JP2012503771A - 抗体および抗体−ｈｉｖビリオン複合体を検出する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は概してＨＩＶに、特に抗−ＨＩＶ抗体および抗体−ＨＩＶビリオン複合体を検出する方法に関する。
【選択図】なし

Description

この出願は、２００８年９月２５日に出願された米国仮出願第６１／１００，２１９号からの優先権を主張し、その全内容を本明細書に援用する。
この発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた助成金番号ＵＯ１ ＡＩ０６７８５４の下での政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

本発明は概してＨＩＶに、および特に抗ＨＩＶ抗体および抗体−ＨＩＶビリオン複合体を検出する方法に関する。

予防的ＨＩＶ−１ワクチンの開発は世界的な優先事項である（１２）。予防的ＨＩＶ−１ワクチンの開発における主な障害は、ワクチンまたは自然感染によって防御抗体を誘導することができないことである。非ヒト霊長類における研究は、広く中和する抗−ＨＩＶ−１モノクローナル抗体の受動的注入はサル−ヒト免疫不全ウイルス類（ＳＨＩＶ類）による感染を防ぐことを示した（２９，４１，６４）。従って、伝染の時点で十分に高いレベルの広く中和する抗体が存在するならば、ＨＩＶ−１感染からの防御が可能である可能性がある。しかし、現在までに、広く中和する抗−Ｅｎｖ抗体を一貫して誘導する免疫原配合物は存在していない。さらに、自己由来中和抗体応答は伝染の数ヵ月後まで起こらない（１，２４，５０，６０）。最初の伝染事象の後の、その間に防御抗体がＨＩＶ−１を消滅させるチャンス（ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）は不確かであるが、ＨＩＶ−１に感染したＣＤ４＋Ｔ細胞の潜在的なプールの確立より前の期間に限られそうである（３４，６１）。ウイルス潜伏は血清転換の時点で確実に確立されているが（６）、それは伝染の早くも数日後である可能性がある（１８）。

有効なＨＩＶワクチンの開発に対する重大な障害は、初期ＨＩＶ−１株を全ての遺伝的亜型にわたって中和する抗体を誘導することができないことである（１７，４２）。ＨＩＶ−１のエンベロープに基づくワクチンの多数の形が、まれな広く中和するヒトｍＡｂ類がそれに結合する（すなわちＥｎｖ類が抗原性である）エピトープを示すが、これらのワクチンは免疫原性では無く、動物またはヒトにおいて、中和の広さに関わっていることが示されているｇｐ１２０ ＣＤ４結合部位（３８）、ｇｐ４１の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）（４４，４８）に対して、またはｇｐ１２０糖質Ｅｎｖ抗原（５１）に対して広く中和する抗体を誘導することに失敗している。

ＨＩＶ−１の血清転換は、臨床での急性ＨＩＶ−１感染（ＡＨＩ）の開始から見積もった場合に、広い範囲の時間にわたって起こることが報告されている（５，３０，４５）；しかし、特定の特異性およびアイソタイプのＨＩＶ抗体の血清転換のタイミングは、検出可能な血漿ウイルス血症の最初の時点に関して正確には定量化されていない。ウイルス感染細胞と反応する抗−ＨＩＶ−１ ＩｇＭは、ＡＨＩの過程の間に検出されているが（１０，１１）、ＡＨＩにおけるウイルスＲＮＡの最初の検出に関するこれらの抗体のタイミングおよびＩｇＭ−ビリオン免疫複合体の存在はまだ定められていない。自己由来中和抗体は、ＨＩＶ−特異的抗体の最初の出現の数ヵ月後にようやく生じることが知られている（１，２４，５０，６０）。ＨＩＶ−１の制御における早期ＨＩＶ−１抗体の役割の理解に関する重要な疑問は、第１に早期抗−ＨＩＶ−１抗体の性質およびタイミングは何なのかであり、第２に伝染後のウイルスの複製の制御におけるこれらの抗体の寄与は何なのかである。

本発明は、少なくとも部分的に、暗黒期（ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｈａｓｅ）（伝染および検出可能なウイルス血症の間の時間）（１９）から６〜１２ヶ月の感染の確立を通しての、特定の抗エンベロープ（Ｅｎｖ）抗体応答のタイミングを調べるため、および初期の血漿ウイルス血症の制御におけるＢ細胞応答の作用のモデルを作るために設計された試験に由来する。その結果は、ＨＩＶ−１に対する最も早期に検出可能な抗体はビリオン−抗体免疫複合体の形であり、５日後に遊離の抗ｇｐ４１ ＩｇＭ血漿抗体が続くことを示している。ウイルス動態の数学的モデリングは、初期のＥｎｖ ｇｐ４１抗体応答は初期のウイルス複製の制御にほとんど影響しないことを示唆している。

本発明は、抗−ＨＩＶ抗体およびビリオン−抗体複合体を検出する方法を提供する。

本発明は概してＨＩＶに関する。より具体的には、本発明は抗−ＨＩＶ抗体および抗体−ビリオン複合体を検出する方法に関する。
本発明の目的および利点は、下記の記述から明らかであろう。

図１Ａおよび１Ｂ。（図１Ａ）２１人のＨＩＶ＋血清転換血漿の提供者パネル（暗黒期クレードＢ感染）のウイルス負荷の速度論を決定した。対象の整列は、ＶＬが１００コピー／ｍｌに達した最初の日であるＴ_０によった。（図１Ｂ）ウイルス血症が最初に検出可能である日（Ｔ_０）と比較した、それぞれの日に試験した試料の総数を示す柱状図。ビン（Ｂｉｎｓ）は１０日の間隔である。 図２Ａおよび２Ｂ。（図２Ａ）暗黒期クレードＢ血漿提供者のコホートにおける、抗−ｇｐ４１および抗−ｇｐ１２０抗体応答のカプランマイヤープロット。実線は、計算されたＴ_０の後のそれぞれの時間間隔にＨＩＶ特異的抗体応答を発現する集団の増大する百分率を示す。破線は、それぞれ上限および下限の点ごとの（ｐｏｉｎｔ−ｗｉｓｅ）信頼区間を示す。（図２Ｂ）暗黒期クレードＢ血漿提供者のコホートにおける、抗−Ｇａｇ（ｐ２４、ｐ１７、ｐ５５）および抗−Ｐｏｌ（ｐ３１）応答と比較した、抗−Ｅｎｖ抗体応答のタイミングの対での比較。実線（左から右へ）は、Ｔ_０からの抗体上昇の中位日（ｍｅｄｉａｎ ｄａｙ）を示し、線の切れ目はそれらのＴ_０からの上昇の時間に関してグループ分けしたＨＩＶ特異的抗体応答を示す。ＩｇＧ抗−ｇｐ４１抗体の出現に関する中位時間は１３．５日であり（図２Ａ、左のパネル）、一方でＩｇＧ ｇｐ１２０抗体の出現に関する中位時間は２８日であった（図２Ａ、右のパネル）。 図２Ａおよび２Ｂ。（図２Ａ）暗黒期クレードＢ血漿提供者のコホートにおける、抗−ｇｐ４１および抗−ｇｐ１２０抗体応答のカプランマイヤープロット。実線は、計算されたＴ_０の後のそれぞれの時間間隔にＨＩＶ特異的抗体応答を発現する集団の増大する百分率を示す。破線は、それぞれ上限および下限の点ごとの（ｐｏｉｎｔ−ｗｉｓｅ）信頼区間を示す。（図２Ｂ）暗黒期クレードＢ血漿提供者のコホートにおける、抗−Ｇａｇ（ｐ２４、ｐ１７、ｐ５５）および抗−Ｐｏｌ（ｐ３１）応答と比較した、抗−Ｅｎｖ抗体応答のタイミングの対での比較。実線（左から右へ）は、Ｔ_０からの抗体上昇の中位日（ｍｅｄｉａｎ ｄａｙ）を示し、線の切れ目はそれらのＴ_０からの上昇の時間に関してグループ分けしたＨＩＶ特異的抗体応答を示す。ＩｇＧ抗−ｇｐ４１抗体の出現に関する中位時間は１３．５日であり（図２Ａ、左のパネル）、一方でＩｇＧ ｇｐ１２０抗体の出現に関する中位時間は２８日であった（図２Ａ、右のパネル）。 図３Ａ〜３Ｃ。抗−ｇｐ４１ ＩｇＭ抗体は、最初に検出可能なＨＩＶ抗体であり、自己由来ｇｐ１４０伝染Ｅｎｖ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｅｎｖ）またはコンセンサスＥｎｖ ｇｐ１４０タンパク質は、ＨＩＶ感染における最初の抗体アイソタイプの検出に関して等しく感受性である。（図３Ａ）ＩｇＭ抗体、（図３Ｂ）ＩｇＧ抗体、（図３Ｃ）ＩｇＡ抗体が、コンセンサスｇｐ１４０（ＣｏｎＢ）または自己由来Ｅｎｖ（６２４６Ｅｎｖ）のどちらかを用いて検出された。アステリスクは自己由来ｇｐ１４０ Ｅｎｖが由来した血漿試料を示す。コンセンサスｇｐ１６０オリゴマーは自己由来ｇｐ１４０ Ｅｎｖオリゴマーと同時に抗−ｇｐ４１抗体を検出する。 図４Ａ〜４Ｄ。急性ＨＩＶ感染における抗−ｇｐ４１特異的抗体アイソタイプの速度論。早期ＨＩＶ特異的抗体応答の（図４Ａ）連続的発現および（図４Ｂ）同時発現の代表的な例を示す。（図４Ｃ）３個のコホートのそれぞれにおける、異なる速度論的パターンを示した患者の百分率。（図４Ｄ）Ｇａｇ特異的抗体応答の同時発現。ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプの抗−ｐ５５抗体を、暗黒期クレードＢコホートにおける全ての対象に関して測定した。Ｐｔ．１２００７は、最初のＲＮＡ陽性試料および最後のＲＮＡ陰性試料の間の大きな間隔のためにＴ_０に対して整列させることができなかった。しかし、抗体陽性および抗体陰性の間の短い間隔は抗体アイソタイプの速度論の測定を可能にし、従ってそのパネルは最初のＲＮＡ陽性試料のようにＴ_０に対して整列させた。 図５。Ｔ_０後８．０日の中位時間において生成したＨＩＶ免疫複合体。Ｐｔｓ．９０１５、１２００８、９０７７、９０７９、９０２１および９０７６に関する免疫複合体の検出をＴ_０に対して整列させ、遊離抗体応答の検出と比較してプロットする。 図６Ａおよび６Ｂ。Ｔ_０後の時点における急性ＨＩＶ−１感染の間の補体結合抗体の個体発生。検出可能なＨＩＶ特異的抗体を有していた暗黒期コホートからの２人の代表的な患者（６２４０（図６Ａ）、６２４６（図６Ｂ））を、早期ウイルス分離株ＨＩＶ ＱＨ０６９２および実験室適応分離株ＨＩＶ ＳＦ１６２を用いて補体活性化に関して評価した。 図７Ａおよび７Ｂ。（図７Ａ）急性感染の最初の４０日以内では高ガンマグロブリン血症は観察されなかった。総抗体レベルを、最初のＨＩＶ（−）の試料およびパネル中の最後の試料（ＨＩＶ＋）において測定した。パネルにわたる濃度の中央値を示す。（図７Ｂ）ＨＩＶ急性期ウイルス血症の間のリウマチ因子（ＲＦ）の検出。ＩｇＭリウマチ因子を、陽性リウマチ因子対照を有する標準的なＥＬＩＳＡ検出を用いて測定した。ＶＬ＝ＲＮＡコピー／ｍｌにおけるウイルス負荷。 図７Ａおよび７Ｂ。（図７Ａ）急性感染の最初の４０日以内では高ガンマグロブリン血症は観察されなかった。総抗体レベルを、最初のＨＩＶ（−）の試料およびパネル中の最後の試料（ＨＩＶ＋）において測定した。パネルにわたる濃度の中央値を示す。（図７Ｂ）ＨＩＶ急性期ウイルス血症の間のリウマチ因子（ＲＦ）の検出。ＩｇＭリウマチ因子を、陽性リウマチ因子対照を有する標準的なＥＬＩＳＡ検出を用いて測定した。ＶＬ＝ＲＮＡコピー／ｍｌにおけるウイルス負荷。 図８。標的細胞限定モデルによる、ＡＨＩにおける血漿ウイルス血症に対する抗体の作用のモデル化。標的細胞限定モデルは、９０３２を除く試験した血漿提供者に関して最も適合するモデルである。９０３２に関しては、抗−ｇｐ４１ ＩｇＭおよびＩｇＧの合計により高めたビリオン排除を用いるモデルが最高の適合を与える。 図９Ａおよび９Ｂ。（図９Ａ）ＨＩＶ−１特異的抗体を特性付けるのに利用された、トリニダードトバゴコホートからの１４人の対象およびＣＨＡＶＩ ００１コホートからの１０人の対象のウイルス負荷の速度論。対象の整列は、試験における登録の最初の日によった。（図９Ｂ）登録の最初の日に関する試料の分布。 図１０Ａ〜１０Ｃ。対象６２４０からの自己由来ｇｐ１４０伝染ＥｎｖまたはコンセンサスＥｎｖ ｇｐ１４０タンパク質は、ＨＩＶ感染における最初の抗体アイソタイプの検出に関して同等に高感度である。（図１０Ａ）ＩｇＭ抗体、（図１０Ｂ）ＩｇＧ抗体、（図１０Ｃ）ＩｇＡ抗体。アステリスクは、ｇｐ１４０オリゴマーの発現のためにそれから自己由来ｇｐ１４０ Ｅｎｖを増幅、配列決定およびクローン化した血漿試料を示す。 図１１。１４人のＣＡＰＲＩＳＡおよび１２人のトリニダードの患者での、急性感染試験における登録からの非中和性クラスターＩＩ抗−ＭＰＥＲ抗体（ｃＩＩ−ＭＰＥＲ）、Ｃｄ４ｉおよびＣＤ４ｂｓ抗体の発現。 図１２Ａおよび１２Ｂ。Ｃ１４ ｍＡｂはビリオンを捕獲して免疫複合体を形成する。 図１３。急性感染の早期に存在する粘膜ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ Ｅｎｖ ＩｇＭ−Ｐｔ．７００−０１−０４７−０。 図１４。急性感染の早期に存在する２Ｆ５エピトープに特異的な粘膜ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ Ｅｎｖ ＩｇＡ−Ｐｔ．７００−０１−０４７−０。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。 図１５Ａ〜１５Ｋ。（図１５Ａ〜１５Ｆ）感染していない末端回腸試料（Ｃ１４）に由来するＣ１４−２ ＩｇＭの特性付け。（図１５Ｇ〜１５Ｋ）急性ＨＩＶ−１感染を有する患者の末端回腸に由来するＦ３ ＩｇＭの特性付け。

本発明は、ＨＩＶ−１に曝露された、および／または感染した人の血清または血漿中の特異的抗体および抗体−ＨＩＶビリオン複合体を検出する方法に関する。ＨＩＶ−１の伝染は結果として特異的ＨＩＶ抗原に結合する抗体の産生をもたらすことが以前に示されており、ＨＩＶに対する抗体陽性に関して検査する商業的に入手できる抗体／抗原検査が利用可能である。この発明は、遊離の抗体が現在利用可能である商業的検査により検出される前に抗体−ビリオン複合体を検出するための方法を提供する。この発明は、急性感染にある人を感染からの時間を概算することができるように段階づけることができるアッセイの開発を可能にする。

下記の実施例で記述される研究において、伝染した／起因ウイルス（ｆｏｕｎｄｅｒ ｖｉｒｕｓ）に対する初期のＢ細胞応答はＨＩＶ−１ ｇｐ４１ Ｅｎｖに対するものであり、ｇｐ１２０に対する応答はさらに１４日遅れることが示されている。初期のＩｇＭおよびＩｇＧ ｇｐ４１抗体の、血漿提供者コホートにおけるウイルス速度論に対する作用の数学的モデル化は、急性期血漿ウイルス血症の制御に対する初期の抗体応答の作用はもしあったとしてもほとんど無いことを明らかにした。

ＨＩＶ−１ Ｅｎｖに対する初期抗体応答のタイミングおよび特異性は、いくつかの理由のため興味深い。第１に、ワクチンがＨＩＶ−１の伝染した、または起因株を消滅させるためのチャンスはおそらく極めて短く、このチャンスのタイミングはＣＤ４＋Ｔ細胞の潜伏プールの確立の時間に依存して対象ごとに異なるであろう。その曝露後の予防はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）においてＳＩＶ負荷後２４時間を越えて防御せず（１８）、これはそのチャンスがヒトにおいて１０日以下である可能性があることを暗に意味する（６１）。さらに、Ｔ_０の５〜７日前における全身性の炎症および血漿中の急性期反応物の証拠の早期出現（Ｋｅｓｓｌｅｒ， Ｂ、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ， Ａ、およびＢｏｒｒｏｗ， Ｐ、私信）、さらにＴ_０の７日後のアポトーシスの血漿分析物の出現（２２）は、ワクチンの有効性に関するこの短く見積もられたチャンスに支持を追加する。防御的であるべき抗体に関して狭い時間のチャンスが存在する可能性があるとすると、および免疫複合体が伝染の約１８日後（Ｔ_０の８日後、および伝染からＴ_０までの時間を７〜２１日の範囲で平均１０日と見積もる（７，１１，１４，２１，４０，５２））にようやく生じるとすると、ＨＩＶ−１に対する最初の抗体応答は、それが伝染した／起因ＨＩＶ−１株を消滅させる、または制御するために起こるべき最も適した時と比較してかなり遅れる。

この研究は、急性ＨＩＶ−１感染におけるウイルス血症の初期の段階の間のビリオン−抗体複合体の最初の実証である。以前の研究は急性感染の後期に注目しておりＨＩＶ−１感染の早期において免疫複合体を見つけ出さず、むしろ慢性感染においてのみ免疫複合体を見つけ出した（１６）。急性感染の間のこれらの早期免疫複合体の存在は、抗体でコートされたウイルスが感染性であるままなのかどうかという疑問を提起する；オプソニン化されたウイルスの感染性を決定するための研究が進行中である（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｄ．Ｃ．、Ｔｏｍａｒａｓ， Ｇ．Ｄ．、Ｈａｙｎｅｓ， Ｂ．Ｆ．、未公開）。しかし、ＨＩＶ−１の伝染の可能性は急性感染の間に最も高いことは十分に確証されている。まとめると、これらのデータは、伝染した／起因ウイルスが最初にビリオンに結合する抗体を誘導するＨＩＶ−１回避戦略は、まだ非中和性であることを示唆している。これらの初期の抗体応答が防御的である可能性があるのかどうか、ワクチンがＨＩＶ−１の伝染の後にこれらの抗体のタイミングおよび重要さ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の早期の押し上げのために備える（ｐｒｉｍｅ）ことができるのかどうかを決定するために、Ｔ_０の８日後に存在する免疫複合体中の抗体の特異性および結合力を解読するためにさらなる研究が必要である。

Ｅｎｖに対する早期のＢ細胞応答がｇｐ４１を選択的に認識したことも興味深い。Ｌｉらは最近、広く中和する抗体が出現する時、それらは遅く出現し、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位に対する抗体を含むことを示した（３８）。広く中和するＣＤ４結合部位抗体同様、ＭＰＥＲにおいてｇｐ４１上に広く中和するエピトープがあるが、ＭＰＥＲに対する中和抗体はまれにしか作られず、それらが作られる場合、生じるのに伝染後２年より長い期間を必要とする（Ｓｈｅｎ．， Ｘ、Ｔｏｍａｒａｓ， Ｇ． Ｄ．、非公開の観察結果）。従って、伝染の間および直後に起こる宿主−病原体相互作用は、結果として宿主Ｂ細胞によるｇｐ１２０の認識において、感染した細胞の潜伏プールがおそらく確立される後までの遅延をもたらす。

慢性ＨＩＶ−１感染ではＢ細胞のポリクローナル活性化が起こり、早期ＨＩＶ−１感染においても同様であることが報告されている（４７）。血漿提供者においてポリクローナル高ガンマグロブリン血症は見つからなかったが、対象の約３０％において血漿リウマチ因子が見つかった。従って、ポリクローナルＢ細胞活性化はこの自己抗体の検出により示されるように早い時期に起こり、これはおそらくリウマチ因子自己抗体の産生者であるＣＤ５＋Ｂ細胞の引き金を引いていることを示している（２６）。

ＨＩＶ−１の感染の後に見られるＩｇのクラススイッチのパターンに不均一性があったのも興味深い。対象の半分において免疫複合体は遊離の抗体と同時に出現しているため、抗ＨＩＶ ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡの同時出現は抗体の検出を覆い隠す免疫複合体の存在によるものではありそうもないことが示されている。血漿中のＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗−ＨＩＶ−１抗体の同時出現に関する他の可能性のある説明には、次のものが含まれる：ＨＩＶ−１への以前の曝露、並びに、伝染後の一次Ｔ細胞独立性Ｂ１および辺縁帯Ｂ細胞の、ＨＩＶ−１に対する応答（９）。

ＥｎｖおよびＧａｇに対するＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡの同時出現が、対象の約６０％が以前にＨＩＶ−１抗原に曝露されたことを表し、ＨＩＶ−１の完全感染に対する急速な二次応答を表すのなら、その応答の変則的な見方は、抗−ＥｎｖおよびＧａｇ ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡの連続的出現を有する対象において一次ＩｇＭ応答（Ｔ_０後の１３．０日目）が起こるのと全く同じ時に、推定される“二次”応答が起こるというものである。同時応答が実際に、以前のＨＩＶ−１への曝露からの二次的なものであるならば、それは観察されるよりもおおよそ７日早く起こっているはずである。従って、試験したＡＨＩの２／３より多くにおける血漿中のＩｇＭおよびクラススイッチした抗体の同時出現は、前にＨＩＶ−１に曝露されたことを示すものではありそうもない。

ヒトおよび非ヒト霊長類の両方において、伝染のすぐ後、感染が確立した時に、ＣＤ４ Ｔリンパ球の重篤な枯渇があり（４，５７）、それはＢ細胞応答の刺激のための十分なＤＣ４の支援の不足につながり得る。大量のアポトーシスによるＣＤ４＋ＣＣＲ５＋ Ｔリンパ球の早期の枯渇は、Ｔ細胞の恒常性を変えるのに加え、さらに初期の防御的Ｂ細胞応答の抑制につながり得る（２２，４３）。従って、初期のＴ独立性抗体応答の誘発は、Ｔ細胞が枯渇した環境において、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡ抗ＨＩＶ−１抗体の同時出現の原因である可能性がある。同様のＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡ抗−肺炎球菌抗体の同時出現を伴うＴ独立性パターンが肺炎球菌ワクチンの後に起こる（９）。

血漿ウイルス血症の制御において、早期の抗体応答のあらゆる有益な、または有害な作用を決定するためには、抗体のタイミングおよびウイルス負荷の動態の両方をモデル化することが重要であった。ヌルモデルとして、体液性または細胞性免疫応答の影響を含まない単純な標的−細胞限定モデルが用いられた（５３）。ウイルス負荷のピークを越えて、およびＴ_０後の４０日目までに及んだＶＬデータが入手できた６人の血漿提供者の内の５人に関して、このモデルはＶＬデータとの良好な一致を与えた。それにも関わらず、抗体の様々な既知の機能効果のいずれかを組み込んだモデルを用いることによりその一致を向上させることができるのかどうかに関して問いかけがなされた。驚くようなことでは無いが、それは１人の血漿提供者９０３２のみに関するものであり、それに関して標的細胞限定モデルは抗体をモデル中に含めた際に向上が見られたＶＬデータと良好な一致を与えなかった。興味深いことに、この提供者は、ピークＶＬが他の提供者におけるよりも有意に低かった（３．４×１０^４コピー／ｍｌ）点で異常であった。まとめると、これらの分析は、ほとんどの提供者に関して早期の抗体はウイルス血症の制御に関してほとんど機能的重要性を有していなかったことを示唆していた。

伝染したウイルスにより誘導される早期の抗体が何らかの抗ウイルス作用を有しているならば、血漿中の複合体化した、または遊離の抗体の出現の後に、抗体に誘導されるウイルス逃避が検出されるはずである。この点について、Ｋｅｅｌｅら（３５）は最近、この報告において試験された血漿提供者に関して伝染した起因ウイルスを配列決定し、Ｔ_０の１４日後におけるウイルス配列がランダムウイルス進化のモデルに従っており、従って早期の抗体に誘導される選択の証拠を示さなかったことを見出した。

ＨＩＶ−１に関して、抗体結合の機能的重要性にはＴリンパ球またはマクロファージ上でのウイルスの中和（３１，３２）、抗体依存の細胞性細胞障害作用（ＡＤＣＶＩ／ＡＤＣＣ）、補体に仲介される中和、抗体Ｆｃに仲介されるエフェクター機能、ウイルス溶解（ｖｉｒｏｌｙｓｉｓ）および／またはトランスサイトーシスの阻害が含まれ得る。最近の研究（２９）は、Ｆｃγ−受容体−結合機能はウイルスの中和に必要な濃度よりも高い抗体濃度を必要とするため、異なる抗−ウイルス機能を仲介する抗体の濃度は完全なウイルス除去のための重要な考慮すべき事柄である可能性があることを示唆した。加えて、抗体および補体に仲介されるビリオンの溶解が急性感染において発現する可能性があり、それは感染の急性期の間の血漿ウイルス負荷と相関する可能性がある（３３）。この抗ウイルス活性は中和抗体とは相関せず、非中和抗体の抗ウイルス構成要素であると考えられている。樹状細胞（ＤＣ）は粘膜に位置しており、そこでそれらは感染を確立するのを助ける第１の細胞型の１つであると考えられている（（６２）において概説されている）。急性ＨＩＶ−１感染において誘発されるまさに最も早い抗体は、粘膜表面で樹状細胞においてＨＩＶ−１の感染を妨害することができるのかどうかを決定することは重要であろう。

伝染した／起因ウイルスに対する初期のＢ細胞応答は感染の最初の４０日の間は初期のウイルスレベルを制御しないことは明らかである。しかし、ウイルスの伝染の後に誘発された何らかの抗体特異性がビリオンの亜集団に影響を及ぼす可能性があるが、それらが出現した時点で血漿ウイルス血症に有意に影響を及ぼすのには実質的に十分では無いことを除外することはできない。重要な疑問は、これらのタイプの非中和抗体が、感染の前に存在した場合、またはむしろ、将来のＨＩＶ−１ワクチンにより完全に異なるタイプの阻害抗体が誘導される必要があると考えられる場合、保護的であることができるのかどうかである。自己由来の中和抗体はエンベロープの可変ループを標的とし（４６，４９，５０，６０）、それはＨＩＶ−１を消滅させるためのあらゆるチャンスが過ぎ去ったずっと後に生じる可能性がある。従って、有効なＨＩＶ−１ワクチンは感染より先に天然のビリオンエンベロープ分子に結合する抗体を誘導する必要があり、さらに伝染後の最初の週の内に急速な二次中和抗体応答の成熟をもたらすであろう。

抗体−ＨＩＶビリオン複合体に結合する抗体の例は、図１５Ｆにおいて述べられているような、Ｃ１４−２抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を有するｍＡｂである。さらなる例は、図１５Ｋにおいて述べられているような、Ｆ３抗体の重鎖配列を有する抗体である。本発明には、それらの完全なままの抗体または断片（例えば抗原結合断片）が含まれる。典型的な機能断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）_２断片が含まれる。単鎖抗体を用いることもできる。適切な断片および単鎖抗体を調製するための技法は、当技術で周知である。（例えば、米国特許第５，８５５，８６６号；第５，８７７，２８９号；第５，９６５，１３２号；第６，０９３，３９９号；第６，２６１，５３５号；第６，００４，５５５号；第７，４１７，１２５号および第７，０７８，４９１号ならびにＷＯ ９８／４５３３１を参照。）本発明は、具体的に開示された抗体（および断片）の結合特性を保持している変形を含む、本明細書で開示された抗体（および断片）の変形、および同じものを用いる方法も含む。

上記で記述された抗体、およびその断片は、組成物（例えば医薬組成物）として配合することができる。適切な組成物は、医薬的に許容できるキャリヤー（例えば水性媒体）中で溶解させた、または分散させた抗体（または抗体断片）を含むことができる。その組成物は無菌であることができ、注射可能な形であることができる。その抗体（およびその断片）は、皮膚または粘膜への局所投与に適した組成物として配合することもできる。その組成物は液体、軟膏、クリーム、ゲル、ペーストおよびエアロゾルの形で摂取することができる。標準的な配合技法を適切な組成物の調製において用いることができる。その抗体は性交後圧注として、またはコンドームと共に投与するために配合することができる。

本発明の抗体および抗体断片は、対象（例えばヒト）においてＨＩＶ感染を阻害する、または処置するために用いることができる。適切な用量範囲は、例えば抗体に、ならびに配合物の性質および投与経路に依存する可能性がある。当業者は過度の実験無しに最適な用量を決定することができる。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体の用量が適切である可能性がある。

本発明の特定の観点は、下記の限定的では無い実施例においてより詳細に記述することができる。（Tomaras et al, J. Virol. 82:12449 (2008)も参照）。

実施例１
実験の詳細
試験した対象
４個の異なる急性感染コホートからの対象の亜集団を調べた：２１人の血漿提供者、トリニダードコホート（クレードＢ）からの１２人のＡＨＩの対象、ＣＡＰＲＩＳＡ（クレードＣ）コホートからの１４人のＡＨＩの対象、およびＣＨＡＶＩ００１急性感染コホートからの１０人のＡＨＩの対象。

ウイルス負荷試験
血漿のウイルスＲＮＡをＱｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ニュージャージー州リンドハースト）（ＨＩＶ− １ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｕｌｔｒａ）により測定した。

抗体結合アッセイにおいて用いられた抗原
直接的抗体結合アッセイのために用いられた抗原は次のものである：グループＭコンセンサスＥｎｖ ＣＯＮ−Ｓ ｇｐ１４０、コンセンサスＢ ｇｐ１４０、クレードＢ野生型Ｅｎｖ ｇｐｌ２０ｓ（組換えワクチン（３９）または２９３Ｔトランスフェクションのどちらかにより製造した。ＩＩＩＢ、ＪＲＦＬ、８９．６、さらに次のペプチド（Ｐｒｉｍｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびそれらの配列。ＳＰ４００（ｇｐ４１の免疫優性領域、ＲＶＬＡＶＥＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＮＫＩ）、ＳＰ６２、ｇｐ４１ ＭＰＥＲ、（ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮ）、４Ｅ１０ Ｐ、（ＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）、コンセンサスＢ Ｖ３ ｇｐｌ２０領域、（ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＥＩＩＧＤＩＲＱＡＨ）、コンセンサスＭ Ｖ３ ＣＯＮ−Ｓ ｇｐｌ２０領域、ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＧＰＧＱＡＦＹＡＴＧＤＩＩＧＤＩＲＱＡＨ。急性ＨＩＶ−１のエンベロープ遺伝子の配列は、４人の亜型Ｂ急性ＨＩＶ−１に感染した人のものに由来していた（対象６２４６、６２４０、および９０２１、単一ゲノム増幅（ＳＧＡ）（３５）による。組換え可溶性ｇｐ１４０タンパク質を生成するため、ｇｐ１４０Ｃと名付けたｇｐ１４０ ｅｎｖ遺伝子のコンストラクトを設計し、ここでＨＩＶ−１ Ｅｎｖの膜貫通および細胞質ドメインは欠失しており、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位における２個の決定的に重要なＡｒｇ残基が２個のＧｌｕ残基で置き換えられていた。４種類のｇｐ１４０Ｃ ｅｎｖ遺伝子は全て、高度に発現するヒトのハウスキーピング遺伝子のコドン使用頻度を用いることによりコドンを最適化され、デノボ合成され（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ワシントン州ボセル）、標準的な分子技術を用いてｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）の中にクローニングされた。組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質は、２９３Ｔ細胞において、得られたプラスミドを用いた一過性トランスフェクションにより生成し、ガランサス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）カラムクロマトグラフィー（３９）により精製した。自己由来Ｖ３ペプチドは、これらの同じＥｎｖから作られた。

抗体アッセイの基準
抗原ごと抗体ごとの陽性基準は、３０以上の血清陰性をスクリーニングすることにより決定された。標準化されたＨＩＶ＋陽性対照をそれぞれのアッセイにおいて滴定し（レビージェニングス（Ｌｅｖｙ−Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）プロットを用いて、平均の３ＳＴＤＥＶ以内のみでの力価の許容で追跡した（ｔｒａｃｋｅｄ））、平均Ｏ．Ｄ．を血清の希釈度の関数としてプロットして、４パラメーターロジスティック方程式（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて抗体の力価を決定する。試料ごとの変動係数（ＣＶ）は１５％以下である。それぞれのアッセイには、特異性を保証するために、ならびにアッセイ間の一貫性および再現性を維持するために、２種類の陰性血清および２種類のＨＩＶ＋の対照血清が含まれる。生データの取得、データ分析の完全性を電子工学的に追跡した（２１ＣＦＲパート１１遵守）。

直接ＥＬＩＳＡ
コンセンサスクレードＢまたはエンベロープ糖タンパク質、ｇｐ４１タンパク質、コンセンサスＶ３ペプチド、ｇｐ４１免疫優性、ならびにＭＰＥＲエピトープ、さらに自己由来Ｖ３およびｇｐ１４０ Ｅｎｖオリゴマーを用いて直接ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム中の抗原０．２μｇ／ウェルでコートし、アッセイ希釈液（４％（ｗ／ｖ）乳清タンパク質／１５％正常ヤギ血清／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）でブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ＃３３６９）中で行った。血清を１：２５で始まる２倍系列希釈中で１時間保温し、続いてＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。１００μｌのアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ９５４４）を１：４０００で１時間保温し、洗浄し、１００μｌの基質（ＣＢＣ緩衝液＋２ｍＭ ＭｇＣｌ２＋１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ｎｐｐ［４−ニトロフェニルホスフェート ジ（２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール）塩］）を用いて検出した。プレートを４０５ｎｍで４５分間読み取った。

比較阻害試験（抗体ブロッキングアッセイ）
１ｂ１２（ＣＤ４ＢＳ）、２Ｇ１２（抗−ＣＨＯ）、およびＭＰＥＲ ｍＡｂである２Ｆ５および３Ｈ１１を用いて比較阻害試験（抗体ブロッキングアッセイ）を実施した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ＃３３６９）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム中のＪＲＦＬ０．２μｇ／ウェルでコートし、アッセイ希釈液（４％（ｗ／ｖ）乳清タンパク質／１５％正常ヤギ血清／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）でブロッキングした。全てのアッセイの工程はアッセイ希釈液中で行われ（基質の工程を除く）、室温で（１３Ｈ１１アッセイは３７°で）１時間保温し、続いてＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。血清を１：５０で希釈し、３通りの（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）ウェルで保温した。５０μｌのビオチン化した標的ＭａｂをＥＣ５０（ビオチン化−ＭａｂのＪＲＦＬに対する直接結合曲線により決定した）において添加した。ビオチン−Ｍａｂの結合の程度を、１：１０００でのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｖ５５９１）、続いて基質（ＣＢＣ緩衝液＋２ｍＭ ＭｇＣｌ２＋１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ｎｐｐ［４−ニトロフェニルホスフェート ジ（２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール）塩］）を用いて検出した。プレートを、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍで４５分間読み取った。３通りのウェルを、バックグラウンドを減算して平均した。パーセント阻害を次のように計算した：１００−（血清の３通りの平均／阻害無しの対照の平均）^*１００。ＣＤ４結合部位ブロッキングアッセイを、１００μｌの飽和濃度の可溶性ＣＤ４（Ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ Ｐｈａｒｍ Ｉｎｃ．）を血清とビオチン−Ｍａｂの保温の工程の間で保温したことを除き、上記のように行った。

ＡｔｈｅＮＡアッセイ
タンパク質１６０、１２０、６６、５５、４１、３１、２４および１７に対する抗体の結合を、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で、ＡｔｈｅＮＡ Ｍｕｌｔｉｌｙｔｅ ＨＩＶ−１ Ｂｅａｄ Ｂｌｏｔ ｋｉｔ（Ｚｅｕｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ７１００ ＩＧ）を用いて、そのキットの製造業者のプロトコルに従って測定した。

カルジオリピンおよびリウマチ因子アッセイ
抗カルジオリピン抗体アッセイを、記述されている（２）ように行った。ＩｇＧ抗原を用いるＩｇＭリウマチ因子を測定するためのアッセイは、リウマチ因子対照（Ｊｕｄｙ Ｆｌｅｍｉｎｇ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒにより親切に提供された）を用いて標準化された。

アイソタイプ結合抗体
ＨＩＶ抗原または精製したＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡタンパク質（対照として用いた）を、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）のウェル上に一夜プレコートし、自動化および較正されたプレートウォッシャー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）で洗浄した。血清／血漿試験試料を希釈し、プレートに結合した抗原と共に保温した。次いでプレートを洗浄し、抗原−抗体複合体を、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたアイソタイプ特異的抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭと共に保温した。光学密度の読みをＶｅｒｓａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、それぞれの複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）のペアに関する平均のＯ．Ｄ．の読みを、バックグラウンドを減算して計算した。それぞれの試験試料に関して、２通りの抗原を含む、および非抗原を含むマイクロタイタープレートのウェルを採点した（ｓｃｏｒｅｄ）（すなわち、Ｏ．Ｄ．抗原−Ｏ．Ｄ．非抗原）。陽性の点数は、バックグラウンドを減算して０．１Ｏ．Ｄ．以上、および複製間で１５％ＣＶを有するベースラインの３倍以上と定められる。別のレベルの確認として、血漿提供者の試料において、ＨＩＶ ｇｐ４１特異的ＩｇＭ結合抗体試験を、第３世代ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国イリノイ州アボットパーク）の試験と比較し、あらゆる抗体応答の第１検出に関して商業的に入手可能なキットと等しい感度が見出された。

検体分取（Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｐｒｅｐ）ＭｕｌｔｉＴｒａｐによるＩｇＧ除去。
ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体の検出のため、プロテインＧカラムを用いてＩｇＧを除去した。簡潔には、血漿を１０分間遠心分離し（１０，０００×ｇ）、希釈緩衝液中で２倍に希釈し、１．２ｕｍフィルタープレート（Ｐａｌｌ ＡｃｒｏＰｒｅｐ）中で濾過した。濾過および希釈された試料を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ Ｐｌａｔｅｓ（ＧＥ， Ｉｎｃ．）を用いて、少し修正した製造者の説明書に従ってＩｇＧを枯渇させた。標本中のＩｇＧの除去は、ＨＩＶ特異的結合アッセイによりアッセイして９０％を超えていた。

カスタマイズしたＬｕｍｉｎｅｘアッセイ
５×１０^６個のカルボキシル化された蛍光ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ、テキサス州オースティン）を、２５μｇのＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いられる精製されたＨＩＶ抗原の１種類に共有結合させ、１：１０希釈での患者の試料と共に保温した。ＨＩＶ特異的Ａｂアイソタイプを、それぞれフィコエリトリンにコンジュゲートしたヤギ抗−ヒトＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウエストグローブ）、マウス−抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミンガム）、またはヤギ−抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミンガム）を用いて４μｇ／ｍｌで検出した。次いでビーズを洗浄し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上で獲得した。精製したＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡタンパク質（Ｓｉｇｍａ）および一定ＨＩＶ＋血清力価測定を全てのアッセイにおいて陽性対照として利用した。バックグラウンドの値（検出Ａｂの非存在下でのビーズ）および正常ヒト血漿を陰性対照として利用した。ＩｇＭの検出に関するリウマチ因子のための対照は、内部ＩｇＧタンパク質標準であった。

ＨＩＶ−１免疫複合体捕捉アッセイ
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した１μｇ／ｍｌの濃度の抗−ヒトＩｇＭまたはＩｇＧで４℃で一夜コートした。それに続く全ての工程は室温で行った。保温および洗浄の後、コートしたプレートを５％ＦＢＳ、５％ミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎを補ったＰＢＳで２時間ブロッキングした。ブロッキングおよび洗浄の後、９０μｌの未希釈の血漿をそれぞれのウェルに添加し、９０分間保温し、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎを補ったＰＢＳで４回洗浄した。２００μｌのＡＶＬ溶解緩衝液とキャリヤーＲＮＡを添加し、１５分間振とうし、溶解物中のウイルスＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ ｖｉｒａｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔにより抽出した。ビリオン−抗体複合体からのＨＩＶ−１ ＲＮＡを、ｇａｇのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。免疫複合体のＥＬＩＳＡ捕捉アッセイによる検出を、プロテインＧカラム吸着（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｉｎｃ）を用いてＩｇＧ−ビリオン免疫複合体を枯渇させることにより確認した。ＩｇＧ吸着は製造業者の説明書に従って行った。９０μｌの血漿をプロテインＧカラムに添加した。混合し、１０分間保温した後、カラムを５０００×ｇで１分間遠心分離した。免疫複合体の存在は、Ｂａｒｏｎらによる方法（１６）と同様に、入れたウイルスＲＮＡを素通り画分のウイルスＲＮＡにより割った百分率により計算された。ＨＩＶＩＧ（ＮＩＨ， ＤＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ）にＨＩＶ−１ ＮＬ４−３偽型ウイルスを加えたものが免疫複合体捕捉に関する陽性対照であり（８１±４％）、正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）またはＲＰＭＩ−１６４０にＨＩＶ−１ ＮＬ４−３を加えたものが陰性対照であった。非ＨＩＶ−１特異的捕捉（正常ヒト血清にＮＬ４３を加えたもの）のカットオフは１６．２±０．８％であり、ウイルスのみの対照のバックグラウンドは６．５±４．６％であった。

補体結合アッセイ
ウイルスおよび希釈した血漿試料（１：４０）を、補体の源としての１０％正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の存在下で、または１０％熱非働化ＮＨＳと共に３７℃で保温した。次いで高レベルのＣＲ２を発現するＭＴ−２細胞を添加し、そのウイルス／細胞懸濁液を２時間保温した。結合しなかったビリオンを連続的な洗浄により除去した。結合したビリオンを０．５％トリトンＸを用いた処理により崩壊させ、放出されたＰ２４をＥＬＩＳＡにより測定した。％結合を決定するため、得られたＰ２４を補体の非特異的結合（ｈｉ ＮＨＳ）に関して補正した後、最初のウイルスのＰ２４で割った。

中和抗体アッセイ
血漿提供者コホートにおける抗体に仲介される中和を、記述されている（３７）ように、ＴＺＭ−ｂｌ細胞における１ラウンドの感染の後のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現における低減の関数として測定した。２Ｆ−および４Ｅ１０−特異的中和抗体に関する血漿のアッセイに関して、ＨＩＶ−１ ２Ｆ５または４Ｅ１０エピトープを発現するＨＩＶ−２偽ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｅｓ）を以前に記述された（２４）ように用いた。

同時の、および連続的な速度論を分類するための統計分析および方法
混合効果モデル（５５，５８，５９）、ノンパラメトリック回帰（２５）、二項検定、カプラン・マイヤー曲線および加速度故障時間（ＡＦＴ）モデル（１３）を用いて統計分析を行った。４つ全てのコホートに関して、ノンパラメトリック回帰（２５）に基づくスプライン平滑化を行ってウイルス負荷および抗体曲線の見積もりを得た。ウイルス血症の急性のバーストが記録されていた血漿提供者コホートに関して、共同解析のために異なる試験パネルを整列させるために、正確な時間の開始点（Ｔ_０）を定める。それぞれの患者に関して、そのＴ_０は上昇するウイルス負荷の非線形混合効果モデルにおけるモデルパラメーターとして見積もられ、アッセイの検出限界における検閲（ｃｅｎｓｏｒｉｎｇ）を説明した（５５）。右の検閲は生存分析において用いられ、“対象の追跡調査期間の間に何の事象も起こらなかった（もっと後の時間（タイムスケールにおける“右”）において事象が起こる可能性があるが）”こととして定義される。彼らの短い追跡調査期間（Ｔ_０後１２日間）のため、２人の対象が検閲された。それぞれの分析物（例えば抗ＩｇＡ／ＩｇＧ／ＩｇＭ ｇｐ４１抗体応答）に関して、Ｔ_０より前に記録されたデータはその分析物に関するバックグラウンドレベルを決定するための線形混合効果モデル（５８）に適合しており、ここで未来の応答の上方９５％予測限界（５９）を陽性の閾値として用いて最後の陰性の観察結果および最初の陽性の観察結果を定めた。同時の、および連続的な速度論を分類する統計的方法は、ＥＬＩＳＡの計算から得られた結果を陽性の基準（ｃｒｉｔｉｅｒｉｏｎ）に基づいて確かめた。

カプラン・マイヤー推定値を用いて最初の上昇のタイミングの分布を記述した。分析物のペアの間の上昇のタイミングにおける相対的順位の両側二項検定を、タイミングにおける正の差（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を成功、およびゼロでは無い差の数を試行の数として行った。調整したｐ値（ｑ値）をコンピュータで計算して多重検定の偽発見率（ＦＤＲ）に関して制御した（５４）。血漿提供者およびＣＨＡＶＩ ００１コホートの両方においてウイルス負荷および抗体マーカーの間の関連を評価するため、加速度故障時間（ＡＦＴ）モデル（１３）を用いてウイルス負荷の増大または減衰と最初の上昇までの時間の相関を調べ（検閲を条件とする）、線形混合効果モデル（５８）を用いて時間の経過に伴う下降するウイルス負荷および抗体応答の大きさの相関を調べた。加えて、統計的相関および線形回帰分析を行い、トリニダードおよびＣＡＰＲＩＳＡコホートにおける異なる阻害アッセイ間のもっともらしい関連を確認した。

モデル化
血漿提供者のＶＬデータを数学的にモデル化するために用いた標的細胞限定モデルは次のものである：

。
ＨＩＶ感染を受けやすい細胞を標的細胞Ｔと呼ぶ。そのモデルは、標的細胞が細胞あたり一定の速度γで生み出され、速度ｄで死ぬと仮定する。ＨＩＶと相互作用すると、これらの細胞は感染速度定数ｋで生産的に（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｌｙ）感染した細胞Ｉになる。感染した細胞は細胞あたり速度δで死に、ウイルス粒子（ビリオン）Ｖを感染した細胞あたり速度ｐで産生する。ビリオンはビリオンあたり一定の速度ｃで排除されると仮定する。

オプソニン化による増進されたビリオンの排除を組み込むため、上記のモデルにおいて、Ｖ（ｔ）に関する方程式を次の方程式で置き換える：

。
ここで、ビリオンの排除は因子（１＋αＩｇ（ｔ））により増進され、ここでＩｇ（ｔ）は測定された血漿中の抗−ｇｐ４１ ＩｇＭ、抗−ｇｐ４１ ＩｇＧの濃度または両方の免疫グロブリンの濃度の合計のどちらかである。α＝０である場合、オプソニン化の効果は無い。

ウイルスの中和における抗体の作用をモデル化するため、方程式（１）における感染性定数ｋを因子（１＋βＩｇ（ｔ）により減算した。ここで、β＝０である場合、抗体に仲介されるウイルスの中和は無い。最後に、抗体依存性細胞性細胞傷害作用または補体に仲介される溶解による感染した細胞の喪失の速度を増進させる抗体の可能性を組み込むため、δを因子（１＋γＩｇ（ｔ））により増大させた。γ＝０である場合、増進される死は無い。

ｔ＝０の時間として選ばれたＴ_０において、定義により血漿ＶＬは１００コピー／ｍｌである。Ｔ_０までにいくらかのＣＤ４＋の枯渇が起こっていた可能性があるが、単純化のため、感染していない細胞のレベルはまだ１０^６細胞／ｍｌであると仮定する。Ｔ_０における感染した細胞の数は、予備的適合に基づいて１または１０細胞／ｍｌのどちらかであると見積もられた。この感染した細胞の低い数は、Ｔ_０までにほとんどＴ細胞の枯渇が無いという仮定を支持する。

標的細胞限定モデルおよび抗体の作用を含んだその３種類の変形を、Ｉｇ（ｔ）に関する測定された抗−ｇｐ４１の濃度へのスプライン適合を用いて、それぞれの血漿提供者のＶＬデータに適合させた。ＶＬデータへの適合は非線形最小二乗法を用いて行われ、ここでそのモデルからのｌｏｇ_ｅＶを測定されたＶＬのｌｏｇ_ｅに適合させた。Ｆ検定を用いて、標的細胞限定モデルまたは３種類の変形の１種類のどちらがそのデータに最もよく適合するかを決定した。提供者９０３２に関して、最もよく適合した標的細胞限定モデルは、ＶＬが最大であった時点において最大値に達しないために残差の平方和にペナルティー関数が加えられない限り非常に乏しいそのデータへの適合を与えた。すなわち、そのデータにおいて、およびそのモデルにおいてＶＬが最大であった時間の間の差の平方に等しい、最小化されるべきその関数に追加の項を加えた。

トリニダードコホートから選択された対象におけるＭＮ中和抗体の開発−中和アッセイ：ｃＭＡＧＩアッセイ。
以前に記述された(Doria-Rose et al, J. Med. Primatol. 32:218-228 (2003))ものを少し修正してアッセイを行った。簡潔には、血清の系列希釈液をウイルスと共に１時間保温し、次いでｃＭＡＧＩ細胞の２通りのウェルに添加した。２日後に、固定および染色された細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現を測定することにより細胞における感染性を評価した。［（Ｖｏ−Ｖｎ）／Ｖｏ］×１００によりパーセント中和を算出し、ここでＶｎは抗体の存在下でのウイルスの感染性であり、Ｖｏは抗体の非存在下でのウイルスの感染性である。ウイルス ＨＩＶ−１_ＭＮは、国立衛生研究所、国立アレルギー・感染症研究所エイズ部門、ＡＩＤＳ試薬の研究および寄託プログラム（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）を通して得た。

結果
血漿提供者コホート。米国（クレードＢ）からのＨＩＶ−１血清転換血漿提供者を、ＨＩＶ−１感染における最も早期の抗体事象に関して試験した。これらの対象は３日ごとに血漿を提供し、その血漿単位（ｐｌａｓｍａ ｕｎｉｔｓ）はＨＩＶ−１、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎に関する検査が完了するまで数週間保管された（１９）。感染症に関して一旦陽性であると、血漿試料の提供は中止された；従って、これらの血漿提供者の細胞も長期追跡調査も入手できない。その米国の血漿提供者コホートの分析は、ウイルスＲＮＡが伝染において最初に検出された定められた時点に関する最も早いＨＩＶ−１抗体応答の計算を提供した。それぞれの提供者のパネルを単一の基準時間に整列させるために、ＶＬの軌跡がアッセイの下方検出限界（１００ＨＩＶ−１コピー／ｍｌ）と交差する最初の時点を表す時間ゼロ（Ｔ_０）を確立した（図１Ａ）。検出可能な血漿ウイルス血症の開始であるＴ_０はウイルスの伝染のおおよそ１０日（７〜２１日の範囲）（７，１１，１４，２１，４０，５２）後であり、ＨＩＶ−感染の暗黒期の終了を表す。このコホートからの試験した血漿試料は、検出可能なウイルス血症の開始の最初の２０日前および最初の２０日後以内の試験に関する最も高頻度な試料採取を有していた（図１Ｂ）。

伝染後の最初のＩｇＧ抗−Ｅｎｖ応答。最も早期の抗体が検出されたことを確実にするため、標準化したＥＬＩＳＡおよびより高感度なＬｕｍｉｎｅｘ定量的抗体アッセイの両方を利用した。抗−ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ＩｇＧの測定のためのＥＬＩＳＡに関する感度の下方のレベルは２．２ｎｇ／ｍｌであり、抗−ＨＩＶ−１ ＩｇＧの測定のためのＬｕｍｉｎｅｘアッセイの感度のより低いレベルは０．２ｎｇ／ｍｌであった。最初の抗体応答の同定のため、自己由来のコンセンサスＢおよびクレードＢ野生型Ｅｎｖを抗原として試験した。非Ｅｎｖ抗原に関して、全ての抗原は野生型クレードＢであった。コンセンサスＢ Ｅｎｖ抗原が最も早期の抗体を検出したことを実証するため、ならびに４人の血漿提供者からの自己由来Ｅｎｖ抗原、ｇｐ１４０、およびＥｎｖ ｇｐ１２０ Ｖ３ペプチドを用いてより早期の抗体応答を検出することができるのかどうかを決定するため、対象を生成し、血漿Ｅｎｖ抗体を検出する能力に関してコンセンサスＢ ＥｎｖまたはＶ３ペプチドと比較した。最初に、コンセンサスまたは野生型のクレードＢ Ｅｎｖを用いて、ＨＩＶ−１の伝染の後の最も早期の検出可能な抗−Ｅｎｖ ＩｇＧ血漿抗体応答はエンベロープｇｐ４１に対してであることが分かり、Ｔ_０の１３．０日（中央値）後に起こった。図２Ａは、より後でありより様々なｇｐ１２０に対する抗体応答のタイミングと比較して、より早い抗−ｇｐ４１抗体応答のタイミングを図説する（ｐ＜．０１）。ここで試験したＴ_０後１２〜６７日間の追跡調査期間の間に対象の３３％において起こったｇｐ１２０抗体応答とは対照的に、ｇｐ４１に対する抗体は対象の９０％において１８日目までに発現した（ＫＭの推定値は１００％、２人の対象は、彼らがＴ_０後１２日目において追跡調査から失われたため検閲された）（表１）。２種類の追加の野生型クレードＢ ｇｐ１２０エンベロープタンパク質：ＪＲＦＬおよび８９．６ ｇｐ１２０ Ｅｎｖを調べた際には、抗−ｇｐ１２０抗体応答のタイミングに有意な差は無かった（示していない）。図２Ｂは、ＨＩＶ−Ｉ ｐ２４、ｐ５５、ｐ６６、ｐ１７およびｐ３１ ＨＩＶ−１タンパク質に対する抗体の出現の時間と比較した、ｇｐ４１およびｇｐ１２０抗体の出現の中位時間を示す。それぞれの特異性の抗体のタイミングの対比較は、ＨＩＶ−１の構造的構成要素の抗体のタイミング（抗−Ｇａｇ）はＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗体のタイミングよりかなり遅いことを示した。

米国血漿提供者において検出された様々な抗−Ｅｎｖ抗体応答のタイミングの要約を表１において示す。ｇｐ４１に対して誘発された第１抗体に関して、ｇｐ４１応答の１３／１９（６８％）がｇｐ４１の免疫優性領域を含んでおり、初期ｇｐ１２０の血漿提供者の７／７がＶ３ループに位置づけることができる応答を含んでいた（すなわち、伝染の最初の４０日以内にｇｐ１２０抗体を有した血漿提供者の１００％はＶ３抗体も有していた）。米国血漿提供者の対象において（Ｔ_０後４０日以内に）全く出現しなかった抗体は、抗−ＭＰＥＲ（中和性および非中和性）抗体、ＣＤ４結合部位抗体（ＣＤ４ｂｓ）およびＣＤ４誘導抗体（ＣＤ４ｉ）であった。容易に中和されるＴｉｅｒ１（３７）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ偽ウイルス、例えばＢ．ＳＦ１６２に対する中和抗体、および抗体依存性の細胞に仲介されるウイルス阻害（ＡＤＣＶＩ）活性（２９）も、同様にＴ_０後の最初の４０日以内に出現しなかった（データは示していない）。ＡＤＣＶＩは急性感染の後期の間に存在することが以前に報告されており、従って血漿提供者の対象における急性ウイルス血症の間のここで調べられた時点は、ＡＤＣＶＩの発現のおそらく直前である（２０）。予想されたように、ビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡにより測定した際に広く中和する抗体２Ｆ５、４Ｅ１０、１ｂ１２および２Ｇ１２に類似した特異性を有する広く中和する抗体も、Ｔ_０後の最初の４０日の間に出現しなかった（示していない）。

アイソタイプ特異的ｇｐ４１抗体応答の分析。ＩｇＧ抗体は免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラススイッチの後に産生され、古典的にはＩｇＭ抗体の後に産生される。ＨＩＶ Ｅｎｖ特異的ＩｇＭを、組換えｇｐ４１、ｇｐ１２０ならびにコンセンサスＢおよびグループＭコンセンサスｇｐ１４０タンパク質抗原を用いるＬｕｍｉｎｅｘアッセイの使用に関してアッセイした。ＩｇＧ応答の様に、Ｅｎｖに対する第１ＩｇＭ抗体もｇｐ４１のみを標的とした。ＨＩＶ−１−特異的ＩｇＭ抗体の出現の中位時間はＴ_０後１３日（５〜１８日の範囲）であった。この試験において利用されたカスタム抗−ＩｇＭ ＥＬＩＳＡは、最初の遊離のＨＩＶ特異的抗体の検出に関して、第３世代の市販のＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ Ａｎｔｉ−ＨＩＶ １／２ ＥＩＡ、イリノイ州アボットパーク）と同等に高感度であった。その２種類のアッセイ間の第１抗体検出のタイミングにおける違いは有意では無かった（検出された日における中央値の差＝０、ｐ値＝０．６６、ウィルコクソン符号順位検定）。

４種類の自己由来ｇｐ１４０エンベロープを、伝染した、または起因ウイルス（３５）を表す４人の異なる血漿提供者の対象（Ｐｔｓ．６２４６，６２４０，９０２１，６３５２１）からｇｐ１４０Ｃタンパク質オリゴマーとして発現させ、４種類の対象を血漿抗体結合アッセイのための標的として自己由来Ｅｎｖ Ｖ３ループペプチドを用いて試験した。そのｇｐ１４０ Ｅｎｖの内の３種類は、コンセンサスＥｎｖを用いて抗体応答が検出された対象から選ばれ、一方で検出可能な抗−ｇｐ４１応答を有しなかった１人の対象からｇｐ１４０を発現させた。単一の提供者からの、自己由来およびコンセンサスクレードＢ Ｅｎｖ（ＣｏｎＢ）に対するＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡに関する代表的な例を示す（図３Ａ〜３Ｃ、および図１０）。自己由来Ｅｎｖおよび自己由来Ｖ３ペプチドの両方を用いた場合（示していない）、グループＭコンセンサスＥｎｖまたはコンセンサスＢ Ｖ３ペプチドを用いて検出されたＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答と比べて、より早期のＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答を検出することはできなかった。興味深いことに、コンセンサスＥｎｖを用いて試験した場合、自己由来エンベロープに対し、ｇｐ４１抗体応答の大きさがより大きかった。

Ｉｇのクラススイッチのパターンを、血漿の試料採取が抗−ｇｐ４１ ＩｇＭおよびＩｇＧの最初の出現を決定するのに十分に早い、血漿提供者（１５人の対象）、４人のクレードＢ ＣＨＡＶＩ ００１の対象において、およびトリニダード／トバゴコホートからの３人のクレードＢ ＡＨＩの対象において調べた（実験の詳細；図９参照）。図４は、血漿提供者コホートにおける連続的なクラススイッチ速度論（図４Ａ）または同時のクラススイッチ速度論（図４Ｂ）のどちらかを有する代表的な対象を示す。両方の対象において、ＩｇＭ応答は一過性であり、２０〜４０日の期間にわたって減衰し、一方でＩｇＧ応答は同じ期間にわたって上昇した。抗−ｇｐ４１ ＩｇＭ応答は対象の９／２２（４１％）においてＩｇＧ応答よりも早く出現した；しかし、対象の１３／２２（５９％）において、ＩｇＭ抗−ｇｐ４１はＩｇＧおよびＩｇＡ抗−ｇｐ４１抗体と同時に検出された（図４Ｃ）。ｇｐ４１免疫優性ペプチドに対する抗−ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ応答は、３種類のアイソタイプの同時出現が潜在的に異なるｇｐ４１エピトープへの応答によるものである可能性があるのかどうかを決定するために、抗−ｇｐ４１ ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡの同時出現を有する対象６２４６においても試験された。抗−免疫優性ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡはＴ_０の１０日後に同時に検出され、これはこの対象において抗体の同時出現が多数のｇｐ４１エピトープへの抗体応答の発現のみに原因を帰することができなかったことを示している（示していない）。同時のＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体応答がエンベロープに特有であるのか、またはむしろ他のＨＩＶ−１タンパク質に対する応答においても起こるのかどうかを決定するため、ｐ５５ Ｇａｇに対するアイソタイプ抗体応答のパターンも決定した。ｐ５５ Ｇａｇに対するＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体も、ｇｐ４１ Ｅｎｖに対するＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の同時出現を有していた対象において同時に検出された（図４Ｄ）。

ＡＨＩにおける免疫複合体の検出。より早期の抗体が作られているが血漿中には無く、むしろビリオン−ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体複合体の形でのみ存在しているのかどうかを決定するため、米国血漿提供者のパネルをビリオンに結合した抗体の形でのより早い抗体応答に関してアッセイした。

試験した十分に高い血漿ウイルスＲＮＡレベルを有する対象の６／６において、ビリオンに結合したＩｇＧまたはＩｇＭ抗体のどちらかを含む免疫複合体が検出された（図５）。免疫複合体は、Ｔ_０後８日（範囲：５〜１４日）の中位時間において検出された。免疫複合体の検出は、市販のＥＬＩＳＡおよびカスタムＥＬＩＳＡ両方による遊離抗体の検出に中央値で５日（５〜７日の範囲）先行していた（表２）。ビリオン−抗体複合体は、同時または連続的Ｉｇアイソタイプ速度論のどちらを有する対象においても検出され、これは早期の免疫複合体の存在はおそらくＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗−ｇｐ４１アイソタイプの同時検出を説明しないことを示唆している。

ＩｇＧ免疫複合体の検出は、プロテインＧカラムを用いてビリオンに結合した抗体を捕捉し、続いてビリオンを溶解してウイルスＲＮＡを測定する、検出の第２アッセイ（示していない）により確かめられた。ＩｇＧ免疫複合体の測定のための両方の方法を用いて、免疫複合体の出現および減少の同じ速度論が観察された（示していない）。まとめると、これらのデータはＴ_０後の８日目における、ならびに遊離の血漿抗−ＨＩＶ ＩｇＭおよびＩｇＧの出現の前の抗−ビリオンＩｇＭおよびＩｇＧのより早期の産生を示唆している。ＩｇＭおよびＩｇＧビリオン免疫複合体両方の同時出現は、これらの対象における抗−ビリオンＩｇＭおよびＩｇＧの同時誘導を示唆しているか、または現行のアッセイでは検出できない特異性を有するＨＩＶビリオン構成要素に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のさらに早期の誘導を示しているかのどちらかである。免疫複合体の検出の低下は、細網内皮細胞系による排除によるものである可能性がある。これらの抗体−ビリオン複合体の検出は低下するが、ウイルス（抗原）および抗体はまだ存在するのは興味深い。免疫複合体において結合している抗体の特異性のさらなる研究およびそれらが抗原提示細胞への結合を可能にすることにより感染性を変えることができるのかどうかは、研究中である。

ＡＨＩ抗−ｇｐ４１ Ｅｎｖ抗体は補体を活性化する。ＡＨＩにおける抗体の重要な機能的構成要素である可能性があるものは、補体を固定するそれらの能力である。早期の抗−ｇｐ４１抗体は血清の補体を結合することができるかどうかに関する決定が行われた。６人の米国血漿提供者からの血漿を、補体活性化／ＣＲ２への結合に関して、ＨＩＶ−１ビリオンと共培養したｈＰＢＭＣを用いて調べた。補体を活性化する結合抗体は、図３に示したように、血漿抗体が検出された全ての時点で全てのパネルにおいて存在していた。さらに、補体を活性化する抗体の出現の速度論は、ｇｐ４１結合抗体と同じ速度論に従っていた。実験室適応ＨＩＶ−１株（Ｂ．ＳＦ１６２）および早期に伝染したウイルス株（Ｂ．ＱＨ０６９２）の両方を抗体および補体の標的として調べ、それぞれのウイルスについて類似の結果が得られた（図６）。

米国血漿提供者におけるＨＩＶ−１の伝染の後のポリクローナルＢ細胞活性化。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ１２０はポリクローナルＢ細胞活性化因子であること（３）、Ｉｇ ＶＨ３に超抗原として結合すること（２３）、およびポリクローナルＩｇのクラススイッチを誘導すること（２８）が示唆されている。慢性ＨＩＶ−１感染を有する患者はポリクローナル高ガンマグロブリン血症を有しており（３６）、いくつかの研究が早期ＨＩＶ−１感染における高ガンマグロブリン血症を報告している（４７，５６）。ポリクローナルＢ細胞活性化がＨＩＶ−１の伝染した／起因Ｅｎｖに対する初期抗体応答の間に起こるのかどうかを調べるため、定量的なＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡのレベルを米国血漿提供者における最初および最後の血漿試料において測定した。血漿提供者パネルにおいてＡＨＩの間にＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡの有意な上昇は無かった（図７Ａ）。同様に、それぞれの提供者パネルにおける最後の血漿試料（Ｔ_０後２５〜４１日の範囲）を、次の自己抗体：ＳＳＡ／Ｒｏ、ＳＳＢ／Ｌａ、Ｓｍ、ＲＮＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ−１、二本鎖ＤＮＡ、セントロメアＢ、およびヒストンに関して分析し、全てがこれらの特異性全てに関して陰性であった（示していない）。しかし、試験した１９人の血漿提供者の試料および１０人のＣＨＡＶＩ ００１急性感染コホートの対象の、リウマチ因子自己抗体（ＩｇＧと反応するＩｇＭ抗体）に関するスクリーニングにおいて、８／２９（２８％）はＨＩＶ−１の伝染後にリウマチ因子に関して試験結果が陽性であり（図７Ｂ）、それらのおおよそ半分は急性ウイルス血症の間の最初の検出後にＲＦ抗体のレベルの低下を示した。従って、一部の対象において、急性ＨＩＶ−１感染の間のＢ細胞活性化は結果として自己抗体、リウマチ因子の産生をもたらし得る（２６）。

急性ウイルス負荷速度論を有する初期のｇｐ４１抗体応答のモデル化およびウイルスの配列の進化に対する抗体の圧力の評価。ＨＩＶ−１のウイルス負荷（ＶＬ）の制御に対する初期抗−ｇｐ４１抗体応答の作用を決定するため、早期ウイルス動態の数学的モデル化を用いた。最初に、抗体の作用を含まない標的細胞限定モデル（５３）を用いて、Ｔ_０後の最初の４０日間にわたって得られた血漿提供者のＶＬデータを、これらの期間にわたって完全なＶＬおよび抗体データの両方が入手可能である６人の提供者（６２４０、６２４６、９０３２、９０７７、９０７９および１２００８）に関して分析した。９０３２を除く全ての提供者に関して、標的細胞限定モデルは実験的に決定されたＶＬデータとの良好な一致を与えた（図８）。次いで抗体のオプソニン化、抗体に仲介されるウイルスの中和、または抗体に依存するＨＩＶ−１感染細胞の喪失による増進されたビリオン排除を含むこのモデルの３種類の変形を、その同じデータに当てはめた。これらのモデル（実験の詳細を参照）において、これらの作用の仲介における抗−ｇｐ４１ ＩｇＭ、ＩｇＧの測定されたレベルまたはＩｇＭおよびＩｇＧの合計を含めた。抗−ｇｐ１２０の方向付けられた抗体は、それらは試験した期間の間に全ての対象には出現しなかったため、およびそれらが出現した場合それらは抗−ｇｐ４１抗体よりも中位時間で１５日遅く出現したため、そのモデルには適合しなかった。提供者９０３２を除く全ての場合において、抗体に仲介される作用を含めることはモデルの適合を向上しなかった（表３）。従って、患者の大部分に関して、基本的な標的細胞限定モデルはそのデータと最も適合性があり、すなわち、抗ｇｐ４１ ＩｇＧ、ＩｇＭのどちらかまたは両方を含む体液性免疫応答を含めることは、Ｔ_０後の最初の４０日間に観察されたウイルス速度論へのそのモデルの適合を向上させない。これは、ＡＨＩにおける早期には、標的細胞限定または細胞に仲介される応答のどちらかがウイルス負荷の制御において支配的な役割を果たしていることを示唆している。この考えを支持して、抗−ｇｐ４１ ＩｇＧの規模およびウイルス負荷の減衰速度の間には統計的に有意な関連は確認されなかった。ウイルス負荷の減衰速度および最初の抗体の上昇までの時間の間にも統計的に有意な関連は確認されなかった。

血漿提供者における、および３種類の追加のＡＨＩコホートにおけるＣＤ４を誘導可能な（ＣＤ４ｉ）抗体、ＣＤ４結合部位抗体、および非中和性クラスターＩＩ（ＭＰＥＲ）ｇｐ４１抗体の個体発生は、伝染後６〜１２ヶ月続いた。伝染後のＶＬの下り勾配の間の抗体応答の分析のため、異性間性交での伝染を有するトリニダード／トバゴからの１２人のクレードＢの対象、南アフリカからの１４人の急性のクレードＣの対象（ＣＡＰＲＩＳＡコホート）（２４）、および１０人のクレードＢの米国のＡＨＩの対象（３人は未処理、７人は抗レトロウイルス処置を受けた、ＣＨＡＶＩ ００１コホート）を試験した。トリニダードトバゴならびにＣＨＡＶＩ ００１コホートにおける対象の亜集団からのこの試験で用いられた試料の、急性期のウイルス速度論および分布を図９において示す。抗−ｇｐ４１抗体を産生するＨＩＶ−１感染に対する初期のＢ細胞応答の後、抗−ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ Ｂ細胞応答は最終的には他のＥｎｖ特異性を含むように広がった。ＭＰＥＲ ｇｐ４１に結合する抗体（クラスターＩＩ抗体）（６３）は、中和性（例えばＭａｂ ２Ｆ５、Ｚ１３、４Ｅ１０）または非中和性（例えばＭａｂ ２６７Ｄ、１２６−６、１３Ｈ１１）のどちらかであることができる（（２）において概説されている）。非中和性抗−ｇｐ４１ ＭＰＥＲ抗体は一般に感染した対象の約８０％において作られているが（２）、広く中和するＭＰＥＲ抗体はまれにしか作られていない（２７）。ＣＤ４ｉ抗体は共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合部位で、またはその近くで結合し、二価抗体は共受容体結合部位の中に収まることができないため、一般にｓＣＤ４がインビトロ中和アッセイに添加された後にのみＨＩＶ−１を強力に中和する（１５）。広く中和するＣＤ４ＢＳ抗体もまれにしか作られない（３８）。これらの３種類の抗−Ｅｎｖ特異性に関する以前に記述されたアッセイを、血漿提供者パネル（Ｔ_０の４０日後まで追跡調査された）を調べるために、さらにクレードＣ ＣＡＰＲＩＳＡ（２４）およびクレードＢトリニダード／トバゴ（８）の急性ＨＩＶ−１感染コホート（共に伝染の６〜１２ヶ月後まで追跡調査された）における選択された対象からの一連の血漿試料を調べるために用いた。述べたように、ＣＤ４ｉ、ＣＤ４ＢＳ、および非中和性クラスターＩＩ ｇｐ４１抗体はＴ_０後の最初の４０日の間は作られない（表１）。ＣＡＰＲＩＳＡおよびトリニダード／トバゴＡＨＩコホートにおいて、ＣＤ４ｉ抗体、ＣＤ４結合部位抗体および非中和性クラスターＩＩ ＭＰＥＲ ｇｐ４１抗体は、急性感染の研究に登録された５から１０週間後までに、おおよそ同時に生じた（図１１）（２４）。

血漿提供者、ＣＡＰＲＩＳＡおよびトリニダードＡＨＩコホートにおける抗−ＨＩＶ−１異種Ｔｉｅｒ１および自己由来中和抗体応答の評価。前に述べたように、高度に中和感受性のｔｉｅｒ１クレードＢウイルスＳＦ１６２．ＬＳを用いると、血漿提供者においてＴ_０の４０日後までの間中和性の抗体応答は検出されなかった。ＨＩＶ−１ ＭＮに対する異種ｔｉｅｒ１中和抗体はトリニダード／トバゴコホートにおいて感染の８週間後に早くも存在しており（表４）、自己由来Ｖ３ペプチドが異種ＨＩＶ−１ ＭＮの中和に競合したため（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｌ．、未公開）、主にＶ３に方向付けられているようだった。自己由来中和抗体は、トリニダード／トバゴクレードＢコホートにおいて伝染の時点から中央値で３２週間後に生じ（Ｔｏｍａｒａｓ， Ｇ．Ｄ．， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｌ．、未公開）、ＣＡＲＰＩＳＡクレードＣコホートにおいて伝染後平均１９週の時点で生じた（２４）。

まとめると、ＨＩＶ−１を消滅させるための免疫応答に関するチャンスは、伝染の瞬間からＨＩＶ−１に感染した細胞の潜伏プールの確立までに存在する。伝染した／起因ウイルスに対する初期の免疫応答を研究するのに重要な時間はＨＩＶ−１感染の暗黒期（伝染から血漿ウイルスの最初の出現までの時間）であるが、現在までこの期間はロジスティックに分析するのが難しかった。ＨＩＶ−１の伝染のすぐ後のＢ細胞応答を調べるため、急性感染におけるＨＩＶ−１の血漿ウイルス負荷（ＶＬ）の急上昇の直前、間、および後の時点において頻繁な血漿試料が入手可能である米国血漿提供者において、自己由来およびコンセンサスＥｎｖに対するエンベロープ特異的抗体応答を決定し、抗体の作用を血漿ウイルス血症の速度論に基づいてモデル化した。最初の検出可能なＢ細胞応答は血漿ウイルス検出の８日後に免疫複合体の形であり、一方で最初の遊離の血漿抗−ＨＩＶ−１抗体はｇｐ４１に対するものであり、血漿ウイルスの出現の１３日後に出現した。それに対し、エンベロープｇｐ１２０−特異的抗体はさらに１４日遅れた。最も早期のウイルス動態の数学的モデル化を行い、血漿ＶＬにより評価されるインビボでのＨＩＶの複製に対する抗体の影響を決定した。初期の抗−ｇｐ４１ ＩｇＧ、ＩｇＭまたは両方の応答をそのモデルに含めることは、血漿ＶＬの早期の動態に有意に影響を与えなかった。これらの結果は、伝染したＨＩＶ−１により誘導される最初のＩｇＭおよびＩｇＧ抗体はビリオンに結合することができるが、急性期のウイルス血症にそれらが自然感染において起こるタイミングおよび大きさにおいてほとんど影響を有しないことを示している。

実施例２
抗−ＩｇＭを９６ウェルマイクロタイタープレート上にコートした。抗体およびウイルスを一緒に前保温し、次いでそのプレートに適用した。結合しなかった抗体およびウイルスを洗浄した後、捕捉された抗体−ウイルス複合体の量を、ＲＴ−ＰＣＲにより定量されたウイルスＲＮＡにより決定した。偽型ＨＩＶ−１ウイルス（ＳＦ１６２）および複製能があるＨＩＶ−１（ＮＬ４−３）をこのアッセイにおいて用いた。ビリオンの捕捉に関する陽性対照は、モノクローナル抗体２Ｇ１２（ＮＬ４−３のコピーされた２８，０００ＲＮＡコピー）およびウイルス複合体に関して陽性であるヒト血漿（９０１５−０２）であった。陰性対照はウイルスのみ（ＳＦ１６２またはＮＬ４−３のみ）および陰性のヒト血漿であった。図１２において示されているように、Ｃ１４ ｍＡｂはＨＩＶ−１ ＳＦ１６２を抗体の最適濃度０．１μｇ／ｍｌで捕捉した。

実施例３
急性ＨＩＶ−１の対象からの精漿を、カスタムＨＩＶ−１ ｌｕｍｉｎｅｘパネルを用いてＨＩＶ−１抗原への結合に関して調べた。ＩｇＡおよびＩｇＭを、ハイスループットプロテインＧ精製によりＩｇＧを枯渇させた、希釈した精漿から測定した。抗原への結合を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の点から測定し、既知の濃度の陽性対照の抗体力価測定に基づいて、濃度測定値（μｇ／ｍｌ）に変換した。

エンベロープＨＩＶ−１特異的抗体は急性感染の早い時点において精漿中で検出される。ＨＩＶ−１特異的ＩｇＧとは対照的に、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ特異的ＩｇＡは感染の急性期の間減少する。一部の人において、まれではあるが、ＨＩＶ−１特異的ＩｇＭが検出される。この対象は異常に高レベル（１００μｇ／ｍｌ）のＨＩＶ−１特異的ＩｇＭ抗体を有する。

実施例４
急性ＨＩＶ−１の対象からの精漿を、カスタムＨＩＶ−１ ｌｕｍｉｎｅｘパネルを用いてＨＩＶ−１抗原への結合に関して調べた。ＩｇＡを、ハイスループットプロテインＧ精製によりＩｇＧを枯渇させた、希釈した精漿から測定した。抗原への結合を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の点から測定し、既知の濃度の陽性対照の抗体力価測定に基づいて、濃度測定値（μｇ／ｍｌ）に変換した。

Ｇｐ４１ Ｅｎｖ ＨＩＶ−１特異的抗体は急性感染の早い時点において精漿中で検出される。一部の人において、ＩｇＡ抗体はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ＭＰＥＲの２Ｆ５エピトープに、その同じエピトープに関する検出可能なＩｇＧ抗体の非存在下で特異的である。

参考文献

上記で引用されている全ての文書および他の情報源を本明細書にそのまま援用する。

表１．個体発生：暗黒期クレードＢコホートにおけるＥｎｖ特異的ＩｇＧ。
^ａＮ＝追跡調査期間の間に上昇を示した血漿提供者の対象の数。^ｂウイルス負荷が１００コピー／ｍｌに達した最初の日であるＴ_０からの中位時間。^ｃＩＤ＝免疫優性。^ｄ上方信頼限界は無限である（Ｔ_０から６７日より大きい上昇が起こり得る）。

表２．Ｔ_０に関する免疫複合体および遊離のＨＩＶ抗体のタイミング。
^ａＡＢＢＯＴＴ抗−ＨＩＶ １／２ ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、陽性のカットオフ＞１．０。^ｂ社内でのＩｇＭ ＥＬＩＳＡ、Ｏ．Ｄ．抗原−Ｏ．Ｄ．抗原無し、陽性の基準は０．１以上、およびベースラインの３倍以上。^ｃ免疫複合体の定量的リアルタイムＰＣＲにより２００コピー／ｍｌ未満。^ｄＨＩＶ−１ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｕｌｔｒａ、Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ニュージャージー州リンドハースト。ボールド体のフォントは陽性の値を示す。

表３．標的細胞限定モデルおよび抗−ｇｐ４１抗体を含む変形の、早期の血漿ＶＬ速度論データに適合する能力の比較。それぞれの提供者からのウイルス負荷データを、標的細胞限定モデルおよび抗−ｇｐ４１ ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＧ＋ＩｇＭの作用を組み込んだモデルを用いて適合させた。^ａＣＥ＝増進された排除、^ｂＩＤ＝減少した感染性、^ｃＣＤＥ＝増進された細胞死。抗体の作用を含むモデルは１個の追加のパラメーターが含まれ、それは０に設定された場合そのモデルを標的細胞限定モデルにする。Ｆ検定を用いて、抗体を含むモデルのいずれかが標的細胞モデルよりも有意によくＶＬデータに適合するかどうかを決定した。その表は、Ｆ検定からコンピュータで計算されたｐ値を与える。０．０５未満のｐ値は、抗体を含むモデルが標的細胞限定モデルよりもよく適合することを示している。

Claims (21)

1. 次のことを含む、ＨＩＶ ＲＮＡに関して陽性であるが抗−ＨＩＶ抗体に関して陰性である対象を同定する方法であって、以下の：
   ｉ）前記の対象から生物学的試料を得て、
   ｉｉ）前記の試料を、固体支持体に結合させた抗−ＩｇＭ、抗−ＩｇＧ、抗−ＩｇＡまたは抗−Ｃ３Ｄ抗体と、前記の試料中に存在する抗体−ＨＩＶビリオン複合体が前記の抗体に結合することができるような条件下で接触させ、
   ｉｉｉ）前記の固体支持体を、複合体になっていないＨＩＶビリオンが除去されるような条件下で洗浄し、
   ｉｖ）前記の固体支持体を、前記の固体支持体に結合した抗体−ＨＩＶビリオン複合体からのウイルスＲＮＡを測定することができるような条件下で処理し、そして
   ｖ）工程（ｉｖ）から得られたウイルスＲＮＡに関してアッセイする、
   ここで、前記のウイルスＲＮＡの存在は、前記の対照がＨＩＶ ＲＮＡに関して陽性であるが抗−ＨＩＶ抗体に関して陰性であることを示す
   ことを含む、前記方法。
2. 前記の対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
3. 前記の抗体が抗−ヒトＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体である、請求項１に記載の方法。
4. 前記の生物学的試料が血漿試料、血清試料、粘膜試料、尿試料、唾液試料または直腸洗浄液である、請求項１に記載の方法。
5. 前記の粘膜試料が精漿試料または子宮洗浄試料である、請求項４に記載の方法。
6. 前記の固体支持体がＥＬＩＳＡプレートである、請求項１に記載の方法。
7. 工程（ｉｉ）において前記の試料をプロテインＧカラムと接触させる、請求項１に記載の方法。
8. 工程（ｉｖ）において前記のウイルスＲＮＡに関するアッセイのためにリアルタイム逆転写ＰＣＲを用いる、請求項１に記載の方法。
9. 前記の方法がＨＩＶの伝染事象の３週間以内である対照を同定する方法である、請求項１に記載の方法。
10. 対象において抗体−ＨＩＶビリオン複合体を検出する方法であって、以下の：
    ｉ）前記の対象から生物学的試料を得て、
    ｉｉ）前記の試料を、固体支持体に結合させた抗−ＩｇＭ、抗−ＩｇＧ、抗−ＩｇＡまたは抗−Ｃ３Ｄ抗体と、前記の試料中に存在する抗体−ＨＩＶビリオン複合体が前記の抗体に結合することができるような条件下で接触させ、
    ｉｉｉ）前記の固体支持体を、複合体になっていないＨＩＶビリオンが除去されるような条件下で洗浄し、
    ｉｖ）前記の固体支持体を、前記の固体支持体に結合した抗体−ＨＩＶビリオン複合体からのウイルスＲＮＡを測定することができるような条件下で処理し、そして
    ｖ）工程（ｉｖ）から得られたウイルスＲＮＡに関してアッセイし、それにより前記の検出を達成する
    ことを含む、前記方法。
11. 前記の対象がヒトである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記の抗体が抗−ヒトＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩＧＡ抗体である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記の生物学的試料が血漿試料、血清試料、粘膜試料、尿試料、唾液試料または直腸洗浄液である、請求項１０に記載の方法。
14. 前記の粘膜試料が精漿試料または子宮洗浄試料である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記の固体支持体がＥＬＩＳＡプレートである、請求項１０に記載の方法。
16. 工程（ｉｉ）において前記の試料をプロテインＧカラムと接触させる、請求項１０に記載の方法。
17. 工程（ｉｖ）において前記のウイルスＲＮＡに関するアッセイのためにリアルタイム逆転写ＰＣＲを用いる、請求項１０に記載の方法。
18. 図１５Ｆにおいて示されているＣ１４−２の可変重および可変軽鎖を有する精製された抗体、またはそのｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）_２断片。
19. 請求項１８に記載の抗体またはその断片、並びにキャリヤーを含む、組成物。
20. 図１５Ｋにおいて示されているＦ３の重鎖を有する精製された抗体、またはそのｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）_２断片。
21. 請求項２０に記載の抗体、またはその断片およびキャリヤーを含む組成物。

Images