JP2012050373A - Method for producing bifidobacterium bacillus-containing fermented food - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ラクトコッカス属細菌とビフィドバクテリウム属細菌とを用いて乳原料を発酵させることにより得られる乳製品発酵食品の製造方法、及びそれに好適に用いられるラクトコッカス属細菌に関する。 The present invention relates to a method for producing a dairy fermented food obtained by fermenting a milk raw material using a Lactococcus bacterium and a Bifidobacterium bacterium, and a Lactococcus bacterium suitably used for the method.
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌（bifidobacteria）」ともいう。）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つである。ビフィズス菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の、生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。 Bifidobacterium bacteria such as Bifidobacterium longum (hereinafter also referred to as “bifidobacteria”) are the intestinal flora formed in the human intestinal tract. One of the dominant species. Bifidobacteria are known to have an intestinal regulating action that restores the balance of enteric bacteria, an immune enhancing action, a carcinogenesis inhibiting action, and the like. For this reason, in recent years, the demand for foods containing living bifidobacteria such as fermented bifidobacteria has been increasing with the increasing health awareness of consumers.
ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、例えば１×１０7ＣＦＵ（colony forming unit）／ｍＬのビフィズス菌を含有させるためには、通常、発酵乳中に一定量の様々な生育促進物質を添加することが行われている。 Bifidobacteria have poor growth in milky media. For this reason, for example, in order to contain 1 × 10 7 CFU (colony forming unit) / mL of bifidobacteria, a certain amount of various growth promoting substances is usually added to the fermented milk.
しかし、前記生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。また、ビフィズス菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、ビフィズス菌が一旦増殖しても、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィズス菌量は加速度的に減少してしまう。 However, the growth promoting substance is generally expensive and the flavor may be impaired. In addition, bifidobacteria are difficult to preserve under acidic conditions and are likely to die. For this reason, even if bifidobacteria once proliferate, the amount of living bifidobacteria in the fermented dairy product will decrease at an accelerated rate in the process of circulating the fermented dairy product and the like.
そこで、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィズス菌を多く含有する発酵乳を製造するとともに、生きているビフィズス菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造することが課題となっている。 Therefore, by improving the viability and preservation viability of bifidobacteria, it produces fermented milk that contains a lot of live bifidobacteria, and the live bifidobacteria It has been a challenge to produce fermented milk that is abundantly contained even at the time of eating.
ビフィズス菌を、それ以外の乳酸菌と混合発酵させることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。 Various methods for improving the viability and storage viability of bifidobacteria by adding bifidobacteria with other lactic acid bacteria and without adding the growth promoting substance have been disclosed.
発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcuslactis subsp. cremoris）、およびビフィズス菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。 Examples of methods for improving the viability of bifidobacteria in fermented milk production include Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subsp. Cremoris. And yogurt characterized by containing bifidobacteria and a method for producing the same (for example, see Patent Document 1).
その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。 Other methods for improving the storage viability of bifidobacteria in fermented milk include, for example, Bifidobacterium breve and lactate that does not produce diacetyl and acetoin in a milk-based medium. A method for producing bifidobacteria fermented milk characterized by coculturing Coccus lactis subspecies lactis is disclosed (for example, see Patent Document 2).
また、細胞壁局在性タンパク質分解酵素（cell wall-enveloped proteinase, PrtP）を有するラクトコッカス・ラクティスと、ビフィドバクテリウム属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法（例えば、特許文献３参照）や、細胞壁局在性タンパク質分解酵素を有する乳酸菌の菌体破砕物又は前記乳酸菌から分画された前記酵素画分を添加した、乳タンパク質を含有する培地に、ビフィドバクテリウム属菌を接種することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌含有組成物の製造方法（例えば、特許文献４参照）、さらには、10%還元脱脂粉乳培地における発酵性を有し、且つビフィドバクテリウム・ロンガムに対する増殖促進効果と生残性改善効果を有するラクトコッカスを用いることを特徴とする、発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳が開示されている（例えば、特許文献５参照）。 Further, fermented milk characterized by fermenting a fermentation base using Lactococcus lactis having cell wall-enveloped proteinase (PrtP) and Bifidobacterium. A milk protein-containing medium, to which is added a lactic acid bacterium crushed material having cell wall-localized proteolytic enzyme or the enzyme fraction fractionated from the lactic acid bacterium. In addition, a method for producing a Bifidobacterium-containing composition characterized by inoculating Bifidobacterium spp. (See, for example, Patent Document 4), and further fermentability in a 10% reduced skim milk medium A method for producing fermented milk, comprising using Lactococcus having a growth promoting effect on Bifidobacterium longum and a survival improvement effect And fermented milk produced by the production method is disclosed (e.g., refer to Patent Document 5).
前記のように、食品中でのビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する技術が提案されているが、いずれもラクトコッカス・ラクティスの亜種に属する細菌を用いた方法であり、その他のラクトコッカス属に関する知見はこれまで得られていなかった。 As described above, techniques for improving the viability and preservation viability of bifidobacteria in foods have been proposed, both of which are methods using bacteria belonging to the subspecies of Lactococcus lactis, and others The knowledge about the genus Lactococcus has not been obtained so far.
ラクトコッカス・ラクティス亜種細菌は、幅広く乳製品の発酵に用いられていることから、これらに感染するファージも世界中に広がっている。製造工程におけるファージ汚染は非常に深刻な問題であり、一度ファージに汚染された工場では、同一のラクトコッカス・ラクティス菌株を用いて製造することは非常に困難となり、別の菌株を使用しなければならない。 Since Lactococcus lactis subsp. Bacteria are widely used for fermentation of dairy products, phages that infect these are also spread all over the world. Phage contamination in the manufacturing process is a very serious problem. In a factory once contaminated with phages, it is very difficult to produce using the same Lactococcus lactis strain, and another strain must be used. Don't be.
しかも、ファージによっては、宿主となる乳酸菌が同一菌種であれば様々な菌株に感染してしまうケースが見受けられるため、幅広く利用されているラクトコッカス・ラクティス亜種菌株を製造に使用する場合は、ファージ汚染の確率が高くなってしまう問題があり、ラクトコッカス・ラクティス亜種以外の、幅広い菌種が求められている。しかしながら、ラクトコッカス・ラクティス亜種以外には、ビフィズス菌の保存生残性を改善させ得るラクトコッカス属細菌は報告されていない。 In addition, depending on the phage, there are cases where various strains can be infected if the host lactic acid bacterium is the same strain, so when using the widely used Lactococcus lactis subsp. However, there is a problem that the probability of phage contamination increases, and a wide range of bacterial species other than Lactococcus lactis subspecies is required. However, other than Lactococcus lactis subspecies, no bacteria of the genus Lactococcus that can improve the storage viability of Bifidobacterium have been reported.
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種のファージに感染しにくく、かつビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた乳製品の製造方法、及び、該製造方法により製造された乳製品・発酵乳、並びに前記乳酸菌を含むビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供することを目的とする。 The present invention relates to a method for producing a dairy product using a lactic acid bacterium that is difficult to infect phages of Lactococcus lactis subspecies and that can improve the storage survival of Bifidobacterium, and the production method It is an object of the present invention to provide a fermented milk product / fermented milk and a starter for fermenting milk raw material containing Bifidobacterium bacteria containing the lactic acid bacteria.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトコッカス・ラフィノラクティスの一部の菌株を、ビフィドバクテリウム属細菌と混合発酵させた場合に、ビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性が向上されることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that when some strains of Lactococcus raffinolactis are mixed and fermented with Bifidobacterium, The present inventors have found that the preservation survival is improved and completed the present invention.
すなわち、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌を用いて、乳原料を発酵させることを特徴とする発酵食品の製造方法であって、
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存した場合のビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、発酵食品の製造方法、である。
また、本発明は、前記方法により製造された発酵食品を提供する。
また、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスからなる乳原料発酵用スターターであって、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターを提供する。
That is, the present invention is a method for producing a fermented food characterized by fermenting a milk raw material using Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium.
The Lactococcus raffinolactis is a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk, and the same bacteria are added at 5.0 × 10 6 to 2.0 × 10 6 per ml of the medium. 8 CFU and Bifidobacterium genus bacteria were inoculated with 1.0 × 10 7 to 3.0 × 10 9 CFU per ml of medium, respectively, and the pH of the medium reached 4.6 to 5.5. This is a method for producing a fermented food, which has the property of maintaining the survival rate of Bifidobacterium bacteria at 30% or more when the medium is rapidly cooled at the time and stored at 10 ° C. for 2 weeks.
Moreover, this invention provides the fermented food manufactured by the said method.
In addition, the present invention is a starter for milk raw material fermentation comprising Lactococcus raffinolactis, wherein the Lactococcus raffinolactis is 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder In a medium containing 5 × 10 6 to 2.0 × 10 8 CFU per ml of medium and 1.0 × 10 7 to 3.0 × 10 9 per ml of medium of Bifidobacterium. CFU, each inoculated and cultured, the survival rate of Bifidobacterium when the pH of the medium reaches 4.6-5.5, and the medium is rapidly cooled and stored at 10 ° C. for 2 weeks A starter for fermenting milk raw material containing Bifidobacterium having a property of maintaining 30% or more.
本発明の発酵食品の製造方法、及び、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターは、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下に維持する性質を有することを好ましい態様としている。 The method for producing a fermented food according to the present invention, and the starter for milk raw material fermentation containing Bifidobacterium, the lactococcus raffinolactis is 1% (W / W) glucose and 10% (W / W). In a medium containing reduced skim milk powder, the same bacteria are 5.0 × 10 6 to 2.0 × 10 8 CFU per ml of the medium, and Bifidobacterium is 1.0 × 10 7 to 3.0 per ml of the medium. × 10 9 CFU, each inoculated and cultured, and when the pH of the medium reached 4.6 to 5.5, the medium was rapidly cooled and the dissolved oxygen concentration when stored at 10 ° C. for 2 weeks was 2 ppm or less It is a preferable aspect to have the property of maintaining the above.
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスが、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM ABP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM ABP-11279）からなる群より選択されることをことを好ましい態様としている。 In the present invention, the Lactococcus raffinolactis is selected from the group consisting of Lactococcus raffinolactis LcR21 (FERM ABP-11278) and Lactococcus raffinolactis LcR32 (FERM ABP-11279). Is a preferred embodiment.
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株であることを好ましい態様としている。
Moreover, this invention makes it a preferable aspect that the said Bifidobacterium genus microbe is Bifidobacterium longum.
In addition, the present invention has a preferred embodiment in which the Bifidobacterium longum is Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain.
また、本発明は、さらに、ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびラクトバチルス・デルブルッキーからなる群より選択される乳酸菌とを発酵に用いることを好ましい態様としている。 Moreover, this invention makes it a preferable aspect to use for a fermentation the lactic acid bacteria further selected from the group which consists of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrukee.
また、本発明は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM ABP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM ABP-11279）からなる群より選択される菌株を提供する。 The present invention also provides a strain selected from the group consisting of Lactococcus raffinolactis LcR21 (FERM ABP-11278) and Lactococcus raffinolactis LcR32 (FERM ABP-11279).
本発明の発酵食品の製造方法により、ビフィドバクテリウム属細菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する発酵食品を効率よく製造することができる。また、本発明の発酵食品の製造方法により製造された発酵食品は、健康管理上有用なものである。また、本発明により製造される発酵食品は、製造中及び保存中に、ラクトコッカス・ラクティス亜種細菌に感染するファージに感染しにくい。 By the method for producing a fermented food of the present invention, a fermented food containing a large amount of Bifidobacterium bacteria, particularly Bifidobacterium longum, can be efficiently produced. Moreover, the fermented food manufactured by the manufacturing method of the fermented food of this invention is useful on health management. Moreover, the fermented food manufactured by this invention is hard to be infected with the phage which infects Lactococcus lactis subspecies bacteria during manufacture and a preservation | save.
また、本発明のビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターは、前記発酵食品の製造に使用することができる。 Moreover, the starter for milk raw material fermentation containing the Bifidobacterium genus bacteria of this invention can be used for manufacture of the said fermented food.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる細菌は、ラクトコッカス・ラフィノラクティスであって、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 〜５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上に維持する性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティスである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The bacterium used in the present invention is Lactococcus raffinolactis, and the bacterium is added to a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder at a rate of 5.0 × per ml of the medium. 10 6 to 2.0 × 10 8 CFU and Bifidobacterium are 1.0 × 10 7 to 3.0 × 10 9 CFU, preferably 1.0 × 10 7 to 5.0 per ml of medium. × 10 7 CFU, each inoculated and cultured. When the pH of the medium reached 4.6 to 5.5, the medium was rapidly cooled and stored at 10 ° C. for 2 weeks. Lactococcus raffinolactis having a property of maintaining a survival rate of 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more.
１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地は、グルコースが１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳が１０％（Ｗ／Ｗ）となるように、水に溶解し、殺菌することによって製造することができる。殺菌は、例えば、８０〜１２２℃で４０〜５分間、好ましくは８５〜９５℃で３５〜５分間の加熱処理により行うことができる。 The medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk is such that glucose is 1% (W / W) and reduced skim milk is 10% (W / W). In addition, it can be produced by dissolving in water and sterilizing. Sterilization can be performed by, for example, heat treatment at 80 to 122 ° C. for 40 to 5 minutes, preferably 85 to 95 ° C. for 35 to 5 minutes.
前記細菌の細胞数（ＣＦＵ）は、適当に希釈した菌の懸濁液を、好適な寒天培地、例えばＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に広げ、出現するコロニー数によって測定することができる。
生残率は、保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合をいう。
The bacterial cell number (CFU) is measured by spreading an appropriately diluted bacterial suspension on a suitable agar medium, for example, a BCP-added plate count agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), and the number of colonies that appear. be able to.
The survival rate refers to the ratio of the viable cell count after storage to the viable cell count at the start of storage.
本発明の一態様では、上記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０7 〜５．０×１０7 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときの溶存酸素濃度を、２ｐｐｍ以下、好ましくは１ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐｐｍ以下に維持する性質を有することが好ましい。ビフィドバクテリウム属細菌は、培地中の溶存酸素濃度が高いと生育し難くなるため、ラクトコッカス・ラフィノラクティスをビフィドバクテリウム属細菌とともに用いて乳原料を発酵させる場合、ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、培地中の溶存酸素濃度を高めないものであることが好ましい。
上記のような性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス菌株は、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターターとして好適である。本発明の「ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター」とは、このような、ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵食品を製造するためのスターター、すなわち、発酵食品を製造するためにビフィドバクテリウム属細菌とともに乳原料に接種される細菌をいう。
In one embodiment of the present invention, the Lactococcus raffinolactis is a culture medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced skim milk powder. 6 ~2.0 × 10 8 CFU, and Bifidobacterium bacteria per medium 1ml 1.0 × 10 7 ~3.0 × 10 9 CFU, preferably 1.0 × 10 7 ~5.0 × 10 7 CFU, each inoculated and cultured. When the pH of the medium reached 4.6 to 5.5, the medium was rapidly cooled, and the dissolved oxygen concentration when stored at 10 ° C. for 2 weeks was 2 ppm or less. It preferably has a property of maintaining 1 ppm or less, more preferably 0.5 ppm or less. Bifidobacterium bacteria are difficult to grow when the dissolved oxygen concentration in the medium is high. Is preferably one that does not increase the dissolved oxygen concentration in the medium.
The Lactococcus raffinolactis strain having the above properties is suitable as a starter for fermenting milk raw materials containing Bifidobacterium. The “starter for fermenting milk raw material containing Bifidobacterium bacteria” of the present invention is a starter for producing such fermented foods containing Bifidobacterium bacteria, that is, for producing fermented foods. Refers to bacteria inoculated into milk raw materials together with Bifidobacterium.
本発明に用いるラクトコッカス・ラフィノラクティスの具体的菌株としては、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21（FERM ABP-11278）、及びラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32（FERM ABP-11279）が挙げられる。これらの菌株は、平成２２年８月１１日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、各々カッコ内に記載された受領番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。 Specific strains of Lactococcus raffinolactis used in the present invention include Lactococcus raffinolactis LcR21 (FERM ABP-11278) and Lactococcus raffinolactis LcR32 (FERM ABP-11279). On August 11, 2010, each of these strains was parenthesized at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki, 305-8566, Japan). The receipt number written in the box is internationally deposited under the Budapest Treaty.
本発明の方法は、上記のような性質を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス（以下、「本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス」と記載することがある。）と、ビフィドバクテリウム属細菌とを用いて、乳原料を発酵させることにより、発酵食品を製造する方法である。 The method of the present invention uses Lactococcus raffinolactis (hereinafter sometimes referred to as “Lactococcus raffinolactis of the present invention”) having the above properties and a Bifidobacterium genus bacterium. Thus, a fermented food is produced by fermenting milk raw materials.
ビフィドバクテリウム属細菌としては、特に制限されないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及び、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに再分類されている）が挙げられる。これらの中では、ビフィドバクテリウム・ロンガムが好ましい。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムとしてより具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株が挙げられる。同菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から購入することができる。 Bifidobacterium is not particularly limited, but includes Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium And Bifidobacterium adolescentis, and Bifidobacterium infantis (reclassified as Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum sub-species Infantis). Of these, Bifidobacterium longum is preferred. More specific examples of Bifidobacterium longum include Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain. The strain can be purchased from, for example, the American Type Culture Collection (address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America).
乳原料（milk raw material）としては、乳由来の原料であって、本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌を用いて発酵させることにより、発酵食品を製造することができるものであれば特に制限されず、乳又はその分画物又は加工品、例えば牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、及び脱脂粉乳、又はこれらを水に混合、溶解または懸濁させたもの等が挙げられる。乳原料は、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合されてもよい。乳原料は、発酵前に、常法に従って殺菌、均質化、冷却等を施してもよい。 Milk raw material is a raw material derived from milk and fermented with Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium of the present invention, and other lactic acid bacteria as required. However, milk or a fraction or processed product thereof, such as milk, skim milk, fresh cream, butter, whole milk powder, and skim milk powder, or skim milk powder can be used. And the like mixed, dissolved or suspended. The milk raw material may be blended with sweeteners such as sucrose, pectin, fruit, fruit juice, agar, gelatin, fats and oils, fragrances, coloring agents, stabilizers, reducing agents and the like as necessary. The milk raw material may be sterilized, homogenized, cooled, etc. according to a conventional method before fermentation.
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の乳原料への接種量は特に制限されないが、本発明の乳酸菌については好ましくは１０4〜１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、ビフィドバクテリウム属細菌については好ましくは１０5〜１０9ＣＦＵ／ｍｌ乳原料、より好ましくは１０7〜１０8ＣＦＵ／ｍｌ乳原料である。また、本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量の比は特に制限されないが、１０００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１がより好ましい。 The amount of Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium inoculated to the milk raw material is not particularly limited, but the lactic acid bacterium of the present invention is preferably 10 4 to 10 8 CFU / ml milk raw material, more preferably Is 10 6 to 10 7 CFU / ml milk raw material, and for Bifidobacterium, preferably 10 5 to 10 9 CFU / ml milk raw material, more preferably 10 7 to 10 8 CFU / ml milk raw material. Moreover, the ratio of the inoculation amount of Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium of the present invention is not particularly limited, but is preferably 1000: 1 to 1:10, and more preferably 10: 1 to 1: 1.
乳原料に接種する他の乳酸菌は、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。また、ビフィドバクテリウム属細菌も、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。 The other lactic acid bacteria inoculated into the milk raw material may be a single strain or a plurality of strains. Also, the Bifidobacterium genus bacterium may be a single strain or a plurality of strains.
乳原料に接種する本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌は、予め他の培地で種培養又は前培養しておくことが好ましい。培地としては、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌、並びに必要に応じて他の乳酸菌の培養に適した培地であれば特に制限されないが、例えば、還元脱脂粉乳を含む培地が挙げられる。還元脱脂粉乳の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。また種培養又は前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加してもよい。特にビフィドバクテリウム属細菌は、還元脱脂粉乳を含む培地での増殖性が低いため、生育促進物質、例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有する培地を用いることが好ましい。培地の殺菌条件は、前記と同様である。 The Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium of the present invention to be inoculated into the milk raw material, and other lactic acid bacteria as necessary, are preferably seeded or precultured in another medium in advance. The medium is not particularly limited as long as it is a medium suitable for cultivation of Lactococcus raffinolactis, Bifidobacterium, and other lactic acid bacteria as necessary. Examples include a medium containing reduced skim milk powder. It is done. The concentration of the reduced skim milk powder is preferably 3% (W / W) or more, particularly preferably 8% (W / W) or more. Moreover, you may add growth promoters, such as a yeast extract, reducing agents, such as L-cysteine, to the culture medium used for seed culture or preculture. In particular, Bifidobacterium bacteria have a low growth ability in a medium containing reduced skim milk, so use a medium containing a growth promoting substance, for example, 0.1 to 1% (W / W) yeast extract. Is preferred. The sterilization conditions for the medium are the same as described above.
必要に応じて、乳原料に、本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌に加えて、他の乳酸菌を加えて発酵を行ってもよい。他の乳酸菌としては、食品の製造に用いられるものであって、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌の生育を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば発酵食品がヨーグルトの場合、ストレプトコッカス・サーモフィルス、および、ラクトバチルス・デルブルッキー等が挙げられる。これらの乳酸菌は、単一の菌株であってもよく、複数の菌株であってもよい。 If necessary, in addition to Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium genus bacteria of the present invention, other lactic acid bacteria may be added to the milk raw material for fermentation. Other lactic acid bacteria are not particularly limited as long as they are used in food production and do not inhibit the growth of Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium, but fermented foods such as yogurt Examples include Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruecki. These lactic acid bacteria may be a single strain or a plurality of strains.
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、及びビフィドバクテリウム属細菌を用いて乳を発酵させた場合、通常、ｐＨが５付近であり、ドリンクヨーグルトが得られる。さらにストレプトコッカス・サーモフィルスやラクトバチルス・デルブルッキー等の乳酸菌を併用して発酵させると、ｐＨが低下し、よりしっかりとした組織を有したヨーグルト（スプーンで摂取できるヨーグルト）を製造することができる。 When milk is fermented using Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium of the present invention, the pH is usually around 5 and drink yogurt is obtained. Furthermore, when lactic acid bacteria such as Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruecki are fermented together, yogurt (yogurt that can be ingested with a spoon) with a reduced pH can be produced.
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス及びビフィドバクテリウム属細菌の接種量と、上記他の乳酸菌の接種量の比率は特に制限されないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。 The ratio of the inoculum of Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium of the present invention and the inoculum of other lactic acid bacteria is not particularly limited, but is preferably 1000: 1 to 10: 1.
本発明のラクトコッカス・ラフィノラクティス、ビフィドバクテリウム属細菌、及び他の乳酸菌を乳原料に接種する順序は特に問わず、全てを同時に投与してもよい。また、これらの細菌のうち任意の細菌を、複数回接種してもよい。 The order of inoculating the milk raw material with Lactococcus raffinolactis, Bifidobacterium, and other lactic acid bacteria of the present invention is not particularly limited, and all may be administered simultaneously. Moreover, you may inoculate arbitrary bacteria among these bacteria in multiple times.
培養温度、培養時間等の発酵条件は、通常の乳原料からの発酵食品の製造と同様の条件を採用することができる。例えば、培養温度は３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃がより好ましい。培養時間は、製造する発酵食品の種類によって適宜設定することができるが、通常、５〜１８時間が好ましい。 As fermentation conditions such as culture temperature and culture time, the same conditions as in the production of fermented foods from ordinary milk raw materials can be employed. For example, the culture temperature is preferably 30 ° C to 40 ° C, more preferably 36 ° C to 38 ° C. Although culture | cultivation time can be suitably set with the kind of fermented food to manufacture, 5 to 18 hours are preferable normally.
得られた発酵食品は、通常の乳原料からの発酵食品と同様に適宜加工することができる。例えば、発酵後の発酵食品をそのまま食品としてもよいし、均質化して液状に加工してもよい。さらに、蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を添加してもよい。また、発酵食品は、適宜、容器に充填してもよい。 The obtained fermented food can be appropriately processed in the same manner as fermented food from ordinary milk raw materials. For example, the fermented food after fermentation may be used as it is, or may be homogenized and processed into a liquid state. Furthermore, sweeteners such as sucrose, pectin, fruit, fruit juice, agar, gelatin, fats and oils, fragrances, coloring agents, stabilizers, reducing agents and the like may be added. Moreover, you may fill a container with a fermented food suitably.
上記のようにして製造される発酵食品は、ビフィドバクテリウム属細菌の保存生残性に優れている。また、本発明により製造される発酵食品に含まれるラクトコッカス・ラフィノラクティスは、該発酵食品の製造中及び保存中に、ラクトコッカス・ラクティス亜種細菌に感染するファージ、例えば、MCCφ223等の９３６タイプファージ等の感染を受けない。 The fermented food produced as described above is excellent in the preservation survival of Bifidobacterium. Further, the Lactococcus raffinolactis contained in the fermented food produced according to the present invention is a phage that infects Lactococcus lactis subspecies bacteria during production and storage of the fermented food, for example, 936 types such as MCCφ223. Not susceptible to phage infection.
次に、試験例及び実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to test examples and examples.
〔試験例１〕ラクトコッカス属細菌の自然界からの単離
ラクトコッカス属細菌を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。）で希釈し、下記組成のBriggs liver broth（前記文献、３１９ページ）の平板（寒天１５g/Lを含む）に塗布し、３０℃で嫌気培養した。
[Test Example 1] Isolation of Lactococcus bacteria from nature In order to obtain Lactococcus bacteria from nature, samples collected from nature in Japan were anaerobic dilutions (published in 1980 by Shubunsha Publishing Co., Ltd. It was diluted with the world of endophytic bacteria (page 322), applied to a plate (including 15 g / L of agar) of Briggs liver broth (the above-mentioned document, page 319) having the following composition, and anaerobically cultured at 30 ° C.
〔嫌気性希釈液〕
塩類溶液I（0.78% K2HPO4溶液） 37.5 ml
塩類溶液II（0.47% KH2PO4、1.18% NaCl、
1.20% (NH4)2SO4、0.12% CaCl2、0.25%
MgSO4・H2O を含む溶液） 37.5 ml
Resazurin （0.1%水溶液） 1 ml
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.5 g
Ｌ−アスコルビン酸 （25%水溶液） 2 ml
Na2CO3 （8%溶液） 50 ml
寒天 0.5 g
精製水 860 ml
[Anaerobic diluent]
Salt solution I (0.78% K 2 HPO 4 solution) 37.5 ml
Saline solution II (0.47% KH 2 PO 4 , 1.18% NaCl,
1.20% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.12% CaCl 2 , 0.25%
37.5 ml of a solution containing MgSO 4 · H 2 O
Resazurin (0.1% aqueous solution) 1 ml
L-cysteine HCl · H 2 O 0.5 g
L-ascorbic acid (25% aqueous solution) 2 ml
Na 2 CO 3 (8% solution) 50 ml
Agar 0.5 g
860 ml of purified water
〔Briggs liver broth〕
トマトジュース浸出液 400 ml
ネオペプトン（Difco） 15 g
酵母エキス（Difco） 6 g
肝臓エキス 75 ml
グルコース 20 g
可溶性でんぷん 0.5 g
NaCl 5 g
Tween 80 1 g
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.2 g
精製水 525 ml
pH 6.8
[Briggs liver broth]
Tomato juice leachate 400 ml
Neopeptone (Difco) 15 g
Yeast extract (Difco) 6 g
Liver extract 75 ml
Glucose 20 g
Soluble starch 0.5 g
NaCl 5 g
Tween 80 1 g
L-cysteine HCl / H 2 O 0.2 g
Purified water 525 ml
pH 6.8
そして、得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。これらの菌を、下記組成のＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。 And the bacteria which showed the form of streptococcus in the obtained colony and were Gram-positive by microscopic observation of the coated specimen were caught. These bacteria were streaked on a BL agar plate of the following composition, and anaerobic culture was repeated in the same manner as described above to obtain a purely isolated strain.
〔ＢＬ寒天培地〕
Lab-Lemco powder（Oxoid） 2.4 g
プロテオースペプトン No.3（Difco） 10 g
トリプチケース（Trypticase）（BBL） 5 g
フィトン（Phytone） 3 g
酵母エキス（Difco） 5 g
肝臓エキス 150 ml
グルコース 10 g
可溶性でんぷん 0.5 g
溶液Ａ 10 ml
トーレシリコンSH5535（10%溶液） 5 ml
Tween 80 1 g
寒天 15 g
Ｌ−システイン HCl・H2O 0.5 g
馬血液 50 ml
pH 7.2
肝臓エキス：肝臓末（極東）10gを170mlの精製水で50〜60℃の温浴槽中約１時間浸出した後、100℃で数分間加熱し、pH 7.2に調整してから濾紙で濾過する。
溶液Ａ：MgSO4・7H2O 15g、FeSO4・7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、MnSO4 0.337gを精製水250mlに溶解する。
Ｌ−システインと馬血液以外の成分を湯煎して溶解させ、pHを調整し、115℃で20分滅菌後、50℃に冷却し、Ｌ−システインと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。
[BL agar medium]
Lab-Lemco powder (Oxoid) 2.4 g
Proteose peptone No.3 (Difco) 10 g
Trypticase (BBL) 5 g
Phytone 3 g
Yeast extract (Difco) 5 g
Liver extract 150 ml
Glucose 10 g
Soluble starch 0.5 g
Solution A 10 ml
Torre Silicon SH5535 (10% solution) 5 ml
Tween 80 1 g
Agar 15 g
L-cysteine HCl · H 2 O 0.5 g
Horse blood 50 ml
pH 7.2
Liver extract: 10 g of liver end (far east) is leached with 170 ml of purified water for about 1 hour in a hot bath at 50-60 ° C., heated at 100 ° C. for several minutes, adjusted to pH 7.2, and filtered through filter paper.
Solution A: MgSO 4 · 7H 2 O 15g, FeSO 4 · 7H 2 O 0.5g, dissolved NaCl 0.5 g, the MnSO 4 0.337 g purified water 250 ml.
Ingredients other than L-cysteine and horse blood are dissolved in hot water, adjusted to pH, sterilized at 115 ° C for 20 minutes, cooled to 50 ° C, added with L-cysteine and horse blood, and dispensed into a petri dish. A flat plate.
これらの菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列を常法により同定した。ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information、国立バイオテクノロジー情報センター）の国際塩基配列データベース（GenBank）上で、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による16S リボソーマルRNA遺伝子配列の全長についての相同性検索を行い、それぞれのタイプストレインと９８％以上の相同性を有するラクトコッカス・ラフィノラクティス(Lactococcus raffinolactis)を２０株同定した。得られた菌株はすべて無芽胞、非運動性の通性嫌気性グラム陽性球菌で、カタラーゼおよびガス産生はいずれも陰性であった。 The base sequences of the genomic DNA of these strains were identified by a conventional method. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) on the international base sequence database (GenBank) of NCBI (National Center for Biotechnology Information) The homologous search for the full length of the 16S ribosomal RNA gene sequence was performed, and 20 strains of Lactococcus raffinolactis having 98% or more homology with each type strain were identified. The obtained strains were all non-spore, non-motile facultative anaerobic gram-positive cocci, and both catalase and gas production were negative.
〔試験例２〕ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験 [Test Example 2] Mixed culture test with Bifidobacterium longum
まず、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、培地 1mlあたり1.0×106〜5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して、シードカルチャーを得た。 First, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain was added to a medium containing 0.6% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder in an amount of 1.0 × 10 6 to 1 ml of the medium. 5.0 × 10 7 CFU was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain a seed culture.
また、ラクトースおよびグルコースを０．５％添加したDifco（登録商標）M17 Broth（ベクトン・ディッキンソン社製）に、ラクトコッカス各菌株、及び表１に記載の菌株の試験例１で得られた培養液を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。各培養菌体を、遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の乳性培地（１％グルコース（Ｗ／Ｗ）、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳）に懸濁し、シードカルチャーを得た。菌株名がJCMで始る菌株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（JCM）（〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1）から入手することができる。 In addition, the culture solution obtained in Test Example 1 of each strain of Lactococcus and strains described in Table 1 was added to Difco (registered trademark) M17 Broth (manufactured by Becton Dickinson) to which 0.5% of lactose and glucose was added. Was inoculated 3% and cultured at 30 ° C. for 16 hours. Each cultured cell is collected by centrifugation, washed, and then suspended in a milk medium (1% glucose (W / W), 10% (W / W) reduced skim milk powder) in the same amount as the original culture solution. It became cloudy and got a seed culture. Strains whose strain names start with JCM can be obtained from RIKEN Microbial System Storage Facility (JCM) (2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198).
前記と同じ組成の乳性培地（９５℃で１０分間殺菌）に、前記のように調製したラクトコッカスの各菌株のシードカルチャー、又は同様にして調製した各種ラクトコッカス属細菌のシードカルチャーを培地 1mlあたり5.0×106〜2.0×108CFUと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを培地 1mlあたり1.0〜5.0×107CFU 接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。 1 ml of a seed culture of each strain of Lactococcus prepared as described above or a seed culture of various Lactococcus bacteria prepared in the same manner in a milky medium (sterilized at 95 ° C. for 10 minutes) having the same composition as above and per 5.0 × 10 6 ~2.0 × 10 8 CFU, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain seed culture was 1.0~5.0 × 10 7 CFU inoculated per medium 1ml of, fermented for 16 hours at 37 ℃ I got milk.
前記発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数、及び溶存酸素を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行った。また、溶存酸素の測定は、発酵乳の温度を10℃に保ちながら蛍光式酸素計FO-960S (ASR社製)を用いて計測した。測定結果を表１に示す。表１中、「E+N」は、「×10n」を表す。 The fermented milk was rapidly cooled, and pH, the number of Bifidobacterium contained, and dissolved oxygen were measured. The number of bifidobacteria was measured on a TOS propionate agar medium (manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) flat plate. The dissolved oxygen was measured using a fluorescence oximeter FO-960S (manufactured by ASR) while maintaining the temperature of the fermented milk at 10 ° C. The measurement results are shown in Table 1. In Table 1, “E + N” represents “× 10 n ”.
一部の菌株は、２週間の10℃保存後に、ビフィズス菌を３０％以上生残させていた。これらの菌株はいずれも、２週間保存後の発酵乳中の溶存酸素が2.0ppm以下であった。 Some strains survived more than 30% of bifidobacteria after storage at 10 ° C. for 2 weeks. All of these strains had dissolved oxygen of 2.0 ppm or less in fermented milk after storage for 2 weeks.
〔試験例３〕
試験例で得られた、ビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に高める菌株について、ファージ感受性試験を実施した。ラクトコッカス・ラクティス FERM BP-10742をはじめ、様々なラクトコッカス・ラクティス菌株に感染する９３６タイプファージ(MCCφ223)を、前記と同じ組成の乳性培地３ｍｌに1.0×105PFU（plaque forming unit）、および前記のように調製したラクトコッカスの各菌株のシードカルチャーを、培地 1mlあたり5.0×106〜2.0×108 添加し、30℃、16時間培養した後の培地の凝固性を確認した。結果を表２に示す。
[Test Example 3]
A phage susceptibility test was performed on the strain obtained in the test example and increasing the survival rate of Bifidobacterium bacteria to 30% or more. Lactococcus lactis FERM BP-10742 and other 936 type phages (MCCφ223) that infect various Lactococcus lactis strains were added to 3 ml of a milk medium having the same composition as described above, 1.0 × 10 5 PFU (plaque forming unit), The seed culture of each strain of Lactococcus prepared as described above was added at 5.0 × 10 6 to 2.0 × 10 8 per 1 ml of the medium, and the coagulability of the medium after culturing at 30 ° C. for 16 hours was confirmed. The results are shown in Table 2.
幅広くラクトコッカス・ラクティス菌株に感染するファージも、ラクトコッカス・ラフィノラクティスには感染しなかった。本試験は、ファージMCCφ223に限定されるものではなく、その他公的機関より得られるラクトコッカス・ラクティス菌株に感染するファージを用いても、同様の結果を得ることができる。 Phage that were widely infected with Lactococcus lactis strains were not infected with Lactococcus raffinolactis. This test is not limited to phage MCCφ223, and similar results can be obtained using phages that infect Lactococcus lactis strains obtained from other public institutions.
〔実施例１〕
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス、及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬ（９０℃で３０分間殺菌）に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で４時間培養した。
なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のシードカルチャーは、０．６％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス及び１１％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株を1.0×106〜5.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
[Example 1]
30 mL of a seed culture of Lactococcus raffinolactis LcR21 strain was inoculated into 1000 mL of medium containing 10% (W / W) reduced skim milk powder (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes) and cultured at 25 ° C. for 16 hours. On the other hand, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain was added to 1000 mL of medium containing 0.2% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes). 100 ml of the seed culture was inoculated and cultured at 37 ° C. for 4 hours.
The seed culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain is a medium containing 0.6% (W / W) yeast extract and 11% (W / W) reduced skim milk powder. The longum ATCC BAA-999 strain was inoculated with 1.0 × 10 6 to 5.0 × 10 7 CFU and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
これとは別に、原料として脱脂粉乳、全粉乳、蔗糖及びペクチンを混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌した乳原料に、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR21株のカルチャー５００ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で２０時間培養して発酵乳を得た。 Separately, skim milk powder, whole milk powder, sucrose and pectin are mixed and dissolved as raw materials, milk fat 0.5% (W / W), non-fat milk solid content 8.0% (W / W), sucrose 8 A milk raw material 50 L composed of 0.0% (W / W) and pectin 0.2% (W / W) was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes and cooled to 40 ° C. The sterilized milk raw material is inoculated with 500 mL of the culture of Lactococcus raffinolactis LcR21 and the culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 previously cultured as described above and cultured at 37 ° C. for 20 hours. To obtain fermented milk.
前記発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．６６％、ｐＨ４．９、６．６×１０7ＣＦＵ／mlのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は４．４×１０7ＣＦＵ／mlであり、生残率は６６％であった。また、この時の溶存酸素濃度は1.49ppmであった。 The fermented milk was immediately stirred and cooled, and the cooled fermented milk was homogenized at a pressure of 15 MPa, filled in a 200 mL glass container and sealed to obtain a drink yogurt. The obtained drink yogurt contained bifidobacteria having a lactic acid acidity of 0.66%, a pH of 4.9, and 6.6 × 10 7 CFU / ml. When this drink yogurt was stored at 10 ° C. for 14 days, the number of bifidobacteria was 4.4 × 10 7 CFU / ml, and the survival rate was 66%. The dissolved oxygen concentration at this time was 1.49 ppm.
〔実施例３〕ヨーグルトの製造（Ｉ）
還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地１０００ｍＬに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、１６時間培養した。一方、酵母エキス０．１％（Ｗ／Ｗ）、及び還元脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）を含む培地（９０℃で３０分間殺菌）１０００ｍＬにストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃、５時間培養した。
なお、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のシードカルチャーは、０．１％（Ｗ／Ｗ）酵母エキスおよび１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に、1.0×105〜1.0×107CFU接種し、３７℃で１６時間培養して得た。
[Example 3] Production of yogurt (I)
30 mL of a seed culture of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis FERM BP-10758 strain was inoculated into 1000 mL of a medium containing 10% (W / W) reduced skim milk powder and cultured at 37 ° C. for 16 hours. On the other hand, seed culture of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain in 1000 mL of medium (sterilized at 90 ° C. for 30 minutes) containing yeast extract 0.1% (W / W) and reduced skim milk powder 10% (W / W) Was inoculated and cultured at 37 ° C. for 5 hours.
In addition, the seed culture of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis FERM BP-10758 strain is 1.0% in a medium containing 0.1% (W / W) yeast extract and 10% (W / W) reduced skim milk powder. It was obtained by inoculating × 10 5 to 1.0 × 10 7 CFU and culturing at 37 ° C. for 16 hours.
In addition, the seed culture of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain is 1.0 × 10 5 to 1.0 × in a medium containing 0.1% (W / W) yeast extract and 10% (W / W) reduced skim milk powder. 10 7 CFU was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質を混合溶解し、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（Ｗ／Ｗ）からなる乳原料５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した。さらに、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。 Non-fat dry milk, cream and milk protein are mixed and dissolved, and 50 liters of milk material consisting of milk fat 3.0% (W / W) and nonfat milk solid content 12.0% (W / W) is heated to 70 ° C And homogenized at a pressure of 15 MPa. Furthermore, it sterilized at 90 degreeC for 10 minute (s), and cooled to 40 degreeC.
この殺菌した乳原料に、前記の通り、前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスFERM BP-10758株のカルチャーを１５０ｍＬ、ストレプトコッカス・サーモフィルスFERM P-17216株のカルチャーを４５０ｍＬ、実施例１のLcC46株と同様の方法にて前培養を行ったラクトコッカス・ラフィノラクティスLcR32株のカルチャー５００ｍＬと、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃で４時間培養し、直ちに攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。 As described above, this sterilized milk raw material is 150 mL of the culture of Lactobacillus delbrucky subspecies Lactis FERM BP-10758 strain that has been pre-cultured, 450 mL of the culture of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain, Inoculated with 500 mL culture of Lactococcus raffinolactis LcR32 strain precultured in the same manner as the LcC46 strain of Example 1 and 500 mL culture of Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 strain at 37 ° C. After culturing for 4 hours, the mixture was immediately stirred and cooled, filled into a 100 mL paper cup container, and sealed to obtain yogurt.
得られたヨーグルトは乳酸酸度０．６９％、ｐＨ４．８９、１．０×１０8ＣＦＵ／ｍｌのビフィズス菌を含有していた。このヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は９．３×１０7ＣＦＵ／ｍｌであり、生残率は９３％であった。また、この時の溶存酸素濃度は0.69ppmであった。 The obtained yogurt contained bifidobacteria having a lactate acidity of 0.69%, a pH of 4.89, and 1.0 × 10 8 CFU / ml. When this yogurt was stored at 10 ° C. for 14 days, the number of bifidobacteria was 9.3 × 10 7 CFU / ml, and the survival rate was 93%. The dissolved oxygen concentration at this time was 0.69 ppm.
Claims (13)
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存した場合のビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、発酵食品の製造方法。 A method for producing a fermented food characterized by fermenting a milk raw material using Lactococcus raffinolactis and Bifidobacterium.
The Lactococcus raffinolactis is a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk, and the same bacteria are added at 5.0 × 10 6 to 2.0 × 10 6 per ml of the medium. 8 CFU and Bifidobacterium genus bacteria were inoculated at 1.0 × 10 7 to 3.0 × 10 9 CFU per 1 ml of the medium, respectively, and the pH of the medium reached 4.6 to 5.5 A fermented food production method having a property of maintaining the survival rate of Bifidobacterium bacteria at 30% or more when the medium is rapidly cooled at the time of storage at 10 ° C. for 2 weeks.
前記ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、及び１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む培地に同細菌を培地１ｍｌ当たり５．０×１０6 〜２．０×１０8 ＣＦＵ、及び、ビフィドバクテリウム属細菌を培地１ｍｌ当たり１．０×１０7 〜３．０×１０9 ＣＦＵ、各々接種して培養し、培地のｐＨが４．６〜５．５に達した時点で培地を急冷して、１０℃で２週間保存したときのビフィドバクテリウム属細菌の生残率を３０％以上に維持する性質を有する、ビフィドバクテリウム属細菌入り乳原料発酵用スターター。 A starter for fermenting milk ingredients consisting of Lactococcus raffinolactis,
The Lactococcus raffinolactis is a medium containing 1% (W / W) glucose and 10% (W / W) reduced nonfat dry milk, and the same bacteria are added at 5.0 × 10 6 to 2.0 × 10 6 per ml of the medium. 8 CFU and Bifidobacterium genus bacteria were inoculated at 1.0 × 10 7 to 3.0 × 10 9 CFU per 1 ml of the medium, respectively, and the pH of the medium reached 4.6 to 5.5 When the medium is rapidly cooled and stored at 10 ° C. for 2 weeks, the survival rate of the Bifidobacterium is maintained at 30% or more. starter.
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