JP2012514983A - 非胚性幹細胞およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年1月13日に出願された、米国特許出願第61/144,206号の優先権を主張する。該出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
胚幹(ES)細胞のような全能性幹細胞は、生体内ですべての細胞系統に分化することができ、インビトロで誘導されると、ほとんどの細胞型に分化することができる。ES細胞は、早期哺乳類胚由来である。その分化全能性により、変性または遺伝疾患の治療に非常に有望であると考えられている。しかしながら、道徳的配慮およびロジスティックな検討から、研究および治療においてヒトES細胞の使用が阻まれている。(例えば、成熟した、または若い動物の組織からの)非胚性起源の全能性または多能性幹細胞はこの障害を解決するであろう。そのような非胚性起源の幹細胞が得られてきてはいるが、これらの細胞の中には、発生能が限定されているものもある。また、ロジスティックに、これらの細胞は、得るのが難しく、意義ある臨床または研究用途を満たすには、細胞の量があまりにわずかである。さらに、細胞によっては、生体内で奇形腫に至ることもあり、したがって、インビボでの使用は望めない。より安全で、簡単に作製でき、豊富な量得ることができる、非胚全能性または多能性幹細胞に対する要求がある。
本発明は、非胚起源から作製された幹細胞の集団が全能性または多能性であり、非常に高収率で得ることができ、生体内で奇形腫に至らないという、少なくとも部分的には予期せぬ発見に基づく。
ES細胞は(神経または脳のグリア細胞のような)多様な細胞型を再生するために用いることができ、したがって多様な変性疾患または組織損傷を治療することができることが提案されてきた。しかしながら、道徳的配慮およびロジスティックな検討から、ES細胞の使用が阻まれている。非胚性由来の幹細胞、すなわち、生後(post−natal)幹細胞(例えば、骨髄由来間充織幹細胞(MSCs))は有望な代替物である。しかしながら、この代替は、ロジスティックな検討および限定された増殖/分化能によって常に許容されるわけではない。
本発明のSBR細胞およびSBT細胞は、さまざまな方法で用いることができる。変性または遺伝子疾患を治療するために、ヒト胚操作の倫理的考慮を避けるために、細胞を用いることができる。
上述の幹細胞は、細胞型に関連した疾患の治療に薬物が有用であることを示す形で、特定の細胞型に影響を与えることができる薬物を同定するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。
対象における変性疾患の治療、疾患の兆候の軽減、または疾患の始まりを遅らせる方法は本発明の範囲内である。治療されるべき対象は、状態または興味がある疾患を診断するための標準的技術によって同定することができる。治療方法は、必要とする対象に上述のSBR細胞またはSBT細胞の有効量を投与することを必要とする。
対象における脳またはCNS組織損傷の治療または疾患の兆候の軽減の方法は本発明の範囲内である。該方法は、脳組織損傷を受けている、または脳組織損傷に発展する危険性のある対象を同定することを含む。対象はヒトであってもよいし、ネコ、イヌ、またはウマのようなヒト以外の哺乳類であってもよい。脳組織損傷の例としては、脳虚血(例えば、慢性脳卒中)または神経変性疾患(例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄小脳疾患、またはハンチントン病)によって引き起こされる損傷が挙げられる。治療されるべき対象は、興味のある状態または疾患に対する標準的診断技術によって同定することができる。治療方法は、上述したSBR細胞またはSBT細胞あるいは活性薬剤/化合物の有効量を必要とする対象に対して投与することを必要とする。
上述のSBR細胞またはSBT細胞はまたガンおよび他の細胞増殖性疾患を治療するためにも用いることができる。細胞増殖性疾患とは、(悪性および良性腫瘍などの)制御できない、自律的な細胞増殖によって特徴付けられる疾患を指す。「ガン」という用語は、制御できない細胞増殖、浸潤、および時には転移によって特徴付けられる疾患の分類を指す。ガン細胞は、自律的増殖(すなわち、細胞成長を急速に増殖させることによって特徴付けられる異常状態)をすることができる。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の状態にかかわらず、癌性増殖または腫瘍形成プロセス、転移性組織または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官のあらゆるタイプを含むことを意味する。ガンの例としては、限定されるものではないが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、神経膠腫、褐色細胞腫、肝癌、卵巣癌、皮膚癌、精巣癌、胃癌、膵癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、脳腫瘍、食道癌、膀胱癌、副腎皮質癌、肺癌、気管支癌、子宮内膜癌、上咽頭癌、子宮頸癌または肝癌、および未知の原発部位の癌が挙げられる。
上述した細胞および方法は、本分野で既知の種々の遺伝子治療法において用いることができる。遺伝子治療としては、生体外および生体内技術の双方を含む。特に上述した幹細胞は、オリゴヌクレオチド調節物質または調節物質をコードする核酸分子を用いて、通常は生体外で設計することができ、設計された細胞は、次いで治療される患者に提供される。細胞培養物は、例えば、細胞を分離し(例えば、機械的分離)、薬学的に許容されるキャリア(例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液)と細胞とを密に混合することによって、患者に対して投与できるように製剤化される。あるいは、細胞は適切な細胞適合性支持体上で培養され、患者に移植されてもよい。設計された細胞は、異種のまたはアロタイプの拒絶を回避するように通常自己移植である。そのような生体外の方法は本分野で既知である。
本発明は、異なる幹細胞ラインを簡便で系統的に利用する手段を目的として幹細胞バンクまたはライブラリーを特徴とする。バンクまたはライブラリーにおける幹細胞は、健康な対象またはユーザー例えば研究者に有益な既知の病態または病的兆候を有する対象からの上述のBLSC、SBR細胞、またはSBT細胞由来である。上述の幹細胞から分化した細胞を有する細胞バンクまたはライブラリーも本発明の範囲内である。幹細胞から分化した細胞の例としては、脳細胞、神経、星状膠細胞、グリア細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、膵島細胞、脂肪細胞、心細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、筋細胞、および眼細胞が挙げられる。対象はヒトまたはヒト以外の脊椎動物である。幹細胞は、ヒト、マウス、ウサギ、ウシ、ブタなどのどんな哺乳類器官由来であってもよい。
移植を目的とした組織適合ドナー細胞または組織を作製するために遺伝的に上述の幹細胞を操作することができる。移植および細胞治療のゴールは、機能不全の組織または器官を機能的なドナー組織または器官にうまく置換することである。しかしながら、移植を成功させるためには、二つの主な障壁を克服する必要がある:適切なドナー組織または器官を入手すること、および免疫拒絶である。利用できるドナーの数が限定されること、および長期間の免疫抑制プロトコールとともに毒性の高い免疫抑制剤を一緒に投与する必要があることによって、機能不全の組織または器官の置換および拒絶の治療は制限される。現在のおよび実験的な移植プロトコールは、主に兄弟のドナー、同種異系ドナーの他の小さなプールおよび異種ドナーに主に依存している。上述の遺伝的に設計された幹細胞は、これらの限界を克服するために用いることができる。
本発明は、上述の細胞または活性薬剤/化合物を含む薬剤組成物を提供する。治療的に有効な量の細胞または活性薬剤/化合物および任意の他の活性物質を製薬上許容しうるキャリアと混合することによって薬剤組成物を準備することができる。キャリアは投与経路によって、異なる形態であってもよい。他の活性物質の例としては、既知の、または上述のスクリーニング方法によって同定される活性化合物が挙げられる。
BLSCsの活性化、精製および増殖方法は、国際公開第2007/100845号に記載されている。本実施例において、BLSCsは、2つの方法を用いてヒト対象の血液から精製された。分離された細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。結果を図1A〜1Cおよび図2A〜2Cに示す。2つの方法により、各々200×106および230×106BLSC/血液mlが産生したことがわかる。
SBR細胞、SBT細胞、およびBLSCsの遺伝子発現について調べた。全RNAは、Qiagen RNA抽出キット(Qiagen、CA)、Paris kit(Ambion)、またはRNAzol kit(InvitroGen)を使って、培養したSBR細胞またはSBT細胞(各々6百万以上)から分離した。cDNAは0.25ng オリゴ−(dT)12−18および逆転写酵素(Qiagen)を使って、メーカー(Qiagen)のプロトコールにしたがって、2.0μgのRNAから作製した。しかしながら、1億以上のBLSCsから検出できるRNAは何ら得られなかった。
本明細書で開示されているすべての特徴は、どのような組み合わせにおいても組み合せることができる。明細書で開示されている各特徴は、同じ、等価の、または同様の目的を果たす他の特徴によって置換することができる。したがって、他で明示的に述べられていない限り、開示されている各特徴は等価のまたは他の特徴を有する包括的一群の一例に過ぎない。
Claims (36)
- 複数の割球様幹細胞(BLSCs)を得る、
レチノイン酸(RA)または形質転換成長因子β(TGF−β)を含む培地中で前記BLSCsを培養する、および
培養細胞から多能性または全能性細胞を同定し、濃縮することを含み、
この際前記多能性または全能性細胞はGADPHまたはβ−アクチンのmRNAを発現させる、多能性または全能性細胞集団の作製方法。 - 前記多能性または全能性細胞は、サイズが1〜15μmである、請求項1に記載の方法。
- 前記培地は0.1〜20μMのRAを含み、前記BLSCsは2〜8週間培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記培地は1〜15μMのRAを含み、前記BLSCsは2〜8週間培養される、請求項3に記載の方法。
- 前記培地は5〜12μMのRAを含み、前記BLSCsは3〜4週間培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記多能性または全能性細胞は、サイズが1〜15μmであり、懸濁中でシート様構造を形成する、請求項5に記載の方法。
- 前記培地が1〜40nMのTGF−βを含み、前記BLSCsは2〜8週間培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記培地が2〜20nMのTGF−βを含み、前記BLSCsは2〜8週間培養される、請求項7に記載の方法。
- 前記培地が5〜12nMのTGF−βを含み、前記BLSCsは4〜6週間培養される、請求項8に記載の方法。
- 前記多能性または全能性細胞は、サイズが1〜15μmであり、円形であり、集合体を形成する、請求項9に記載の方法。
- (1)多能性または全能性であり、(2)サイズが1〜15μmであり、(3)GADPHまたはβ−アクチンのmRNAを発現させる培養細胞を複数含む組成物。
- 前記組成物がレチノイン酸(RA)または形質転換成長因子β(TGF−β)をさらに含む、請求項11に記載の組成物。
- 第一の細胞集団がCD66e+である、請求項11に記載の組成物。
- 前記細胞が組み換え核酸を含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記組み換え核酸はポリペプチドをコードし、前記細胞はポリペプチドをコードするmRNAを含む、請求項14に記載の組成物。
- 前記細胞が請求項1に記載の方法によって作製される、請求項11に記載の組成物。
- 第二の細胞集団がCD66e−である、請求項16に記載の組成物。
- 前記細胞がβ2−ミクログロブリン遺伝子を発現しない、請求項11に記載の組成物。
- 前記細胞が、細胞に対する抗原抗体反応を介するTリンパ球を誘発するクラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)遺伝子によってコードされる一以上のタンパク質を発現しない、請求項11に記載の組成物。
- 前記細胞が、CDl0+、CD90+、CD105+、およびCXCR4+である、請求項11に記載の組成物。
- 前記細胞が、トリパンブルー染色陰性である、請求項11に記載の組成物。
- 必要とする対象に請求項11に記載の組成物を有効量投与することを含む、対象に対する変性疾患の治療方法。
- 前記組成物における各細胞は、組み換え核酸を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記組み換え核酸がポリペプチドをコードし、前記細胞がポリペプチドをコードするmRNAを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記変性疾患が、糖尿病、神経変性疾患、関節炎、またはガンである、請求項24に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項25に記載の方法。
- 必要とする対象に請求項11に記載の組成物を有効量投与することを含む、対象に対する自己免疫疾患の治療方法。
- 請求項11に記載の組成物と試験化合物とを接触させる、および
変性疾患において下方制御されるポリペプチドの発現レベルを定量する、ことを含み、
この際、試験化合物の存在下での発現レベルが、前記化合物非存在下のレベルよりも高い場合には、前記化合物が前記疾患の治療を目的とする候補であることを示す、変性疾患を治療するための薬物候補を同定するための方法。 - 前記変性疾患が、糖尿病、神経変性疾患、関節炎、ガン、または自己免疫疾患である、請求項28に記載の方法。
- 請求項11に記載の組成物を得る、この際、前記組成物における細胞が非相同核酸を含み、および必要とする対象に細胞を投与することを含む、非相同核酸を対象に導入する方法。
- 前記非相同核酸がポリペプチドをコードする、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が対象においてポリペプチドを発現させる、請求項31に記載の方法。
- 請求項11に記載の組成物を複数含む、セルバンク。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項33に記載のセルバンク。
- 複数の割球様幹細胞集団を得るために、複数の対象からの細胞をそれぞれ培養する、
少なくとも一の所定の特性を各々に対して得るために前記細胞集団の特性を明らかにする、および
少なくとも一の所定の特性によって前記細胞集団の各々を分類する、請求項33に記載の細胞バンクの製造方法。 - さらに前記細胞集団を拡大することを含む、請求項35に記載の方法。
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