JP2012504395A - テトラサイクリン誘導可能な転写制御配列 - Google Patents
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Abstract
Description
従って、本発明が対象とする技術的問題は、高い基礎活性及び不適当又は信頼できない誘導の欠点を回避することを可能にする誘導可能な遺伝子の調節を改良する手段及び方法の提供といえる。この技術的問題は、請求の範囲及び下記において特徴付けられる具体例によって解決される。
−該転写制御配列は、それに機能的に結合された核酸の発現の、少なくとも100倍の、少なくとも200倍の、少なくとも300倍の、少なくとも400倍の、少なくとも500倍の又は少なくとも1000倍の誘導を可能にし、そして
−この転写制御配列は、市販のPtet−14プロモーター(米国、Clontech Laboratories Inc.)の基礎的活性より有意に少ない基礎的遺伝子発現即ち非誘導状態での遺伝子発現を可能にする。前述の誘導及び/又は基礎的活性は、好ましくは、下記の実施例に記載されたようにして測定される。
図面は、下記を示している:
a)テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフ(該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、DNAらせんの向かい合った面に結合する);及び
b)その5’末端で更なる一般的転写因子結合部位に機能的に結合したTATAボックスを含む最小プロモーター。
a)テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフ(該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、DNAらせんの向かい合った面に結合する);
b)一般的転写因子結合部位、好ましくは、TFIIB(これは、その3’末端でTATAボックスに機能的に結合される)を含む最小プロモーター;
c)5’末端でTATAボックスに結合された、好ましくはhCMVプロモーターに由来する、イニシエーター配列エレメントである非翻訳(5’UTR)領域;及び
d)5’末端でイニシエーター配列に機能的に結合され、好ましくは、無関係の転写レギュレーターと相互作用するシス調節用エレメントを含まない非翻訳リーダー領域(5’UTR)。
本発明の転写制御配列は、厳格な調節が可能であるので、特に、組換えポリペプチド生成、アンチセンスアプローチ、RNAiアプローチ又はリボザイムアプローチに有用であることが見出されている。その上、有意に減少した基礎的活性のために、本発明の転写制御配列は、更に、遺伝子治療における利用に適している。
a)テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフ(該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、DNAらせんの向かい合った面に結合する);
b)最小プロモーター;及び
c)TYMVの5’UTR。
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス性又はレトロウイルスベクター、並びに人工染色体例えば細菌又は酵母の人工染色体を包含する。その上、この用語は又、ターゲティング用コンストラクトのゲノムDNAへのランダムな又は位置指定した組込みを可能にするターゲティング用コンストラクトにも関係する。かかるターゲティング用コンストラクトは、好ましくは、以下に詳述するように、相同組換え又は異種組込みに十分な長さのDNAを含む。本発明の転写制御配列を包含するベクターは、好ましくは、更に、宿主における増殖及び/又は選択のための選択マーカーを包含する。このベクターは、当分野で周知の様々な技術によって、宿主細胞に取り込まれうる。例えば、プラスミドベクターは、沈澱物、例えば沈澱リン酸カルシウム若しくは沈澱塩化ルビジウムに、又は帯電脂質との複合体に又は炭素ベースのクラスター例えばフラーレンに導入することができる。別法として、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によって導入することができる。ベクターがウイルスであるならば、それを、宿主細胞への投与前に、イン・ビトロで適当なパッケージング細胞系統を用いてパッケージ化することができる。レトロウイルスベクターは、複製能を有するものであっても欠損したものであってもよい。後者の場合には、ウイルスの増殖は、一般に、補足性宿主細胞においてのみ起こる。
ここで用いる場合、「宿主細胞」は、異種DNAの導入により改変することのできる任意の培養可能な細胞を包含する。好ましくは、宿主細胞は、転写調節用タンパク質が安定に発現され、翻訳後修飾され、適当な細胞内区画に局在化され、適当な転写装置に参加させられうるものである。適当な宿主細胞の選択は又、検出シグナルの選択によっても影響される。例えば、上記のようなレポーターコンストラクトは、転写調節用タンパク質に応じて、遺伝子転写の活性化又は抑制に際して、選択可能な又はスクリーニング可能な特徴を与えることができ;最適な選択又はスクリーニングを達成するために、宿主細胞の表現型が考慮される。本発明の宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞を包含する。原核生物は、グラム陰性又は陽性微生物例えば大腸菌又はバチルス細菌を包含する。原核細胞は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを含む転写制御配列又はベクターの増殖のために用いられるということは理解されるべきである。トランスフォーメーションのための適当な原核宿主細胞は、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、及びシュードモナス属、ストレプトミセス属及びブドウ球菌属を包含する。真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス)、哺乳動物細胞、及び寄生性生物例えばトリパノゾーマを包含するが、これらに限られない。ここで用いる場合、酵母は、厳密な分類学的意味での酵母即ち単細胞生物だけでなく、糸状菌の酵母様多細胞性真菌をも包含する。典型的種は、クルイベライ・ラクティス、シゾサッカロミセス・ポンベ、及びトウモロコシ黒穂菌(Ustilago maydis)を包含するが、サッカロミセス・セビシエが好ましい。本発明の実施において使用することのできる他の酵母は、アカパンカビ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランス、ピキア・ パストリス、カンジダ・トロピカリス、及びハンセヌラ・ポリモルファである。哺乳動物宿主細胞培養系は、樹立された細胞系統例えばCOS細胞、L細胞、3T3細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、胚性幹細胞を包含するが、BHK、HeK又はHeLa細胞が好ましい。真核細胞は、好ましくは、本発明の転写制御配列又は発現ベクターを適用することにより、組換え遺伝子発現に用いられる。
本発明の転写制御配列を含む、好ましくは発現すべき核酸(即ち、トランス遺伝子)に機能的に結合されたポリヌクレオチド又はベクターを、非ヒト動物の受精卵母細胞にトランスファーして、非ヒトトランスジェニック動物を創出することができる。前記の非ヒトトランスジェニック動物は、該核酸を、一種以上の細胞型又は組織で発現することができる(但し、これらの細胞又は組織は、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターを同時発現し、テトラサイクリン又はその類似体と接触される)。ここで意味するトランスジェニック非ヒト動物は、トランス遺伝子を含む細胞を有し、該トランス遺伝子は、非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に出生前に例えば胎児期に導入された。トランス遺伝子は、トランスジェニック非ヒト動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるDNAであり、それは、成熟非ヒト動物のゲノム中にとどまり、それにより、コードされる遺伝子産物の、トランスジェニック非ヒト動物の一種以上の細胞型又は組織での発現を指示する。好適な非ヒトトランスジェニック動物は、哺乳動物、特に、ゲッ歯類、マウス及びラット、大規模なタンパク質生産に有用なヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマを含む家畜(いわゆる「遺伝子農業(gene farming)」)及び昆虫である。昆虫は、いわゆる無菌昆虫制御アプローチに利用することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、トランス遺伝子を、受精卵母細胞の雄性前核に、例えばマイクロインジェクションにより導入して、その卵母細胞を偽妊娠雌養育動物にて発生させることにより創出することができる。トランスジェニック動物特にマウスなどの動物の生成のための方法は、当分野では、慣用的なものとなっており、例えば、米国特許第4,736,866号及び4,870,009号及びHogan 1986, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている。トランスジェニック創出動物を用いて、そのトランス遺伝子を有する更なる動物を繁殖させることができる。本発明によるトランス遺伝子を有するトランスジェニック動物を、更に、別のトランス遺伝子を有する別のトランスジェニック動物と例えばテトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック動物と交配させることができる(以下で、一層詳細に検討する)。この発明は又、上記の、本発明のベクター又は転写制御配列を、好ましくはトランス遺伝子の形態で、含む相同組換え非ヒト動物をも提供する。かかる非ヒト相同組換え動物において、該核酸は、ゲノムの特異的部位に導入されている(即ち、該核酸分子は、ゲノムの内因性遺伝子又は他の部分と相同組換えされている)。該場合には、動物は、好ましくはマウスである。かかる相同組換え動物を創出するために、好ましくは、導入すべき核酸をコードするDNAを、その5’及び3’末端で、相同組換えが起きる遺伝子又はゲノムの部分の更なる核酸と隣接して含むベクターを調製する。この隣接する更なる核酸は、融合タンパク質をコードしており、真核遺伝子との上首尾の相同組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロベースのフランキングDNA(5’及び3’末端の両方で)が、このベクターに含まれる(例えば、相同組換え用ベクターの説明は、Thomas, 1987, Cell 51:503 を参照されたい)。このベクターは、胚性幹細胞系統に導入され(例えば、エレクトロポレーションによって)、導入されたDNAが内因性DNAと相同組換えされた細胞を選択する(例えば、Li 1992, Cell 69:915を参照されたい)。これらの選択した細胞を、次いで、動物(例えば、マウス)の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成させる(例えば、Bradley, A., Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson編(IRL, Oxford, 1987)pp. 113-152を参照されたい)。キメラ胚を、次いで、適当な偽妊娠雌養育動物に移植して、該胚を出産予定日までもたらすことができる。この相同組換えされたDNAを生殖細胞中に有する子孫を用いて、全細胞が該相同組換えされたDNAを含む動物を繁殖させることができる。これらの「生殖細胞系列伝達」動物を、更に、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードする遺伝子を有する動物と交配させることができる。上記の相同組換えアプローチに加えて、酵素補助された位置指定組込み系が、当分野で公知であり、この発明の調節系の成分に適用して、DNA分子を、第二の標的DNA分子中の予め決めた位置に統合することができる。かかる酵素補助された統合システムの例は、Creレコンビナーゼ−lox標的システム(例えば、Baubonis 1993, Nucl. Acids Res. 21:2025-2029;及びFukushige 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909に記載されたもの)及びFLPレコンビナーゼ−FRT標的システム(例えば、Dang 1992, Dev. Genet. 13:367-375;及びFiering 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473に記載されたもの)を包含する。
用語「植物」は、ここで用いる場合、植物及び藻類を包含する。好ましくは、この用語は、多細胞の陸生植物を指す。一層好ましくは、これらの多細胞の陸生植物は、高等植物例えば、トウモロコシ、菜種、大豆、米、マンジュギク、アブラナ属各種蔬菜、トリシウム(tricium)又はグリシンを含む作物。原則として、トランスジェニック植物は、Becker 1992, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197, Bevan 1984, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721,及び「Vector for Gene Transfer in Higher Plants」: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization,編:Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15-38に記載されたようにして得ることができる。好ましくは、植物細胞のトランスフォーメーション、即ちトランスジェニック植物の生成は、アグロバクテリウム媒介のトランスフォーメーションにより又は物理的力を適用すること(例えば、「遺伝子銃」)により達成される。
a)前記の宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物における、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドの発現;及び
b)該宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物におけるテトラサイクリン又はその類似体の濃度の調節。
SEQ ID No:説明
1:tetオペレーター
2:hCMV最小プロモーター
3:TFIIB結合部位
4:TFIID結合部位、TATAボックス
5:Ptet−T2からの最小プロモーター
6:RFX−1結合部位
7:AP4結合部位
8:HP−1結合部位
9:HP−2結合部位
10:Ptet−T4からの改変された最小プロモーター
11:TYMV5’UTR
12:Ptet−T6からの改変されたTYMV5’UTR
13:Ptet−T3
14:Ptet−T4
15:Ptet−T5
16:Ptet−T6
17:Ptet−T7
18:MMTV最小プロモーター
19:Ptet−T8
20:Oct−11 Oct12(OTF−1)結合部位
21:NF1結合部位
22:FOXA1結合部位
23:Ptet−T9
24:Ptet−T10
25:Ptet−T11
I)tet−オペレーター7量体の合成及び最小プロモーターへの結合
オリゴヌクレオチドを合成して、対(TOH−1〜TOH−6、下記の表1参照)をアニーリングにより形成させた。dsオリゴTOH−1〜TOH−6をPAGEで精製して連結した。最小プロモーター(T3)の一つを含む完全なオペレーター7量体の初期合成を以下に示す。
プロモーターT1〜T11は、Xho及びNcoIにより、直接、pUHC131−1プラスミド(Bonin 1994、Gene 141:75-77)に導入された。Ptet−1の参照プラスミドを、XhoI及びSacIにより、Ptet−1を、T2プロモーターを含むpUHC131−1プラスミドに導入することによって生成した。Ptet−1の参照プラスミドは、pTRE−Tightプラスミド(Clontech Laboratories, Inc., 米国)からのPtet−14を、XhoI及びSacIにより、T4プロモーターを含むpUHC131−1プラスミド中に導入することにより生成された。すべてのコンストラクトのヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
これらの新規なプロモーターシリーズの性能を、現在使用可能なテトラサイクリン依存性プロモーターと、HeLaM2細胞への一時的トランスフェクション後に、ドキシサイクリン(Dox)を伴って(+)又は伴わないで(−)比較した。
Hela−M2細胞を、標準的条件下で、下記の表3に列挙した発現用コンストラクトによりリポフェクションにより、トランスフェクトした。発現の定量をP/Rlucアッセイにより行なった。この表には、ホタルルシフェラーゼに結合された示したプロモーターコンストラクトの活性が、標準化のためのTK−Rluc(レニラ)内部対照と共に示されている。与えられたRlu値は、+dox条件(誘導時)に対するものである。如何なる場合にも、−dox値は、アッセイ系のバックグラウンド読みと同じであったので、定量されなかった。最小調節因子は、有効バックグラウンドが機器のブランク読みの10%より低いと仮定して評価された。
MMTVベースのPtetプロモーターをHEK293細胞にて試験して、pTRE−Tightプラスミド(Clontech Laboratories, Inc., 米国)由来のPtet−14及び上記のPtet−T6と比較した。HEK293細胞は、バックグラウンド効果に関して重要であると記されてきているので選択した。培養、トランスフェクション及び活性測定は、実施例2又は3においてHeLa細胞について記載したように行なった。HEK293細胞は、rtTA発現プラスミド(Tet−O−Advanced,Clontech, 米国)で、一時的に、同時トランスフェクトされた。結果は、下記の表4に示してある。すべてのMMTVベースのPtetプロモーターが、市販のPtet−14プロモーター(tight)より有意に低い基礎的活性を示すということは明らかである。その上、これらのプロモーターは、T6プロモーターより低い基礎的活性さえ示す。
Claims (24)
- 下記を含む転写制御配列:
a)テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフであって、該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、DNAヘリックスの向かい合った面に結合する当該少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフ;及び
b)その5’末端で更なる一般的転写因子結合部位に機能的に結合するTATAボックスを含む最小プロモーター。 - 前記の一般的転写転写因子結合部位がTFIIB転写因子結合部位である、請求項1に記載の転写制御配列。
- 少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフが、17の連続(contiguous)ヌクレオチドよりなるスペーサーにより分離されている、請求項1又は2に記載の転写制御配列。
- 前記のスペーサーが、シス調節エレメントを含まない、請求項3に記載の転写制御配列。
- 前記の最小プロモーターが、hCMV最小プロモーターに由来する、請求項1〜4の何れか一つに記載の転写制御配列。
- 前記の最小プロモーターが、SEQ ID No:5又は10に示した核酸配列を含む、請求項5に記載の転写制御配列。
- 最小プロモーターが、DSEエレメントを含まず、5’UTR配列が欠失している、請求項6に記載の転写制御配列。
- 前記の最小プロモーターが、その3’末端で、カブ黄斑モザイク・ウイルス(TYMV)の5’UTRに結合している、請求項1〜7の何れか一つに記載の転写制御配列。
- 下記を含む転写制御配列:
a)テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフであって、該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、DNAヘリックスの向かい合った面に結合する当該少なくとも2つのtetオペレーター配列モチーフ;
b)最小プロモーター;及び
c)TYMVの5’UTR。 - 前記のTYMVの5’UTRが、RFX−1結合部位、AP4結合部位、HP1結合部位及び/又はHP2結合部位を含まない、請求項8又は9に記載の転写制御配列。
- 前記のTYMVの5’UTRが、SEQ ID No:11に示した核酸配列を有する、請求項8〜10の何れか一つに記載の転写制御配列
- SEQ ID No:13〜17の何れか一つに示された核酸配列を含む、好ましくは請求項1〜11の何れか一つに記載された、転写制御配列。
- 請求項1〜12の何れか一つの転写制御配列を含むベクター。
- 前記のベクターが、発現ベクターである、請求項13に記載のベクター。
- 前記の転写制御配列が、発現すべき核酸配列に機能的に結合された、請求項14に記載のベクター。
- 請求項1〜11の何れか一つに記載の転写制御配列又は請求項12〜14の何れか一つに記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜12の何れか一つに記載の転写制御配列又は請求項13〜15の何れか一つに記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項1〜12の何れか一つに記載の転写制御配列又は請求項13〜15の何れか一つに記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
- 請求項1〜12の何れか一つの転写制御配列に機能的に結合された核酸配列の発現を、宿主細胞において調節する方法であって、下記を含む当該方法:
a)該宿主細胞中で、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを発現させること;及び
b)該宿主細胞中のテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調節すること。 - 請求項1〜12の何れか一つに記載の転写制御配列に機能的に結合された核酸配列の発現を、植物において調節する方法であって、下記を含む当該方法:
a)該植物において、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを発現させること;及び
b)該宿主細胞中のテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調節すること。 - 前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、tetオペレーターに、テトラサイクリン又はその類似体の非存在下で結合する、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、核酸配列の発現を活性化し又は阻害する、請求項21に記載の方法。
- 前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、tetオペレーターに、テトラサイクリン又はその類似体の存在下で結合する、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、核酸配列の発現を活性化し又は阻害する、請求項23に記載の方法。
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