JP2012117860A - 人工生体膜マイクロアレイの作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の人工生体膜を高密度に集積した人工生体膜素子を容易に形成できるようにする。
【解決手段】ステップＳ１０１で、親水性の複数の検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃおよび各々の検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃに連続する親水性の複数の原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを基板１０１の上に形成する。次に、ステップＳ１０２で、所望の分子を含む人工生体膜原料１０５ａ，１０５ｂ，１０５ｃを原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに供給する。次に、ステップＳ１０３で、所望の分子を含む人工生体膜原料１０５ａ，１０５ｂ，１０５ｃの自発展開現象により脂質二分子膜の単一膜よりなる人工生体膜を検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃに形成する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、病理診断や細胞診断を行うためのバイオチップとして用いることができる人工生体膜マイクロアレイの製造方法に関するものである。

病理診断、環境センシング、ナノバイオオプティクス、エレクトロニクスなどの幅広い分野への応用が可能な素子の基本構造として、固体基板の表面に生体分子を固定化した素子が重要視されている。この素子は、生体組織内で起こる生体分子間反応メカニズムを解明するといった基礎研究分野においても、威力を発揮すると期待される。特定多数の生体分子が位置制御性よく基板上に固定化されたマイクロアレイは、医療・環境センシング素子において、検体の種類や濃度の同定、あるいは生体分子間の相互作用をハイスループットで調査・診断できるバイオチップとして、多大な市場価値が期待されている。

上述したバイオチップの代表的なものとして、ＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイは、既知である複数のＤＮＡ断片を、プラスチックやガラスなどの基板上に高密度に配置した検出基板である。ＤＮＡマイクロアレイでは、検体をＤＮＡ断片が固定されている基板の上で反応させ、結合箇所を蛍光や電流検出により特定することで、細胞内の発現遺伝子を測定している。

検体のＤＮＡ鎖が結合するのは、相補的な塩基配列の部分となる。ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されている各ＤＮＡ断片の塩基配列は既知であるので、検体のＤＮＡ鎖が結合している箇所より、検体に含まれるＤＮＡ配列を検出することができる。なお、ＤＮＡマイクロアレイでは、多種類のＤＮＡ（１本鎖）を配置（配列）してあり多くの測定処理を同時に行えるため、迅速・高速な処理が可能となっている（ハイスループット）。

ＤＮＡ以外の生体分子についても、同様のマイクロアレイを作製することができれば、様々な生体分子を同時に検出することが可能となる。とくにタンパク質は、生体内での情報伝達における中心的役割を担っており、タンパク質マイクロアレイが簡便に作製可能な方法が提供されれば、波及効果は大きい。

タンパク質を固体表面に固定化する方法としては、ビオチン-ストレプトアビジン間の特異結合を利用した方法が広く用いられている（非特許文献１参照）。また、有機分子の自己組織化膜を用いてタンパク質を固体表面に固定化する方法もある（非特許文献２参照）。しかしながら、これらの手法は、一般に、末端をチオール化した化合物を用いるため、タンパク質を固定化する対象が金表面などの特殊な材料に限定される。また、反応プロセスが多段階にわたるため、基板上に固定化できるタンパク質の収率の、反応プロセスにともなう悪化が無視できない。

さらに、ビオチン-ストレプトアビジン結合を用いた手法では、基板に結合するためのビオチン分子の末端化学修飾や、タンパク質の末端ビオチン化修飾が必要なため、反応収率、時間的効率を考慮するとバイオチップの大量製造には困難な点が多い。また、上記のように化学修飾を施すことによって、多くの場合タンパク質が本来持つ生理機能を失活してしまうことが問題になっている。

これらの欠点を解決するために、脂質二分子膜を固体表面に支持し、支持された脂質二分子膜にタンパク質を結合させ、ないしは埋めこんで固定化する方法が考えられる。脂質二分子膜は細胞膜の基本構造であるため、基板上に形成した脂質二分子膜の表面上または内部に生体分子を固定化すれば、生理条件に近い環境で生体分子は存在し得る。このため、生体分子を非破壊で、かつ生理機能を保持したまま、長期間安定して生体分子を基板上に担持することができる。

固体表面上に脂質二分子膜を支持させ、これを人工生体膜としてバイオセンサーなどに用いる手法は、これまでにも知られている（非特許文献３参照）。 また、このような人工生体膜をパターン化する手法も開発されている（非特許文献４参照）。しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイと同様に、ハイスループットな検出を行うためには、組成の異なる人工生体膜を高い集積度で配列した人工生体膜マイクロアレイが重要となる。

人工生体膜のマイクロアレイを作製する方法としては、パターン化基板にベシクル融合法で組成の異なる人工生体膜を集積化した手法がある（非特許文献５参照）。この方法は、ベシクルの水溶液をマイクロアレイに滴下して人工生体膜を支持させている。このため、集積度は用いる水溶液の最小滴下サイズによって制限を受ける。実際、非特許文献５の技術で作製されたアレイは、５０μｍ角の領域を各辺１０μｍの間隔を開けた配列の作製が限界であった。また、この手法では、逐一溶液を滴下して組成の異なる人工生体膜を支持させなくてはならず、多種の配列構造を作製するためには相応のプロセス数が必要となる。また、上述した人工生体膜は、液中にないと構造が維持できないため、液滴を乾燥させないという制限もある。

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上述したように、基板に支持された人工生体膜に生体分子を固定化すれば、生体分子は生理条件に近い環境下におかれるため、生体分子の機能を維持したまま固定された状態が得られる。このため、膜たんぱく質をはじめとする生体分子を指示薬に用いた検査には最適である。

しかしながら、人工生体膜マイクロアレイの製造方法は、現在のところベシクル融合法に限られている。また、ベシクル融合法は、溶液プロセスであるための制限から、マイクロアレイの配列密度も限定されているうえ、配列数（集積度）の増加に比例して増加するプロセス数が必要なため、大量生産にも不向きである。これらのように、従来では、複数の人工生体膜を高密度に集積した人工生体膜マイクロアレイの形成が、容易ではないという問題があった。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、複数の人工生体膜を高密度に集積した人工生体膜マイクロアレイを容易に形成できるようにすることを目的とする。

本発明に係る人工生体膜マイクロアレイの作製方法は、複数の親水性の検出部および検出部に各々連続する親水性の複数の原料供給部を基板の上に形成する親水領域形成工程と、検出部および原料供給部を囲う疎水性の領域を基板の上に形成する疎水領域形成工程と、人工生体膜原料を各々の原料供給部に供給する原料供給工程と、人工生体膜原料の自発展開現象により人工生体膜原料を組成とする人工生体膜を、各々の検出部に形成する自発展開工程とを少なくとも備える

上記人工生体膜マイクロアレイの作製方法において、人工生体膜原料は、脂質分子を含むものであればよい。また、検出部および原料供給部は、疎水性の領域に対して段差を備えて形成されていてもよい。また、自発展開工程の後で、基板の検出部が形成されている部分を分離する分離工程を備えるようにしてもよい。

以上説明したように、本発明によれば、人工生体膜原料の自発展開現象により生体分子を備えた人工生体膜原料の組成を持った人工生体膜を、親水性とした検出部に形成するようにしたので、複数の生体分子を高密度に集積した人工生体膜マイクロアレイが、容易に形成できるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの作製方法に説明する説明図である。 図２Ａは、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの作製方法に説明する説明図である。 図２Ｂは、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの作製方法に説明する説明図である。 図３は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの構成例を示す平面図である。 図４は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの一部の観察結果を示す写真である。 図５は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの一部の観察結果を示す写真である。 図６は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの構成例を示す平面図である。 図７は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの一部の観察結果を示す写真である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における人工生体膜マイクロアレイの作製方法に説明する説明図である。

まず、ステップＳ１０１で、図１の（ａ）に示すように、親水性表面を有する複数の検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃおよび各々の検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃに連続する親水性表面を有する複数の原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを基板１０１の上に形成する（親水領域形成工程）。また、図１の（ａ）にあわせて示すように、複数の検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃおよび原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを囲う疎水性の領域１０４を基板１０１の上に形成する（疎水領域形成工程）。なお、親水領域および疎水領域の形状については、本発明の人工生体膜マイクロアレイの最終利用形態に応じて、自由に規定することができる。また、上記の親水領域形成工程および疎水領域形成工程の順序については、問わない。

次に、ステップＳ１０２で、脂質分子や生体分子の混合物である人工生体膜原料を原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに供給する（原料供給工程）。原料供給部１０３ａには、人工生体膜原料１０５ａを供給し、原料供給部１０３ｂには、人工生体膜原料１０５ｂを供給し、原料供給部１０３ｃには、人工生体膜原料１０５ｃを供給する。

次に、ステップＳ１０３で、人工生体膜原料１０５ａ，１０５ｂ，１０５ｃの組成を有する脂質二分子膜の単一膜よりなる人工生体膜を検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃに形成する（自発展開工程）。この自発展開工程では、基板１０１を電解質溶液に浸漬するなど、原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃから検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃの領域を、電解質溶液に接触させればよい。電解質溶液としては、リン酸バッファーおよび生理食塩水などが利用できる。また、原料や基板の材料によっては電解質を含まない純水に接触させればよい場合もある。

また、自発展開の後において、検出部１０２ａには人工生体膜１０６ａが形成され、検出部１０２ｂには人工生体膜１０６ｂが形成され、検出部１０２ｃには人工生体膜１０６ｃが形成される。原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃから検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃの領域が、電解質溶液に浸漬した状態とすることで、原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに供給された人工生体膜原料による自発展開が生じ、基板１０１の上の親水性の領域に、人工生体膜原料を構成する分子による人工生体膜が自発的に形成されていく（非特許文献６，７参照）。脂質二分子膜の自発展開により、人工生体膜は、基板１０１の上の全ての親水性領域に形成されることになる。

ここで、原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに生体分子を含む人工生体膜原料（例えば脂質分子）を供給すれば、親水性領域に形成される人工生体膜は、生体分子を備えた状態となる。従って、原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃに連続して形成されている親水性領域である検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃにも、人工生体膜とともに生体分子も配置することができる。

例えば、原料供給部１０３ａには、生体分子Ａを備えた人工生体膜原料１０５ａを供給し、原料供給部１０３ｂには、生体分子Ｂを備えた人工生体膜原料１０５ｂを供給し、原料供給部１０３ｃには、生体分子Ｃを備えた人工生体膜原料１０５ｃを供給する。人工生体膜原料は、脂質分子を含有していればなおよい。このようにすることで、検出部１０２ａには、生体分子Ａを備える人工生体膜が配置でき、検出部１０２ｂには、生体分子Ｂを備える人工生体膜が配置でき、検出部１０２ｃには、生体分子Ｃを備える人工生体膜が配置できる。

脂質二分子膜の自発展開は、展開していく親水性領域の線幅が１０ｎｍ程度であっても進行する（非特許文献８参照）。また、各親水性領域は、数ｎｍ程度の間隔で離間していれば、これらの間の疎水性領域をわたって脂質二分子膜が展開していくことがない。言い換えると、各親水性領域を疎水性領域により数ｎｍ程度離間していれば、各々が混合することなく分離した状態で、脂質二分子膜を自発展開させることができる。

従って、上述したように、３つの検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃを設けた場合、例えば各々の線幅を１０ｎｍとし、各々間隔を５ｎｍとすれば、実質的な検出部の領域は、数十ｎｍの範囲とすることができる。本実施の形態によれば、このような極小の検出領域内に、複数の人工生体膜を配置することができる。なお、親水性の領域からなる検出部および原料供給部は、疎水性の領域に対して凹部もしくは凸部とするなど段差を備えて形成してもよい。

例えば、図２Ａに示すように、基板１０１を断裁線２０１および断裁線２０２で切断（分離）すれば、図２Ｂに示すように、本実施の形態における人工生体膜マイクロアレイを、３個の人工生体膜１０６ａ，人工生体膜１０６ｂ，人工生体膜１０６ｃが集積された小型のチップとすることができる。例えば、直線上とした検出部に対して直交する断裁線で切断すればよい。

また、断裁線２０１および断裁線２０２の間隔を小さくすることで、基板１０１より、複数のチップを切り出すことができるので、複数の人工生体膜を高密度に集積した人工生体膜マイクロアレイが、容易に量産できるようになる。なお、上述したステップＳ１０２以降は、電解質溶液内で行うことが重要である。自発展開により得られた人工生体膜は、電解質溶液内に配置されていれば、安定に存在できる。

ここで、疎水性の領域で囲われた親水性の領域となる検出部１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃおよび原料供給部１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃなどのパターンは、公知の成膜技術，リソグラフィー技術，およびエッチング技術などを用いることで形成できる。これは、半導体集積回路の製造技術としてよく知られている技術である。

例えば、石英などの親水性表面を有する基板の表面に、親水性の領域を残すように金などの金属膜を形成すればよい。金や白金などの化学的に非常に安定な金属であれば、電解質中で生じる錆などの劣化や、生体毒性や検体との化学反応の心配が無用となる。この場合、親水性の領域にレジストパターンを形成し、この上に蒸着法などにより金属膜を堆積（形成）し、この後、レジストパターンを除去してこの領域の基板表面を露出させればよい。基板表面が露出している領域（パターン）は、親水性の領域である。また、配列される各検出部の間隔は、これらのパターニング技術で実現可能な寸法にまで微細化することが可能である。

人工生体膜を形成するための脂質二分子膜の材料としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ステロイドなどの脂質分子であればよい。これらを単独で用いてもよく、また、複数の分子を混合して用いてもよい。また、コレステロールなどの細胞膜中に含まれる物質をさらに混合してもよい。

これらの原料の中に、人工生体膜に組み込む生体分子を混合する。ここでいう生体分子としては、機能性脂質、タンパク質、受容体、イオンチャネル、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡが例示される。

生体分子を人工生体膜に結合し、また組み込ませる方法について、以下に説明する。なお、以下に説明する方法に限定されるものではない。

まず、生体分子が脂質分子と構造が類似した分子であれば、脂質分子と混合すれば、形成される脂質二分子膜に生体分子が組み込まれ、これが自発展開することで、生体分子が組み込まれた人工生体膜が得られる。

また、生体分子が膜タンパク質であれば、人工生体膜形成（自発展開）時に人工生体膜内に自発的に取り込まれる。

また、アビジン−ビオチン、ニッケル−ヒスチジン連鎖など、生体分子特有の選択的結合形成が可能な低分子であれば、選択的結合の対となる一方の材料を脂質分子に結合させれば、目的の生体分子を脂質二分子膜に結合させることができ、結果として生体分子を備える人工生体膜が得られる。例えば、生体分子がビオチンの場合、アビジンを脂質分子に結合させておけばよい。また、生体分子がヒスチジン連鎖の場合、ニッケルを脂質分子に結合させておけばよい。

また、生体分子が疎水性である場合、脂質分子による脂質二分子膜の形成時に、二分子膜の中心の疎水部位に当該生体分子が取り込まれるようになる。このため、これらを自発展開させれば、生体分子を備える人工生体膜が得られる。

以下、実施例を用いてより詳細に説明する。

［実施例１］
はじめに、実施例１について説明する。

［基板作製］
まず、４インチの石英ウエハを用意し、この上に、プライマーとしてヘキサメチルジシロキサンを塗布する。ヘキサメチルジシロキサンを滴下した後、石英ウエハを５００ｒｐｍで３０秒間回転させ、滴下を停止してから、継続して２０００ｒｐｍで３０秒間回転させる。

次に、石英ウエハの上に、フォトレジスト（東京応化工業株式会社製；ＴＳＭＲ−Ｖ９０）を塗布する。フォトレジストを滴下した後、状態で石英ウエハを５００ｒｐｍで３０秒間回転させ、供給を停止してから、継続して２０００ｒｐｍで３０秒間回転させる。また、このようにしてフォトレジスト膜を形成した後、基板を１２０℃の温度条件としたオーブン内に９０秒間配置してプリベークを行った。

次に、フォトマスクを用いてフォトレジスト膜に所望のパターンを露光して潜像を形成し、これを現像してレジストパターンを形成した。このレジストパターンは、検出部および検出部に連続する原料供給部となる部分がパターン部として残り、この周囲の疎水性となる領域の石英ウエハ表面が露出した形状である。

次に、上述したレジストパターンが形成されている石英ウエハの上に、スパッタ法で、まず、チタンを堆積して膜厚５ｎｍのチタン膜を形成する。引き続き、チタン膜の上に、金を堆積して膜厚４５ｎｍの金膜を形成する。チタン膜は、石英と金膜との間の密着性を向上させるために用いる。このようにして金属膜を形成した後、石英ウエハをメチルエチルケトンからなる溶解液に浸漬し、また、超音波を印加し、レジストパターンを溶解して剥離する。

このリフトオフにより、レジストパターンの上の金属膜をレジストパターンとともに除去し、ウエハをカッティングして取り出せば、図３の平面図に示すように、親水性の検出部３０２および検出部３０２に連続する原料供給部３０３ａ，３０３ｂ，３０３ｃが、石英基板３０１の上に形成できる。また、検出部３０２および原料供給部３０３ａ，３０３ｂ，３０３ｃ、金からなる疎水性の領域３０４で囲われた状態となる。本実施例では、各原料供給部より、各々３本の親水性領域の線（検出部３０２）を連続して形成している。検出部３０２は、各々幅１０μｍに形成した。また、各線の間隔は、各５μｍとした。また、金の膜厚は５０ｎｍとした。また、疎水部の膜厚は５０ｎｍとした。

［２］人工生体膜の形成
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ：脂質分子）１．６３ｍｇと、クマリン色素が結合した１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（クマリン−ＤＭＰＥ；脂質分子）０．０２ｍｇとを、クロロホルム３ｍＬに溶解して混合した（クマリン−ＤＭＰＥの濃度１ｍｏｌ％）。これをガラスびんに収容し、この状態でクロロホルムを蒸発させ、Ｌ−α−ＰＣとクマリン−ＤＭＰＥとを混合した混合脂質分子による膜を形成した。膜は、ガラスびん内壁に付着して形成される。さらに、この混合脂質分子による膜を真空下で１２時間乾燥させ、クロロホルムを除去した。得られた膜（試料Ａ）は、空気中・室温において、粘稠性を有する固体であった。

次に、前述同様の手法で、フルオレセイン色素が結合した１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（フルオレセイン−ＤＨＰＥ）を、Ｌ−α−ＰＣ中に１モル％の濃度で含む混合物（混合脂質分子）を用意し、これより試料Ｂを作製した。また、テキサスレッド色素が結合した１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（テキサスレッド−ＤＨＰＥ）を、Ｌ−α−ＰＣ中に１モル％の濃度で含む混合物を用意し、これより試料Ｃを作製した。試料Ｂおよび試料Ｃも、空気中・室温において、粘稠性を有する固体であった。

次に、ガラス製キャピラリーを作製し、作製したキャピラリーの尖端で試料Ａを掻き取り（分取し），原料供給部３０３ａに塗布した。同様に、試料Ｂを原料供給部３０３ｂに塗布し、試料Ｃを原料供給部３０３ｃに塗布した。各試料は、およそ直径１００μｍのスポット状の塊であった。

上述した各試料を塗布（供給）した石英基板３０１の上に、ｐＨ７．６に調整されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭの電解質溶液を静かに供給した。この電解質溶液の供給は、水浸用の対物レンズを備えた共焦点レーザー顕微鏡に、石英基板３０１を設置し、対物レンズと石英基板３０１との間に行った。供給した電解質溶液は、石英基板３０１と上記対物レンズとの間に配置された状態となる。

上述した電解質溶液の供給により、各原料供給部に塗布した各試人工生体膜原料は、自発展開を開始し、石英基板３０１の上の親水領域である原料供給部３０３ａ，３０３ｂ，３０３ｃおよびこれらに各々連続して形成されている検出部３０２に、人工生体膜が形成された。

原料供給部３０３ａおよびこれに連続して形成されている検出部３０２には、クマリン−ＤＭＰＥを含む試料Ａによる人工生体膜が形成された。また、原料供給部３０３ｂおよびこれに連続して形成されている検出部３０２には、試料Ｂによるフルオレセイン−ＤＨＰＥを含む人工生体膜が形成された。また、原料供給部３０３ｃおよびこれに連続して形成されている検出部３０２には、試料Ｃによるテキサスレッド−ＤＨＰＥを含む人工生体膜が形成された。

上述した自発展開を開始してから２時間経過した後、検出部３０２を上述の共焦点レーザー顕微鏡で観察した。なお、用いた共焦点レーザー顕微鏡では、同時に２つの励起光を照射することができるが、ここでは、試料Ｂによる人工生体膜が形成されている検出部３０２と試料Ｃによる人工生体膜が形成されている検出部３０２とを、同時に観察した。観察条件は、試料Ｂによる人工生体膜が形成されている検出部３０２においては、励起光４８８ｎｍとし、波長５０５−５２５ｎｍのフルオレセイン由来の蛍光を検出した。また、試料Ｃによる人工生体膜が形成されている検出部３０２においては、励起光５４３ｎｍとし、波長６１０ｎｍ〜のテキサスレッド由来の蛍光を検出した。

上述した観察の結果、図４に示すように、原料供給部３０３ｂ（不図示）に連続する検出部３０２ｂ、および原料供給部３０３ｃ（不図示）に連続する検出部３０２ｃに、テキサスレッド色素による蛍光、およびフルオレセイン色素による蛍光が、各々３本のライン状に確認された。ここで、上述したように、２成分を同時に観察しており、原料供給部３０３ａ（不図示）に連続する検出部３０２ａにおいては、対応する励起光を照射していないので、試料Ａによる人工生体膜の状態は、観察されない。なお、図４は、グレースケールで示しているが、実際には、検出部３０２ｃは、赤色が確認され、検出部３０２ｂは、緑色が確認された。この図４に示す観察結果から明らかなように、自発展開する人工生体膜は、石英表面が露出した親水表面のみに形成され、かつ、親水表面全体に広がった時点でそれ以上の展開を停止している。

さらに、三種類の色素を同時に観察するために、紫外光を石英基板３０１の全体に照射して各色素を励起し、この結果の蛍光をデジタルスチルカメラにて撮影した。図５は、撮影結果を示す写真である。図５に示すように、原料供給部３０３ａとこれに連続する検出部３０２ａ、原料供給部３０３ｂとこれに連続する検出部３０２ｂ、および原料供給部３０３ｃとこれに連続する検出部３０２ｃの領域に蛍光が確認され、この周囲の金からなる疎水性の領域３０４には蛍光が確認されない。なお、図５は、グレースケールで示しているが、原料供給部３０３ａおよび検出部３０２ａは、青色に撮影され、原料供給部３０３ｂおよび検出部３０２ｂは、緑色に撮影され、原料供給部３０３ｃおよび検出部３０２ｃは、赤色に撮影された。

以上の結果から明らかなように、各々異なる組成を持つ人工生体膜が、自発展開によって、同時に、各原料供給部および検出部の形状通りに形成されている。本実施例によれば、組成の異なる人工生体膜を、１０μｍの幅のライン状に３本ずつ、各々５μｍの間隔をあけて形成できることが示された。

［実施例２］
次に、実施例２について説明する。実施例２では、図６の平面図に示すように、石英基板６０１の上に、親水性の検出部６０２および検出部６０２に連続する原料供給部６０３ａ，６０３ｂ，６０３ｃ，６０３ｄ，６０３ｅ，６０３ｆを備え、これら親水性領域の周囲に金属膜（Ｔｉ／Ａｕ）からなる疎水性の領域６０４を備える人工生体膜マイクロアレイを作製した。作製方法は、前述した実施例１と同様である。

次に、Ｌ−α−ＰＣにテキサスレッド−ＤＨＰＥを５ｍｏｌ％含む第１試料、Ｌ−α−ＰＣにフルオレセイン−ＤＨＰＥ５ｍｏｌ％含む第２試料、およびＬ−α−ＰＣにクマリン−ＤＭＰＥを５ｍｏｌ％含む第３試料を用意する。

次に、用意した第１試料を原料供給部６０３ａおよび原料供給部６０３ｄに供給し、第２試料を原料供給部６０３ｂおよび原料供給部６０３ｅに供給し、第３試料を原料供給部６０３ｃおよび原料供給部６０３ｆに供給した。前述した実施例１と同様に、ガラス製キャピラリーの尖端で、各試料を各原料供給部に塗布することで、上述した原料の供給を行った。塗布した各試料は、およそ直径１００μｍのスポット状の塊であった。

上述した各試料を塗布（供給）した石英基板６０１の上に、ｐＨ７．６に調整されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭの電解質溶液を静かに供給した。この電解質溶液の供給は、水浸用の対物レンズを備えた共焦点レーザー顕微鏡に、石英基板６０１を設置し、対物レンズと石英基板６０１との間に行った。供給した電解質溶液は、石英基板６０１と上記対物レンズとの間に配置された状態となる。

上述した電解質溶液の供給により、各原料供給部に塗布した各試料は、自発展開を開始し、石英基板６０１の上の親水領域である原料供給部６０３ａ，６０３ｂ，６０３ｃ，６０３ｄ，６０３ｅ，６０３ｆおよびこれらに各々連続して形成されている検出部６０２に、人工生体膜が形成された。

上述した自発展開を開始してから４時間経過した後、検出部６０２を上述の共焦点レーザー顕微鏡で観察した。観察条件は、第１試料による人工生体膜が形成されている検出部６０２においては、励起光５４３ｎｍとし、波長６１０ｎｍ〜のテキサスレッド由来の蛍光を検出した。また、第２試料による人工生体膜が形成されている検出部６０２においては、励起光４８８ｎｍとし、波長５０５−５２５ｎｍのフルオレセイン由来の蛍光を検出した。また、第３試料による人工生体膜が形成されている検出部６０２においては、励起光４０５ｎｍとし、波長４６０−４６０ｎｍのクマリン由来の蛍光を検出した。

上述した観察の結果、図７に示すように、まず、原料供給部６０３ａ，６０３ｄ（不図示）に連続する検出部６０２ａ，６０２ｄに、テキサスレッド色素による蛍光が、各々１本のライン状に確認された。なお、用いた共焦点レーザー顕微鏡では、同時に２つの励起光を照射することが可能であるが、図７では、励起光５４３ｎｍおよび励起光４８８ｎｍを照射して観察した結果と、励起光４０５ｎｍを照射して観察した結果とを合成して示している。

また、原料供給部６０３ｂ，６０３ｅ（不図示）に連続する検出部６０２ｂ，６０２ｅに、フルオレセイン色素による蛍光が、各々１本のライン状に確認された。また、原料供給部６０３ｃ，６０３ｆ（不図示）に連続する検出部６０２ｃ，６０２ｆに、クマリン色素による蛍光が、各々１本のライン状に確認された。なお、図７は、グレースケールで示しているが、実際には、検出部６０２ａ，６０２ｄは、赤色が確認され、検出部６０２ｂ，６０２ｅは、緑色が確認され、検出部６０２ｃ，６０２ｆは、青色が確認された。

上述した図７に示す観察結果から明らかなように、自発展開する人工生体膜は、石英表面が露出した親水表面のみに形成され、かつ、親水表面全体に広がった時点でそれ以上の展開を停止している。これらの結果から明らかなように、各々異なる組成を持つ人工生体膜が、自発展開によって、同時に、各原料供給部および検出部の形状通りに形成されている。本実施例によれば、組成の異なる（結合している色素が異なる）人工生体膜を、１０μｍの幅のライン状に１本ずつ、各々５μｍの間隔をあけて形成できることが示された。また、前述した実施例１に比較して、検出部の配列をより複雑な形状としたが、このような構成としても、前述同様に複数の人工生体膜を高密度に集積した人工生体膜マイクロアレイが、容易に形成できる。また、多数の検出部を同時に形成でき、この領域を複数の部分に分割して切り出すことができるので、ハイスループット化が可能である。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの組み合わせおよび変形が実施可能であることは明白である。例えば、上述した実施例では、同じ脂質分子を用いて異なる検出部に対して各々人工生体膜を形成したが、各々の検出部に、異なる脂質分子からなる人工生体膜を形成してもよいことは、いうまでもない。また、上述では、親水性表面を有する基板を用い、疎水性の金属膜を形成することで、親水性の検出部および原料供給部を形成したが、これに限るものではない。例えば、疎水性表面を有する基板を用い、この基板の上に、親水性を有する材料のパターンを形成することで、親水性の検出部および原料供給部としてもよい。

１０１…基板、１０２，１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃ…検出部、１０３，１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃ…原料供給部、１０４…疎水性の領域、１０５ａ，１０５ｂ，１０５ｃ…脂質二分子膜、１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃ…人工生体膜。

Claims (4)

1. 複数の親水性の検出部および前記検出部に各々連続する親水性の複数の原料供給部を基板の上に形成する親水領域形成工程と、
   前記検出部および前記原料供給部を囲う疎水性の領域を前記基板の上に形成する疎水領域形成工程と、
   人工生体膜原料を各々の前記原料供給部に供給する原料供給工程と、
   前記人工生体膜原料の自発展開現象により前記人工生体膜原料を組成とする人工生体膜を、各々の前記検出部に形成する自発展開工程と
   を少なくとも備えることを特徴とする人工生体膜マイクロアレイの作製方法。
2. 請求項１記載の人工生体膜マイクロアレイの作製方法において、
   前記人工生体膜原料は、脂質分子を含むことを特徴とする人工生体膜マイクロアレイの作製方法。
3. 請求項１または２記載の人工生体膜マイクロアレイの作製方法において、
   前記検出部および前記原料供給部は、前記疎水性の領域に対して段差を備えて形成されていることを特徴とする人工生体膜マイクロアレイの作製方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工生体膜マイクロアレイの作製方法において、
   前記自発展開工程の後で、前記基板の前記検出部が形成されている部分を分離する分離工程を備えることを特徴とする人工生体膜マイクロアレイの作製方法。