JP2012210187A - Method for condensing cell suspension - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞懸濁液から細胞を分離するための技術に関する。さらに詳しくは、中空糸型分離膜を用いた、細胞懸濁液処理器およびそれを用いた細胞懸濁液の濃縮方法に関する。 The present invention relates to a technique for separating cells from a cell suspension. More specifically, the present invention relates to a cell suspension treatment device using a hollow fiber type separation membrane and a cell suspension concentration method using the same.
細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、体内に移植する方法が用いられている。これら移植に用いる細胞は、移植に適した溶液に懸濁され、また適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から採取した又は体外での培養を経た細胞は、組織由来の夾雑物や培地などを含んでおり、また、細胞が溶液に希釈された状態で採取されることが多い。そこで、移植に用いるためには、夾雑物や培地を取り除き、移植に適した溶液に置換され（洗浄）、移植に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。この目的のため、従来は、遠心分離を用いた洗浄、濃縮操作が広く行われてきた。 In the field of cell medicine, a method is used in which cells collected from a living body are cultured directly or ex vivo and then transplanted into the body. The cells used for transplantation are suspended in a solution suitable for transplantation, adjusted to an appropriate concentration, and transplanted. However, cells collected from a living body or subjected to in vitro culture contain tissue-derived contaminants and culture media, and are often collected in a state where the cells are diluted in a solution. Therefore, in order to use for transplantation, it is necessary to remove impurities and culture medium, replace with a solution suitable for transplantation (washing), and concentrate to a cell concentration suitable for transplantation. For this purpose, conventionally, washing and concentration operations using centrifugation have been widely performed.
たとえば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離装置を用いる方法が開示されている（特許文献１）。 For example, a method of using a centrifugal separator to separate and concentrate regenerative cells from human tissue has been disclosed (Patent Document 1).
また、特許文献２には、細胞懸濁液をろ過する方法として、フィルター膜を遠心する方法が開示されている。 Patent Document 2 discloses a method of centrifuging a filter membrane as a method of filtering a cell suspension.
しかし、このように遠心分離装置を用いる方法は、装置が大型になることや、コストが増大することになり、利用できる施設が限定されてしまうことが懸念される。 However, there is a concern that the method using the centrifuge device as described above increases the size of the device, increases the cost, and limits the facilities that can be used.
これに対して、中空糸型分離膜を用いた細胞懸濁液のろ過に関しては、コンパクトで簡便な装置のものが血漿分離分野において種種提案されている（特許文献３）。しかしながら、上記分離膜は、体内を循環するヒト血液から血漿をろ過し、分離することを目的としており、血液細胞の濃度は大きく変化することはなく、細胞懸濁液の細胞濃度が高まる濃縮は意図していない。また、ヒト体内からの血漿成分の分離であり、早急な血漿のろ過は人体に悪影響を及ぼすため、高いろ過速度も意図していない。 On the other hand, regarding the filtration of cell suspensions using a hollow fiber type separation membrane, various types of compact and simple devices have been proposed in the field of plasma separation (Patent Document 3). However, the separation membrane is intended to filter and separate plasma from human blood circulating in the body. The concentration of blood cells does not change greatly, and the concentration of cells that increase the cell suspension concentration Not intended. Moreover, it is the separation of plasma components from the human body, and rapid filtration of plasma has an adverse effect on the human body, so a high filtration rate is not intended.
一方、中空糸型分離膜を用いた細胞懸濁液のろ過に関して、特許文献４のような細胞懸濁液から高いろ過速度を維持したままろ過を可能とする方法が開示されている。しかしながら、該分離膜は、ろ過液の高い生産性を意図しており、分離後の細胞へのダメージや細胞のロスなくろ過することに関しては考慮されていない。 On the other hand, regarding filtration of a cell suspension using a hollow fiber type separation membrane, a method that enables filtration while maintaining a high filtration rate from a cell suspension as disclosed in Patent Document 4 is disclosed. However, the separation membrane is intended for high productivity of the filtrate, and no consideration is given to filtration without damage to cells or loss of cells after separation.
本発明の目的は、細胞懸濁液（ただし、ヒト血液は除く）を濃縮するに際して、簡便、低コストな方法で、短時間に、細胞をロスすることなく、さらに細胞へのダメージが少ない濃縮方法を提供することである。 The object of the present invention is to concentrate a cell suspension (excluding human blood) with a simple and low-cost method in a short time without losing cells and with little damage to the cells. Is to provide a method.
本発明者らは、上記課題について検討した結果、特定の中空糸分離膜を用いることで、目的とする細胞を効率よく濃縮できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、細胞懸濁液（ただし、ヒト血液は除く）の濃縮方法であって、細胞懸濁液を受け入れるための細胞懸濁液入口と、該細胞成分を実質上含まない液体を排出するためのろ液出口と、細胞懸濁液を排出するための細胞懸濁液出口と、前記細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された分画分子量が１０００ｋＤ以下の中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いて濃縮する方法である。 As a result of examining the above problems, the present inventors have found that the intended cells can be efficiently concentrated by using a specific hollow fiber separation membrane, and the present invention has been completed. That is, the present invention is a method for concentrating a cell suspension (excluding human blood), comprising a cell suspension inlet for receiving a cell suspension and a liquid substantially free of the cell component. A filtrate outlet for discharging, a cell suspension outlet for discharging a cell suspension, and a molecular weight cut-off of 1000 kD or less disposed between the cell suspension inlet and the cell suspension outlet. This is a method comprising a hollow fiber type separation membrane and concentrating using a cell suspension treatment device which is an internal pressure filtration method.
さらには、該中空糸型分離膜がポリエーテルスルホン又は酢酸セルロースからなる細胞懸濁液処理器を用いる細胞懸濁液の濃縮方法である。 Furthermore, the cell suspension concentration method uses a cell suspension treatment device in which the hollow fiber type separation membrane is made of polyethersulfone or cellulose acetate.
さらには、該中空糸型分離膜に線速２００〜１０００ｃｍ/分で細胞懸濁液を供給することを特徴とする細胞懸濁液の濃縮方法である。 Furthermore, the cell suspension concentration method is characterized in that the cell suspension is supplied to the hollow fiber type separation membrane at a linear velocity of 200 to 1000 cm / min.
本発明によれば、細胞懸濁液から細胞を分離するに際して、簡便で、効率的に濃縮できさらに細胞へのダメージが少ない分離が出来る。更に加えれば、本発明の細胞懸濁液処理器は無菌的な閉鎖系で処理することも可能であり、濃縮された細胞は細胞治療用として提供することが可能である。 According to the present invention, when separating cells from a cell suspension, the cells can be easily and efficiently concentrated and further separated with little damage to the cells. In addition, the cell suspension processor of the present invention can be processed in a sterile closed system, and concentrated cells can be provided for cell therapy.
以下に、本発明について説明する。 The present invention will be described below.
本発明の細胞懸濁液処理器は、図１に示すとおり例示されるが、これに限定されるものではない。筒状容器１はストレートな胴部２とその両側の頭部３、ヘッダー部９からなり、頭部３、ヘッダー部９にはろ過液出口４が備えられている。このろ過液出口は一方に備えられていても、両端に備えられていてもよい。この例ではヘッダー部９に細胞懸濁液入口８ａ、頭部３には細胞懸濁液出口８ｂが設けられている。該筒状容器１内部には、装填された中空糸型分離膜の束５と、ヘッダー部９の内部に設けられた中空糸型分離膜の束５を容器内部に固定するとともに中空糸型分離膜の開口端６を形成している樹脂層部７、更に頭部３の内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部７および開口端６は、ヘッダー部９（或いは頭部３）に被冠された構造となっており、細胞懸濁液出入口８ａ、８ｂとろ過液出口４が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。 Although the cell suspension processing apparatus of this invention is illustrated as shown in FIG. 1, it is not limited to this. The cylindrical container 1 is composed of a straight body portion 2, head portions 3 on both sides thereof, and header portions 9, and the head portion 3 and header portion 9 are provided with a filtrate outlet 4. The filtrate outlet may be provided on one side or on both ends. In this example, a header 9 is provided with a cell suspension inlet 8a, and a head 3 is provided with a cell suspension outlet 8b. Inside the cylindrical container 1, a bundle 5 of hollow fiber type separation membranes loaded and a bundle 5 of hollow fiber type separation membranes provided inside the header portion 9 are fixed inside the container and hollow fiber type separation is performed. The resin layer portion 7 forming the opening end 6 of the film and the structure equivalent to this provided inside the head portion 3 are provided. The resin layer portion 7 and the open end 6 have a structure covered with a header portion 9 (or head portion 3), and the cell suspension inlet / outlet ports 8a and 8b and the filtrate outlet port 4 are hollow fiber type separation membranes. It is separated by the wall material which comprises, and has a non-continuous structure.
なお、図１に示した例では、各部分を筒状容器の胴部２、頭部３、ヘッダー部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、ヘッダー部９が筒状容器の頭部３に一体化したものや、筒状容器の胴部２と頭部３が別々のパーツから形成されている場合でも、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に細胞懸濁液出入口とろ過液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。 In the example shown in FIG. 1, each part is distinguished as a barrel 2, a head 3, and a header 9 of a cylindrical container, but this is for convenience. Even when the header portion 9 is integrated with the head portion 3 of the cylindrical container, or when the trunk portion 2 and the head portion 3 of the cylindrical container are formed of separate parts, The cell suspension outlet is continuous without being separated by the wall material constituting the hollow fiber type separation membrane, and the cell suspension outlet and the filtrate outlet are further separated by the wall material constituting the hollow fiber type separation membrane. If it has the structure which has, it can take various structures.
本発明の細胞懸濁液処理器には、中空糸型分離膜を数十から数千本程度束ねたものを筒状の容器内に充填していることが好ましい。尚、本発明において、中空糸型分離膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に中空糸型分離膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。 In the cell suspension treatment apparatus of the present invention, it is preferable to fill a cylindrical container with a bundle of dozens to thousands of hollow fiber type separation membranes. In the present invention, the arrangement of the hollow fiber type separation membrane may be linear, bent, or helical, and it is between the cell suspension inlet and the cell suspension outlet. The shape is not particularly limited as long as both ends of the hollow fiber type separation membrane are held.
細胞懸濁液処理器の筒状容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等のブロック共重合体を使用することが好ましい。 As materials for cylindrical containers of cell suspension treatment equipment, acrylonitrile polymers such as acrylonitrile butadiene styrene terpolymer; polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers of tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene, polyvinyl chloride, etc. Halogenated polymer: Polyamide, polyimide, polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene, polymethylpentene and the like can be used. In particular, it is preferable to use a sterilization-resistant material, specifically, a block copolymer such as polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polyimide, polycarbonate, polysulfone, polymethylpentene, and polystyrene.
中空糸型分離膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。 As the material for the resin layer portion for fixing the hollow fiber type separation membrane, general adhesive materials such as polyurethane resin, epoxy resin, and silicon resin can be preferably used.
本発明の細胞懸濁液処理器に用いられる中空糸型分離膜の分画分子量は１０００ｋＤ以下（表面の孔径でいえば、通常０．１μｍ以下）であることが好ましい。分画分子量（あるいは表面孔径）がこれより大きくなると、孔と細胞の接触が強まったり、孔に細胞が入り込んだりすることで、細胞が膜に接着し回収効率が低下する傾向がある。中空糸型分離膜の分画分子量として、より好ましく７５０ｋＤ以下であり、更に好ましくは５００ｋＤ以下である。 The molecular weight cutoff of the hollow fiber type separation membrane used in the cell suspension treatment apparatus of the present invention is preferably 1000 kD or less (usually 0.1 μm or less in terms of the pore size on the surface). When the molecular weight cut off (or the surface pore diameter) is larger than this, the contact between the pores and the cells becomes stronger, or the cells enter the pores, so that the cells adhere to the membrane and the recovery efficiency tends to decrease. The molecular weight cut-off of the hollow fiber type separation membrane is more preferably 750 kD or less, and further preferably 500 kD or less.
本発明に用いられる中空糸型分離膜の樹脂材料は、どのような材料でも好適に用いることができ、例えば、再生セルロース、硝酸セルロースや酢酸セルロースなどのセルロースエステルなどのセルロース系樹脂、ポリアクリロニトリル、ナイロン６６などのポリアミド系の樹脂、ポリエーテルスルホン、エチレンビニルアルコール、ポリスルホン、ポリエチレンやポリプロピレンなどのオレフィン系樹脂、ＰＶＤＦやＰＦＡなどのフッ素系樹脂などが例示される。 As the resin material for the hollow fiber type separation membrane used in the present invention, any material can be suitably used. For example, regenerated cellulose, cellulose resin such as cellulose ester such as cellulose nitrate and cellulose acetate, polyacrylonitrile, Examples thereof include polyamide resins such as nylon 66, polyethersulfone, ethylene vinyl alcohol, polysulfone, olefin resins such as polyethylene and polypropylene, and fluorine resins such as PVDF and PFA.
この中でも、好ましくはセルロース系樹脂、ポリエーテルスルホン又はポリスルホンが好適に用いることができる。更に好ましくは、酢酸セルロースやポリエーテルスルホンが好適に用いることができる。中空糸膜などの膜材料において、膜のもつ親水性、疎水性の物性は膜表面に付着する微粒子、蛋白質、細胞などの成分の付着しやすさやはがれやすさに影響を与え、親水性が高い材料のほうがこれら成分の付着を低減できるといわれている。親水性の高い材料からなる中空糸型分離膜を用いることで、微粒子、蛋白質、細胞などの膜表面に付着や膜への目詰まりを低減でき、高い回収率や高いろ過速度が期待できる。 Of these, cellulose resin, polyethersulfone, or polysulfone can be preferably used. More preferably, cellulose acetate and polyethersulfone can be suitably used. In membrane materials such as hollow fiber membranes, the hydrophilic and hydrophobic physical properties of the membrane have an effect on the ease of adhesion and removal of components such as fine particles, proteins, and cells that adhere to the membrane surface, and are highly hydrophilic. It is said that the material can reduce the adhesion of these components. By using a hollow fiber type separation membrane made of a highly hydrophilic material, it is possible to reduce adhesion and clogging to the membrane surface such as fine particles, proteins and cells, and a high recovery rate and a high filtration rate can be expected.
また、本発明に用いられる中空糸型分離膜の膜表面に親水性の材料をコーティングしてもよい。コーティングすることで膜表面の親水性を改善でき、蛋白質や細胞の膜への付着を低減し、回収効率を高くすることも期待できる。 Further, a hydrophilic material may be coated on the membrane surface of the hollow fiber type separation membrane used in the present invention. Coating can improve the hydrophilicity of the membrane surface, reduce the adhesion of proteins and cells to the membrane, and can also be expected to increase the recovery efficiency.
本発明に用いられる中空糸型分離膜の内径は１００μｍ〜２０００μｍであることが好ましく、１００μｍ〜１５００μｍがより好ましくは、２００μｍ〜１５００μｍが更に好ましい。膜の内径が１００μｍより小さくなると、細胞回収後にも膜内に濃縮された細胞懸濁液が残ってしまう恐れがあり、効率的な細胞の回収ができなくなる。また、中空糸型分離膜の内径は２０００μｍ以下であることが好ましい。２０００μｍより大きくなると、ろ過に必要な膜面積を実現するためには非常にたくさんの中空糸型分離膜を用意する必要があり、コスト等の増大が懸念される。 The inner diameter of the hollow fiber type separation membrane used in the present invention is preferably 100 μm to 2000 μm, more preferably 100 μm to 1500 μm, still more preferably 200 μm to 1500 μm. If the inner diameter of the membrane is smaller than 100 μm, a concentrated cell suspension may remain in the membrane even after cell recovery, and efficient cell recovery cannot be performed. The inner diameter of the hollow fiber type separation membrane is preferably 2000 μm or less. When it becomes larger than 2000 μm, it is necessary to prepare a large number of hollow fiber type separation membranes in order to realize a membrane area necessary for filtration, and there is a concern about an increase in cost and the like.
本発明のに用いられる中空糸型分離膜の膜面積は０．０１〜１．０ｍ２の範囲が好ましく、０．０２〜１．０ｍ２の範囲が更に好ましい。膜面積が０．０１ｍ２を下回ると、十分な単位時間あたりのろ過量を得ることができず、１．０ｍ２より大きすぎると細胞懸濁液が中空糸型分離膜内に残存し、回収される細胞数が少なくなることが懸念される。ここで、膜面積とは、中空糸型分離膜のうち、物質のろ過に寄与する有効部分長さ、内径および総本数から求まる内膜面積のことをいう。 Membrane area of the hollow fiber type separation membrane used in the present invention is preferably in the range of 0.01 to 1.0 M 2, more preferably in the range of 0.02~1.0m 2. When the membrane area is less than 0.01 m 2 , a sufficient filtration amount per unit time cannot be obtained, and when it is larger than 1.0 m 2 , the cell suspension remains in the hollow fiber type separation membrane and is recovered. There is concern that the number of cells to be reduced. Here, the membrane area refers to the inner membrane area determined from the effective portion length, inner diameter and total number of the hollow fiber type separation membranes that contribute to the filtration of substances.
本発明に用いられる中空糸型分離膜の長さは、３〜４０ｃｍであることが好ましく、５〜３０ｃｍであることが更に好ましい。中空糸型分離膜の長さが３ｃｍより短いとろ過効率が低下することが懸念され、中空糸型分離膜の長さが４０ｃｍより短長いと、ハンドリングへの影響が懸念される。 The length of the hollow fiber type separation membrane used in the present invention is preferably 3 to 40 cm, and more preferably 5 to 30 cm. If the length of the hollow fiber type separation membrane is shorter than 3 cm, the filtration efficiency may be lowered. If the length of the hollow fiber type separation membrane is shorter than 40 cm, the handling may be affected.
本発明の細胞懸濁液処理器の開口端６の面積は、１〜３０ｃｍ２が好ましく、１〜２０ｃｍ２がより好ましい。開口端６の面積が１ｃｍ２より小さくなると充填できる中空糸数が少ないため、効率的なろ過ができなくなる。開口端６の面積が２０ｃｍ２より大きくなると、細胞懸濁液が均等に中空糸に流入できなくなり効率的なろ過ができなくなる懸念があり好ましくない。 1-30 cm < 2 > is preferable and, as for the area of the opening end 6 of the cell suspension processing apparatus of this invention, 1-20 cm < 2 > is more preferable. When the area of the open end 6 is smaller than 1 cm 2 , the number of hollow fibers that can be filled is small, and thus efficient filtration cannot be performed. If the area of the open end 6 is larger than 20 cm 2, there is a concern that the cell suspension cannot uniformly flow into the hollow fiber and efficient filtration cannot be performed.
本発明によれば、簡便でかつ効率的に細胞を濃縮でき、分離細胞へのダメージが少なく、更には無菌的な閉鎖系で処理することが容易な点から、ヒトに移植される細胞の濃縮に好適に使用することができる。 According to the present invention, cells can be concentrated simply and efficiently, there is little damage to isolated cells, and further, the cells can be concentrated in a sterile closed system. Can be suitably used.
本発明で濃縮し得る細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板など、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞または、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞が例示される。 Examples of cells that can be concentrated in the present invention include artificial pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal cells, adipose-derived stromal stem cells, pluripotency Multipotent biological stem cells such as adult stem cells, bone marrow stromal cells, hematopoietic stem cells, lymphocytes such as T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK cells, NKT cells, regulatory T cells Cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, granulocytes, erythrocytes, platelets, neurons, somatic cells such as myocytes, fibroblasts, hepatocytes, cardiomyocytes, or treatments such as gene transfer or differentiation The cell which performed is illustrated.
中でも顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞に対して好適に用いることができる。 Among them, it can be suitably used for immune cells such as granulocytes, T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK cells, NKT cells, regulatory T cells, macrophages and dendritic cells. .
また、本発明で用いる細胞懸濁液としては、細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。または、上記に例示した細胞を生体外で培養液、例えば、ＤＭＥＭ，α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０や、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養した後の細胞懸濁液が例示される。 The cell suspension used in the present invention is not particularly limited as long as it is a suspension containing cells. For example, fat, skin, blood vessel, cornea, oral cavity, kidney, liver, pancreas, heart, nerve, muscle , Suspensions, blood and bone marrow fluid after enzymatic treatment, crushing treatment, extraction treatment, degradation treatment, sonication, etc. of biological tissues such as prostate, intestine, amniotic membrane, placenta, umbilical cord and filtration Examples thereof include cell suspensions prepared by pretreatment such as treatment, enzyme treatment, decomposition treatment, and ultrasonic treatment. Alternatively, the cells suspended after culturing the cells exemplified above in vitro using a culture solution such as DMEM, α-MEM, MEM, IMEM, RPMI-1640, and stimulating factors such as cytokines, antibodies and peptides. A turbid liquid is illustrated.
また、本発明により分離される細胞は、白血病治療、心筋再生や血管再生、幹細胞疲弊疾患、骨疾患、軟骨疾患、虚血性疾患、血管系疾患、神経病、やけど、慢性炎症、心疾患、免疫不全、クーロン病等の疾患、豊胸、しわとり、美容成形、組織陥没症等の組織増大などの再生医療、Ｔ細胞療法、ＮＫＴ細胞療法、樹状細胞移入療法などの免疫療法、遺伝子導入した細胞を用いる遺伝子療法などに用いることも可能であるが、これらに限定されるものではない。また、分離された細胞をスキャフォールドなどの構造材料に播種して治療に用いることも可能である。 In addition, the cells isolated according to the present invention can be used for leukemia treatment, myocardial regeneration and vascular regeneration, stem cell exhaustion disease, bone disease, cartilage disease, ischemic disease, vascular disease, neurological disease, burn, chronic inflammation, heart disease, immunity Regenerative medicine such as failure, coulomb disease, breast augmentation, wrinkle removal, cosmetic molding, tissue enlargement such as tissue depression, immunotherapy such as T cell therapy, NKT cell therapy, dendritic cell transfer therapy, gene transfer It can be used for gene therapy using cells, but is not limited thereto. In addition, the separated cells can be seeded on a structural material such as a scaffold and used for treatment.
本発明の細胞懸濁液処理器の滅菌は、特に限定されず、γ線滅菌や電子線滅菌やＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。 Sterilization of the cell suspension treatment apparatus of the present invention is not particularly limited, and a sterilization method widely used for sterilization of medical devices such as γ-ray sterilization, electron beam sterilization, EOG sterilization, and high-pressure steam sterilization is preferably used. Can do.
本発明の細胞懸濁液処理器は、細胞懸濁液を線速１５０〜２０００ｃｍ/分で流して用いることが好ましい。より好ましくは線速２００〜１０００ｃｍ/分で用いることが好ましい。線速２００ｃｍ/分以下では、ろ過速度の低下や、細胞回収率の低下が懸念される。線速１０００ｃｍ/分以上では、細胞懸濁液処理器にかかる圧力が大きくなりすぎて、処理器が破壊されたりすることが懸念される。ここで、線速とは細胞懸濁液処理器内の中空糸内空断面を単位時間あたりに通過する細胞懸濁液量で、細胞懸濁液の細胞懸濁液処理器への流入速度（流速）を細胞懸濁液処理器内の中空糸内空の全断面積で除して算出することができる。ここで、本発明におけるろ過速度とは、単位時間、中空糸型分離膜内側の単位面積あたりに中空糸型分離膜よりろ過される溶液量のことである。 The cell suspension treatment device of the present invention is preferably used by flowing the cell suspension at a linear velocity of 150 to 2000 cm / min. More preferably, it is used at a linear velocity of 200 to 1000 cm / min. If the linear velocity is 200 cm / min or less, there is a concern about a decrease in filtration rate and a decrease in cell recovery rate. If the linear velocity is 1000 cm / min or more, there is a concern that the pressure applied to the cell suspension treatment device becomes too high and the treatment device is destroyed. Here, the linear velocity is the amount of the cell suspension that passes through the hollow cross-section of the hollow fiber in the cell suspension treatment device per unit time, and the flow rate of the cell suspension into the cell suspension treatment device ( (Flow rate) can be calculated by dividing by the total cross-sectional area of the hollow fiber in the cell suspension treatment device. Here, the filtration rate in the present invention refers to the amount of solution filtered from the hollow fiber type separation membrane per unit area per unit area inside the hollow fiber type separation membrane.
以下、本発明の細胞懸濁液処理器を用いて細胞を分離する方法を例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更をすることができる。 Hereinafter, the method for separating cells using the cell suspension treatment apparatus of the present invention will be exemplified, but the present invention is not limited to this, and various modifications may be made without departing from the gist of the present invention. Can do.
本発明の細胞懸濁液処理器を用いた細胞懸濁液から細胞の分離（濃縮）では、細胞懸濁液処理器内に備えられた中空糸型分離膜に流入した細胞懸濁液が内圧ろ過により、細胞を実質上含まないろ液が中空糸型分離膜の外側にろ別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液が細胞懸濁液出口より流出する。なお、ここで細胞を実質上含まないろ液とは、その細胞の数が、流入前の細胞懸濁液中の細胞の数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。 In the separation (concentration) of cells from the cell suspension using the cell suspension treatment device of the present invention, the cell suspension flowing into the hollow fiber type separation membrane provided in the cell suspension treatment device is subjected to internal pressure. By filtration, the filtrate substantially free of cells is filtered out of the hollow fiber type separation membrane, and the cell suspension enriched with cell components flows out from the cell suspension outlet. Here, the filtrate substantially free of cells means that the number of cells does not exceed 0.1% of the number of cells in the cell suspension before inflow.
先ず、細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液入口および出口にチューブ等を取り付け（処理器内の中空糸に細胞懸濁液が流入および流出する回路の一部となる）、更に取り付けたチューブを細胞懸濁液が入った細胞バッグなどの容器に連結し、バッグなどの容器と細胞懸濁液処理器との間で細胞懸濁液が循環できるようにする。なお、液を循環させるために、ポンプなどの機械をこの回路に介在させることが考えられる。また、ろ過液出口には廃液タンクなどに連絡されたチューブを連結しておくことが好ましい。このとき、回路の全体の取り付けは、無菌的な環境下で行われることが好ましい。また、この際に、細胞懸濁液出口側の流路を狭くするなどして、分離膜に圧力をかけることもできるし、ろ過側のチューブにポンプ等を用いて圧力をかけながらろ過を行ってもよく、一般的に中空糸型分離膜で用いられる各種ろ過方法を併用することができる。 First, a tube or the like is attached to the cell suspension inlet and outlet of the cell suspension treatment device (part of the circuit in which the cell suspension flows into and out of the hollow fiber in the treatment device), and the attached tube Is connected to a container such as a cell bag containing the cell suspension so that the cell suspension can circulate between the container such as the bag and the cell suspension treatment device. It is conceivable that a machine such as a pump is interposed in this circuit in order to circulate the liquid. Moreover, it is preferable to connect the tube connected to the waste liquid tank etc. to the filtrate outlet. At this time, it is preferable that the entire circuit is attached in an aseptic environment. At this time, it is possible to apply pressure to the separation membrane by narrowing the flow path on the outlet side of the cell suspension, or to perform filtration while applying pressure to the tube on the filtration side using a pump or the like. Various filtration methods generally used in hollow fiber separation membranes may be used in combination.
一方、濃縮が進んだ後、バッファーなどの洗浄液を追加し、濃縮を繰り返すことで、細胞の洗浄や培地の交換を行うことができる。この際、洗浄液の投入は、循環回路のチューブに設けた流入口から行う。この際、無菌的に液を注入できる流入口を用いることが好ましい。 On the other hand, after the concentration has progressed, a washing solution such as a buffer is added, and the concentration can be repeated to wash the cells and exchange the medium. At this time, the cleaning liquid is supplied from an inlet provided in the tube of the circulation circuit. At this time, it is preferable to use an inlet capable of aseptically injecting the liquid.
濃縮・洗浄された細胞懸濁液は、回収バッグなどに収集して、その後の治療などに用いることができる。この際、回収バッグは、循環回路のチューブに別途三方活栓などの流出口を設けて無菌的に行うことが好ましい。 The concentrated and washed cell suspension can be collected in a collection bag and used for subsequent treatment. At this time, the collection bag is preferably aseptically provided by separately providing an outlet such as a three-way stopcock on the tube of the circulation circuit.
以下、実験結果を用いて本発明を説明する。なお、ここで細胞回収率とは、一定量まで濃縮した時点での細胞懸濁液中の細胞数を初期細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。また生存比率とは、トリパンブルー染色により染色された細胞を死細胞とし、染色されていない生細胞数を全細胞数で除して生存率を算出し、処理後の生存率を処理前の生存率で除した値を生存比率とした。細胞数は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定し、白血球分画の細胞濃度を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量と細胞濃度より算出した。 Hereinafter, the present invention will be described using experimental results. Here, the cell recovery rate is a value obtained by dividing the number of cells in the cell suspension when concentrated to a certain amount by the initial number of cells, and indicates that the higher the value, the better the recovery efficiency. The survival rate is calculated by calculating the survival rate by dividing the number of living cells not stained with the total number of cells and calculating the survival rate after treatment with trypan blue staining. The value divided by the rate was defined as the survival rate. The number of cells is determined by measuring the cell suspension with a blood cell counter (Sysmex, K-4500), calculating the cell concentration of the leukocyte fraction as the cell concentration in this example, and calculating from the cell suspension amount and the cell concentration. did.
各実験例における細胞濃縮の方法は、各実施例に記載した細胞懸濁液処理器の入り口と出口に塩ビチューブをつなげた。プラスチック容器に細胞懸濁液を貯留させて、懸濁液がモジュールおよびチューブを循環できるように細胞懸濁液処理器の両端から延びる塩ビチューブの両端を懸濁液中に垂らした。塩ビチューブにはポンプを設置し、懸濁液の流れが適当な流速に設定できるようにした。細胞懸濁液処理器のろ液出口にもチューブを取り付け、こちらは廃液入れに注ぐように設置した。また、細胞懸濁液処理器入口、出口、ろ液出口に三方活栓および圧力計をつなげ、細胞懸濁液処理器入口、出口およびろ液出口圧力を測定した。ポンプにより流速を調整し、回路に細胞懸濁液を循環させながらろ過を行った。実施例１〜８および比較例１〜３は初期の膜間圧力差（ＴＭＰ）が６０ｍｍＨｇ程度となるように線速度を調整し、実施した。ここで、ＴＭＰは細胞懸濁液処理器入口圧および出口圧の平均値とろ液出口圧の差を意味する。初期ＴＭＰとは濃縮開始時のＴＭＰ値を意味する。一定量まで濃縮した後、チューブや中空糸型分離膜内の細胞懸濁液をエアーで押し出した後、ポンプを停止し、プラスチック容器中の細胞懸濁液の細胞数を測定し、回収率を算出した。以下の実施例では、市販されている中空糸型分離膜モジュールを本発明の細胞懸濁液処理器として実験を実施した。 As a method for cell concentration in each experimental example, a vinyl chloride tube was connected to the inlet and outlet of the cell suspension treatment device described in each example. The cell suspension was stored in a plastic container and both ends of a PVC tube extending from both ends of the cell suspension processor were suspended in the suspension so that the suspension could circulate through the module and the tube. A pump was installed in the PVC tube so that the suspension flow could be set to an appropriate flow rate. A tube was also attached to the filtrate outlet of the cell suspension processor, and this was set up to be poured into a waste container. In addition, a three-way stopcock and a pressure gauge were connected to the cell suspension processor inlet, outlet, and filtrate outlet, and the cell suspension processor inlet, outlet, and filtrate outlet pressure were measured. The flow rate was adjusted by a pump, and filtration was performed while circulating the cell suspension in the circuit. In Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 3, the linear velocity was adjusted so that the initial transmembrane pressure difference (TMP) was about 60 mmHg. Here, TMP means the difference between the average value of the cell suspension processor inlet pressure and outlet pressure and the filtrate outlet pressure. The initial TMP means the TMP value at the start of concentration. After concentration to a certain amount, push the cell suspension in the tube or hollow fiber type separation membrane with air, stop the pump, measure the number of cells in the plastic container and measure the recovery rate. Calculated. In the following examples, experiments were conducted using a commercially available hollow fiber separation membrane module as the cell suspension treatment apparatus of the present invention.
〔実施例１〕
酢酸セルロースの中空糸型分離膜〔ＦＢ−０２−ＶＣ−ＦＵＣ１５８２ＥＸＰ（株式会社ダイセン・メンブレン・システムズ社製）、膜面積１３００ｃｍ２、中空糸内径０．８ｍｍ、分画分子量１５０ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。ヒトＴ細胞性白血病由来株細胞（ｊｕｒｋａｔ細胞）がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度２３０ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１９８ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は９８％であった。
[Example 1]
Cellulose using cellulose acetate hollow fiber separation membrane [FB-02-VC-FUC1582 EXP (manufactured by Daisen Membrane Systems Co., Ltd.), membrane area 1300 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.8 mm, fractional molecular weight 150 kD] Concentration studies were performed. Studies were conducted to filter the medium from 1500 ml of a cell suspension (jurkat cell concentration 2.0 × 10 6 cells / ml) in which human T-cell leukemia-derived strain cells (jurkat cells) were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 198 ml at a filtration rate of 230 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 98%.
〔実施例２〕
透析用の酢酸セルロース中空糸型分離膜〔トリアセテートホローファイバーダイアライザー ＦＢ−５０Ｐβｅｃｏ（ニプロ株式会社製）、膜面積５０００ｃｍ２、中空糸内径０．２ｍｍ（分画分子量５００ｋＤ以下）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．７×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）３０００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度７６ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１４５ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は９５％であった。
[Example 2]
Cell concentration studies using a cellulose acetate hollow fiber separation membrane for dialysis [Triacetate hollow fiber dialyzer FB-50Pβeco (manufactured by Nipro Corporation), membrane area 5000 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.2 mm (fractionated molecular weight 500 kD or less)] Went. A study was conducted to filter the medium from 3000 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration: 2.7 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 145 ml at a filtration rate of 76 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 95%.
〔実施例３〕ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔ＦＢ−０２−ＶＣ−ＦＵＳ５０８２ＥＸＰ（株式会社ダイセン・メンブレン・システムズ社製）、膜面積１３００ｃｍ２、中空糸内径０．８ｍｍ、分画分子量５００ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．１×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度９２３ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１６７ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は９３％であった。 [Example 3] Polyethersulfone hollow fiber separation membrane [FB-02-VC-FUS5082 EXP (manufactured by Daisen Membrane Systems Co., Ltd.), membrane area 1300 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.8 mm, fractional molecular weight 500 kD] was used to study cell concentration. A study was conducted on filtering the medium from 1500 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration 2.1 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 167 ml at a filtration rate of 923 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 93%.
〔実施例４〕
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｐ−Ｎ１−５００Ｅ−１００−０１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、膜面積２６００ｃｍ２、中空糸内径０．５ｍｍ、分画分子量５００ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度７４０ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１４５ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は８７％であった。
Example 4
Cell concentration using polyethersulfone hollow fiber separation membrane [Model: P-N1-500E-100-01N (Spectrum Laboratories), membrane area 2600 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.5 mm, fractional molecular weight 500 kD] Study was carried out. A study was conducted to filter the medium from 1500 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration of 2.0 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 145 ml at a filtration rate of 740 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 87%.
〔実施例５〕
透析用のポリエーテルスルホン中空糸型分離膜〔型式：ＪＭＳ ＢＩＯＰＥＳシリーズＮｅｏＢＰ−Ｎ８０（株式会社ＪＭＳ製）、膜面積８０００ｃｍ２、中空糸内径０．２ｍｍ（分画分子量５００ｋＤ以下）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）３０００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度６６ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１４８ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は９５％であった。
Example 5
Polyethersulfone hollow fiber type separation membrane for dialysis (model: JMS BIOPES series NeoBP-N80 (manufactured by JMS), membrane area 8000 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.2 mm (fractionated molecular weight 500 kD or less)) Concentration studies were performed. Studies were conducted on filtering the medium from 3000 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration of 2.0 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 148 ml at a filtration rate of 66 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 95%.
〔実施例６〕
ポリスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２−５００Ｓ−３００−０１Ｐ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、膜面積３１００ｃｍ２、中空糸内径０．５ｍｍ、分画分子量５００ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度３．１×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度２５８ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１５８ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は６９％であった。
Example 6
Cell concentration studies were performed using a polysulfone hollow fiber separation membrane [model: M2-500S-300-01P (Spectrum Laboratories), membrane area 3100 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.5 mm, fractional molecular weight 500 kD]. . A study was conducted on filtering the culture medium from 1500 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration: 3.1 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 158 ml at a filtration rate of 258 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 69%.
〔実施例７〕
ポリスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２ＡＢ−３００−０１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、膜面積３１００ｃｍ２、中空糸内径０．５ｍｍ、分画分子量１００ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度１１６ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を２０５ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は９２％であった。
Example 7
Cell concentration was examined using a polysulfone hollow fiber separation membrane [model: M2AB-300-01N (Spectrum Laboratories), membrane area: 3100 cm 2 , hollow fiber inner diameter: 0.5 mm, fractional molecular weight: 100 kD]. A study was conducted to filter the medium from 1500 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration of 2.0 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 205 ml at a filtration rate of 116 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 92%.
〔実施例８〕
透析用のポリスルホン透析用中空糸型分離膜〔フレゼニウスダイアライザー ＦＸシリーズ ＦＸ６０（フレゼニウスメディカルジャパン株式会社製）、膜面積６０００ｃｍ２、中空糸内径０．１８５ｍｍ（分画分子量５００ｋＤ以下）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）３０００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度７５ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１５０ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は９９％であった。
Example 8
Cell concentration using polysulfone dialysis hollow fiber separation membrane for dialysis [Fresenius dialyzer FX series FX60 (manufactured by Fresenius Medical Japan), membrane area 6000 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.185 mm (fractionated molecular weight 500 kD or less)] Study was carried out. Studies were conducted on filtering the culture medium from 3000 ml of a cell suspension (jurkat cell concentration 2.0 × 10 6 cells / ml) in which jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 150 ml at a filtration rate of 75 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 99%.
〔比較例１〕
混合セルロースの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２１Ｍ−３００−０１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、膜面積２５００ｃｍ２、中空糸内径０．６ｍｍ、孔径０．１μｍ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度１．８ｘ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度１９２ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を２３０ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は４７％であった。
[Comparative Example 1]
Cell concentration studies were conducted using a mixed cellulose hollow fiber type separation membrane [model: M21M-300-01N (Spectrum Laboratories), membrane area 2500 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.6 mm, pore diameter 0.1 μm]. A study was conducted to filter the medium from 1500 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration 1.8 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 230 ml at a filtration rate of 192 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 47%.
〔比較例２〕
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２−Ｎ０２Ｅ−３００−Ｆ１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、膜面積３１００ｃｍ２、中空糸内径０．５ｍｍ、孔径０．２μｍ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度２．１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度８３８ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１２９ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は５３％であった。
[Comparative Example 2]
Cell concentration studies using a polyethersulfone hollow fiber separation membrane [model: M2-N02E-300-F1N (Spectrum Laboratories), membrane area 3100 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.5 mm, pore diameter 0.2 μm] went. A study was conducted to filter the medium from 1500 ml of a cell suspension (Jurkat cell concentration 2.1 × 10 6 cells / ml) in which Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 129 ml at a filtration rate of 838 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 53%.
〔比較例３〕
ポリスルホンの中空糸型分離膜〔サルフラックスＦＳ−０５（株式会社カネカ製）、膜面積５０００ｃｍ２、中空糸内径０．３４ｍｍ、孔径０．３μｍ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。ｊｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁された細胞懸濁液（ｊｕｒｋａｔ細胞濃度１．３ｘ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌ）１５００ｍｌから培地をろ過する検討をおこなった。結果、ろ過速度４８０ｍｌ／ｍ２／分で、細胞懸濁液を１４０ｍｌまで濃縮でき、細胞回収率は３７％であった。
[Comparative Example 3]
Cell concentration studies were conducted using a polysulfone hollow fiber separation membrane [Salflux FS-05 (manufactured by Kaneka Corporation), membrane area 5000 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.34 mm, pore diameter 0.3 μm]. Studies were conducted on filtering the medium from 1500 ml of a cell suspension (jurkat cell concentration: 1.3 × 10 6 cells / ml) in which jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium. As a result, the cell suspension could be concentrated to 140 ml at a filtration rate of 480 ml / m 2 / min, and the cell recovery rate was 37%.
〔実施例９〕〔実施例１０〕〔実施例１１〕
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔ＦＢ−０２−ＶＣ−ＦＵＳ５０８２ＥＸＰ（株式会社ダイセン・メンブレン・システムズ社製）、膜面積２５００ｃｍ２、中空糸内径０．８ｍｍ、分画分子量５００ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。表２に示すように線速度を変化させて細胞回収率、ろ過速度への影響を検討した。線速度１２０ｃｍ／分ではろ過速度２４０ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率５３％、線速度３８０ｃｍ／分ではろ過速度８００ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率７３％、線速度６５０ｃｍ／分ではろ過速度２０００ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率８３％であった。
[Example 9] [Example 10] [Example 11]
Using polyethersulfone hollow fiber separation membrane [FB-02-VC-FUS5082 EXP (manufactured by Daisen Membrane Systems Co., Ltd.), membrane area 2500 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.8 mm, fractional molecular weight 500 kD] Cell concentration studies were performed. As shown in Table 2, the linear velocity was changed to examine the influence on the cell recovery rate and filtration rate. At a linear velocity of 120 cm / min, a filtration rate of 240 ml / m 2 / min, a cell recovery rate of 53%, at a linear velocity of 380 cm / min, a filtration rate of 800 ml / m 2 / min, at a cell recovery rate of 73%, and at a linear velocity of 650 cm / min, a filtration rate The cell recovery rate was 2000 ml / m 2 / min and the cell recovery rate was 83%.
〔実施例３〕〔実施例１２〕〔実施例１３〕〔実施例１４〕
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔ＦＢ−０２−ＶＣ−ＦＵＳ５０８２ＥＸＰ（株式会社ダイセン・メンブレン・システムズ社製）、膜面積１３００ｃｍ２、中空糸内径０．８ｍｍ、分画分子量５００ｋＤ〕を用いて細胞濃縮検討を行った。表２に示すように線速度を変化させて細胞回収率、ろ過速度への影響を検討した。線速度２３０ｃｍ／分ではろ過速度２６９ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率８４％、線速度４００ｃｍ／分ではろ過速度９２３ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率９３％、線速度５８０ｃｍ／分ではろ過速度１０３８ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率８６％、線速度１１５０ｃｍ／分ではろ過速度９００ｍｌ／ｍ２／分、細胞回収率９６％であった。
[Example 3] [Example 12] [Example 13] [Example 14]
Using polyethersulfone hollow fiber separation membrane [FB-02-VC-FUS5082 EXP (manufactured by Daisen Membrane Systems Co., Ltd.), membrane area 1300 cm 2 , hollow fiber inner diameter 0.8 mm, fractional molecular weight 500 kD] Cell concentration studies were performed. As shown in Table 2, the linear velocity was changed to examine the influence on the cell recovery rate and filtration rate. At a linear velocity of 230 cm / min, a filtration rate of 269 ml / m 2 / min, a cell recovery rate of 84%, at a linear velocity of 400 cm / min, a filtration rate of 923 ml / m 2 / min, at a cell recovery rate of 93%, and at a linear velocity of 580 cm / min, a filtration rate At 1038 ml / m 2 / min, cell recovery rate of 86%, linear velocity of 1150 cm / min, filtration rate was 900 ml / m 2 / min and cell recovery rate was 96%.
以上の結果から、分画分離量、中空糸材料の回収率への影響を表１に、線速度の回収率への影響を表２に示した。 From the above results, the influence on the fraction separation amount and the recovery rate of the hollow fiber material is shown in Table 1, and the influence of the linear velocity on the recovery rate is shown in Table 2.
１ 筒状容器
２ 胴部
３ 頭部
４ａ ろ過液出口
５ 中空糸型分離膜の束
６ 開口端（点線部）
７ 樹脂層部（斜線部）
８ａ 細胞懸濁液入口
８ｂ 細胞懸濁液出口
９ ヘッダー部
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Cylindrical container 2 Body part 3 Head part 4a Filtrate outlet 5 Bundle of hollow fiber type separation membranes 6 Open end (dotted line part)
7 Resin layer (shaded area)
8a Cell suspension inlet 8b Cell suspension outlet 9 Header
Claims (6)
The cell suspension concentration method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell suspension is supplied to the hollow fiber separation membrane at a linear speed of 200 to 1000 cm / min.
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