JP2012031089A - Immunostimulator - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類を有効成分として含む免疫賦活剤に関する。 The present invention relates to an immunostimulant containing an acidic mucopolysaccharide produced by marine bacteria as an active ingredient.
免疫機構には多くの種類の細胞が関与しているが、特に白血球の役割は大きく、中でもマクロファージは免疫応答の初期段階での働きを含め、あらゆる段階に関与している重要な白血球の一種である。近年、白血球の働きが物質レベルで解明されてきており、白血球の機能や細胞間相互作用は、白血球が分泌する微量タンパク質（サイトカイン）によって担われることが分かってきている。 Many types of cells are involved in the immune system, but the role of leukocytes is particularly large, and macrophages are a type of important leukocytes that are involved in all stages, including the action in the early stages of the immune response. is there. In recent years, the function of leukocytes has been elucidated at the substance level, and it has been found that the functions and intercellular interactions of leukocytes are borne by trace proteins (cytokines) secreted by leukocytes.
マクロファージは元来貪食旺盛な細胞と定義されているが、単なる原始的食細胞にとどまらず、活性化することによりがん細胞に対する傷害性の獲得や各種サイトカイン類の放出によるリンパ球の活性化に関与する等深く免疫系に関与していることが明らかになってきた。マクロファージは一酸化窒素(ＮＯ)を産生する。一酸化窒素(ＮＯ)は、免疫系に重要な働きを担っており、ＮＯはヘルパーＴ細胞の賦活化や、サイトカインの合成促進などの作用を介して免疫力を増加させる方向に働く。したがって、ＮＯの産生促進は、免疫賦活の指標の一つとされており、従来より核酸、生薬抽出物、リポポリサッカライド、その他の多糖類等様々なマクロファージを活性化する物質が提案されている。例えば、核酸組成物(特許文献１)、海藻抽出物由来組成物(特許文献２)、乳酸菌製剤(特許文献３)、多糖類(特許文献４)などがあげられる。 Macrophages are originally defined as phagocytic cells, but they are not just primordial phagocytic cells, but they can be activated to acquire damage to cancer cells and activate lymphocytes by releasing various cytokines. It has become clear that they are deeply involved in the immune system. Macrophages produce nitric oxide (NO). Nitric oxide (NO) plays an important role in the immune system, and NO works in the direction of increasing immunity through actions such as activation of helper T cells and promotion of cytokine synthesis. Therefore, promotion of NO production is considered as one of the indicators of immunostimulation, and substances that activate various macrophages such as nucleic acids, herbal extracts, lipopolysaccharides, and other polysaccharides have been proposed. Examples include nucleic acid compositions (Patent Document 1), seaweed extract-derived compositions (Patent Document 2), lactic acid bacteria preparations (Patent Document 3), polysaccharides (Patent Document 4), and the like.
サイトカインには多くの種類があり、中でも、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）に代表される炎症性サイトカインは、主にマクロファージから放出される。ＴＮＦ−αの産生促進は免疫賦活の指標の一つとされており、腫瘍に対する免疫作用の強化や、直接的な抗腫瘍効果、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランス改善によるとされるアレルギー性疾患の改善効果や免疫賦活作用などが知られている（特許文献５）。 There are many types of cytokines. Among them, inflammatory cytokines represented by tumor necrosis factor (TNF-α) are mainly released from macrophages. The promotion of TNF-α production is considered as one of the indicators of immune activation. It is an allergic disease that is said to be due to enhanced immune action against tumors, direct anti-tumor effect, and improved balance between Th1 and Th2 cells. Improvement effects and immunostimulatory effects are known (Patent Document 5).
ＩＬ−１２はナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)を活性化する作用を有するサイトカインとして発見され、細胞性免疫活性の増加、マクロファージの活性化、ＩｇＥ産生抑制などの活性が確認されている(非特許文献１)。このためアレルギー、がん、ウイルス病等の治療薬としての応用が期待されている。また、ＩＬ−１２はＮＫ細胞やＮＫＴ細胞などの活性化による抗腫瘍性の発現に重要であり、がんを攻撃するキラーＴ細胞を強力に活性化し、細胞性免疫力を増強するＩＮＦ-γの産生や働きを活性化する。一方、ＩＬ−１２は生体の免疫バランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２）をＴｈ１側に誘導する作用を有することでアレルギーや自己免疫疾患の発症を抑制する効果があると期待されている。このようなＩＬ−１２産生促進作用を有するものとしては、従来、例えば、酸性ムコ多糖類（特許文献４）、マクロファージ活性化及びインターロイキン１２の産生を誘導するコンドロシン（特許文献６）が知られている。 IL-12 was discovered as a cytokine having an action of activating natural killer cells (NK cells), and activities such as increase in cellular immune activity, activation of macrophages, and suppression of IgE production have been confirmed (non-patent literature). 1). Therefore, it is expected to be applied as a therapeutic agent for allergies, cancers, viral diseases and the like. IL-12 is important for the expression of antitumor by activation of NK cells, NKT cells, etc., and INF-γ that strongly activates killer T cells that attack cancer and enhances cellular immunity. Activates the production and work of On the other hand, IL-12 is expected to have an effect of suppressing the onset of allergies and autoimmune diseases by having an action of inducing the immune balance (Th1 / Th2) of the living body to the Th1 side. Conventionally known examples of such an IL-12 production promoting action include acidic mucopolysaccharide (Patent Document 4), chondrosin (Patent Document 6) that induces macrophage activation and interleukin 12 production. ing.
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は活性化されたＴ細胞で産生され、免疫系に対して調節作用を有するサイトカインである。ＩＦＮ−γは、また、マクロファージを刺激して細菌を貪食殺菌させる作用がある。ＩＦＮ−γの産生促進は、免疫賦活の指標の一つとされており、このようなＩＦＮ−γ産生促進作用を有するものとしては、従来、例えば、乳酸菌産生多糖（特許文献７）等が報告されている。 Interferon-γ (IFN-γ) is a cytokine produced by activated T cells and having a regulatory effect on the immune system. IFN-γ also acts to stimulate macrophages to phagocytose bacteria. Promotion of IFN-γ production is considered as one of the indicators of immunostimulation, and conventionally, for example, polysaccharides produced by lactic acid bacteria (Patent Document 7) and the like have been reported as having such an IFN-γ production promotion action. ing.
前記した以外にも、多くの天然物について免疫賦活作用が研究され、効果が認められたいくつかの素材や抽出物が、健康食品等の原料として既に実用化されている。しかしながら、これらの中には 例えば、特許文献１にかかる発明にあっては、成分の種類や配合比率などが特定されておらず、また特許文献２にかかる発明にあっては、ネオアガロオリゴ糖とその脱硫化された中性糖を主体とし、それ以外にもより重合度の高い不消化物性多糖類、レクチン、核酸、灰分等を含有するものであった。さらに特許文献３にかかる発明にあっては、乳酸菌の菌体又はその処理物から成っていた。また、特許文献５に係る発明にあってはコショウ科植物成分を含有する免疫賦活性飲食物であり、特許文献７に係る発明にあっては、乳酸菌から産生された多糖類からなる免疫調節用組成物であった。すなわち、これらの文献にかかるいずれの発明も活性本体の特定がなされておらず、このままでは安全性や効力の面での検討が不十分であり実際上食品や医薬品としての応用が困難であった。そのため安全性と効力を兼ね備える免疫賦活剤の提供は、未だ求められているのが現状である。
また、特許文献４及び６に係る発明にあっては、特定の糖構造を有する糖鎖による免疫賦活剤ではあるが、免疫賦活活性作用が限定されていたので、さらに広範囲に有用で、安全な免疫賦活剤が求められていた。本発明はこれらの要望を満足する酸性ムコ多糖類からなる免疫賦活剤を提供することを目的とする。
In addition to the above, immunostimulatory action has been studied for many natural products, and several materials and extracts that have been found effective have already been put into practical use as raw materials for health foods and the like. However, among these, for example, in the invention according to Patent Document 1, the types of ingredients and the blending ratio are not specified, and in the invention according to Patent Document 2, neo-agaro-oligosaccharide and It was mainly composed of the desulfurized neutral sugar, and in addition, it contained indigestible polysaccharides, lectins, nucleic acids, ash, etc. having a higher degree of polymerization. Furthermore, in the invention concerning patent document 3, it consisted of the microbial cell of lactic acid bacteria, or its processed material. Moreover, in the invention which concerns on patent document 5, it is an immunostimulatory food and drink containing a pepper family plant component, and in the invention which concerns on patent document 7, it is for the immunoregulation which consists of the polysaccharide produced from lactic acid bacteria. It was a composition. That is, in any of the inventions related to these documents, the active body has not been specified, and as it is, examination in terms of safety and efficacy is insufficient and practical application as a food or medicine is difficult. . Therefore, at present, provision of an immunostimulator having both safety and efficacy is still required.
Further, in the inventions according to Patent Documents 4 and 6, although it is an immunostimulant with a sugar chain having a specific sugar structure, since the immunostimulatory activity is limited, it is more widely useful and safe. There has been a need for an immunostimulator. An object of the present invention is to provide an immunostimulant comprising an acidic mucopolysaccharide that satisfies these demands.
本発明は、特定の種類の糖からなる酸性ムコ糖類を有効成分とする免疫賦活剤からなり、海洋細菌が産生する酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する以下に記載の免疫賦活剤に関する。 The present invention comprises an immunostimulant comprising an acidic mucosaccharide comprising a specific type of sugar as an active ingredient, and contains an acidic mucopolysaccharide produced by marine bacteria or a physiologically acceptable salt or derivative thereof as an active ingredient. The present invention relates to the immunostimulant described below.
（１）糖構成分が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトース、ピルビン酸、Ｄ−アラニンからなり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万である酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
（２）上記酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体の糖構成成分のモル比が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニン＝（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３）であることを特徴とする上記（１）に記載の免疫賦活剤。
（３）上記酸性ムコ多糖類が、コベティア属微生物由来の多糖類であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の免疫賦活剤。
（４）上記コベティア属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９５の微生物であることを特徴とする上記（３）記載の免疫賦活剤。
（５）一酸化窒素（ＮＯ）産生誘導活性、ＴＮＦ-α産生誘導活性、ＩＬ−１２産生誘導活性、及びＩＮＦ-γ産生誘導活性から選ばれた少なくともいずれかの作用を有することを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(1) The sugar component consists of N-acetyl-D-glucosamine, D-galactronic acid, N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose, pyruvic acid, D-alanine, and the average measured by gel filtration chromatography An immunostimulant comprising an acidic mucopolysaccharide having a molecular weight of 1,000,000 to 1,500,000 as a standard, or a physiologically acceptable salt or derivative thereof as an active ingredient.
(2) The molar ratio of the sugar constituents of the acidic mucopolysaccharide or physiologically acceptable salt or derivative thereof is N-acetyl-D-glucosamine: D-galactronic acid: N-acetyl-D-galactosamine: D -Galactose: pyruvic acid: D-alanine = (1.0-1.2): (1.6-1.8): (2.4-2.6): 1: (1.2-1.4 ): The immunostimulator according to (1) above, which is (1.1 to 1.3).
(3) The immunostimulator according to (1) or (2) above, wherein the acidic mucopolysaccharide is a polysaccharide derived from a Covetia microorganism.
(4) The immunostimulator according to (3) above, wherein the microorganism belonging to the genus Covetia is a microorganism having a deposit number of FERM P-21295.
(5) It has at least one action selected from nitric oxide (NO) production induction activity, TNF-α production induction activity, IL-12 production induction activity, and INF-γ production induction activity The immunostimulant according to any one of (1) to (4) above.
本発明によれば、安全性と効力を兼ね備える免疫賦活剤が提供される。
また、ＮＯの産生、ＴＮＦ−αの産生、ＩＬ−１２の産生及びＩＦＮ−γの産生、を誘導する新たな手段が提供される。
According to the present invention, an immunostimulator having both safety and efficacy is provided.
Also provided are new means for inducing NO production, TNF-α production, IL-12 production and IFN-γ production.
［免疫賦活化剤］
本発明者等は、優れた免疫賦活効果を有する物質を見出すべく、マウス由来マクロファージ様細胞株及びマウス脾臓細胞を用いて検索した。その結果、海洋細菌が産生する酸性ムコ多糖類が、マクロファージ及び脾臓細胞の免疫機能性促進作用を有することを知見した。また、上記酸性ムコ多糖類は、細胞毒性が極めて弱く、免疫賦活化剤として極めて有効であることを見出した。即ち、本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、海洋細菌が産生する酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する免疫賦活剤に関する。
[Immunostimulator]
The present inventors searched using a mouse-derived macrophage-like cell line and a mouse spleen cell in order to find a substance having an excellent immunostimulatory effect. As a result, it was found that acidic mucopolysaccharides produced by marine bacteria have an effect of promoting immune function of macrophages and spleen cells. The acidic mucopolysaccharide was found to be extremely effective as an immunostimulator because of its extremely low cytotoxicity. That is, this invention is completed based on the said knowledge, and relates to the immunostimulant which contains the acidic mucopolysaccharide which marine bacteria produce as an active ingredient.
かかる酸性ムコ多糖類としては、海洋細菌コベチア・エスピー P-21295(Cobetia sp. P-21295)菌株又はその変異株の培養物より分離精製された酸性ムコ多糖類を用いることが好ましい（非特許文献２）。本酸性ムコ多糖類は、すでに公知の物質であり（非特許文献２、特許文献８参照）。また、本酸性ムコ多糖類は、メラニン培養細胞のメラニン生成抑制効果を有することが知られているが、これをＮＯ及びサイトカイン類の誘導活性剤等の免疫賦活剤として使用したという報告は、現在までに全く知られていないものである。 As such acidic mucopolysaccharides, it is preferable to use acidic mucopolysaccharides isolated and purified from the culture of the marine bacterium Cobeetia sp. P-21295 (Cobetia sp. P-21295) or its mutants (non-patent document). 2). The acidic mucopolysaccharide is a known substance (see Non-Patent Document 2 and Patent Document 8). In addition, this acidic mucopolysaccharide is known to have an inhibitory effect on melanin production in cultured melanin cells, but reports that it is used as an immunostimulator such as an inducing activator for NO and cytokines are currently available. It is not known at all.
本酸性ムコ多糖類は、ＮＯ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、及びＩＦＮ−γ、の産生の誘導を促進することができることから、免疫賦活効果が期待される医薬分野、健康食品分野及び化粧品分野に有用な素材を提供することができる。特に花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギーやリウマチなどの自己免疫疾患及びがんの予防又は治療に有効である。また、本酸性ムコ多糖類は、免疫賦活活性として、例えばマクロファージ活性化作用に伴う腫瘍壊死因子(ＴＮＦ-α)の誘導能を有する。この活性は、本酸性ムコ多糖類が免疫系を介して抗腫瘍性を有することを示唆するものである。 Since the present acidic mucopolysaccharide can promote the induction of production of NO, TNF-α, IL-12, and IFN-γ, the pharmaceutical field, the health food field, and the cosmetic field where an immunostimulatory effect is expected Useful materials can be provided. It is particularly effective for the prevention or treatment of allergies such as hay fever and atopic dermatitis, autoimmune diseases such as rheumatism, and cancer. The acidic mucopolysaccharide has an ability to induce tumor necrosis factor (TNF-α) associated with macrophage activation, for example, as an immunostimulatory activity. This activity suggests that the acidic mucopolysaccharide has antitumor properties via the immune system.
［免疫賦活組成物］
上記多糖類を免疫賦活組成物として用いる場合、有効成分である本酸性ムコ多糖類と医薬品又は食品に一般に用いられている各種成分、例えば、油分、保湿剤、防腐剤、殺菌剤、色剤、粉末、香料、増粘剤、緩衝剤などを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。また、上記免疫賦活組成物に、本酸性ムコ多糖類を配合するに当たっては、これら化合物のＩＮＦ−γ誘導作用及びＩＬ−１２産生誘導作用等を考慮することが好ましく、一般にはこれら化合物を有効成分として少なくとも０．００１重量％以上、好ましくは０.０１〜２０．０重量％程度添加すればよい。必ずしも有効成分を単離して使用する必要はなく、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の化合物を含む粗精製物を使用することができる。免疫賦活組成物の剤型は任意であり、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、ドリンク剤等の可溶化系、乳液又はクリーム等の乳化系、あるいは軟膏又は分散液などの剤型をとることができる。
上記免疫賦活剤は、優れた免疫賦活効果を示すと共に、安定性及び高い安全性を併せ持つ。例えば、がん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の発生を防ぐことができる。また、既に発症しているがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の治療に使用できる。
[Immunostimulatory composition]
When using the polysaccharide as an immunostimulatory composition, the acidic mucopolysaccharide as an active ingredient and various components commonly used in pharmaceuticals or foods, such as oils, moisturizers, preservatives, bactericides, colorants, A powder, a fragrance, a thickener, a buffering agent, and the like are prepared by appropriately blending the dosage form within a range not impairing the effects of the present invention. In addition, in blending the acidic mucopolysaccharide with the immunostimulatory composition, it is preferable to consider the INF-γ inducing action and the IL-12 production inducing action of these compounds, and generally these compounds are effective ingredients. And at least 0.001% by weight or more, preferably about 0.01 to 20.0% by weight. It is not always necessary to isolate and use the active ingredient, and a crude product containing the compound of the present invention can be used as long as the effects of the present invention are not impaired. The dosage form of the immunostimulatory composition is arbitrary, for example, a solubilizing system such as a capsule, tablet, pill, granule or drink, an emulsifying system such as an emulsion or cream, or a dosage form such as an ointment or dispersion. Can be taken.
The immunostimulant exhibits an excellent immunostimulatory effect and has both stability and high safety. For example, the occurrence of cancer, viral disease, atopic dermatitis and the like can be prevented. It can also be used to treat cancers that have already developed, viral diseases, atopic dermatitis, and the like.
［有効成分］
本発明で用いられる酸性ムコ多糖類は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。本酸性ムコ多糖類の調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水又は人工海水で調製した培地で培養して多糖類を生産し、採取、精製して得ることができる（非特許文献２）。より具体的には、例えば、炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する多糖類生産用海水培地においてコベチア・エスピー P-21295(Cobetia sp. P-21295)菌株又はその変異株を培養し、培養液中から本酸性ムコ多糖類を分離、精製して得ることができる。前記した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより、本発明の有効成分である本多糖が効率的に生産されることとなる。
[Active ingredients]
As the acidic mucopolysaccharide used in the present invention, those prepared by various methods can be used as long as they are purified to such an extent that they can be used as pharmaceuticals. Various methods are known as methods for preparing the present acidic mucopolysaccharide. For example, polysaccharides can be produced by culturing marine microorganisms in a medium prepared with sucrose as a carbon source, peptone as a nitrogen source, seawater containing yeast extract or artificial seawater, and collected and purified (non-patented). Reference 2). More specifically, for example, in the seawater medium for polysaccharide production containing sucrose as a carbon source, peptone as a nitrogen source, and yeast extract, a Covetia sp. P-21295 (Cobetia sp. It can be obtained by culturing and separating and purifying the acidic mucopolysaccharide from the culture broth. By culturing microorganisms using the above-mentioned medium and microorganisms using conventional methods, the present polysaccharide, which is the active ingredient of the present invention, can be produced efficiently.
本発明の免疫賦活剤として用いられる多糖類は、構成糖のモル比がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニン＝（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３)の範囲にあり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることが好ましい。構成成分の分析には、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィー又はアミノ酸自動分析装置を用いることができる。この構成成分の分析には、多糖類を２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、又は４Ｎ−ＨＣｌで１００℃、１２時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでＴＦＡ又はＨＣｌを除いたものを検体とし、各種標品との比較によって中性糖、ウロン酸、有機酸、アミノ糖又はアミノ酸の分析を行う。構成有機酸の分析にはこの他に酵素法又はNMR分析装置を用いて解析することができる。 The polysaccharide used as the immunostimulant of the present invention has a constituent sugar molar ratio of N-acetyl-D-glucosamine: D-galactronic acid: N-acetyl-D-galactosamine: D-galactose: pyruvic acid: D-alanine. = (1.0-1.2) :( 1.6-1.8) :( 2.4-2.6): 1: (1.2-1.4) :( 1.1-1. It is preferable that the average molecular weight measured by gel filtration chromatography is in the range of 3) to 1 million to 1.5 million using pullulan as a standard. Cellulose acetate membrane electrophoresis, high performance liquid chromatography, or an amino acid automatic analyzer can be used for analysis of the constituent components. For analysis of this component, polysaccharides were hydrolyzed with 2M trifluoroacetic acid (TFA) or 4N-HCl at 100 ° C. for 12 hours, and TFA or HCl was removed with a rotary evaporator as samples. Neutral sugars, uronic acids, organic acids, amino sugars or amino acids are analyzed by comparison with standard products. In addition to this, analysis of the constituent organic acid can be carried out using an enzymatic method or an NMR analyzer.
本多糖類の分子量の測定は、ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いることができる。具体的には、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ−７Ｍ（昭和電工製）をカラムとする高速液体クロマトグラフィー（島津製）を使用し、０．１Ｍ−ＮａＣｌを移動相とし、分子量既知のプルラン（Shodex STANDARD KIT P-82、昭和電工製）を標準サンプルとして作成した分子量保持時間標準曲線を使用して測定することができる。 Gel filtration chromatography can be used to measure the molecular weight of the polysaccharide. Specifically, high-performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu) using Asahipak GFA-7M (manufactured by Showa Denko) as a column, 0.1M-NaCl as the mobile phase, and pullulan (Shodex STANDARD KIT P- 82, manufactured by Showa Denko) as a standard sample, and a molecular weight retention time standard curve.
本多糖類はカルバゾール硫酸法で陽性を示し、ウロン酸の存在が推測される。また上記の条件で加水分解した検体はエルソン−モルガン法で陽性を示すことからヘキソサミンが含まれていると判断できる。また塩の存在下において第４級アンモニウム塩により沈殿を生じることからも、本発明の多糖類は酸性多糖であると認められる。 The polysaccharide is positive by the carbazole sulfate method, and the presence of uronic acid is presumed. Moreover, it can be judged that the sample hydrolyzed on said conditions contains hexosamine from positive by the Elson-Morgan method. In addition, since the quaternary ammonium salt causes precipitation in the presence of the salt, the polysaccharide of the present invention is recognized as an acidic polysaccharide.
［酸性ムコ多糖類産生菌］
本酸性ムコ多糖類産生菌は、瀬戸内海で採取した海水をスクリーニング源として窒素源、炭素源および海水で調製し、寒天で固めた寒天平板培地で、２２〜２８℃にて２日〜７日間培養し、生育した粘稠性を示すコロニーを釣菌して純粋分離して得た。この菌株を上記と同じ組成の液体培地で振とう培養し、多糖類を産生することを確認して選別した。多糖類の免疫賦活作用を調べ、本菌株（FERM P-21295）がその目的に適った性質を有することを知見し、選別した。
得られた本菌株の16S rDNA塩基配列、さらには培養学的および生化学的特性を調べることにより、該菌株の同定を試み、コベティア(Cobetia)属に属する微生物であることを明らかにした。次いで本規菌株の培養物を分析し、本酸性ムコ多糖類が産生されていることを確認した。前記した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより本多糖が効率的に生産される。
[Acid mucopolysaccharide-producing bacteria]
This acid mucopolysaccharide-producing bacterium is an agar plate medium prepared with a nitrogen source, a carbon source and seawater using seawater collected from the Seto Inland Sea as a screening source and hardened with agar at 22 to 28 ° C. for 2 to 7 days. Cultivated and grown, colonies showing viscous properties were obtained by pure isolation. This strain was cultured with shaking in a liquid medium having the same composition as described above, and confirmed to produce polysaccharides. The immunostimulatory action of the polysaccharide was examined, and it was found that the present strain (FERM P-21295) has properties suitable for its purpose.
By examining the 16S rDNA base sequence of the obtained strain, as well as culture and biochemical characteristics, it was attempted to identify the strain and revealed that it was a microorganism belonging to the genus Cobetia. Subsequently, the culture of this strain was analyzed to confirm that the acidic mucopolysaccharide was produced. The polysaccharide is efficiently produced by culturing microorganisms using the above-mentioned medium and microorganisms using conventional methods.
［微生物の菌学的性質］
コベティア（Cobetia）属に属し寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９５として寄託されている微生物株は、本多糖類を産生する能力があり、瀬戸内海の海水より本発明者らによって純粋分離されたものである。
次にこの微生物株の菌学的性質について述べる。本微生物は、コベティア（Cobetia）属に属し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９５として寄託されている微生物であり、以下の菌学的性質を有する。
＜形態＞
細胞の形態：桿菌
運動性：無し
胞子形成：無し
＜生育状態＞
コロニーの形態：円形
コロニーの色調：クリーム色
コロニーの表面：スムーズ
生育温度：１０℃、３７℃及び４５℃で生育する。
生育ｐＨ：５.５〜９.５（至適生育ｐＨ：６．５〜７．５）
酸素要求性：好気性
[Mycological properties of microorganisms]
The microbial strain belonging to the genus Cobetia and deposited under the deposit number FERM P-21295 has the ability to produce this polysaccharide and has been purely isolated by the present inventors from seawater of the Seto Inland Sea.
Next, the mycological properties of this microbial strain will be described. This microorganism belongs to the genus Cobetia and is deposited under the deposit number FERM P-21295, and has the following mycological properties.
<Form>
Cell morphology: Aspergillus motility: None Sporulation: None <Growth state>
Colony morphology: Circular colony color: Cream color Surface of colony: Smooth growth temperature: Grows at 10 ° C, 37 ° C and 45 ° C.
Growth pH: 5.5 to 9.5 (optimum growth pH: 6.5 to 7.5)
Oxygen demand: Aerobic
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
カタラーゼ反応：陽性
オキシダーゼ反応：陰性
O／Fテスト(酸化／発酵) ：陰性／陰性
β−ガラクトシダーゼ活性：陰性
インドール産生：陰性
硝酸塩還元：陰性
でんぷん加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ウレアーゼ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
資化性 （Ｄ-グルコース、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、こはく酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、Ｌ-アラニン）：有り
資化性 （Ｌ-アラビノース、マルトース、ラクトース、サッカロース、D-マンノース、D-マンニトール、Ｎ-アセチル-D-グルコサミン、ｎ-カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ-リンゴ酸、酢酸フェニル、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-セリン）：無し
本微生物は、16S rDNA塩基配列がCobetia marina DSM 4741のそれと99.4%の相同率を有し、かつ100%は一致しない塩基配列を有する。
<Physiological properties>
Gram staining: Negative catalase reaction: Positive oxidase reaction: Negative
O / F test (oxidation / fermentation): negative / negative β-galactosidase activity: negative indole production: negative nitrate reduction: negative starch hydrolysis: negative gelatin hydrolysis: negative esculin hydrolysis: negative urease: negative arginine dihydrolase: negative Assimilation (D-glucose, sodium acetate, sodium citrate, sodium gluconate, sodium succinate, sodium lactate, sodium propionate, L-alanine): Available assimilation (L-arabinose, maltose, lactose, saccharose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-D-glucosamine, n-capric acid, adipic acid, dl-malic acid, phenyl acetate, L-histidine, L-serine): None This microorganism has 16S rDNA base sequence Has 99.4% homology with that of Cobetia marina DSM 4741 and 100% does not match Having the nucleotide sequence.
本微生物は、コベティア(Cobetia)属微生物に適した培養条件での培養にて培養物を得、次に培養物から多糖を分離することにより回収可能なコベティア(Cobetia)属微生物である。より詳細には、Cobetia marina DSM 4741(非特許文献３、４)と99.4%の相同な16S rDNA塩基配列を有し、かつ、100%の相同率は有しない微生物であり免疫賦活作用を有する本多糖類を産生する微生物である。 This microorganism is a microorganism belonging to the genus Cobetia that can be recovered by culturing under culture conditions suitable for microorganisms belonging to the genus Cobetia and then separating the polysaccharide from the culture. More specifically, this book has a 99.4% homologous 16S rDNA base sequence with Cobetia marina DSM 4741 (Non-patent Documents 3 and 4) and does not have a 100% homology rate and has an immunostimulatory effect. It is a microorganism that produces polysaccharides.
なお、Cobetia marina DSM4741株は、Cobetia marina の標準株として位置付けられている。寄託番号と公の寄託先は、下記のとおりである。
１． ATCC253741(American Type Culture Collection, Manassas, VA. USA)
２．DSM4741(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Braunschweig, Germany)
３． NCIMB1877(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)
コベティア(Cobetia)属の微生物は、海洋微生物であり海洋資源開発の進展の中で興味が持たれているものの一つであり、DSM4741株は、Arahalら(非特許文献４)によって命名され、承認されているものである(非特許文献３)。
本微生物は、コベティア(Cobetia)属に属することが、16S rDNA塩基配列分析などの分類学的調査を通じて決定されたことより、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６)に寄託し、平成１9年5月2日、寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９５として受託された。
The Cobetia marina DSM4741 strain is positioned as a standard strain of Cobetia marina. Deposit numbers and public deposit numbers are as follows.
1. ATCC253741 (American Type Culture Collection, Manassas, VA. USA)
2. DSM4741 (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Braunschweig, Germany)
3. NCIMB1877 (National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)
The microorganism of the genus Cobetia is a marine microorganism and is one of interest in the progress of marine resource development. The DSM4741 strain is named and approved by Arahal et al. (Non-patent Document 3).
The fact that this microorganism belongs to the genus Cobetia was determined through taxonomical surveys such as 16S rDNA nucleotide sequence analysis. As a result, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) It was deposited in Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 1-chome, 1-chome, 1-center, 6), and was deposited on May 2, 1999 as deposit number FERM P-21295.
（酸性ムコ多糖類の製造方法）
酸性ムコ多糖類の製造方には、（ア）コベティア（Cobetia）属に属し寄託番号FERM P-21295として寄託されている微生物を培地中で培養し多糖類を産生させて培養物を得る工程と、（イ）培養物から多糖類を単離する工程と、を含む。以下詳細に説明する。
(Method for producing acidic mucopolysaccharide)
The method for producing acidic mucopolysaccharides includes (a) a step of culturing a microorganism belonging to the genus Cobetia and depositing the deposit number FERM P-21295 in a medium to produce a polysaccharide and producing a culture. (A) isolating the polysaccharide from the culture. This will be described in detail below.
（ア）微生物を培養し多糖類を産生する工程
多糖類を得るためには、本微生物（ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９５）又はその変異株を用いる。微生物として本菌株又はその変異株を用いることで、多糖類を効率的に生産することができる。液体培養は静置、振とう(攪拌)、通気培養法、および固形培養には寒天平板法を用いることができる。
基本培地としては、多糖類を産生しうる微生物が生育できるものであって、少なくとも炭素源と、窒素源と、各種無機塩とおよび微量元素とを適量含有するものが用いられる。さらに好ましくは、上記基本培地として、コベティア(Cobetia)属に属する微生物が生育できるものが用いられる。炭素源としては、グルコース等の糖、あるいは糖蜜や廃糖蜜が挙げられる。炭素源として１種又は２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の化合物やペプトン、酵母エキス、アミノ酸などの天然物が挙げられる。窒素源として１種又は２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。無機塩として１種又は２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。固体培地の場合は寒天を用いる。
(A) Step of culturing microorganisms to produce polysaccharides In order to obtain polysaccharides, the present microorganism (FERM P-21295) or a mutant thereof is used. By using this strain or a mutant thereof as a microorganism, polysaccharides can be produced efficiently. For liquid culture, stationary, shaking (stirring), aeration culture, and agar plate can be used for solid culture.
As the basic medium, a microorganism capable of growing a polysaccharide capable of producing a polysaccharide and containing an appropriate amount of at least a carbon source, a nitrogen source, various inorganic salts, and trace elements is used. More preferably, a culture medium capable of growing microorganisms belonging to the genus Cobetia is used as the basic medium. Examples of the carbon source include sugars such as glucose, molasses and waste molasses. One or two or more carbon sources can be used alone or in combination. Nitrogen sources include compounds such as nitrates and ammonium salts, and natural products such as peptone, yeast extract and amino acids. One or two or more nitrogen sources can be used alone or in combination. Examples of the inorganic salt include phosphate, magnesium salt, potassium salt and the like. One or two or more inorganic salts can be used alone or in combination. In the case of a solid medium, agar is used.
培養条件は使用する培地、培地のｐＨ、培地への添加物、培養温度などは通常微生物の培養の際に用いられている条件をそのまま用いることができる。培養時のｐＨは微生物が生育し、かつ多糖類を生産する範囲（ｐＨ５.５〜９.５）であれば制限されないが、通常は６．５から７．５の範囲のｐＨが好ましい。培養温度については微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、２２℃から２８℃の範囲が多糖類の産生には良好である。培養期間は培養のｐＨや温度により変化するが、通常２日から７日が適切である。 The culture conditions used can be the same as those normally used for culturing microorganisms, such as the medium to be used, the pH of the medium, the additives to the medium, and the culture temperature. The pH during the cultivation is not limited as long as the microorganism grows and produces a polysaccharide (pH 5.5 to 9.5), but a pH in the range of 6.5 to 7.5 is usually preferable. The culture temperature is not limited as long as microorganisms grow and produce polysaccharides, but a range of 22 ° C. to 28 ° C. is good for producing polysaccharides. The culture period varies depending on the culture pH and temperature, but usually 2 to 7 days is appropriate.
コベティア（Cobetia）属に属し寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９５として寄託されている微生物を、炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地で静置、振とう(又は撹拌)、又は通気条件で２２℃から２８℃の範囲で２日から７日間培養することが好ましい。 A microorganism belonging to the genus Cobetia and deposited under the deposit number FERM P-21295 is allowed to stand in a culture medium containing a carbon source, a nitrogen source and a mineral salt, shaken (or stirred), or aerated at 22 ° C. It is preferable to culture for 2 to 7 days in the range of from 2 to 28 ° C.
上記した培地と本微生物を用いて微生物を培養することにより、目的とする多糖類が効率的に産生されることとなる。上記により得られた多糖画分は、糖分析反応(フェノール硫酸法、カルバゾール硫酸法など)および加水分解後HPLC分析によりアミノ糖、アミノ酸又は有機酸を分析することができる。さらに、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度の多糖類を高収率で得ることが可能となる。 By culturing a microorganism using the above medium and the present microorganism, the target polysaccharide is efficiently produced. The polysaccharide fraction obtained as described above can be analyzed for amino sugar, amino acid or organic acid by sugar analysis reaction (phenol sulfate method, carbazole sulfate method, etc.) and HPLC analysis after hydrolysis. Furthermore, a high-purity polysaccharide can be obtained in a high yield through the extraction / recovery process described below.
（イ）産生された多糖類を分離・回収する工程
上記製造方法で得られた培養物から多糖類を抽出する方法としては、多糖類の分離回収に用いられる種々の方法を用いることができる。例えば、液体培養の場合は培養物をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、２〜３倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは１〜１５重量％塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を２〜３回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや塩析および活性炭処理法などを用いることができる。
(I) Step of separating and collecting the produced polysaccharide As a method for extracting the polysaccharide from the culture obtained by the above production method, various methods used for separating and collecting the polysaccharide can be used. For example, in the case of liquid culture, after sterilizing the culture as it is or at a high temperature, the microbial cells are removed by centrifugation, and this is left as it is or concentrated, and then 2-3 times the amount of ethanol, isopropanol, or Acetone or the like is added to cause precipitation. This precipitate is dissolved again in water or 1 to 15% by weight sodium chloride solution, and then precipitation with alcohol or the like is repeated 2-3 times, dialyzed with water, and using a spray dryer or a freeze dryer. The polysaccharide is obtained by drying. In addition, electrodialysis and ultrafiltration can be used. For further purification, various types of chromatography such as ion exchange and gel filtration, salting out, activated carbon treatment, and the like can be used.
以上の工程により多糖類が産生および回収される。本実施形態により得られる多糖類は特に制限なく種々の用途に使用されうるものであるが、本多糖類には本明細書に記載のとおり免疫賦活効果のあることから、健康食品分野および医薬分野、及び化粧品分野に有用な素材を提供することができる。 The polysaccharide is produced and recovered through the above steps. The polysaccharide obtained according to the present embodiment can be used for various applications without any particular limitation. However, since the polysaccharide has an immunostimulatory effect as described in the present specification, the field of health food and the field of medicine And materials useful in the cosmetics field.
多糖類の調製方法としては、各種の方法が使用され得るが、用途の制限を受けないという観点からは、医薬として使用できる程度に精製し得るものが好ましい。例えば、本菌株を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水又は人工海水を寒天で固めた培地又は寒天を加えない液体培地で培養して多糖類を生産し、採取、精製して得ることができる。より具体的には、例えば、液体培養では、炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する多糖類産生用海水培地において本菌株又はその変異株を培養し、培養液から多糖類を分離、精製して得ることができる。 Various methods can be used as a method for preparing the polysaccharide, but from the viewpoint of not being restricted in use, those that can be purified to a degree that can be used as a pharmaceutical are preferable. For example, sucrose is used as a carbon source, peptone is used as a nitrogen source, seawater containing yeast extract or artificial seawater is cultured in agar or liquid medium without adding agar to produce polysaccharides, collected and purified Can be obtained. More specifically, for example, in liquid culture, sucrose is used as a carbon source, peptone is used as a nitrogen source, and the present strain or a mutant thereof is cultured in a polysaccharide-producing seawater medium containing yeast extract. It can be obtained by separation and purification.
［製造例１］
ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、蔗糖３％の組成を有し海水で調製した培地を、温度１２１℃としたオートクレーブ中で１５分間滅菌し、本菌株(FERM P-21295)の斜面培養から、1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(１０ｍｌ)に接種し、２５℃の温度で２４時間静置培養を行い、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成の培地２００ｍｌ(１２１℃、１５分間滅菌)に接種し、２５℃の温度で３日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。
尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。
[Production Example 1]
A medium prepared with seawater having a composition of 0.5% peptone, 0.1% yeast extract and 3% sucrose was sterilized in an autoclave at a temperature of 121 ° C. for 15 minutes, and the strain (FERM P-21295) From the slant culture, 1 platinum loop is inoculated into the above-mentioned sterilized medium (10 ml) in a test tube, followed by stationary culture at a temperature of 25 ° C. for 24 hours. 200 ml of the medium (121 ° C., sterilized for 15 minutes) and static culture at 25 ° C. for 3 days. After culturing, the culture broth is centrifuged, filtered using a filter aid (Radiolite # 500), ethanol is added to the supernatant from which the bacterial cells have been removed, and the precipitated fraction is collected. The fraction which precipitates was collected, dissolved in water, dialyzed, treated with activated carbon, and freeze-dried to obtain a polysaccharide fraction.
In addition, as a practical purification level, the polymer fraction obtained by a membrane filtration apparatus equipped with a hollow fiber UF membrane module (Spectrum) having a molecular weight of 50,000 cut from the culture filtrate is concentrated in a short time. Desalted and recovered, treated with activated carbon, and powdered by freeze-drying. The membrane filtration apparatus used was SYLS-SB04 manufactured by Toyobo Engineering.
本多糖を２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、又は４Ｎ−ＨＣｌで１００℃、１２時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでＴＦＡ又はＨＣｌを除いたものを検体とし、構成成分の分析を行った。その結果、本多糖類は、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィー又はアミノ酸自動分析法でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、Ｄ−アラニンが構成成分として認められ、それらのモル比がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニンが（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３)の範囲にあり、ピルビン酸は酵素法においても同様な結果が得られた。またＧＦＡ−７Ｍ（昭和電工製）をカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることが認められた。この結果から本多糖類は公知の酸性ムコ多糖類であると同定された。 This polysaccharide was hydrolyzed with 2M trifluoroacetic acid (TFA) or 4N-HCl at 100 ° C. for 12 hours, and the component was analyzed by removing TFA or HCl with a rotary evaporator as a specimen. As a result, this polysaccharide was obtained by N-acetyl-D-glucosamine, D-galactronic acid, N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose, pyrubin by cellulose acetate membrane electrophoresis, high performance liquid chromatography or amino acid automatic analysis. Acid, D-alanine is recognized as a component, and the molar ratio thereof is N-acetyl-D-glucosamine: D-galactronic acid: N-acetyl-D-galactosamine: D-galactose: pyruvic acid: D-alanine ( 1.0-1.2) :( 1.6-1.8) :( 2.4-2.6): 1: (1.2-1.4) :( 1.1-1.3) As for pyruvic acid, similar results were obtained in the enzymatic method. The average molecular weight of GFA-7M (manufactured by Showa Denko) measured by gel filtration chromatography using a column was found to be 1 million to 1.5 million using pullulan as a standard. From this result, this polysaccharide was identified as a known acidic mucopolysaccharide.
［製造例２］
前培養までは製造例１と同様に処理し、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地２００ml(１２１℃、１５分間)に接種し、２５℃の温度で３日間振とう培養を行った。次いで培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。このようにして得られた多糖類については、製造例１と同様に処理しセルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、製造例１に記載の糖構成及び平均分子量の範囲内にあるムコ糖類が製造されていることを確認した。
[Production Example 2]
Until the preculture, the same treatment as in Production Example 1 was carried out, and then this preculture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask in 200 ml of sterilized medium (121 ° C, 15 minutes) prepared from seawater having the above composition, and 25 ° C. The shaking culture was performed at the temperature of 3 days. Next, the culture solution is centrifuged and then filtered using a filter aid (Radiolite # 500), ethanol is added to the supernatant, and the fractions that precipitate are collected. The fraction was collected, dissolved in water, dialyzed, treated with activated carbon, and freeze-dried to obtain a polysaccharide fraction. As a practical purification level, a polymer fraction obtained from a culture filtrate by a membrane filtration apparatus equipped with a hollow fiber UF membrane module (Spectrum) having a molecular weight of 50,000 cut is concentrated and removed in a short time. The salt was recovered, treated with activated carbon, and powdered by lyophilization. The membrane filtration apparatus used was SYLS-SB04 manufactured by Toyobo Engineering. The polysaccharide thus obtained was treated in the same manner as in Production Example 1 and the uniformity was confirmed using a cellulose acetate membrane electrophoresis, and it was described in Production Example 1 by chemical analysis and nuclear magnetic resonance analysis. It was confirmed that mucosaccharides in the range of the sugar composition and the average molecular weight were produced.
［製造例３］
前培養までは製造例１と同様に処理し、上記製造例１で述べた培地に寒天を１．５％添加した寒天平板培地２５０ｍｌを平板(１８×２６ｃｍ)に広げて前培養液を塗沫し、２５℃の温度で４日間培養を行った後、寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、１％フエノール液に懸濁させ、遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)で菌体を濾過により除いて得られた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。このようにして得られた多糖類については、製造例１と同様に処理しセルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、製造例１に記載の糖構成及び平均分子量の範囲内にあるムコ糖類が製造されていることを確認した。
[Production Example 3]
The pre-culture is processed in the same manner as in Production Example 1, 250 ml of agar plate medium with 1.5% agar added to the medium described in Production Example 1 above is spread on a flat plate (18 × 26 cm) and smeared with the pre-culture solution After culturing for 4 days at a temperature of 25 ° C., scrape the sticky matter generated on the surface of the agar plate, suspend it in 1% phenol solution, centrifuge and filter with a filter aid (Radiolite # 500). The fraction obtained by adding ethanol to the supernatant obtained by filtration of bacterial cells and collecting the precipitate is collected. After dissolving in water, ethanol is added again to collect the precipitated fraction. After dissolving in water, the fraction is dialyzed and treated with activated carbon. The polysaccharide fraction was obtained by lyophilization. In addition, as a practical purification level, the polymer fraction obtained by a membrane filtration apparatus equipped with a hollow fiber UF membrane module (Spectrum) having a molecular weight of 50,000 cut from the culture filtrate is concentrated in a short time. Desalted and recovered, treated with activated carbon, and powdered by freeze-drying. The polysaccharide thus obtained was treated in the same manner as in Production Example 1 and the uniformity was confirmed using a cellulose acetate membrane electrophoresis, and it was described in Production Example 1 by chemical analysis and nuclear magnetic resonance analysis. It was confirmed that mucosaccharides in the range of the sugar composition and the average molecular weight were produced.
［免疫機能性の検討］
製造例で得られた酸性ムコ多糖類を使用して、マウス由来マクロファージ様細胞株(J774.1)のＮＯ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２産生誘導作用を検討した。また、マウス脾臓細胞を用いて酸性ムコ多糖類のＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生誘導作用を調べそれぞれ免疫機能性を検討した。
[Examination of immune functionality]
Using the acidic mucopolysaccharide obtained in the production example, the NO, TNF-α and IL-12 production inducing action of the mouse-derived macrophage-like cell line (J774.1) was examined. In addition, IL-12, IFN-γ and TNF-α production-inducing effects of acidic mucopolysaccharides were examined using mouse spleen cells, and immunofunctionality was examined respectively.
(マクロファージの産生するＮＯ及びＴＮＦ−α)
製造例１で得られた酸性ムコ多糖類を使用した。培養液には、１０%(V/V)ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(コージンバイオ社製)を用いた。マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1(Riken Cell Bank)を所定の濃度となるように含む上記培養液を９６穴プレートに播種し(1.5×105個/well)、マクロファージ細胞に分化誘導した。上記培養液に溶解し０．２μｍのフイルターで予め滅菌した試料を所定の濃度となるように添加して３７℃、５%ＣＯ２下で培養した。２４時間培養後、培養上清を回収し、酸化窒素（ＮＯ）が培地中で酸化されることによって生ずる亜硝酸イオン濃度をグリース試薬法で、又、ＴＮＦ−αの濃度をサイトカイン測定キット(BioSource International, Inc.)を用いてＥＬＩＳＡ法でそれぞれ測定した。なお、ＮＯ産生量は、陽性コントロールであるＬＰＳ（１０μg/ml）添加時のＮＯ産生量を測定し、比活性（ＬＰＳのＮＯ産生量に対するサンプルのNO産生量、単位：%）をＮＯ産生能とした。これらの結果を図１及び図２にそれぞれ示す。
(NO and TNF-α produced by macrophages)
The acidic mucopolysaccharide obtained in Production Example 1 was used. As the culture solution, RPMI1640 medium (manufactured by Kojin Bio Inc.) containing 10% (V / V) FBS was used. The above culture solution containing mouse-derived macrophage-like cell line J774.1 (Riken Cell Bank) at a predetermined concentration was seeded in a 96-well plate (1.5 × 10 5 cells / well) to induce differentiation into macrophage cells. A sample dissolved in the above culture solution and sterilized in advance with a 0.2 μm filter was added to a predetermined concentration and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 24 hours, the culture supernatant is recovered, and the nitrite ion concentration produced by oxidation of nitric oxide (NO) in the medium is determined by the Grease reagent method, and the concentration of TNF-α is determined by the cytokine measurement kit (BioSource International, Inc.) and measured by ELISA method. The NO production amount is determined by measuring the NO production amount when LPS (10 μg / ml) as a positive control is added, and the specific activity (NO production amount of the sample with respect to the NO production amount of LPS, unit:%) is the NO production ability. It was. These results are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
図１に示されるように、対照ではＮＯ産生誘導は全く認められなかった。しかし、本酸性ムコ多糖類を添加すると濃度依存的にＮＯ産生誘導を促進し、マクロファージ活性化作用のあることが認められた。
また、図２に示されるように、本酸性ムコ多糖類で刺激することにより低い濃度（０．１μg／ml）でＴＮＦ−α産生誘導を促進し、マクロファージ活性化作用のあることが認められた。
As shown in FIG. 1, no NO production induction was observed in the control. However, it was confirmed that the addition of the acidic mucopolysaccharide promotes NO production induction in a concentration-dependent manner and has a macrophage activation effect.
In addition, as shown in FIG. 2, it was confirmed that stimulation with the acidic mucopolysaccharide promoted TNF-α production induction at a low concentration (0.1 μg / ml) and had a macrophage activation effect. .
(マクロファージの産生するＩＬ−１２)
製造例１で得られた酸性ムコ多糖類を使用した。培養液には、１０%(V/V)ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(和光純薬社製)を用いた。マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1(Riken Cell Bank)を含む上記培養液を４８穴プレートに播種し(4.0×105個/well)た。２４時間培養後、予め０．２μｍのフイルターで滅菌した試料を所定の濃度になるように添加した培養液と交換して３７℃、５%ＣＯ２下で培養した。２４時間培養後、培養上清を回収し、ＩＬ−１２の濃度をサイトカイン測定キット(インビトロジェン社)を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。この結果を図３に示す。
(IL-12 produced by macrophages)
The acidic mucopolysaccharide obtained in Production Example 1 was used. As the culture solution, RPMI1640 medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% (V / V) FBS was used. The culture solution containing the mouse-derived macrophage-like cell line J774.1 (Riken Cell Bank) was seeded in a 48-well plate (4.0 × 10 5 cells / well). After culturing for 24 hours, the sample was sterilized with a 0.2 μm filter in advance and replaced with a culture solution added to a predetermined concentration, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected, and the concentration of IL-12 was measured by ELISA using a cytokine measurement kit (Invitrogen). The result is shown in FIG.
図３に示されるように対照ではＩＬ−１２産生誘導は全く認められなかった。しかし、本酸性ムコ多糖類を添加するとＩＬ−１２産生誘導を促進し、マクロファージ活性化作用のあることが認められた。 As shown in FIG. 3, no IL-12 production induction was observed in the control. However, it was confirmed that the addition of the acidic mucopolysaccharide promotes the induction of IL-12 production and has a macrophage activation effect.
(脾臓細胞の産生するＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、及びＴＮＦ−α)
製造例１で得られた酸性ムコ多糖類を使用した。培養液には、１０%(V/V)ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(和光純薬社製)を用いた。C3H/HeN及びC57BL/6J Hamマウス（8週齢、メス）の脾臓細胞を採取し、この混合細胞を含む上記培養液を４８穴プレートに播種した(2.0×107個/well)。このウェル中の細胞懸濁液に、予め上記培養液に溶解した試料を所定の濃度になるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間培養後培養上清を回収し、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度をサイトカイン測定キット(インビトロジェン社)を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。この結果を図４〜６に示す。
(IL-12, INF-γ, and TNF-α produced by spleen cells)
The acidic mucopolysaccharide obtained in Production Example 1 was used. As the culture solution, RPMI1640 medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% (V / V) FBS was used. Spleen cells of C3H / HeN and C57BL / 6J Ham mice (8 weeks old, female) were collected, and the culture medium containing the mixed cells was seeded in a 48-well plate (2.0 × 10 7 cells / well). A sample previously dissolved in the culture solution was added to the cell suspension in the well so as to have a predetermined concentration, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected, and the concentrations of IL-12, IFN-γ and TNF-α were measured by ELISA using a cytokine measurement kit (Invitrogen). The results are shown in FIGS.
図４〜６に示されるように、本酸性ムコ多糖類存在下(10μg/ml)で培養したマウスC3H/HeN系とC57BL/6ＪHam系脾臓細胞では、いずれもＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの産生誘導はそれぞれ対照に比べて著しく促進され、リポ多糖ＬＰＳ（0.1μg/ml, シグマ社) と同様なレベルで産生された。免疫賦活作用のあることが認められた。一方、本酸性ムコ多糖類によるＩＬ−１２の産生誘導促進効果は両系統のマウス脾臓細胞ではあまり変わらなかったが、ＩＦＮ-γの産生量はＮＫ活性の低下したC57BL/6ＪHam系がＬＰＳに対する感受性が高いC3H/HeN系の１／５と低くＴｈ１型細胞の活性化が示唆された。 As shown in FIGS. 4 to 6, IL-12, INF-γ and TNF are all used in mouse C3H / HeN and C57BL / 6JHam spleen cells cultured in the presence of the acidic mucopolysaccharide (10 μg / ml). -Α production induction was remarkably promoted as compared to the control, and was produced at the same level as lipopolysaccharide LPS (0.1 μg / ml, Sigma). It was confirmed to have an immunostimulatory effect. On the other hand, the IL-12 production-inducing effect of the acidic mucopolysaccharide was not significantly changed in both strains of mouse spleen cells, but the amount of IFN-γ produced by the C57BL / 6JHam system with reduced NK activity was sensitive to LPS. The activation of Th1-type cells was suggested to be as low as 1/5 of the high C3H / HeN system.
本発明は酸性ムコ多糖類を有効成分として含む免疫賦活剤に関するものであり、一酸化窒素（ＮＯ）産生誘導活性、ＴＮＦ-α産生誘導活性、ＩＬ−１２産生誘導活性、及びＩＮＦ-γ産生誘導活性の優れた免疫賦活作用を呈する新しい剤である。一般には、これら糖化合物を有効成分として少なくとも０．００１重量％以上、好ましくは０.０１〜２０．０重量％程度添加した医薬品又は食品類として提供されるが、有効成分は必ずしも単離・精製して使用する必要はなく、必要に応じて免疫誘導効果を損なわない範囲で、本発明の糖化合物を含む粗精製物をも使用することができるため使用する態様が制限されることが少ない。また、有効成分の糖構成や組成比が特定されているため安全性や効力の面で十分な試験・検討が可能となり、食品や医薬品への応用が迅速化されて実用性のある免疫賦活剤として提供される。さらに、本免疫賦活剤は、優れた免疫賦活効果を示すと共に、安定性及び高い安全性を併せ持つため、例えば、がん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の発生を防ぐことができるとともに、既に発症しているがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の治療に使用できる優れた医薬品を提供することを可能とする。
The present invention relates to an immunostimulant comprising an acidic mucopolysaccharide as an active ingredient, and nitric oxide (NO) production inducing activity, TNF-α production inducing activity, IL-12 production inducing activity, and INF-γ production inducing. It is a new agent that exhibits an immunostimulatory action with excellent activity. Generally, these sugar compounds are provided as pharmaceuticals or foods to which at least 0.001% by weight or more, preferably about 0.01 to 20.0% by weight as an active ingredient is added, but the active ingredient is not necessarily isolated and purified. The crude product containing the sugar compound of the present invention can also be used as long as it does not impair the immunity-inducing effect, so that the mode of use is rarely limited. In addition, because the sugar composition and composition ratio of the active ingredient are specified, it is possible to conduct sufficient tests and studies in terms of safety and efficacy, and the application to foods and pharmaceuticals has been accelerated and has practical utility. Offered as. Furthermore, the present immunostimulant exhibits an excellent immunostimulatory effect and has both stability and high safety, and thus can prevent the occurrence of cancer, viral diseases, atopic dermatitis, etc. It is possible to provide excellent pharmaceuticals that can be used for the treatment of developing cancer, viral diseases, atopic dermatitis, and the like.
Claims (5)
2. It has at least one action selected from nitric oxide (NO) production induction activity, TNF-α production induction activity, IL-12 production induction activity, and INF-γ production induction activity. The immunostimulant in any one of 4 thru | or 4.
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