JP2012081471A - マイクロビーズの配列方法及びその配列装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 マイクロビーズの配列方法において、マイクロビーズ21が流されるとともに、狭窄領域24を有する直線状チャンネル22とこの直線状チャンネル22と順次交差する方形波形状のチャンネル23とを配置し、マイクロビーズ21が捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、前記空の狭窄領域でマイクロビーズ21を捕捉し、マイクロビーズ21が捕捉されている狭窄領域がある場合は、前記狭窄領域をバイパスしてマイクロビーズ21を下流に移動させる。
【選択図】 図5
Description
ところで、ヒドロゲル中にセルをカプセル化することはセルに保護を与えるものであり、バイオリアクターや組織工学と関連する(下記非特許文献1参照)。アルギン酸はその生体適合性、入手の容易さ、比較的低いコストから、最も良く用いられ、研究されるヒドロゲルである。アルギン酸中にセルをカプセル化し、アレイを形成することができれば、セルを保護膜中に包み込みながら、多くのセルを同時に視覚化し分析することができるようになるので、診断研究、薬理学的研究やセロミクスの研究に多く応用されるだろう。
そこで、本発明では、これまでに提案された内部ゲル化法(上記非特許文献5参照)とT字交差路液滴生成法(上記特許文献1参照)をも参照し研究を重ねながら、アルギン酸マイクロビーズ(MAB)を生成するようにした。
〔1〕マイクロビーズの配列方法において、マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルと該直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルとを配置し、前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、前記空の狭窄領域で前記マイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、前記狭窄領域をバイパスして前記マイクロビーズを下流に移動させることを特徴とする。
〔3〕マイクロビーズの配列方法において、上記〔1〕に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列されたマイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動力を作用させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とする。
〔6〕上記〔5〕記載のマイクロビーズの配列装置において、前記加熱手段はターゲットへレーザー光を照射するレーザーであることを特徴とする。
〔8〕上記〔4〕〜〔7〕の何れか一項記載のマイクロビーズの配列装置において、前記狭窄領域を水平方向に複数個配置し、前記マイクロビーズをチップ上にアレイ化して配置することを特徴とする。
図1は本発明の参考例を示すMAB製造装置の模式図である。
この図において、1は連続相である油2を流す第1のマイクロチャンネル(例えば幅は直径150μm、高さは55μm)、3は分散相であるCaCO3 粉末を含むアルギン酸ナトリウム溶液4を流す第2のマイクロチャンネル(例えば幅は直径50μm、高さは55μm)、5はその第1のマイクロチャンネル1と第2のマイクロチャンネル3が交差するT字交差路、6はそのT字交差路5で形成されるCaCO3 粉末を含むアルギン酸ナトリウムからなる液滴、7はレシチン(lecithin:燐脂質の一種)及び酢酸を含む油8が流れる第3のマイクロチャンネル、9は第1のマイクロチャンネル1と第3のマイクロチャンネル7が合流する二路合流チャンバー、10は二路合流チャンバー9にて形成されるマイクロビーズ(μ液滴)、11はその二路合流チャンバー9に連通する混合及び反応チャンネル、12はゲル化が進んだマイクロビーズ(μ液滴)である。
なお、上記実施例では、分散相として不溶性CaCO3 粉末を含んだアルギン酸ナトリウム溶液について述べたが、ph7以上の水溶液に溶けない物質であればよい。例えばバリウム化合物粉末などであってもよい。
さらに、界面活性剤としては、レシチンに限られるものではなく、両親媒性分子であれば、他のものであってもよい。
図2は本発明の参考例を示すMABの図面代用写真であり、図2(a)は完全にゲル化される前の油を、図2(b)は完全にゲル化された後の水中における状態を示す図、図3は本発明の参考例における完全にゲル化する前後におけるMABの直径分布を示す図である。
図3から明らかなように、その直径はゲル化中に29.9%だけ減少している。
この図には、MAB16中でカプセル化に成功したHep G2セル15が示されている。このように、内部ゲル化法とT字交差路液滴生成法を組み合わせることで、単一直径MAB16を生成し、Hep G2セル15をMAB16中にカプセル化することに成功した。MAB中でカプセル化されたセルの数は、アルギン酸ナトリウムにおけるセルの密度を調整することにより制御することができる。
この図において、21はマイクロビーズ(μ液滴)、22は直線状チャンネル、23は方形波形状のチャンネル、24は直線状チャンネル22に形成される狭窄領域、である。なお、図5において、太い矢印はメインストリームを、小さい矢印はサブストリームを示している。
次に、上記した装置の作製について説明する。
ラピッドプロトタイピングが可能であること、作製の容易さ、そして最も重要な、生体適合性を有するといった利点があるため、MAB製造装置とマイクロアレイ装置の両方の作製には、エラストマーPDMS(Dow Corning社製シリコーンエラストマー Sylgard)を用いたソフトリソグラフィーが選択される。まず、シリコンウエハ上に通常のリソグラフィ技術を用いてSU−8金型を形成する。次いでPDMS膜をSU−8のマスター金型から成形する。注入口及び排出口用のアクセスホールがPDMS板に開けられる。PDMSをペトリ皿で硬化させることで別のPDMS板を生成する。最後に、2つのPDMS板の表面を酸素プラズマで処理し、恒久的に接着する。
この装置では、アルギン酸ナトリウム及びトウモロコシ油、大豆から抽出したレシチン(和光純薬工業株式会社製)を用いた。さらに、塩化カルシウム(CaCl2 )、塩化ナトリウム(NaCl)、及びTween20(関東化学株式会社製)を用いた。また、酢酸(ナカライテスク株式会社製)を用いた。炭酸カルシウム(CaCo3 )粉末はYHNANO co.,Ltd.から提供を受けた。全ての化学薬品及び試薬は入手したままの状態で、更なる精製は行わずに使用した。全ての実験に用いた超純水は18MΩ・cmの比抵抗を有するミリポアシステムから得た。
全ての相の流速の制御にはシリンジポンプ(図示なし)を用いた。連続相はトウモロコシ油(メインストリーム)、及びレシチン(2wt%)と酢酸(0.67μl/ml)を含んだトウモロコシ油を用いた。CaCO3 粒子を含んだアルギン酸ナトリウム(2wt%)溶液を分散相として用いた。メインストリームのトウモロコシ油と、酢酸により酸性化されたトウモロコシ油、及びCaCO3 入りアルギン酸懸濁液の流速はそれぞれ0.25ml/h、0.25ml/h、及び0.018ml/hであった。
MABの手順と同様だが、セルの生存可能性を維持するために、全ての溶液は浸透圧に合わせて調節されなければならなかった。アルギン酸ナトリウム(2wt%)溶液は、水の代わりにNaCl(0.9wt%)溶液を用いて調製された。洗浄には、CaCl2 (155mM)溶液(1wt% Tween20)が用いられた。最終洗浄には培地を使用した。
上記手順で調製されたMABはシリンジポンプを用いてマイクロアレイに導入された。実験は逆さにしたNikon顕微鏡(Nicon eclipse,TE300)上に搭載したCCDカメラ(Hamamatsu C5405−05)を用いて視覚化した。
図6は本発明の実験例を示すマイクロビーズ(μ液滴)の捕捉アレイで捕捉されるMABの図面代用写真である。
図6(a)はマイクロビーズ(μ液滴)捕捉アレイにマイクロビーズ(μ液滴)が捕捉された状態を、図6(b)はバイパスモードのスーパーインポーズ画像を、図6(c)は捕捉モードのスーパーインポーズ画像をそれぞれ示している。
以下、マイクロチャンネル中の圧力低下について説明する。
Δp=(fL/D)・(ρV2 /2) …(1)
ここで、Δpは圧力差、fはDarcy摩擦係数、Lはチャンネル長、Dは流体直径、ρは流体密度、Vは流体の平均速度である。
D=4A/P …(2)
ここで、Aはマイクロチャンネルの断面積、Pはマイクロチャンネルの潤辺である。
図7に示される幅を有する長方形チャンネル(Wは幅、Hは高さ)の断面積及び潤辺は次のように示される。
P=2(W+H) …(4)
Darcy摩擦係数fはReynolds数Re、及びアスペクト比αに関連する。アスペクト比αは、高さ/幅あるいは幅/高さのどちらかで定義され、0≦α≦1となる。Darcy摩擦係数f及びReynolds数Reの積は、アスペクト比に依存する定数であるか、また、
f・Re=C(α) …(5)
であり、ここでC(α)はαの関数である定数Cであり、Reは
Re=ρVD/μ …(6)
でも表され、μは流体粘性である。
表1はWhite(上記非特許文献9参照)によって与えられた解である。
Δp=〔C(α)/2)〕・(μLV/D2 ) …(7)
流体の平均速度Vは
V=Q/A …(8)
で表され、ここでQは体積流量である。
Δp=〔C(α)/32)〕・(μLQP2 /A3 ) …(9)
図8は本発明にかかるマイクロ液滴トラップの詳細な説明図である。
上記したが、マイクロ液滴の捕捉は直線状チャンネルに形成された方形波チャンネル(ループチャンネル)で行われる。マイクロ液滴のトラップは直線状チャンネルに沿った狭窄領域でなされ、トラップが空であると、直線状チャンネルに沿った流体抵抗はループチャンネルに沿った流体抵抗よりも低くなる。流れにおけるビーズはメインストリームによって運ばれ捕捉される(捕捉モード)。捕捉されると流体抵抗は直線状チャンネルに沿って急激に増加し、そして、そのメインストリームはループチャンネルに向きが変えられ、続いてビーズは埋められたトラップをバイパスすることによりループチャンネルに沿って運ばれる。
(P2 /P1 )2 ・(P2 /P1 )2 ・(A1 /A2 )3 …(10)
ここで、添字の1及び2はそれぞれ流路1及び流路2を示す。流路1については、分析を簡略化するために、長さL1 の幅を狭くしたチャンネルの長さとすることに注意されたい。大半の圧力低下は幅を狭くしたチャンネル沿いに起こるので、これは有効である。
A1 =W1 H …(11)
A2 =W2 H …(12)
P1 =2(W1 +H) …(13)
P2 =2(W2 +H) …(14)
高さHが両方の流路において同じであることに留意されたい。
Q1 /Q2 =〔C2 (α2 )/C1 (α1 )〕・(L2 /L1 )・
〔(W2 +H)/(W1 +H)〕2 ・(W1 /W2 )3 …(15)
捕捉が動作するためには、流路1沿いの体積流量は流路2沿いの体積流量よりも大きくなくてはならない。すなわち、
Q1 /Q2 ≧1
または
〔C2 (α2 )/C1 (α1 )〕・(L2 /L1 )・
〔(W2 +H)/(W1 +H)〕2 ・(W1 /W2 )3 ≧1 …(16)
である。
図9は本発明の実施例を示す体積流量比Q1 /Q2 が3.66で設計されたマイクロ液滴の捕捉装置中に捕捉されたビーズを示す図である。
このマイクロ液滴の装置31においては、体積流量比Q1 /Q2 は1よりも大きく、結果的に、メインストリームは直線状チャンネル32沿いであり、ビーズ(15μm)34を直線状チャンネル32の狭窄領域33に捕捉し、アレイ状に配置することができた。
図10は本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放(リリース)装置(その1)を示す図であり、図10(a)はそのビーズの捕捉した状態を示す図、図10(b)はその捕捉されたビーズを解放する状態を示す図である。
このように、レーザーを用いた狭窄領域の終端部の加熱により泡を発生させることによって、一度捕捉したビーズを解放する。つまり、一旦捕捉したビーズの並べ換えを自在に行うことができる。
図11は本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放装置(その2)の動作を示す図、図12はそのビーズの解放装置とその動作を示す図であり、図12(a)はビーズ(セル)が捕捉された状態を、図12(b)は試薬の吹き込み状態を、図12(c)はビーズ(セル)が選択された状態を、図12(d)は電極への電位の印加状態を、図12(e)はビーズ(セル)が解放された状態を示す図である。
そこで、図11(a)に示すように、第1電極51に+電位が、第2電極55に−電位が印加されると、第1電極51の斜辺52と水平辺53が交わった下部先端部59は尖っており、一方、第2電極55の垂直辺58は平坦となっているので、第1電極51と第2電極55との間には不平等電界が生成される。つまり、下部先端部59には傾斜度の大きい電界が生成され、第2電極55の垂直辺58には傾斜度の小さい電界が生成される。このように第1電極51と第2電極55との間には不平等電界が生成されるので、図11(b)に示すように、下部先端部59の近傍にビーズ(セル)60が配置される場合には、矢印のように誘電泳動力61Aが働くことになり、ビーズ(セル)60は傾斜度の大きい電界が生じている下部先端部59から傾斜度の小さい電界が生じている第2電極55の垂直辺58へと吸引されることになる。
以下、具体的に説明する。
まず、図12(a)に示すように、マイクロビーズの捕捉アレイ装置でビーズ(セル)65を捕捉する。その捕捉アレイ装置には、上記した第1電極と第2電極からなる電極64が直線状チャンネル61の狭窄領域63に配置されている。
次に、図12(c)に示すように、解放したい所望のビーズ(セル)65′がある場合は、そのビーズ(セル)65′を解放するために電極64′を選択して電極64′へ任意の電圧を印加する。
次に、図12(e)に示すように、解放されたビーズ(セル)65′はメインストリーム67に乗り、方形波形状のチャンネル62を流れていくことになる。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
2 油(連続相)
3 第2のマイクロチャンネル
4 CaCO3 粉末を含むアルギン酸ナトリウム溶液(分散相)
5 T字交差路
6 CaCO3 粉末を含むアルギン酸ナトリウムからなる液滴
7 第3のマイクロチャンネル
8 レシチン及び酢酸を含む油
9 二路合流チャンバー
10 二路合流チャンバーにて形成されるマイクロビーズ(μ液滴)
11 混合及び反応チャンネル
12 ゲル化が進んだマイクロビーズ(μ液滴)
15 Hep G2セル
16,21 マイクロビーズ(μ液滴)
22,32,41,61 直線状チャンネル
23,62 方形波形状のチャンネル
24,33,42,63 直線状チャンネルに形成される狭窄領域
31 マイクロ液滴の装置
34 ビーズ(15μm)
43 アルミニウム
44 ビーズ
45 レーザー
46 泡
51 第1電極
52,56 斜辺
53,57 水平辺
54,58 垂直辺
55 第2電極
59 下部先端部
60,65 ビーズ(セル)
61A 誘電泳動力
64 第1電極と第2電極からなる電極
64′ 電圧を印加したい電極
65′ 解放したい所望のビーズ(セル)
66 試薬
67 メインストリーム
Claims (8)
- マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルと該直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルとを配置し、前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、該空の狭窄領域で前記マイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、前記狭窄領域をバイパスして前記マイクロビーズを下流に移動させることを特徴とするマイクロビーズの配列方法。
- 請求項1に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列された前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部を加熱することにより、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列方法。
- 請求項1に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列されたマイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動力を作用させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列方法。
- (a)マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルと、
(b)該直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルと、
(c)前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、該空の狭窄領域で前記マイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、該狭窄領域をバイパスして前記マイクロビーズを下流に移動させるマイクロビーズ移動手段を具備することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。 - 請求項4記載のマイクロビーズの配列装置において、前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部を加熱手段により加熱することで泡を生成させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
- 請求項5記載のマイクロビーズの配列装置において、前記加熱手段はターゲットへレーザー光を照射するレーザーであることを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
- 請求項4記載のマイクロビーズの配列装置において、前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動手段を設けて、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
- 請求項4〜7の何れか一項記載のマイクロビーズの配列装置において、前記狭窄領域を水平方向に複数個配置し、前記マイクロビーズをチップ上にアレイ化して配置することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
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