JP2012021951A - 軟ｘ線顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】ナノメートルオーダーの超微細な構造の顕微鏡観察を行うことができるようにする。
【解決手段】光源としてコヒーレントな軟Ｘ線を用い、軟Ｘ線の進路上に光学レンズは一切用いず、反射ミラー１１〜１３やハーフミラー１５等の反射光学系を用いて軟Ｘ線の進路を形成するとともに、軟Ｘ線の波面収差を除去する波面補償手段としてデフォーマブルミラー１４を備えることにより、反射光学系によって形成された進路上を超短波の軟Ｘ線が途中で吸収されることなく伝播し、ＣＣＤ検出器１７に対して試料２００の像を結像させることができるようにするとともに、デフォーマブルミラー１４により軟Ｘ線の波面収差を除去して、短波長の限界にせまる集光性を実現して空間分解能を上げることができるようにする。
【選択図】図１

Description

本発明は軟Ｘ線顕微鏡に関し、特に、光源として超短波長の軟Ｘ線を用いた顕微鏡に用いて好適なものである。

光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。特に、分子生物学においては、生体試料における分子挙動の観察をウェットな状態で行うこと、かつ、可能な限りの高い空間分解能を達成することが望まれている。例えば、ＤＮＡやアミノ酸、タンパク質、細胞小器官等の活動を、生きた細胞で観察したいという需要が多く、そのために必要な顕微鏡の開発が進められている。

生体試料の顕微鏡観察においては、生体試料そのものが屈折率不整合層として働く。このような条件下での顕微鏡観察においては、その屈折率不整合層によって発生する球面および非球面収差を補正することが重要な課題である。この課題に対して、アダプティブミラー（可変鏡、変形鏡、補償鏡、補正鏡ともいう）を用いた波面補正法が広く用いられている（例えば、特許文献１〜３を参照）。なお、波面補正法においては、所定の最適化アルゴリズムを用いて、アダプティブミラーの表面形状が決定される。

特許文献１，２に記載の顕微鏡は、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。具体的には、複数波長の光の光路中に波面補償手段を設け、光の波面収差を波面補償手段により除去する。波面補償手段として、ミラー自身の形状を波長オーダーで制御可能なデフォーマブルミラーを用いる。これにより、特にイレース光に対して波面の乱れを除去して完全な中空形状をもつビームに整形できるようにし、空間分解能を向上させている。

特許文献３には、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を用いた顕微鏡（ＣＡＲＳ顕微鏡）が開示されている。これは、目標とする分子を蛍光色素で染色することなく観察できるようにするもので、ＣＡＲＳ顕微鏡法を用いれば、無染色で、分子の固有振動を直接検出することができる。この特許文献３に記載の顕微鏡では、試料を透過した散乱光の波面（集光前の波面）を波面検出手段によりを検出して、集光位置および集光における収差を求め、それをもとに散乱光の透過波面を波面補正手段により補正している。そして、集光位置調節手段としてデフォーマブルミラーを用いている。

特開２００４−２３９６６０号公報 特開２００５−２６６７０５号公報 特開２００５−６２１５５号公報

近年、ホルモンのシグナル伝達や免疫応答、ウイルス感染、神経変性疾患、炎症反応などでの細胞微細構造の観察がますます重要になってきている。このように超微細な構造の顕微鏡観察を可能とするためには、光源としてナノメートルオーダーに達する超短波長のコヒーレント光源を用いることにより、空間分解能（解像度）を更に上げる必要がある。

しかしながら、上記特許文献１〜３に代表される従来の技術では、可視域から紫外域の光源を用い、集光手段として光学レンズを用いている。ところが、光学レンズを用いた透過光学系では、レンズ材質の透過特性により紫外域の光源までしか適用ができない。すなわち、紫外域より波長が短いナノメートルオーダーの超短波長域の光は光学レンズを透過することができず（吸収されてしまう）、生体試料における超微細な分子挙動の顕微鏡観察を行うことができないという問題があった。

本発明は、このような問題を解決するために成されたものであり、ナノメートルオーダーの超微細な構造の顕微鏡観察を行うことができるようにすることを目的とする。

上記した課題を解決するために、本発明では、光源として、紫外線と硬Ｘ線との間の波長域にある軟Ｘ線を用いる。そして、軟Ｘ線の進路上に光学レンズは用いず、反射ミラーを用いて軟Ｘ線の進路を形成する。さらに、軟Ｘ線の進路上に、当該軟Ｘ線の波面収差を除去する波面補償手段を備えるようにしている。

上記のように構成した本発明によれば、光学レンズを用いた透過光学系ではなく、反射ミラーを用いた反射光学系によって軟Ｘ線の進路が形成される。反射光学系では、適用可能な波長に制限がないため、数ナノメートルという短波長域の軟Ｘ線でも問題なく伝播する。また、波面補償手段により軟Ｘ線の波面収差が除去されることにより、短波長の限界にせまる集光性が実現される。これにより、ナノメートルオーダーという超高分解能な顕微鏡を実現することができ、超微細な構造の顕微鏡観察を行うことができるようになる。

本実施形態による軟Ｘ線顕微鏡の構成例を示す図である。 本実施形態による軟Ｘ線顕微鏡の他の構成例を示す図である。 本実施形態による軟Ｘ線顕微鏡の更に別の構成例を示す図である。

以下、本発明の一実施形態を図面に基づいて説明する。図１は、本実施形態による軟Ｘ線顕微鏡の構成例を示す図である。図１に示すように、本実施形態の軟Ｘ線顕微鏡は、複数の反射ミラー１１〜１３、デフォーマブルミラー１４、ハーフミラー１５、ピンホール１６、ＣＣＤ検出器１７および真空容器１８を備えて構成されている。

本実施形態の軟Ｘ線顕微鏡は、軟Ｘ線発生装置１００と共に使用する。軟Ｘ線発生装置１００は、水の窓波長域の軟Ｘ線を発生する。一般に、Ｘ線は波長が１[ｐｍ]〜数１０[ｎｍ]程度の電磁波であり、これには硬Ｘ線と軟Ｘ線とがある。硬Ｘ線は、エネルギーが高くて物質に対する透過性が強いＸ線のことであり、体は透過するが、骨は透過しないため、例えばレントゲン写真を撮影するのに用いられる。一方、軟Ｘ線は、硬Ｘ線よりエネルギーが低くて物質に対する吸収が強く透過性が弱いＸ線のことである。

通常、生体分子である細胞は水分が多く、透過度が高いため、硬Ｘ線では細胞の様子を観察することができない。ところが、硬Ｘ線と紫外線との間の波長域にある軟Ｘ線は、硬Ｘ線に比べて透過度が弱く、物質との相互作用が高くなるので、細胞の観察が可能となる。特に、２〜５[ｎｍ]の波長の軟Ｘ線は、水の層は透過するが、タンパク質などは透過しない。そのため、この波長領域では水の影響が無視でき、水分を含んだままのウェットな状態で生体細胞を観察できることから、当該波長領域は「水の窓」と呼ばれている。

軟Ｘ線発生装置１００から発生された軟Ｘ線のビームは、反射ミラーの一種である凸面鏡１１およびデフォーマブルミラー１４にて順次反射し、ハーフミラー１５を透過した後、反射ミラーの一種である凹面鏡１２で更に反射して、試料２００に至る。

凸面鏡１１、デフォーマブルミラー１４および凹面鏡１２は、軟Ｘ線発生装置１００から試料２００までの軟Ｘ線の進路上に設けられ、軟Ｘ線発生装置１００から発生された軟Ｘ線を試料２００まで伝播させる第１の反射ミラーに相当する。このうち、凸面鏡１１は、軟Ｘ線発生装置１００により発生された軟Ｘ線のビーム径を広げる役割を有する。デフォーマブルミラー１４の前段において凸面鏡１１が軟Ｘ線のビーム径を広げることにより、デフォーマブルミラー１４の制御面を広く有効に活用できるようにしている。

また、凹面鏡１２は本発明における第１の凹面鏡に相当し、当該凹面鏡１２によって軟Ｘ線を試料２００に集光させる。なお、上述の凸面鏡１１において軟Ｘ線のビーム径を広げるのは、デフォーマブルミラー１４の後段において凹面鏡１２が軟Ｘ線を集光しやすいようにするためでもある。

また、デフォーマブルミラー１４は、本発明における波面補償手段に相当し、軟Ｘ線の進路上（本実施形態では、凸面鏡１１とハーフミラー１５との間）に設けられ、当該軟Ｘ線の波面収差を除去する。デフォーマブルミラー１４は、波面センサで軟Ｘ線の波面を検出しながら、コンピュータ制御でミラー自身の波面補償素子にフィードバックをかける。そして、ミラーの裏面からアクチュエータを動かしてミラーの形状（微小領域の凹凸あるいは傾きなど）を変形させることにより、波長オーダーで最適波面を得るものである。

本実施形態では、可視域から紫外域（以下、可視域等という）の光ではなく、それよりも波長が短い水の窓波長域の軟Ｘ線を光源として用いている。この場合、デフォーマブルミラー１４の形状（膜厚）をナノメートルオーダーで制御することが必要となる。そのために、ミラーの材質は、可視域等の場合とは全く異なるものを使用する必要がある。例えば、デフォーマブルミラー１４に多層膜を使うとすれば、その材質をＳｉ−Ｍｏ系とするのが好ましい。金属膜を使う場合は、Ａｕ，Ｐｔなどの薄膜が好ましい。波長に対しフラットな特性を持つからである。他の反射ミラー１１〜１３も同様の材質で形成するのが好ましい。

なお、デフォーマブルミラー１４の代わりに、フレネルゾーンプレートを用いることも可能である。ただし、フレネルゾーンプレートは極微加工において高いコストがかかるというデメリットがある。また、素子は能動的でなく固定であり、熱歪みにも極めて弱い。この点で、デフォーマブルミラー１４を用いる方が好ましい。しかし、デフォーマブルミラー１４を用いた場合も、使う光源が超短時間パルスでなければ、やはり熱歪み等が生じる。

そこで、軟Ｘ線発生装置１００として、超短時間パルスの軟Ｘ線を発生するものを使用するのが好ましい。例えば、本発明者はフェムト−アト秒という極短時間内のパルス状態で軟Ｘ線のレーザや高次高調波を発生可能にした光学素子を開発済みであり、これを軟Ｘ線発生装置１００に使用することが可能である（例えば、「PHYSICAL RWVIEW LETTERS, VOLUME 89, NUMBER 25,“Highly Directive 18.9 nm Nickel-like Molybdenum X-Ray Laser Operating at 150 mJ Pump Energy”」、「Journal of Modern Optics, Vol.53, No.10, 10 July 2006,1451-1458,“33rd harmonic generation form aluminium plasma”」を参照）。

試料２００に軟Ｘ線を照射することによって、試料２００から発生（反射）する軟Ｘ線は、再び凹面鏡１２で反射した後、ハーフミラー１５および凹面鏡１３にて順次反射し、ピンホール１６を通ってＣＣＤ検出器１７に至る。ＣＣＤ検出器１７は、本発明における軟Ｘ線検出手段に相当し、試料２００に軟Ｘ線を照射することによって試料２００から発生（反射）する軟Ｘ線の強度を検出する。

凹面鏡１２，１３およびハーフミラー１５は、試料２００からＣＣＤ検出器１７までの軟Ｘ線の進路上に設けられ、軟Ｘ線を試料２００からＣＣＤ検出器１７まで伝播させる第２の反射ミラーに相当する。このうち、凹面鏡１３は本発明における第２の凹面鏡に相当し、当該凹面鏡１３によって軟Ｘ線をＣＣＤ検出器１７に集光させる。凹面鏡１３とＣＣＤ検出器１７との間には、軟Ｘ線のＣＣＤ検出器１７への集光性を高めるためにピンホール１６を設けている。

以上に説明した各構成要素１１〜１７、軟Ｘ線発生装置１００および試料２００は、軟Ｘ線発生装置１００からＣＣＤ検出器１７までの軟Ｘ線の進路を覆う中空の真空容器１８の内部に収納されている。図示はしていないが、真空容器１８には、試料２００を出し入れ可能な窓が設けられている。軟Ｘ線は空気中を伝播しないので、軟Ｘ線を照射して試料２００の観察を行うときは、真空ポンプ（図示せず）などを用いて真空容器１８内を真空状態にする。

本実施形態では、超短波長の軟Ｘ線を試料２００の極微細部分に照射し、当該試料２００で反射した軟Ｘ線を集光してＣＣＤ検出器１７に結像させるようにしている。このため、試料２００の所望領域を観察したい場合は、試料２００を移動させて軟Ｘ線の照射位置を変更する。試料２００を移動させるために、例えば、試料２００を載せたステージ（図示せず）を操作子の操作により任意に移動させることが可能な移動機構（図示せず）を設けてもよい。あるいは、試料２００を移動させるのではなく、軟Ｘ線の進路を変えるための機構（例えば、コイルに流す電流でミラーの角度を変えることによってビームの進路を制御可能に成されたガルバノミラー）を軟Ｘ線の進路上に設けてもよい。

図２は、本実施形態による軟Ｘ線顕微鏡の他の構成例を示す図である。なお、この図２において、図１に示した符号と同一の符号を付したものは同一の構成要素であるので、ここでは重複する説明を省略する。

図２において、軟Ｘ線発生装置１００から発生された軟Ｘ線は、凸面鏡１１およびデフォーマブルミラー１４にて順次反射し、凹面鏡１２で更に反射して、試料２００’に至る。この図２の例において、試料２００’は極めて薄く加工されており（例えば、５０[ｎｍ]以下の厚さ）、軟Ｘ線が透過する。このようにして試料２００’に軟Ｘ線を照射することによって、試料２００’から発生（透過）した軟Ｘ線は、凹面鏡１３にて反射し、ピンホール１６を通ってＣＣＤ検出器１７に結像する。

図３は、本実施形態による軟Ｘ線顕微鏡の更に別の構成例を示す図である。なお、この図３において、図１示した符号と同一の符号を付したものは同一の構成要素であるので、ここでは重複する説明を省略する。

図３において、軟Ｘ線発生装置１００から発生された軟Ｘ線は、凸面鏡１１およびデフォーマブルミラー１４にて順次反射し、凹面鏡１２で更に反射して、試料２００に至る。そして、このようにして試料２００に軟Ｘ線を照射することによって、試料２００から発生（反射）する軟Ｘ線を、ダイレクトにＣＣＤ検出器１７に結像させる。

図３に示す例の場合、試料２００で反射した軟Ｘ線は集光が行われておらず、ダイレクトにＣＣＤ検出器１７に結像するので、試料２００に対する軟Ｘ線の照射部分（ナノメートルオーダーの超微細構造）がＣＣＤ検出器１７に拡大して結像する。この場合、試料２００とＣＣＤ検出器１７との距離に応じて、像の拡大率が決まる。このため、試料２００の超微細な構造を、上記距離に応じた拡大率により拡大して観察することができる。

ただし、図３の例の場合は、試料２００に照射された軟Ｘ線が分子において反射、吸収、散乱、回折を起こした状態の合成像がそのままＣＣＤ検出器１７に結像する。この結像は、軟Ｘ線の強度情報に加えて位相情報を含んだものであり、試料２００の実像をフーリエ変換した像に相当する。したがって、ＣＣＤ検出器１７に結像した画像をコンピュータ（図示せず）等により逆フーリエ変換することにより、実像に変換する必要がある。つまり、軟Ｘ線のようなコヒーレント光を用いる場合、試料２００で反射してＣＣＤ検出器１７にダイレクトに結像する軟Ｘ線は、強度情報に加えて位相情報を持つので、逆フーリエ変換をすることによって強度情報による実像を得ることができる。

以上詳しく説明したように、本実施形態では、光源として水の窓波長域のコヒーレントな軟Ｘ線を用いる。そして、当該軟Ｘ線の進路上に、軟Ｘ線を吸収してしまう光学レンズは一切用いず、反射ミラー１１〜１３やハーフミラー１５等の反射光学系を用いて軟Ｘ線の進路を形成する。さらに、軟Ｘ線の波面収差を除去する波面補償手段としてデフォーマブルミラー１４を備えるようにしている。

このように構成した本実施形態によれば、反射光学系によって形成された進路上を超短波の軟Ｘ線が途中で吸収されることなく伝播し、ＣＣＤ検出器１７に対して試料２００の像を結像させることができる。また、デフォーマブルミラー１４により軟Ｘ線の波面収差が除去されることにより、短波長の限界にせまる集光性を実現することができる。これにより、ナノメートルオーダーという超高分解能な顕微鏡を実現することができ、超微細な生体試料における分子挙動の顕微鏡観察も行うことができるようになる。

なお、上記実施形態では、軟Ｘ線発生装置１００も真空容器１８の内部に収納する例について説明したが、軟Ｘ線発生装置１００の本体は真空容器１８の外部に設置するようにしてもよい。また、上記実施形態では、凹面鏡１３とＣＣＤ検出器１７との間にピンホール１６を設ける例について説明したが、これは必須ではない。また、このピンホール１６に代えてまたは加えて、凹面鏡１２と試料２００との間にピンホールを設けてもよい。

また、上記実施形態では、反射ミラー１１〜１３やデフォーマブルミラー１４の配置例をいくつか示したが、本発明はこれに限定されない。例えば、凸面鏡１１は設けず、軟Ｘ線発生装置１００から発生した軟Ｘ線をダイレクトにデフォーマブルミラー１４に照射するようにしてもよい。また、デフォーマブルミラー１４の位置は、凹面鏡１２の位置であってもよい（すなわち、デフォーマブルミラー１４の位置と凹面鏡１２の位置とを交換してもよい）。同様に、デフォーマブルミラー１４の位置は、凹面鏡１３の位置であってもよい（すなわち、デフォーマブルミラー１４の位置と凹面鏡１３の位置とを交換してもよい）。さらに、デフォーマブルミラー１４を複数備えるようにしてもよい。例えば、凹面鏡１２の代わりにもう１つのデフォーマブルミラーを設けてもよいし、凹面鏡１３の代わりにもう１つのデフォーマブルミラーを設けてもよい。

また、上記実施形態では、水の窓波長域の軟Ｘ線を用いる例について説明したが、本発明はこれに限定されない。ウェットな状態で細胞を観察するためには、この水の窓波長域を用いるのが好適であるが、ウェットな状態での観察でなくてもよい場合には、必ずしも水の窓波長域の軟Ｘ線を使う必要はない。少なくとも紫外線と硬Ｘ線との間の波長域にある軟Ｘ線であれば適用可能である。例えば、ライフサイエンス、レーザ医療、情報化社会を切り開く新材料開発、機能性材料の評価など、広範囲の分野において本発明を適用することが可能である。

その他、上記実施形態は、何れも本発明を実施するにあたっての具体化の一例を示したものに過ぎず、これによって本発明の技術的範囲が限定的に解釈されてはならないものである。すなわち、本発明はその精神、またはその主要な特徴から逸脱することなく、様々な形で実施することができる。

１１ 凸面鏡
１２，１３ 凹面鏡
１４ デフォーマブルミラー
１５ ハーフミラー
１６ ピンホール
１７ ＣＣＤ検出器
１８ 真空容器
１００ 軟Ｘ線発生装置
２００ 試料

Claims (6)

1. 紫外線と硬Ｘ線との間の波長域にある軟Ｘ線を発生する軟Ｘ線発生装置から試料までの上記軟Ｘ線の進路上に設けられ、上記軟Ｘ線発生装置から発生された上記軟Ｘ線を上記試料まで伝播させる第１の反射ミラーと、
   上記試料に上記軟Ｘ線を照射することによって上記試料から発生する軟Ｘ線を検出する軟Ｘ線検出手段と、
   上記軟Ｘ線の進路上に設けられ、上記軟Ｘ線の波面収差を除去する波面補償手段とを備えたことを特徴とする軟Ｘ線顕微鏡。
2. 上記第１の反射ミラーは第１の凹面鏡を含み、当該第１の凹面鏡によって上記軟Ｘ線を上記試料に集光させることを特徴とする請求項１に記載の軟Ｘ線顕微鏡。
3. 上記第１の凹面鏡と上記試料との間にピンホールを更に備えたことを特徴とする請求項２に記載の軟Ｘ線顕微鏡。
4. 上記試料から上記軟Ｘ線検出手段までの上記軟Ｘ線の進路上に、上記軟Ｘ線を上記試料から上記軟Ｘ線検出手段まで伝播させる第２の反射ミラーを更に備えたことを特徴とする請求項１に記載の軟Ｘ線顕微鏡。
5. 上記第２の反射ミラーは第２の凹面鏡を含み、当該第２の凹面鏡によって上記軟Ｘ線を上記軟Ｘ線検出手段に集光させることを特徴とする請求項４に記載の軟Ｘ線顕微鏡。
6. 上記第２の凹面鏡と上記軟Ｘ線検出手段との間にピンホールを更に備えたことを特徴とする請求項５に記載の軟Ｘ線顕微鏡。

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