(測定試薬);又は、セルロース、若しくは不織布などを担体として使用するイムノクロマトグラフィー法(測定試薬)等が繁用されている。
これらの測定方法又は測定試薬においては、多くの場合、被検物質に対する特異的結合物質であるタンパク質が固定化された担体を使用する。しかしながら、担体への被検物質に対する特異的結合物質であるタンパク質の固定化に物理的吸着法を使用した場合、被検物質に対する特異的結合物質であるタンパク質の種類によっては担体への固定化が難しいものもあった。また、一度固定化したタンパク質が脱離してしまうこともあった。
そして、この被検物質に対する特異的結合物質であるタンパク質の担体への固定化が十分でないと、この固定化された担体を使用して試料中の被検物質の測定を行う場合には、測定反応の際に生成するシグナルの量が減少してしまうことにより測定の感度が低下してしまう恐れがあった。この場合、被検物質を含む試料の測定においても、被検物質が含まれていないという誤った測定結果(偽陰性)が得られる可能性があり、特に臨床検査等においては患者などの疾病の診断を誤らせる危険性を含むものであった。(一定の測定感度が得られず正確な測定を行うことが困難な場合もあった。)
On the other hand, a measuring method or a measuring reagent for measuring a test substance in a sample using a carrier on which a protein that is a specific binding substance for the test substance is immobilized is frequently used. For example, a small amount of test substance contained in a sample using a reaction between substances having specific affinity such as antigen and antibody, sugar and lectin, nucleotide chain and complementary nucleotide chain, and ligand and receptor. Various measuring methods and measuring reagents are known.
This is a measurement of the presence or absence of a test substance contained in a sample by measuring the presence or absence of binding between the test substance contained in the sample and a specific binding substance for this test substance [ Qualitative measurement] or measurement (quantitative measurement) of its content (concentration).
For example, in an immunological measurement method (immunological measurement reagent) using an antigen-antibody reaction (immune reaction, immunological reaction) between an antigen and an antibody, a latex turbidimetric measurement method using latex particles as a carrier (Measurement reagent): Indirect agglutination reaction measurement method using latex particles, organic polymer particles, inorganic particles, metal particles, or red blood cells as a carrier (measurement reagent); microtiter plate, beads, particles, test tube, or container Labeled immunoassay (measuring reagent) such as enzyme immunoassay and luminescence immunoassay using as a carrier; or immunochromatography (measuring reagent) using cellulose or non-woven fabric as a carrier is frequently used. ing.
In these measurement methods or reagents, in many cases, a carrier on which a protein that is a specific binding substance for a test substance is immobilized is used. However, when a physical adsorption method is used to immobilize a protein that is a specific binding substance to a test substance on a carrier, the immobilization to the carrier may not be possible depending on the type of protein that is a specific binding substance to the test substance. Some were difficult. Moreover, the protein once immobilized may be detached.
If the protein, which is a specific binding substance for the test substance, is not sufficiently immobilized on the carrier, the test substance in the sample is measured using this immobilized carrier. There was a risk that the sensitivity of the measurement would be reduced due to a decrease in the amount of signal generated during the reaction. In this case, there is a possibility that an erroneous measurement result (false negative) that the test substance is not contained may be obtained even in the measurement of the sample containing the test substance. The risk of misdiagnosis was included. (There are cases where it is difficult to perform accurate measurement because a certain measurement sensitivity cannot be obtained.)

前記したように、タンパク質の固定化方法のうち、共有結合法は、担体に対するタンパク質の固定化量が比較的少なく、固定化する際の化学反応によってタンパク質が変性したり、タンパク質の生理学的活性の低下が起こりやすいという問題があった。また、架橋試薬等による化学的結合法は、多量のタンパク質を必要とする上に効率が悪く、固定化する際にタンパク質の生理学的活性の低下が起こりやすいという問題点があった。
更に、物理的吸着法においても、タンパク質の種類によっては担体への固定化が難しいという問題点があった。また、一度固定化したタンパク質が脱離してしまうという問題点があった。
従って、本発明の課題は、タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質が固定化された担体、及びタンパク質が固定化された担体を使用した被検物質の測定試薬において、タンパク質を担体に容易に固定化し、かつタンパク質の生理学的活性を低下させたり、変性させたりすることなく長期間固定化することができる手段を提供することである。
As described above, among the protein immobilization methods, the covalent bond method has a relatively small amount of protein immobilized on a carrier, and the protein is denatured by the chemical reaction during immobilization, or the physiological activity of the protein. There was a problem that the reduction was likely to occur. In addition, the chemical bonding method using a crosslinking reagent or the like has a problem that a large amount of protein is required and the efficiency is low, and the physiological activity of the protein is likely to be lowered when the protein is immobilized.
Furthermore, the physical adsorption method also has a problem that it is difficult to immobilize it on a carrier depending on the type of protein. In addition, there is a problem that once immobilized proteins are detached.
Therefore, an object of the present invention is to easily fix a protein on a carrier in a method for immobilizing a protein on a carrier, a carrier on which a protein is immobilized, and a measurement reagent for a test substance using the carrier on which a protein is immobilized. It is to provide means for immobilization and immobilization for a long time without reducing or denaturing the physiological activity of the protein.

本発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質を、シグナル配列を有した状態で発現させて担体に固定化すると、この担体への固定化を容易かつ多量に行うことができ、更にこの固定化を長期間安定に保つことができることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of diligent research, the present inventors have expressed a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having the signal sequence and immobilized it on a carrier. It was found that the immobilization can be kept stable for a long period of time, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させ、このシグナル配列を有するタンパク質を担体に固定化することを特徴とするタンパク質の固定化方法である。   That is, the present invention is a protein immobilization method characterized by expressing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having the signal sequence, and immobilizing the protein having the signal sequence on a carrier. is there.

また、本発明は、タンパク質を固定化した担体であって、このタンパク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質であることを特徴とする、タンパク質を固定化した担体である。   Further, the present invention is a carrier on which a protein is immobilized, wherein the protein is a protein in which a protein having a signal sequence in a base sequence of a gene is expressed in a state having a signal sequence, A carrier on which a protein is immobilized.

更に、本発明は、タンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬であって、このタンパク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質であることを特徴とする、被検物質の測定試薬である。   Furthermore, the present invention provides a measurement reagent for a test substance containing a carrier on which a protein is immobilized, wherein the protein has a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene expressed in a state having the signal sequence. This is a reagent for measuring a test substance.

本発明においては、前記タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質であることが好適である。   In the present invention, the protein is preferably a membrane protein or a secreted protein.

また、本発明においては、前記タンパク質が被検物質に対する特異的結合物質であることが好適である。   In the present invention, it is preferable that the protein is a specific binding substance for a test substance.

更に、本発明においては、被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原であることが好適である。   Furthermore, in the present invention, it is preferable that the test substance is an antibody against Treponema paridum and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema paridum.

本発明の、タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質が固定化された担体、及びタンパク質が固定化された担体を用いた被検物質の測定試薬では、タンパク質としてシグナル配列を有するタンパク質を使用するため、タンパク質の担体への固定化が容易に、かつ多量に行えるものである。
また、本発明のタンパク質が固定化された担体、及び測定試薬の保存中に、タンパク質を固定化した担体からタンパク質が脱離してしまうことを防止し、タンパク質を担体に長期間安定に固定化しておくことができるものである。これにより前記測定試薬の測定の感度の低下を防いで前記測定試薬の安定化が図られ、長期間、正確な被検物質の測定結果を得ることができるという効果を有するものである。
更に、本発明では、そのタンパク質がもともと有しているシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質を用いて担体に固定化を行う。このため、そのタンパク質と本来関係がないペプチドを結合させたタンパク質の場合に考えられる立体障害等によりタンパク質の構造又は機能に障害が起きてしまう可能性が少なく、従って、そのタンパク質が本来持っている酵素反応又は抗原抗体反応等を固定化後も十分に発揮することができるものである。
また、本発明では、タンパク質の担体への固定化を容易にできるため、担体に対する固定化量が少なくてすむものである。
In the method for immobilizing a protein on a carrier, the carrier on which the protein is immobilized, and the test reagent for the test substance using the carrier on which the protein is immobilized, a protein having a signal sequence is used as the protein. Therefore, the protein can be easily immobilized on a carrier in a large amount.
In addition, during the storage of the carrier on which the protein of the present invention is immobilized and the measurement reagent, the protein is prevented from being detached from the carrier on which the protein is immobilized, and the protein is stably immobilized on the carrier for a long period of time. It can be left. Accordingly, the measurement reagent can be prevented from being lowered in sensitivity and stabilized, and the measurement result of the test substance can be obtained for a long period of time.
Furthermore, in the present invention, the protein is immobilized on a carrier using a protein expressed in a state having a signal sequence that the protein originally has. For this reason, there is little possibility that the structure or function of the protein will be impaired due to steric hindrance or the like that is considered in the case of a protein that is not associated with the protein, and the protein originally has Enzyme reactions or antigen-antibody reactions can be sufficiently exhibited even after immobilization.
In the present invention, since the protein can be easily immobilized on the carrier, the amount of the protein immobilized on the carrier can be reduced.

本発明及び比較例の測定試薬を用いて、試料中のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定して結果を示した図である。It is the figure which measured the antibody with respect to Treponema pallidum in a sample using the measuring reagent of this invention and a comparative example, and showed the result. 本発明、比較例及び対照の測定試薬を用いて、試料中のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定して結果を示した図である。It is the figure which measured the antibody with respect to Treponema paridam in a sample using this invention, the comparative example, and the measurement reagent of a control | contrast, and showed the result. 本発明の測定試薬の保存安定性の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the storage stability of the measuring reagent of this invention.

〔1〕発明の基本要件
本発明の「タンパク質の担体への固定化方法」、「タンパク質を固定化した担体」、及び「タンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬」においては、担体に固定化するタンパク質は、その遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質であり、このシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質を担体に固定化するものである。
[1] Basic Requirements of the Invention In the “method for immobilizing a protein on a carrier”, “a carrier on which a protein is immobilized”, and “a reagent for measuring a test substance containing a carrier on which a protein is immobilized”, The protein immobilized on the carrier is a protein having a signal sequence in the base sequence of the gene, and the protein expressed in a state having this signal sequence is immobilized on the carrier.

〔2〕遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質
本発明において、担体に固定化するタンパク質は、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質である。
この遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質としては、その遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するもの、すなわち、成熟型タンパク質のN末端側にシグナル配列を有するものであれば、どのような種類のタンパク質でも用いることができる。
なお、シグナル配列とは、タンパク質がN末端側に有している、細胞質膜の脂質二重層を通過する際に必要な15〜30個程度のアミノ酸残基のことである。このシグナル配列の中央部には疎水性アミノ酸残基が連続する疎水性領域があり、N末端側には塩基性アミノ酸残基が存在しており、C末端側には親水的で側鎖の比較的小さいアミノ酸残基が存在している。また、このアミノ酸残基からなる配列の部分はシグナルペプチドと呼ばれている。
このシグナル配列は、タンパク質が細胞質膜の脂質二重層を通過する際の先導役を務めると考えられており、通常、タンパク質が細胞質膜を通過した後に、シグナルペプチダーゼによって切断・除去される。
よって、生体内で作られ細胞質膜の表面に付着しているか、内部に埋もれているもの、又は細胞質外に分泌された成熟型タンパク質は、シグナル配列を有していない。
[2] Protein having a signal sequence in the base sequence of the gene In the present invention, the protein immobilized on the carrier is a protein having a signal sequence in the base sequence of the gene.
As a protein having a signal sequence in the base sequence of this gene, any protein may be used as long as it has a signal sequence in the base sequence of the gene, that is, a signal sequence on the N-terminal side of the mature protein. Various types of proteins can also be used.
The signal sequence is about 15 to 30 amino acid residues necessary for the protein to pass through the lipid bilayer of the cytoplasmic membrane on the N-terminal side. There is a hydrophobic region in the center of this signal sequence, where hydrophobic amino acid residues are continuous, a basic amino acid residue is present on the N-terminal side, and a hydrophilic side chain is compared on the C-terminal side. Small amino acid residues are present. The portion of the sequence consisting of this amino acid residue is called a signal peptide.
This signal sequence is thought to play a leading role when the protein passes through the lipid bilayer of the cytoplasmic membrane, and is usually cleaved and removed by the signal peptidase after the protein passes through the cytoplasmic membrane.
Therefore, the mature protein produced in vivo and attached to the surface of the cytoplasmic membrane or buried inside, or secreted outside the cytoplasm does not have a signal sequence.

また、本発明においては、タンパク質が、膜タンパク質又は分泌タンパク質であることが好ましい。
ここで、膜タンパク質とは、生体膜を構成しているタンパク質のことをいい、生体膜の表面に付着しているものを膜表在性タンパク質、内部に埋もれているものを膜内在性タンパク質と呼ぶ。
この膜タンパク質としては、例えば、各種酵素、レセプター、輸送体、イオンチャンネル、抗原タンパク質等を挙げることができる。
また、分泌タンパク質とは、細胞質膜外へ分泌されるタンパク質であり、細胞質内のリボソーム上で合成された後、細胞質外へ分泌されることにより成熟型タンパク質となるものをいう。
この分泌タンパク質としては、例えば、各種消化酵素、ペプチドホルモン類、抗体タンパク質、乳タンパク質、卵白タンパク質等を挙げることができる。
In the present invention, the protein is preferably a membrane protein or a secreted protein.
Here, the membrane protein refers to a protein constituting a biological membrane. A protein attached to the surface of the biological membrane is a membrane surface protein, and a protein embedded inside is a membrane integral protein. Call.
Examples of the membrane protein include various enzymes, receptors, transporters, ion channels, and antigen proteins.
A secreted protein is a protein that is secreted outside the cytoplasmic membrane and is synthesized on a ribosome in the cytoplasm and then secreted outside the cytoplasm to become a mature protein.
Examples of the secreted protein include various digestive enzymes, peptide hormones, antibody protein, milk protein, egg white protein and the like.

また、本発明においては、タンパク質が、梅毒の原因菌として知られている、トレポネーマ・パリダム(Treponema Pallidum)の抗原タンパク質であることが好ましい。このトレポネーマ・パリダムの抗原タンパク質としては、トレポネーマ・パリダムの表面抗原タンパク質である15Kダルトン抗原タンパク質、17Kダルトン抗原タンパク質、又は47Kダルトン抗原タンパク質等が知られている。なお、これらの表面抗原タンパク質は、膜表在性タンパク質である。
また、これら表面抗原タンパク質のアミノ酸配列や塩基配列は既に報告されている。(15Kダルトン抗原タンパク質:Molecular Microbiology 4巻,1371〜1379頁,1990年、17Kダルトン抗原タンパク質:Infection and Immunity 61巻,1202〜1210頁,1993年、47Kダルトン抗原タンパク質:Infection and Immunity 60巻,1568〜1576頁,1992年)
In the present invention, the protein is preferably an antigenic protein of Treponema Pallidum, which is known as a causative bacterium for syphilis. Known antigenic proteins of Treponema pallidum include 15K Dalton antigen protein, 17K Dalton antigen protein, or 47K Dalton antigen protein, which are surface antigenic proteins of Treponema pallidum. These surface antigen proteins are membrane surface proteins.
In addition, the amino acid sequences and base sequences of these surface antigen proteins have already been reported. (15K Dalton antigen protein: Molecular Microbiology 4, 1371-1379, 1990, 17K Dalton antigen protein: Infection and Immunity 61, 1202-1210, 1993, 47K Dalton antigen protein: Infection and Immunity 60, 1568 To 1576, 1992)

なお、小胞体、ゴルジ体、リソソームに局在するタンパク質のうち、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を含んでいるものについても、本発明におけるタンパク質ということができる。   Among proteins localized in the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and lysosome, those having a signal sequence in the base sequence of the gene can also be referred to as proteins in the present invention.

〔3〕担体
本発明において、担体は、少なくともタンパク質を固定化する箇所の表面が疎水性であることが好ましい。
なお、担体において、表面が疎水性であるとは、その表面が疎水性の材質よりなるか、又はその表面に疎水性の物質又は官能基が結合若しくは被覆されて疎水性の性質が付与されていること等を挙げることができる。
このような担体としては、以下記載したような、免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬等において通常用いられている担体等を挙げることができる。
[3] Carrier In the present invention, it is preferable that at least the surface of the carrier where the protein is immobilized is hydrophobic.
In the carrier, the surface being hydrophobic means that the surface is made of a hydrophobic material, or a hydrophobic substance or functional group is bonded to or coated on the surface to impart a hydrophobic property. Can be mentioned.
Examples of such carriers include carriers usually used in immunological measurement methods, immunological measurement reagents and the like as described below.

本発明における担体としては、例えば、ラテックス比濁法に使用されているラテックス粒子、又はラテックス比濁法に使用することが可能な粒子を挙げることができる。
このようなラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレン・ラテックス粒子、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体・ラテックス粒子、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体・ラテックス粒子、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体・ラテックス粒子、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、ポリアクロレイン・ラテックス粒子、スチレン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子、スチレン−グリシジル(メタ)アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、メタクリル酸重合体・ラテックス粒子、又はアクリル酸重合体・ラテックス粒子などの合成高分子粒子を均一に懸濁させたラテックス粒子等を挙げることができる。
このラテックス粒子の粒径については、特に制限はない。
なお、ラテックス比濁法を測定原理として被検物質の測定を行う場合、ラテックス粒子が被検物質を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が0.04〜1μmであることが好ましい。
また、被検物質の測定試薬において、「被検物質に対する特異的結合物質を固定化したラテックス粒子」を含ませる濃度であるが、これは、被検物質の種類と試料中の濃度、被検物質に対する特異的結合物質の種類とラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と前記測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
しかし、通常は、試料と被検物質の測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「被検物質に対する特異的結合物質」と試料中に含まれていた「被検物質」との特異的な結合反応が行われる測定反応時に、「被検物質に対する特異的結合物質を固定化したラテックス粒子」の濃度が、反応混合液中において0.005〜1%(w/v)となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「被検物質に対する特異的結合物質を固定化したラテックス粒子」を前記被検物質の測定試薬に含ませる。
Examples of the carrier in the present invention include latex particles used in latex turbidimetry or particles that can be used in latex turbidimetry.
Examples of such latex particles include polystyrene / latex particles, styrene / styrene sulfonate copolymer / latex particles, acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer / latex particles, vinyl chloride / acrylate copolymer / Latex particles, vinyl acetate-acrylic acid copolymer / latex particles, polyacrolein / latex particles, styrene-methacrylic acid copolymer / latex particles, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer / latex particles, heavy methacrylate Examples thereof include latex particles in which synthetic polymer particles such as coalescence / latex particles or acrylic acid polymer / latex particles are uniformly suspended.
There is no restriction | limiting in particular about the particle size of this latex particle.
When measuring a test substance using the latex turbidimetric method as a measurement principle, the degree to which latex particles are bonded through the test substance to form an aggregate, the ease of measurement of the generated aggregate, etc. For this reason, the average particle size of the latex particles is preferably 0.04 to 1 μm.
In addition, the concentration of the test substance measurement reagent includes “latex particles with a specific binding substance immobilized on the test substance”. This is the concentration of the test substance, the concentration in the sample, the test substance Since the optimum concentration differs depending on various conditions such as the kind of specific binding substance to the substance and the distribution density on the surface of the latex particles, the particle size of the latex particles, the mixing ratio of the sample and the measuring reagent, it cannot be generally stated.
However, normally, the sample and the measurement reagent for the test substance are mixed and the “specific binding substance for the test substance” immobilized on the latex particles is specific to the “test substance” contained in the sample. In the measurement reaction in which a typical binding reaction is performed, the concentration of “latex particles with a specific binding substance immobilized on the test substance” is 0.005 to 1% (w / v) in the reaction mixture. In this case, the measurement of the test substance is carried out with “latex particles having a specific binding substance immobilized on the test substance” having such a concentration in the reaction mixture. Include in reagent.

また、本発明における担体としては、例えば、ゼラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法に使用されている粒子、又はこの間接凝集反応測定法に使用することが可能な粒子等を挙げることができる。
このような粒子としては、例えば、ポリスチレン、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子又はその他の人工担体等を挙げることができる。
更に、粒子として、色素を被覆するか又は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着色したものを使用してもよい。
こららの粒子の粒径については、特に制限はない。
しかし、これらの粒子の粒径としては、その平均粒子径が0.01〜100μmの範囲内にあることが好ましく、0.5〜10μmの範囲内にあることがより好ましい。
また、これらの粒子の比重は、1〜10の範囲内にあることが好ましく、1〜2の範囲内にあることがより好ましい。
In addition, as the carrier in the present invention, for example, particles used in indirect agglutination reaction measurement methods such as particle agglutination reaction measurement method using latex particles or latex agglutination reaction measurement method, or used in this indirect agglutination reaction measurement method And particles that can be used.
Examples of such particles include particles made of an organic polymer material such as polystyrene, liposome, latex, gelatin, polyacrylamide, microcapsule or emulsion, and particles made of an inorganic polymer material such as glass, silica gel, carbon or bentonite. Or other artificial carriers can be mentioned.
Further, as the particles, particles colored by coating a dye or by dispersing or encapsulating the dye in the particles may be used.
There are no particular restrictions on the particle size of these particles.
However, the average particle size of these particles is preferably in the range of 0.01 to 100 μm, and more preferably in the range of 0.5 to 10 μm.
Further, the specific gravity of these particles is preferably in the range of 1 to 10, more preferably in the range of 1 to 2.

また、本発明における担体としては、例えば、間接凝集反応測定法に使用されている容器、又はこの間接凝集反応測定法に使用することが可能な容器等を挙げることができる。
このような容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート(マイクロタイタープレート)又はトレイ等を挙げることができる。
なお、前記容器の溶液収容部分(マイクロプレートのウェル等)の底面は、U型、V型又はUV型等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが好ましい。
Examples of the carrier in the present invention include a container used for the indirect agglutination reaction measurement method, a container that can be used for the indirect agglutination reaction measurement method, and the like.
Examples of such containers include test tubes, microplates (microtiter plates) or trays made of glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, or the like.
In addition, it is preferable that the bottom surface of the solution storage portion (such as a well of a microplate) of the container has an inclined shape from the center to the periphery of the bottom surface such as a U shape, a V shape, or a UV shape.

また、本発明における担体としては、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫測定法、すなわち標識免疫測定法に使用されている担体、又はこの標識免疫測定法に使用することが可能な担体等を挙げることができる。
このような担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート(マイクロタイタープレート)、試験管、スティック又は試験片等を挙げることができる。
The carrier in the present invention is used for immunoassay using a labeling substance such as enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, radioimmunoassay, or luminescent immunoassay, that is, labeled immunoassay. Or a carrier that can be used in this labeled immunoassay.
Examples of such a carrier include materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, and glass. There may be mentioned particles, microcapsules, beads, microplates (microtiter plates), test tubes, sticks or test pieces.

また、本発明における担体としては、例えば、特開平9−229936号公報及び特開平10−132819号公報などに記載された被検物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用いる測定法に使用される担体、又はこの測定法に使用することが可能な担体等を挙げることができる。
このような担体としては、例えば、ポリスチレン、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の非吸水性の材質が挙げられる。
In addition, as the carrier in the present invention, for example, a specific binding substance for a test substance (test substance) described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919 is immobilized and coated. A carrier having a flat surface and a carrier used in a measurement method using particles in which a specific binding substance to a test substance (test substance) is immobilized, or a carrier that can be used in this measurement method, etc. be able to.
Examples of such a carrier include non-water-absorbing materials such as polystyrene, glass, polyvinyl chloride, polyacrylate, polypropylene, nylon, polyethylene, polycarbonate, and polymethacrylate.

また、以上記載した担体を強磁性体で被覆又は担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担体等を用いることもできる。
なお、本発明においては、担体がポリスチレンであることが好ましい。
Also, a magnetic carrier prepared by coating the above-described carrier with a ferromagnetic material or containing a ferromagnetic material at the time of carrier molding can be used.
In the present invention, the carrier is preferably polystyrene.

〔4〕遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させる方法
本発明において、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させるためには、例えば、遺伝子工学技術として知られている方法等の通常の方法を用いればよい。
例えば、まずタンパク質の遺伝子(成熟型タンパク質の遺伝子のN末端側にシグナル配列を有するもの)をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させることが出来る。
遺伝子の塩基配列をクローニングする方法としては、例えば、PCR法、リコンビナントPCR法、ライゲーション法、リンカーライゲーション法等を挙げることができる。例えば、PCR法を用いる場合には、天然のタンパク質の遺伝子の塩基配列をプライマーを用いて増幅させる事により、シグナル配列を有した状態で遺伝子の塩基配列を得ることが出来る。
例えば、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するトレポネーマ・パリダム表面抗原タンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させるための方法を17Kダルトン抗原タンパク質を例にして説明すると、まず、PCR法を用いて天然の17Kダルトン抗原タンパク質の遺伝子の塩基配列中の「シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の遺伝子の塩基配列」のみを、プライマーを用いて増幅することにより、「シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の遺伝子の塩基配列」を得る。このようにして得られた「シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の遺伝子の塩基配列」をライゲーション法等により発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを大腸菌に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させることができる。
[4] Method for expressing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having a signal sequence In the present invention, a protein having a signal sequence in a base sequence of a gene is expressed in a state having a signal sequence For this purpose, for example, a normal method such as a method known as genetic engineering technology may be used.
For example, a protein gene (having a signal sequence on the N-terminal side of a mature protein gene) is first cloned, and the obtained gene is incorporated into an expression vector such as a plasmid. By introducing this expression vector into a host cell such as Escherichia coli and culturing the resulting transformant, a protein having a signal sequence in the base sequence of the gene can be expressed in a state having the signal sequence.
Examples of the method for cloning a gene base sequence include a PCR method, a recombinant PCR method, a ligation method, and a linker ligation method. For example, when the PCR method is used, the base sequence of a gene can be obtained with a signal sequence by amplifying the base sequence of the gene of a natural protein using a primer.
For example, a method for expressing a Treponema paridum surface antigen protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having a signal sequence will be described using a 17 K Dalton antigen protein as an example. By amplifying only the “base sequence of the 17K dalton antigen protein gene having a signal sequence” in the base sequence of the natural 17K dalton antigen protein gene using a primer, the “17K dalton antigen protein having a signal sequence” The base sequence of the gene ”is obtained. The thus obtained “base sequence of a 17K Dalton antigen protein gene having a signal sequence” is incorporated into an expression vector by a ligation method or the like, this expression vector is introduced into Escherichia coli, and the resulting transformant is cultured. Thus, a 17 K Dalton antigen protein having a signal sequence in the base sequence of the gene can be expressed in a state having the signal sequence.

〔5〕シグナル配列を有するタンパク質を担体へ固定化する方法
本発明において、シグナル配列を有するタンパク質を担体に固定化するには、シグナル配列を有するタンパク質を担体に接触させることにより、行うことができる。
[5] Method of immobilizing a protein having a signal sequence on a carrier In the present invention, a protein having a signal sequence can be immobilized on a carrier by bringing the protein having a signal sequence into contact with the carrier. .

例えば、担体が容器である場合には、緩衝液等に溶解したシグナル配列を有するタンパク質を、容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させたり、又は担体が粒子である場合には、シグナル配列を有するタンパク質と粒子とを緩衝液等の溶液中で混合し接触させた後に、これを約2℃〜約40℃で約10分〜約1日間行うことにより、担体への固定化を行うことができる。   For example, when the carrier is a container, a protein having a signal sequence dissolved in a buffer solution or the like is added to the solution storage part of the container and brought into contact with the inner wall surface, or when the carrier is a particle, After the protein having the sequence and the particles are mixed and brought into contact in a solution such as a buffer solution, this is performed at about 2 ° C. to about 40 ° C. for about 10 minutes to about 1 day, thereby immobilizing the carrier. be able to.

また、更に非特異的反応や担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により、シグナル配列を有するタンパク質を固定化させた担体のブロッキング処理(マスキング処理)を行ってもよい。
なお、本発明においては、担体に固定化するタンパク質がシグナル配列を有しているため、このシグナル配列部分の疎水性により担体表面と疎水性相互作用により強くかつ安定的に結合、吸着し、脱離を起こし難いものと推測される。
Furthermore, if it is necessary to carry out treatment to suppress non-specific reaction or spontaneous aggregation of the carrier, proteins such as bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin, ovalbumin or salts thereof, surfactants or You may perform the blocking process (masking process) of the support | carrier which fix | immobilized the protein which has a signal sequence by well-known methods, such as making non-fat dry milk etc. contact and coat | cover.
In the present invention, since the protein to be immobilized on the carrier has a signal sequence, the hydrophobicity of the signal sequence portion strongly and stably binds and adsorbs on the surface of the carrier due to the hydrophobic interaction. It is estimated that it is difficult to cause separation.

〔6〕被検物質の測定試薬
本発明の被検物質の測定試薬は、タンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬であって、このタンパク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質であることを特徴とするものであり、「被検物質に対する特異的結合物質を固定化した担体」として、「シグナル配列を有するタンパク質を固定化した担体」を用いて、試料中の被検物質の測定を行うための測定試薬である。
[6] Reagent for measuring a test substance The test reagent for a test substance of the present invention is a test reagent for a test substance containing a carrier on which a protein is immobilized, and the protein contains a signal sequence in the base sequence of the gene. It is characterized in that it is a protein in which a protein having a signal sequence is expressed, and as “a carrier on which a specific binding substance for a test substance is immobilized”, “a protein having a signal sequence is immobilized. It is a measurement reagent for measuring a test substance in a sample using a “supported carrier”.

〔7〕被検物質
1.被検物質
本発明の被検物質の測定試薬において、被検物質とは、試料中におけるその存在の有無、又は含有量(濃度)を測定しようとする物質である。
[7] Test substance Test substance In the reagent for measuring a test substance of the present invention, the test substance is a substance whose presence or content (concentration) is to be measured in a sample.

この被検物質としては、被検物質に対する特異的結合物質としてのシグナル配列を有するタンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬を使用して測定を行うことができるものであれば如何なるものでもよい。   Any test substance can be used as long as it can be measured using a test substance measurement reagent containing a carrier on which a protein having a signal sequence as a specific binding substance for the test substance is immobilized. It may be a thing.

この被検物質を例示すると、例えば、タンパク質、糖質、脂質、又は核酸などのような有機物質等を挙げることができる。   Examples of this test substance include organic substances such as proteins, carbohydrates, lipids, or nucleic acids.

この被検物質としては、ウイルス関連の抗原若しくは抗体、又は細菌関連の抗原若しくは抗体等が好適であるが、特にトレポネーマ・パリダムに対する抗体(抗トレポネーマ・パリダム抗体)である場合が好適である。   The test substance is preferably a virus-related antigen or antibody, or a bacteria-related antigen or antibody, and particularly preferably an antibody against Treponema paridum (anti-treponema paridum antibody).

2.試料
本発明において、試料とは、前記の被検物質が存在する可能性があり、かつその被検物質の存在の有無、又は含有量(濃度)の測定を行おうとするものをいう。
2. Sample In the present invention, a sample refers to a substance in which the above-mentioned test substance may exist and the presence / absence of the test substance or the content (concentration) is to be measured.

例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液;ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液;ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液;細胞或いは菌体の抽出液等を挙げることができる。   For example, human or animal blood, serum, plasma, urine, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, or other body fluids; human or animal brain or other organs, hair, skin, nails, muscles, or Examples include extracts of nerve tissues and the like; extracts or suspensions of human or animal stool; extracts of cells or cells.

〔8〕被検物質に対する特異的結合物質
本発明の被検物質の測定試薬において、被検物質に対する特異的結合物質とは、前記の被検物質に特異的な親和性を有し結合することができる物質のことである。
なお、本発明の被検物質の測定試薬においては、「被検物質に対する特異的結合物質」として、「シグナル配列を有するタンパク質」を固定化した担体を用いることは必須であるが、更に同一又は異なる「被検物質に対する特異的結合物質」を組み合わせて使用してもよい。
[8] Specific binding substance for the test substance In the measurement reagent for the test substance of the present invention, the specific binding substance for the test substance has a specific affinity and binds to the test substance. It is a substance that can be used.
In the reagent for measuring a test substance of the present invention, it is indispensable to use a carrier on which a “protein having a signal sequence” is immobilized as a “specific binding substance to the test substance”. Different “specific binding substances for the test substance” may be used in combination.

また、この被検物質に対する特異的結合物質としては、例えば、被検物質が抗原である場合にはこの抗原に対する抗体、被検物質が抗体である場合にはこの抗体に対する抗原若しくはこの抗体に対する抗体、被検物質がタンパク質などよりなる物質である場合にはそのリガンド、被検物質が糖である場合にはこの糖と結合するレクチン、又は被検物質がレセプターである場合にはこのレセプターに対する物質等を挙げることができる。   The specific binding substance for this test substance is, for example, an antibody against this antigen when the test substance is an antigen, and an antigen against this antibody or an antibody against this antibody when the test substance is an antibody. , A ligand when the test substance is a protein or the like, a lectin that binds to this sugar when the test substance is a sugar, or a substance for this receptor when the test substance is a receptor Etc.

すなわち、被検物質に特異的な親和性を有し結合することができる物質であれば、特に制限なく、被検物質に対する特異的結合物質として、本発明において用いることができる。   That is, any substance can be used in the present invention as a specific binding substance for a test substance without particular limitation as long as the substance has a specific affinity for and binds to the test substance.

なお、本発明においては、被検物質が抗原であり、被検物質に対する特異的結合物質が前記抗原に対する抗体である場合が好適である。   In the present invention, it is preferable that the test substance is an antigen and the specific binding substance for the test substance is an antibody against the antigen.

ここで、抗体としては、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、そしてこれらの断片〔F(ab)’又はFab’など〕等でもよい。 Here, the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may be a fragment thereof (such as F (ab) ′ 2 or Fab ′).

また、本発明においては、被検物質が抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質が前記抗体に対する抗原、又は前記抗体に対する抗体である場合が好適である。   In the present invention, it is preferable that the test substance is an antibody and the specific binding substance for the test substance is an antigen for the antibody or an antibody for the antibody.

この被検物質が抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質が前記抗体に対する抗原である場合、この「前記抗体に対する抗原」は、遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものであってもよい。   When the test substance is an antibody and the specific binding substance to the test substance is an antigen against the antibody, the “antigen against the antibody” may be artificially prepared by a genetic recombination method or the like. Good.

そして、この遺伝子組み換え法などにより人為的に調製した「前記抗体に対する抗原」は、他のタンパク質と融合しているものであってもよく、この融合させる他のタンパク質としては、例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースバインディングプロテイン(MBP)、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパク、プロテインA、又はジーン10等を挙げることができる。   The “antigen against the antibody” artificially prepared by this genetic recombination method may be fused with another protein. Examples of the other protein to be fused include glutathione-S. -Transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin, β-galactosidase, lactase, biotinylated protein, protein A, or gene 10 can be mentioned.

これをより具体的に例示すると、例えば、被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体である場合、被検物質に対する特異的結合物質として、シグナル配列を有するトレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原にマルトースバインディングプロテイン(MBP)が融合しているもの、又はシグナル配列を有するトレポネーマ・パリダムの47Kダルトン抗原にグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)が融合しているもの等を挙げることができる。   More specifically, for example, when the test substance is an antibody against Treponema paridum, as a specific binding substance for the test substance, a 17K dalton antigen of Treponema paridum having a signal sequence is combined with maltose binding protein ( MBP) is fused, or Glutathione-S-transferase (GST) is fused to the 47K Dalton antigen of Treponema pallidum having a signal sequence.

なお、本発明においては、被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原である場合が好適である。   In the present invention, it is preferable that the test substance is an antibody against Treponema paridum and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema paridum.

なお、前記のトレポネーマ・パリダムの抗原としては、例えば、15Kダルトン抗原、17Kダルトン抗原、又は47Kダルトン抗原等を挙げることができる。   Examples of the antigen of Treponema pallidum include 15K dalton antigen, 17K dalton antigen, or 47K dalton antigen.

これらのトレポネーマ・パリダムの各抗原は、遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したものであってもよい。   These antigens of Treponema pallidum may be artificially prepared by a genetic recombination method or the like.

そして、この遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したトレポネーマ・パリダムの抗原は、例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースバインディングプロテイン(MBP)、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパク、プロテインA、又はジーン10等の他のタンパク質と融合しているものであってもよい。   The antigens of Treponema paridum artificially prepared by this genetic recombination method include, for example, glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin, β-galactosidase, lactase, biotinylated protein, It may be fused with other protein such as protein A or gene 10.

なお、本発明においては、以上の被検物質に対する特異的結合物質として用いるトレポネーマ・パリダムの抗原のうち、担体に固定化するものの少なくとも1種類はシグナル配列を有するものである必要がある。   In the present invention, it is necessary that at least one of the antigens of Treponema pallidum used as a specific binding substance for the above test substance to be immobilized on a carrier has a signal sequence.

〔9〕測定試薬
1.測定試薬の測定原理(測定方法)
本発明におけるタンパク質を固定化した担体は、試料中の被検物質を測定する測定試薬に使用することができる。
例えば、担体に固定化された「被検物質に対する特異的結合物質」としての「シグナル配列を有するタンパク質」と試料中に含まれていた「被検物質」との特異的な結合反応を利用して、試料中の被検物質の測定を行う方法を測定原理とする測定試薬に使用することができる。
[9] Measuring reagent Measuring principle of measuring reagent (measuring method)
The carrier on which a protein is immobilized in the present invention can be used as a measurement reagent for measuring a test substance in a sample.
For example, a specific binding reaction between a “protein having a signal sequence” as a “specific binding substance to a test substance” immobilized on a carrier and a “test substance” contained in a sample is used. Thus, it can be used as a measurement reagent whose measurement principle is a method of measuring a test substance in a sample.

なお、この「被検物質に対する特異的結合物質」と「被検物質」との特異的な結合反応としては、例えば、抗原と抗体の抗原抗体反応(免疫反応)、タンパク質などよりなる物質とそのリガンドとの反応、糖とレクチンの反応、又はレセプターとそれに対する物質の反応等を挙げることができる。   The specific binding reaction between the “specific binding substance to the test substance” and the “test substance” includes, for example, an antigen-antibody reaction (immune reaction) between an antigen and an antibody, Examples include a reaction with a ligand, a reaction between a sugar and a lectin, or a reaction between a receptor and a substance corresponding thereto.

そして、このような結合反応を利用して、試料中の被検物質の測定を行う方法の例としては、例えば、免疫学的測定方法等を挙げることができる。   And as an example of the method of measuring the test substance in a sample using such a binding reaction, an immunological measuring method etc. can be mentioned, for example.

なお、この免疫学的測定方法としては、例えば、ラテックス比濁法;ラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法;酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫測定法、すなわち標識免疫測定法;ウエスタンブロット法;Dahlbeackらが示したELSA法(enzyme-linked ligandsorbent assay)〔Thromb.Haemost.,79巻,767〜772頁,1998年、及びWO98/23963号公報〕;又は特開平9−229936号公報及び特開平10−132819号公報等に記載された被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用い、該粒子が担体の被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面に集まるか否かにより測定を行う方法等を挙げることができる。   In addition, as this immunological measurement method, for example, latex turbidimetry; indirect aggregation reaction measurement method such as latex agglutination measurement method; enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, or luminescence immunoassay Immunoassay using a labeling substance such as the labeling method, that is, labeled immunoassay; Western blotting; ELSA method (enzyme-linked ligand sorbent assay) shown by Dahlbeack et al. [Thromb. Haemost. 79, 767-772, 1998, and WO 98/23963]; or JP-A-9-229936, JP-A-10-132919, and the like. Using a carrier having an immobilized coated surface and a particle on which a specific binding substance to the test substance is immobilized, the particle is fixed on the surface coated with the specific binding substance to the test substance on the carrier. A method of performing measurement depending on whether or not they gather can be mentioned.

そして、前記の標識免疫測定法であるが、これは、サンドイッチ法、競合法、又は均一系法(ホモジニアス系法)等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。   The labeled immunoassay is the above-described method, and the present invention can be applied to any method such as the sandwich method, the competitive method, or the homogeneous method (homogeneous method).

2.測定試薬
本発明における被検物質の測定試薬は、前記した測定方法を測定原理とすることができるものであって、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質を、シグナル配列を有した状態で発現させたシグナル配列を有するタンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬である。
2. Measurement Reagent A test reagent for a test substance in the present invention can be based on the measurement method described above, and a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having a signal sequence. A reagent for measuring a test substance comprising a carrier on which a protein having an expressed signal sequence is immobilized.

なお、本発明における被検物質の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の被検物質の測定に使用することができる。
また、本発明における被検物質の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の被検物質の測定に使用することもできる。
Note that the reagent for measuring a test substance in the present invention can be sold alone or used for measurement of a test substance in a sample.
In addition, the measurement reagent for a test substance in the present invention can be sold in combination with other reagents or used for measurement of a test substance in a sample.

前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正(キャリブレーション)を行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。   Examples of the other reagent include a buffer solution, a sample diluent, a reagent diluent, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that generates a signal such as color development, or calibration (calibration). The reagent of the substance containing these substances can be mentioned.

そして、前記の他の試薬を第1試薬とし、本発明における被検物質の測定試薬を第2試薬としたり、又は本発明における被検物質の測定試薬を第1試薬とし、前記の他の試薬を第2試薬としたりして、適宜様々な組合せにて販売、及び使用を行うことができる。   The other reagent is the first reagent and the test substance measurement reagent in the present invention is the second reagent, or the test substance measurement reagent in the present invention is the first reagent, Can be sold and used in various combinations as appropriate.

なお、本発明における被検物質の測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。   In addition, various aqueous solvents can be used as the solvent of the measurement reagent for the test substance in the present invention.

この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。   Examples of the aqueous solvent include purified water, physiological saline, or various buffer solutions such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline. .

この緩衝液のpHについては、適宜適当なpHを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、pH3〜12の範囲内のpHを選択して用いることが一般的である。   About the pH of this buffer solution, an appropriate pH may be appropriately selected and used. Although there is no particular limitation, it is general to select and use a pH within the range of pH 3-12.

なお、本発明における被検物質の測定試薬のpHは、アルカリ性領域のpHを用いる方が、測定試薬の安定化効果を高めることができるので好ましい。例えば、pHがpH7.3以上であるとより好ましい。   In addition, it is preferable to use the pH in the alkaline region as the pH of the measurement reagent for the test substance in the present invention because the effect of stabilizing the measurement reagent can be enhanced. For example, the pH is more preferably 7.3 or higher.

また、本発明における被検物質の測定試薬には、前記の被検物質に対する特異的結合物質であるタンパク質を固定化した担体の他に、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質;前記の陽イオン及び陰イオン以外の各種塩類;各種糖類;脱脂粉乳;正常ウサギ血清などの各種動物血清;アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤;活性化物質;反応促進物質;ポリエチレングリコールなどの感度増加物質;非特異的反応抑制物質等の1種又は2種以上を適宜含有させてもよい。   In addition, in the reagent for measuring a test substance in the present invention, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), in addition to a carrier on which a protein that is a specific binding substance for the test substance is immobilized, Proteins such as casein or salts thereof; various salts other than the above cations and anions; various sugars; skim milk powder; various animal sera such as normal rabbit serum; various preservatives such as sodium azide or antibiotics; One or more of a reaction promoting substance, a sensitivity increasing substance such as polyethylene glycol, and a nonspecific reaction inhibiting substance may be appropriately contained.

そして、これらを被検物質の測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001〜10%(w/v)が好ましく、特に0.01〜5%(w/v)が好ましい。   And the density | concentration at the time of making these contain in the measuring reagent of a test substance is although it does not specifically limit, 0.001-10% (w / v) is preferable, Especially 0.01-5% (w / v) v) is preferred.

〔10〕試料中の被検物質の測定
本発明における被検物質の測定試薬を用いて、試料中の被検物質の測定を行うには、その被検物質の測定試薬の測定原理である測定方法の操作法に従って測定操作を行えばよい。
[10] Measurement of a test substance in a sample In order to measure a test substance in a sample using the test substance measurement reagent in the present invention, measurement is based on the measurement principle of the measurement reagent of the test substance. What is necessary is just to perform measurement operation according to the operation method of a method.

この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。   This measurement may be performed by a method or using an apparatus such as an analyzer.

また、この測定は、1ステップ法(1試薬法)により行ってもよいし、又は2ステップ法(2試薬法)等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。   In addition, this measurement may be performed by a one-step method (one-reagent method) or by a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).

以下、本発明を実施例により更に説明する。
なお、本発明は、これらにより限定されるものではない。
The present invention will be further described below with reference to examples.
In addition, this invention is not limited by these.

〔実施例1〕
(シグナル配列を有するトレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原タンパク質を固定化した担体の調製、及びこの担体を含むトレポネーマ・パリダムに対する抗体の測定試薬の調製)
[Example 1]
(Preparation of a carrier on which 17K Dalton antigen protein of Treponema pallidum having a signal sequence is immobilized, and preparation of a reagent for measuring antibody against Treponema pallidum containing this carrier)

1.シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化プレートの調製 1. Preparation of 17K Dalton Antigen Protein Immobilized Plate with Signal Sequence

(1)遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の調製
トレポネーマ・パリダムを継代培養したウサギ睾丸の破砕物より、トレポネーマ・パリダム菌体を抽出し、遺伝子の塩基配列を抽出した。17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列は、既述のように既に知られており、その全塩基配列とアミノ酸配列は配列表の配列番号1及び配列番号2に示すとおりである。なお、配列番号1中の22番目の配列(tgt/Cys)は成熟型17Kダルトン抗原タンパク質のN末端であり、1から21番目の配列(atg/Metからttg/Leu)がシグナル配列である。
この抽出した配列番号1に示したシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列の両端の20塩基程度のオリゴヌクレオチドを各々プライマーとして合成した。ここで抽出された前記のシグナル配列を有する塩基配列を鋳型とし、上記のプライマーを用いて、PCR法によりシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列を増幅した。次に、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)の塩基配列を含むベクター(ファルマシア社製;pGEX4T3)に、上記で得られた塩基配列を挿入した。このベクターを大腸菌に導入し、菌体の培養を行った。その後、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質が十分に発現した大腸菌を超音波処理により破砕し、これを遠心分離しその上清を、グルタチオンセファロース4Bカラムにかけた。洗浄後、グルタチオン溶液を流すことによりGSTを融合したシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を溶出した。これを透析して、グルタチオンを除いた後、トロンビンを添加し、GSTとシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を切断した。再度、グルタチオンセファロース4Bカラムにかけ、素通り画分を回収することにより、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を得た。
(1) Preparation of 17K Dalton antigen protein having a signal sequence in the base sequence of the gene Treponema paridum cells were extracted from the crushed rabbit testicles subcultured with Treponema paridum, and the base sequence of the gene was extracted. . The base sequence of 17K Dalton antigen protein is already known as described above, and the entire base sequence and amino acid sequence thereof are as shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. The 22nd sequence (tgt / Cys) in SEQ ID NO: 1 is the N-terminal of the mature 17K Dalton antigen protein, and the 1st to 21st sequences (atg / Met to ttg / Leu) are signal sequences.
Oligonucleotides of about 20 bases at both ends of the base sequence of the 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence shown in SEQ ID NO: 1 were synthesized as primers. The base sequence having the signal sequence extracted here was used as a template, and the base sequence of the 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence was amplified by PCR using the above primers. Next, the base sequence obtained above was inserted into a vector (Pharmacia; pGEX4T3) containing the base sequence of glutathione-S-transferase (GST). This vector was introduced into Escherichia coli, and the cells were cultured. Thereafter, Escherichia coli in which the 17K dalton antigen protein having the signal sequence was sufficiently expressed was disrupted by sonication, centrifuged, and the supernatant was applied to a glutathione sepharose 4B column. After washing, a 17K dalton antigen protein having a signal sequence fused with GST was eluted by flowing a glutathione solution. This was dialyzed to remove glutathione, and then thrombin was added to cleave the 17 K dalton antigen protein having GST and a signal sequence. It was again applied to a glutathione sepharose 4B column, and the flow-through fraction was collected to obtain a 17 K dalton antigen protein having a signal sequence.

(2)洗浄液の調製
0.02%(w/v)Tween20を含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、洗浄液とした。
(2) Preparation of washing solution Phosphate buffered saline containing 0.02% (w / v) Tween 20 was prepared and used as a washing solution.

(3)ブロッキング液の調製
0.5%(w/v)カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、ブロッキング液とした。
(3) Preparation of blocking solution Phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate was prepared and used as a blocking solution.

(4)シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化プレートの調製
前記(1)のシグナル配列を有する17Kダルトン抗原を、0μg/mL、0.03125μg/mL、0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mLとなるように、リン酸緩衝生理食塩水に加えた。これをELISA用プレートS(住友ベークライト社製)のウェルに各50μLずつ分注し、その後4℃で一晩放置して、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を各ウェルの内壁に固定化させた。
(4) Preparation of 17K Dalton Antigen Protein-Immobilized Plate Having Signal Sequence 17K Dalton antigen having the signal sequence of (1) above was mixed with 0 μg / mL, 0.03125 μg / mL, 0.0625 μg / mL, 0.125 μg / It added to the phosphate buffered saline so that it might become mL, 0.25 microgram / mL, 0.5 microgram / mL, 1 microgram / mL, and 2 microgram / mL. This was dispensed into each well of ELISA plate S (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) in an amount of 50 μL, and then allowed to stand overnight at 4 ° C. to immobilize the 17 K dalton antigen protein having a signal sequence on the inner wall of each well. .

次に、このELISA用プレートSの各ウェル内の液を除き、前記(2)の洗浄液で2回洗浄した。
その後、各ウェルに前記(3)のブロッキング液を200μLずつ分注して、各ウェルのブロッキングを行った。
そして、このプレートの各ウェル内の液を除き、前記洗浄液で2回洗浄を行った。
以上の操作により調製したものを、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化プレートとした。
Next, the liquid in each well of the ELISA plate S was removed, and the plate was washed twice with the washing liquid (2).
Thereafter, 200 μL of the blocking solution (3) was dispensed into each well, and each well was blocked.
Then, the liquid in each well of the plate was removed, and the plate was washed twice with the washing liquid.
What was prepared by the above operation was used as the 17K dalton antigen protein fixed plate which has a signal sequence.

2.POD標識抗体の調製
(1)POD標識抗体希釈液
0.5%(w/v)カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、POD標識抗体希釈液とした。
2. Preparation of POD-labeled antibody (1) POD-labeled antibody diluent Phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate was prepared and used as a POD-labeled antibody diluent.

(2)POD標識抗体の調製
POD標識ウサギ抗ヒトIgG抗体溶液(ダコ社製;P0406)を前記(1)で調製したPOD標識抗体希釈液で1000倍に希釈し調製した。
(2) Preparation of POD-labeled antibody A POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution (manufactured by Dako; P0406) was prepared by diluting 1000 times with the POD-labeled antibody diluent prepared in (1) above.

〔実施例2〕
(ELISA法によるトレポネーマ・パリダムに対する抗体の測定)
本発明の被検物質の測定試薬を用いて、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定した。
[Example 2]
(Measurement of antibody against Treponema pallidum by ELISA method)
Using the test substance measurement reagent of the present invention, an antibody against Treponema paridum, which is the test substance, was measured.

1.測定
0.5%(w/v)カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水で2000倍希釈したTP抗体陽性血清50μLを、前記実施例1の1で調製したシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化プレートの各ウェルに添加し、37℃で4時間反応させた。
その後、このプレートのウェル内の血清液を除き、前記洗浄液で洗浄した。
更に、前記実施例1の2で調製したPOD標識ウサギ抗ヒトIgG抗体溶液を各ウェルに50μLずつ添加し、室温で4時間反応させた。
次いで、各ウェルを前記洗浄液にて洗浄した。
1. Measurement: Fixation of 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence prepared in 1 of Example 1 with 50 μL of TP antibody-positive serum diluted 2000-fold with phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate Was added to each well of the reaction plate and allowed to react at 37 ° C. for 4 hours.
Thereafter, the serum solution in the wells of the plate was removed and the plate was washed with the washing solution.
Further, 50 μL of the POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution prepared in 2 of Example 1 was added to each well and reacted at room temperature for 4 hours.
Next, each well was washed with the washing solution.

この後、発色液(4mMο−フェニレンジアミン基質液を含む103mMリン酸水素二ナトリウム−49mMクエン酸緩衝液の1mLに対して33μLの0.3%過酸化水素を使用直前に添加したもの)100μLを各ウェルに添加し、室温で20分間反応させた後、4N硫酸水溶液50μLを各ウェルに添加し、反応を停止させた。
その後、マイクロプレートリーダー(バイオラッド社製;3550型)を用いて各ウェルの490nmの吸光度を測定した。
Thereafter, 100 μL of a coloring solution (33 μL of 0.3% hydrogen peroxide added immediately before use) to 1 mL of 103 mM disodium hydrogen phosphate-49 mM citrate buffer containing 4 mM ο-phenylenediamine substrate solution was added. After adding to each well and reacting for 20 minutes at room temperature, 50 μL of 4N sulfuric acid aqueous solution was added to each well to stop the reaction.
Thereafter, the absorbance at 490 nm of each well was measured using a microplate reader (Biorad, Model 3550).

2.測定結果
前記1において、試料中の被検物質(トレポネーマ・パリダムに対する抗体)の測定を行って得られた吸光度を、表1及び図1に示した。
2. Measurement Results Table 1 and FIG. 1 show the absorbance obtained by measuring the test substance (antibody against Treponema pallidum) in the sample.

Figure 2013007759
Figure 2013007759

なお、この図において、横軸はプレートのウェルに固定化を行った時の17Kダルトン抗原タンパク質の濃度、縦軸は490nmにおける吸光度の測定値を表す。   In this figure, the horizontal axis represents the concentration of 17 K Dalton antigen protein when immobilized on the well of the plate, and the vertical axis represents the measured value of absorbance at 490 nm.

〔比較例〕
実施例1における、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列の代わりに、シグナル配列を除去した17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列を用いたこと以外は、実施例1と同様にして測定試薬を調製し、このシグナル配列を有していないトレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原タンパク質を固定化したプレートを含む測定試薬を用いて実施例2の記載に従って、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定した。測定結果を表1及び図1に示した。
[Comparative Example]
A measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that the base sequence of the 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence in Example 1 was used instead of the base sequence of the 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence. Then, an antibody against Treponema paridum, which is a test substance, was measured according to the description in Example 2 using a measuring reagent including a plate on which the 17K Dalton antigen protein of Treponema paridum without this signal sequence was immobilized. . The measurement results are shown in Table 1 and FIG.

◎実施例2及び比較例における測定結果についての考察
表1及び図1より、比較例のシグナル配列を有していない17Kダルトン抗原タンパク質固定化プレートを含む測定試薬においては、固定化のためプレートのウェルに接触させた17Kダルトン抗原タンパク質の濃度が増加しても、吸光度の増加が見られない。すなわちプレートに対するシグナル配列を有していない17Kダルトン抗原タンパク質の固定化が困難であり、十分行われていないため、測定反応の際に生成するシグナル(吸光度)の量がわずかしか生じず、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
◎ Consideration of measurement results in Example 2 and Comparative Example From Table 1 and FIG. 1, in the measurement reagent including the 17K Dalton antigen protein-immobilized plate which does not have the signal sequence of Comparative Example, Even when the concentration of 17K Dalton antigen protein contacted with the well is increased, no increase in absorbance is observed. That is, it is difficult to immobilize 17K Dalton antigen protein that does not have a signal sequence for the plate, and since it is not sufficiently performed, the amount of signal (absorbance) generated during the measurement reaction is small, and the measurement It turns out that the sensitivity has fallen.

これに対して、本発明のシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化プレートを含む測定試薬においては、固定化のためプレートのウェルに接触させた17Kダルトン抗原タンパク質の濃度に応じて、得られる吸光度が増加しており、プレートにシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質が容易に、かつ多量に固定化されていることが分かる。   In contrast, in the measurement reagent including the 17K dalton antigen protein-immobilized plate having the signal sequence of the present invention, the absorbance obtained according to the concentration of 17K dalton antigen protein brought into contact with the well of the plate for immobilization. It can be seen that 17K Dalton antigen protein having a signal sequence on the plate is easily and abundantly immobilized.

従って、プレートへの固定化にシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を使用することにより、抗原タンパク質をプレートに十分に固定化することができ、試料中の被検物質を高感度に測定できることが確かめられた。
そして、本発明の測定試薬により、試料中のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を正確に測定できることが確かめられた。
Therefore, it was confirmed that by using 17K Dalton antigen protein having a signal sequence for immobilization on the plate, the antigen protein can be sufficiently immobilized on the plate, and the test substance in the sample can be measured with high sensitivity. It was.
Then, it was confirmed that the antibody against Treponema pallidum in the sample can be accurately measured by the measuring reagent of the present invention.

〔実施例3〕
(シグナル配列を有するトレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子の調製、及びこの粒子を含むトレポネーマ・パリダムに対する抗体の測定試薬の調製)
Example 3
(Preparation of 17K Dalton antigen protein-immobilized particles of Treponema pallidum having a signal sequence, and preparation of an antibody measurement reagent for Treponema pallidum containing the particles)

1.シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子の調製 1. Preparation of 17K Dalton Antigen Protein Immobilized Particles with Signal Sequence

(1)洗浄液の調製
実施例1と同様に調製した。
(1) Preparation of cleaning solution The cleaning solution was prepared in the same manner as in Example 1.

(2)ブロッキング液の調製
実施例1と同様に調製した。
(2) Preparation of blocking solution Prepared in the same manner as in Example 1.

(3)シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子の調製
実施例1で得られたシグナル配列を有する17Kダルトン抗原と、磁性粒子〔ダイナル社製;Dynabeads M-450 uncoated、粒径:4.5μm、粒径のC.V.5%以下、比重1.5、濃度6%(w/v)〕とを抗原タンパク質濃度200μg/mL、粒子濃度6%となるように混合し、室温で1時間反応させた。その後、上清を除去し、前記(2)のブロッキング液を約20倍量加えて37℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。
その後、得られた粒子を前記(1)の洗浄液にて洗浄した。この粒子を粒子濃度が0.2%(w/v)となるように50mMグリシン緩衝液(pH9.5)に分散させ、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子を調製した。
(3) Preparation of 17K Dalton Antigen Protein-Immobilized Particles Having Signal Sequence 17K Dalton Antigen Having Signal Sequence Obtained in Example 1 and Magnetic Particle [Dynal; Dynabeads M-450 uncoated, Particle Size: 4. 5 μm, C.D. V. 5% or less, specific gravity 1.5, concentration 6% (w / v)] were mixed so that the antigen protein concentration was 200 μg / mL and the particle concentration was 6%, and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the supernatant was removed, and the blocking solution (2) was added in an amount of about 20 times and left standing at 37 ° C. overnight for blocking.
Thereafter, the obtained particles were washed with the washing liquid (1). The particles were dispersed in 50 mM glycine buffer (pH 9.5) so that the particle concentration was 0.2% (w / v) to prepare 17 K Dalton antigen protein-immobilized particles having a signal sequence.

2.POD標識抗体の調製 2. Preparation of POD-labeled antibody

(1)POD標識抗体希釈液
実施例1と同様に調製した。
(1) POD-labeled antibody diluent Prepared in the same manner as in Example 1.

(2)POD標識抗体の調製
POD標識ウサギ抗ヒトIgG抗体溶液(ダコ社製;P0406)を前記(1)で調製したPOD標識抗体希釈液で500倍に希釈し調製した。
(2) Preparation of POD-labeled antibody A POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution (manufactured by Dako; P0406) was prepared by diluting 500 times with the POD-labeled antibody diluent prepared in (1) above.

〔実施例4〕
(ELISA法によるトレポネーマ・パリダムに対する抗体の測定)
本発明の被検物質の測定試薬を用いて、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定した。
Example 4
(Measurement of antibody against Treponema pallidum by ELISA method)
Using the test substance measurement reagent of the present invention, an antibody against Treponema paridum, which is the test substance, was measured.

1.測定
0.5%(w/v)カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水で2000倍希釈したTP抗体陽性血清500μLと、実施例3の1で調製したシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子150μLとを混合し、室温で1時間反応させた。その後、遠心分離により粒子のみを取り出し、この粒子を前記の洗浄液で洗浄した。
更に、実施例3の2で調製したPOD標識ウサギ抗ヒトIgG抗体溶液500μLを添加し、室温で1時間反応させた。
次いで、遠心分離により粒子のみを取り出し、粒子を洗浄液にて洗浄した。
1. Measurement: 500 μL of TP antibody-positive serum diluted 2000-fold with phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate and 17K Dalton antigen protein immobilization having the signal sequence prepared in Example 1 The particles were mixed with 150 μL and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, only the particles were taken out by centrifugation, and the particles were washed with the washing solution.
Furthermore, 500 μL of the POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution prepared in 2 of Example 3 was added and reacted at room temperature for 1 hour.
Next, only the particles were removed by centrifugation, and the particles were washed with a washing solution.

この後、発色液(4mMο−フェニレンジアミン基質液を含む103mMリン酸水素二ナトリウム−49mMクエン酸緩衝液の1mLに対して33μLの0.3%過酸化水素を使用直前に添加したもの)100μLを添加し、37℃で20分間反応させた後、4N硫酸水溶液50μLを添加し、反応を停止させた。
その後、マイクロプレートリーダー(バイオラッド社製;3550型)を用いて上清の490nmの吸光度を測定した。
Thereafter, 100 μL of a coloring solution (33 μL of 0.3% hydrogen peroxide added immediately before use) to 1 mL of 103 mM disodium hydrogen phosphate-49 mM citrate buffer containing 4 mM ο-phenylenediamine substrate solution was added. After addition and reaction at 37 ° C. for 20 minutes, 50 μL of 4N sulfuric acid aqueous solution was added to stop the reaction.
Thereafter, the absorbance at 490 nm of the supernatant was measured using a microplate reader (Biorad; Model 3550).

2.測定結果
前記1において、試料中の被検物質(トレポネーマ・パリダムに対する抗体)の測定を行って得られた吸光度を、表2及び図2に示した。
2. Measurement Results Table 1 and FIG. 2 show the absorbance obtained by measuring the test substance (antibody against Treponema pallidum) in the sample.

Figure 2013007759
Figure 2013007759

なお、この図において、縦軸は490nmにおける吸光度の測定値を表す。   In this figure, the vertical axis represents the measured value of absorbance at 490 nm.

〔比較例〕
実施例1における、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列の代わりに、シグナル配列を除去した17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列を用いたこと以外は、実施例3と同様にして測定試薬を調製し、このシグナル配列を有していないトレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原タンパク質を固定化した粒子を含む測定試薬を用いて実施例4の記載に従って、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定した。測定結果を表2及び図2に示した。
[Comparative Example]
A measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 3 except that the base sequence of the 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence in Example 1 was used instead of the base sequence of the 17 K Dalton antigen protein having the signal sequence removed. Then, an antibody against Treponema pallidum, which is a test substance, was measured according to the description of Example 4 using a measuring reagent containing particles to which the 17K Dalton antigen protein of Treponema pallidum that does not have this signal sequence was immobilized. . The measurement results are shown in Table 2 and FIG.

〔対照〕
また、対照として、実施例3の手順に順じ、17Kダルトン抗原タンパク質を固定していない磁性粒子、及びPOD標識抗体等の測定試薬を調製し、この測定試薬を用いて実施例4の記載に従って、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定した。測定結果を表2及び図2に示した。
[Control]
Further, as a control, following the procedure of Example 3, magnetic particles not immobilized with 17 kDalton antigen protein and measurement reagents such as POD-labeled antibodies were prepared, and this measurement reagent was used as described in Example 4. Then, an antibody against Treponema paridum, which is a test substance, was measured. The measurement results are shown in Table 2 and FIG.

◎実施例4及び比較例における測定結果についての考察
表2及び図2より、比較例の測定試薬を使用して得られた吸光度は、本発明の測定試薬を使用して得られた吸光度の37%にとどまっている。すなわち、粒子に対するシグナル配列を有していない17Kダルトン抗原タンパク質の固定化が困難であり、十分でないため、測定反応のシグナル(吸光度)の生成が低いものにとどまり、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
◎ Consideration of Measurement Results in Example 4 and Comparative Example From Table 2 and FIG. 2, the absorbance obtained using the measurement reagent of the comparative example is 37 of the absorbance obtained using the measurement reagent of the present invention. It remains at%. That is, the 17K Dalton antigen protein that does not have a signal sequence for the particles is difficult to immobilize and is not sufficient, so that only a low signal (absorbance) is generated in the measurement reaction, resulting in a decrease in measurement sensitivity. I understand that

これに対して、本発明のシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子を含む測定試薬においては、得られる吸光度は高いものであり、粒子にシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質が容易に、かつ多量に固定化されていることが分かる。   On the other hand, in the measurement reagent containing the 17K dalton antigen protein-immobilized particles having the signal sequence of the present invention, the obtained absorbance is high, and the 17K dalton antigen protein having the signal sequence in the particles can be easily obtained. It can be seen that a large amount is immobilized.

従って、粒子への固定化にシグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を使用することにより、抗原タンパク質を粒子に十分に固定化することができ、試料中の被検物質を高感度に測定できることが確かめられた。
そして、本発明の測定試薬により、試料中のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を正確に測定できることが確かめられた。
Therefore, it is confirmed that the antigen protein can be sufficiently immobilized on the particle by using the 17 K Dalton antigen protein having a signal sequence for immobilization on the particle, and the test substance in the sample can be measured with high sensitivity. It was.
Then, it was confirmed that the antibody against Treponema pallidum in the sample can be accurately measured by the measuring reagent of the present invention.

〔実施例5〕(トレポネーマ・パリダムに対する抗体の測定試薬の保存安定性の確認) [Example 5] (Confirmation of storage stability of reagent for measuring antibody against Treponema pallidum)

前記実施例3と同様に調製した、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質固定化粒子を含む測定試薬を、5℃で長期間保存し、保存時の安定性の確認を行った。   A measurement reagent containing 17K Dalton antigen protein-immobilized particles having a signal sequence prepared in the same manner as in Example 3 was stored at 5 ° C. for a long period of time, and stability during storage was confirmed.

1.測定試薬の保存
前記実施例3の1及び2で調製した測定試薬を、5℃で1年間保存した。
1. Storage of measurement reagent The measurement reagents prepared in 1 and 2 of Example 3 were stored at 5 ° C for 1 year.

2.測定試薬の安定性の確認
調製直後及び保存後の前記測定試薬の各々を用いて試料中の被検物質(トレポネーマ・パリダムに対する抗体)の測定を行い、前記測定試薬の保存時の安定性の確認を行った。
2. Confirmation of the stability of the measurement reagent Measure the test substance (antibodies against Treponema pallidum) in the sample using each of the measurement reagents immediately after preparation and after storage, and confirm the stability of the measurement reagent when stored Went.

3.試薬
下記の測定試薬を用いた。
(1)前記1における5℃での保存1年後の測定試薬。
(2)測定試薬調製直後すなわち保存開始前の測定試薬。
3. Reagents The following measurement reagents were used.
(1) The measurement reagent after 1 year of storage at 5 ° C. in 1 above.
(2) Immediately after the measurement reagent is prepared, that is, before the start of storage

4.試料
トレポネーマ・パリダムに対する抗体を含むヒト血清を試料として用いた。
4). Sample Human serum containing an antibody against Treponema pallidum was used as a sample.

5.試料中の被検物質(トレポネーマ・パリダムに対する抗体)の測定
前記(1)及び(2)の測定試薬を用いて、実施例4の記載に従って、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定した。
5. Measurement of test substance (antibodies against Treponema pallidum) in the sample Using the measurement reagents (1) and (2) above, antibodies against Treponema pallidum, which is the test substance, were measured according to the description in Example 4. .

6.測定結果
前記5において、試料中の被検物質(トレポネーマ・パリダムに対する抗体)の測定を行って得られた吸光度を、表3及び図3に示した。
6). Measurement Results Table 5 and FIG. 3 show the absorbance obtained by measuring the test substance (antibody against Treponema pallidum) in the sample.

Figure 2013007759
Figure 2013007759

7.まとめ
表3及び図3より、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を粒子に固定化した測定試薬においては、5℃での保存1年後に得た吸光度の値は、調製直後(保存開始前)の吸光度の値の100.6%であり、長期間保存した後においても測定試薬は安定であり、正確な測定値を得られることが分かる。
7). Summary From Table 3 and FIG. 3, in the measurement reagent in which the 17K Dalton antigen protein having the signal sequence was immobilized on the particles, the absorbance value obtained after 1 year of storage at 5 ° C. was immediately after preparation (before the start of storage). It is 100.6% of the absorbance value, and it can be seen that the measurement reagent is stable even after long-term storage and an accurate measurement value can be obtained.

従って、シグナル配列を有する17Kダルトン抗原タンパク質を用いることにより、粒子(担体)への固定化を容易に、かつ多量に行えるだけでなく、前記タンパク質を粒子(担体)に長期間安定に固定化しておくことができることが確かめられた。   Therefore, by using a 17 K Dalton antigen protein having a signal sequence, not only can it be easily and in large quantities immobilized on the particle (carrier), but the protein can be stably immobilized on the particle (carrier) for a long period of time. I was able to confirm that

配列番号1:トレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原タンパク質の塩基配列
配列番号2:トレポネーマ・パリダムの17Kダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 1: Base sequence of 17K Dalton antigen protein of Treponema pallidum SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of 17K Dalton antigen protein of Treponema pallidum

Claims (12)

遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させ、このシグナル配列を有するタンパク質を担体に固定化することを特徴とするタンパク質の固定化方法。 A method for immobilizing a protein, comprising expressing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having the signal sequence, and immobilizing the protein having the signal sequence on a carrier. タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質であることを特徴とする請求項1記載のタンパク質の固定化方法。 The protein immobilization method according to claim 1, wherein the protein is a membrane protein or a secreted protein. タンパク質が被検物質に対する特異的結合物質であることを特徴とする請求項1又は2記載のタンパク質の固定化方法。 The protein immobilization method according to claim 1 or 2, wherein the protein is a specific binding substance for a test substance. 被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原である、請求項3記載のタンパク質の固定化方法。 The method for immobilizing a protein according to claim 3, wherein the test substance is an antibody against Treponema pallidum, and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema pallidum. タンパク質を固定化した担体であって、このタンパク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質であることを特徴とする、タンパク質を固定化した担体。 A carrier on which a protein is immobilized, wherein the protein is a protein in which a protein having a signal sequence in a base sequence of a gene is expressed in a state having a signal sequence. . タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質であることを特徴とする請求項5記載のタンパク質を固定化した担体。 The protein-immobilized carrier according to claim 5, wherein the protein is a membrane protein or a secreted protein. タンパク質が被検物質に対する特異的結合物質であることを特徴とする請求項5又は6記載のタンパク質を固定化した担体。 The protein-immobilized carrier according to claim 5 or 6, wherein the protein is a specific binding substance for a test substance. 被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原である、請求項7記載のタンパク質を固定化した担体。 The carrier on which the protein according to claim 7 is immobilized, wherein the test substance is an antibody against Treponema paridum, and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema paridum. タンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬であって、このタンパク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク質であることを特徴とする、被検物質の測定試薬。 A reagent for measuring a test substance containing a carrier on which a protein is immobilized, wherein the protein is a protein in which a protein having a signal sequence in a base sequence of a gene is expressed in a state having the signal sequence. A reagent for measuring a test substance. タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質であることを特徴とする請求項9記載の被検物質の測定試薬。 The reagent for measuring a test substance according to claim 9, wherein the protein is a membrane protein or a secreted protein. タンパク質が被検物質に対する特異的結合物質であることを特徴とする請求項9又は10記載の被検物質の測定試薬。 The reagent for measuring a test substance according to claim 9 or 10, wherein the protein is a specific binding substance for the test substance. 被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原である、請求項11記載の被検物質の測定試薬 The test substance for a test substance according to claim 11, wherein the test substance is an antibody against Treponema pallidum, and the specific binding substance for the test substance is an antigen of Treponema pallidum.
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