JP2012010707A - テルペン類を酸化する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】非環式もしくは環式テルペンまたはシクロアルケンである物質またはそれらの置換誘導体を酸化するプロセスに用いられる、活性部位のアミノ酸のより極性の低い側鎖を有するアミノ酸による置換が含まれる、P450camまたはP450BM-3である、突然変異体。及び、前記プロセスプロセスを実施することができるかまたは有利な突然変異酵素を選択するのに使用できる細胞または細胞のライブラリー。
【選択図】なし
Description
(i) 異なる側鎖体積を有するアミノ酸への87位における置換、例えば、A、L、I、およびWへの置換(典型的にはFの置換)と、(典型的にはYから) A、L、F、およびWのような異なる側鎖体積を有するアミノ酸への96位における置換との組み合わせ。こうした組み合わせを用いると、野生型酵素と比較して、例えば、Y96W-F87W (空間が少ない)からY96A-F87A (空間がより多い)へ、基質ポケットの上部の利用可能な空間が変化し、更に、例えば、Y96F-F87A中の一方の側からY96A-F87W中の他方の側へ、空間の位置が変化する。
該方法において用い得る酵素であって、その天然に存在する形態において電子伝達レダクターゼドメインを有する該酵素を発現するか、あるいは
(a)本発明の方法で用いられる突然変異型ヘム含有酵素;
(b)電子伝達レダクターゼ;および
(c)電子伝達レドキシン
を発現する。
(a) (i)P450camもしくはその断片;または
(ii)P450camの天然に存在する相同体もしくはその断片;または
(iii) P450camの突然変異体;または
(iii)(i)もしくは(ii)と少なくとも70%のアミノ酸相同性を有し、かつ場合によっては本明細書中で述べる突然変異の組合せのいずれかを有するポリペプチド;ならびに
(b)電子伝達レダクターゼ;および
(c)電子伝達レドキシン
を発現するが、但し、発現されるP450camの突然変異体が以下の中に包含される大腸菌DH5α細胞は除外する:
H2N-P450cam-TDGTSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキシン-COOH、
H2N-P450cam-TDGTRPGPGPGPGPSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキシン-COOH、
H2N-P450cam-TDGTRPGPGPGPGPGPGPSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキシン-COOH、
H2N-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキシン-PLEL- P450cam-COOH。
a) (i)P450BM-3もしくはその断片;または
(ii)P450BM-3の天然に存在する相同体もしくはその断片;または
(iii)突然変異型P450BM-3もしくはその突然変異型相同体。
(i) 特定の基質を(場合によっては特定の酸化生成物または特定の活性を有する生成物へと)酸化する能力、
(ii) 増大した速度で基質の酸化を行う能力、
(iii) 特定の基質に対する酸化活性の低下、
(iv) 特定の基質の生成の低下。
in vitro研究のための突然変異体の発現
P450cam酵素は、ベクターpRH1091(Baldwin, J.E., Blackburn, J.M., Heath, R.J.,およびSutherland, J.D. Bioorg. Med. Chem. Letts., 1992, 2, 663-668)を用いて発現させた。このベクターはtrcプロモーター(trpおよびlacプロモーターの融合体)を利用するものであった。このベクターには強力なリボゾーム結合部位(RBS)が組み込まれており、発現させようとする遺伝子は該遺伝子の5′末端にあるNdeI部位を用いてクローニングする。本発明者らは、camC遺伝子の3′末端でのクローニング部位としてHindIIIを用いた。タンパク質発現のための手順は次のとおりである:細胞を30℃で、OD600nmが1.0〜1.2に達するまで増殖させ、温度を37℃まで上昇させ、樟脳を1Mストック(エタノール溶液)として最終濃度1mMまで添加する。培養物を37℃でさらに6時間インキュベートする。P450camタンパク質は細胞質内で高レベルまで発現されると、その細胞は赤色から赤橙色を帯びる。
オリゴヌクレオチドに対する部位特異的突然変異誘発を、Kunkel法(Kunkel, T.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 488-492)によりBio-Rad突然変異キットを用いて、またPCRによりStratagene社製のQuikChangeキットを用いて行った。Kunkel法の推奨手順をまとめると以下のようになる。P450camをコードするcamC遺伝子のM13 mp19サブクローンを、大腸菌CJ236株内で増殖させた。この株はdut-ung-表現型を有しており、そのためにDNA分子中でチミジンの代わりにウラシルが含まれることを許容する。3サイクル感染させた後で、ウラシル含有一本鎖(USS)M13 DNAは、増殖培地に排出された成熟M13ファージ粒子のフェノール抽出により容易に単離された。1種または複数の突然変異オリゴヌクレオチドをT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次に該USS鋳型にアニーリングした。4種のヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、ATPおよび他の化学的構成要素を添加し、第2の鎖をin vitroで合成した。こうして得た二本鎖形態のものでdut+ung+大腸菌MV1190株を形質転換した。この大腸菌株は、ウラシル含有鋳型鎖を分解し、in vitroで合成された突然変異鎖を増やすはずである。プラークを拾い、突然変異体である可能性のあるファージを大腸菌MV1190株またはTG1株で増殖させた。これらからの一本鎖DNAを配列決定して、突然変異誘発反応がうまくいったか否かを判定した。突然変異の効率は50〜80%であった。NdeIおよびHindIIIを用いた制限消化により突然変異camC遺伝子をM13サブクローンから切り出し、適切な大きさの断片を、同様のNdeI/HindIII消化により調製した発現ベクターのバックボーンに連結する。
基質酸化のプロトコール:in vitro反応
構成要素 最終濃度
P450cam酵素 1μM
プチダレドキシン 10μM
プチダレドキシンレダクターゼ 1μM
ウシ肝カタラーゼ 20μg/ml
KCl 200mM
基質 典型的には1mM
NADH 250〜400μM
*50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)を添加して、容量を調整する。
*場合により温度は30℃に調節した。
*NADHターンオーバー速度は、340nmにおける吸光度を経時的にモニターすることにより求めることができた。
*カタラーゼは、基質の酸化反応を触媒しないが、それは、P450camを変性させる可能性があるあらゆる過酸化水素副生成物を除去するために存在する。
in vivo系
in vivo系は、プラスミドpKK223(Brosuis, J.およびHoly, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 6929-6933)の誘導体であるベクターpGLW11を用いて発現させた。発現はtacプロモーターにより指令し、該ベクターには抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子が組み込まれている。
1.a PCRによるcamA遺伝子の操作
camA遺伝子について、下記のプライマーを該遺伝子の5′末端において用いて、EcoRIクローニング部位を導入し、かつ最初のコドンをGTGから強力な開始コドンATGへと変えた。
camB遺伝子について、5′末端におけるプライマーには、レダクターゼタンパク質とレドキシンタンパク質との間にペプチドリンカーの後ろ半分と、それら2つの増幅遺伝子を共に結合させるための制限部位BamHIとが組み込まれていた。
camA遺伝子およびcamB遺伝子をPCRにより上記のプライマーを用いて増幅した。この新たなcamAはEcoRIおよびBamHIで消化し、この新たなcamBはBamHIおよびHindIIIで消化した。pGLW11発現ベクターをEcoRIおよびHindIIIで消化した。全3種をアガロースゲル電気泳動により精製し、該ゲルからそれぞれの断片を含む3つのゲルスライスを切り出し、共に連結し、次に大腸菌DF5αに形質転換した。該断片の全てがうまく連結されたこと、特に新しいユニークなXbaI部位の存在を、一連の制限消化実験により確認した。該インサートのEcoRI部位からHindIII部位までの全配列を決定して、該配列の全てが正しいものであることを確証した。
2.a 基本的戦略
in vivo系におけるこの調製の出発点は、プチダレドキシンレダクターゼのcamA遺伝子の発現に用いられた組換えプラスミドであった。camA遺伝子は、pGLW11プラスミドにEcoRIおよびBamHI制限部位を用いてクローニングし、この場合、EcoRIは該遺伝子の5′末端にあった。便利なことに、pGLW11ベクターのポリリンカー領域は、BamHI部位の下流にHindIII部位を有している。したがって、camB遺伝子をPCRにより操作して、該遺伝子をBamHIおよびHindIII部位を用いてpGLW11にクローニングできるようにした。この新たなプラスミドは、レダクターゼおよびレドキシンを別個のタンパク質として発現する。
本発明者らは、camB遺伝子内の内部のユニークな制限部位MluI(認識配列ACGCGT)を開始点として用いて、PCR産物がPCR鋳型断片とは異なる大きさを有するようにした。プライマーは以下のとおりであった。
但し、配列中、MluI部位は太字で示す。
・・lacプロモーター・・BamHI・・camB遺伝子・・スペーサー・・RBS・・XbaI・・HindIII・・
XbaIおよびHindIII制限部位ならびに適切なスペーサーを有する改変camBを調製したら、これをcamA遺伝子(レダクターゼタンパク質)を発現させるのに用いたpGLW11ベースのプラスミドに、BamHIおよびHindIII部位を用いてクローニングすることによりin vivo系を構築した。この新たなin vivo系ベクターでは、基本構成要素が以下のように並んでいる。
これは、2つのクローニング部位XbaIおよびHindIIIを用いてcamC遺伝子をin vivo系にクローニングできるようにするための最終ステップである。XbaI部位は、2つのプライマーを用いた全pRH1091プラスミドのPCRにより付加した。これら2つの部位の存在はまた、camC遺伝子のM13へのクローニングも可能にする。何故ならば、XbaIおよびHindIIIは共にcamCおよびM13においてユニークなものだからである。
全ての既存のcamC突然変異体を、pRH1091ベースの発現プラスミドからNdeIおよびHindIIIで切り出した。新たなベクターを同じ制限酵素で同様に切断し、T4 DNAリガーゼを用いてcamC遺伝子をこのプラスミドにクローニングした。このDNAを大腸菌JM109に形質転換し、次いでこれを増殖させてP450camを発現させることができる。
タンパク質の発現のために、細胞をLBamp培地(トリプトン10g/リッター、酵母エキス5g/リッター、NaCl 10g/リッター、50μg/mlアンピシリン)で30℃にて、OD600nmが1.0〜1.2に達するまで増殖させる。IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を(H2O中での1Mストックから)最終濃度1μMまで添加し、培養物を30℃で一夜インキュベートした。
注入器の温度 150℃
検出器の温度 250℃
オーブンの温度 120℃で15分間→25℃/分で200℃に上昇させ、200℃で1分間。
注入器の温度 250℃
検出器の温度 250℃
オーブンの温度 150℃→5℃/分で230℃に上昇させ、230℃で1分間。
図1は、樟脳を用いた酸化反応の結果を示す。5-ケト樟脳は、5-エキソ-ヒドロキシ樟脳をさらに酸化することにより生じる。見てわかるように、驚くべきことに、樟脳の存在下でさらなる酸化はほとんど起こっていない。
第2のin vivo発現系
実施例3に記載のP450cam系の3種のタンパク質の発現のための遺伝子のクラスターは、pCWベクターを用いて全大腸菌細胞内でも発現させた。このベクターは、タンパク質の発現を増大させるために、並んで配置されている2つのtacプロモーターを利用する。それは、RBSを有し、かつ抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与した遺伝子(Barnes, H.J. Methods Enzymol. 1996, 272, 3-14)を含んでいる。
新たなプラスミドを、電子伝達タンパク質の融合のための遺伝子をpCWにクローニングすることにより構築して、異なるP450cam突然変異体がクローニングにより該系に導入できるようにした。camA遺伝子のPCR増幅のために用いた5′末端のオリゴヌクレオチドは、pGLW11ベクターへのクローニングのためのEcoRI部位だけでなく、該遺伝子のATG開始コドンに及ぶNdeI部位も導入した(実施例3、第1a節を参照)。pCWベクターでは、発現させようとする遺伝子のクローニングのためのRBSの下流に位置するNdeI部位が存在する。camA-camB融合遺伝子を含むpGLW11ベクターをNdeIおよびHindIIIで消化し、インサートをアガロースゲル電気泳動により精製した。pCWベクター系もまた、これらの2種の酵素で消化し、線状化したベクターを同じ方法により精製した。これら2つの断片をDNAリガーゼで連結して、pCWベクターに基づく新たなpCWSGBFプラスミドを作製した。これは電子伝達タンパク質の融合体を発現した。pGLW11ベースのプラスミドから切り出されたインサートは、既にタンパク質発現のためのRBSとHindIII部位の直ぐ上流のXbaI部位とを含んでおり(実施例3、第2.c節を参照)、そのために、P450cam突然変異体をコードするcamC遺伝子がこれら2つの部位を用いてクローニングされて、RBSを用いずに発現できるようになっていた。したがって、P450cam突然変異体をコードする遺伝子は、この改変pRH系から切り出され、XbaI部位およびHindIII部位を用いて該新たなpCWSGBFプラスミドにクローニングできる。
この系は、融合系と全く同じ方法で作製した。つまり、pSGB+プラスミドをNdeIおよびHindIII制限酵素で消化し、このインサートをpCWベクターにクローニングした。この新たなプラスミドpCWSGB+は、プチダレドキシンレダクターゼおよびプチダレドキシンを、pCWベクターの1対のtacプロモーターを用いずに別個のものとして発現した。このP450cam突然変異体を、XbaIおよびHindIII部位を用いてこのベクターに導入した。
下記の条件を、実験室における振盪フラスコ中での試験の目的で用い、それは最適化しなかった。より高い発現およびバイオマスを有する適切な発酵装置の条件下では、生成物の最終収量は非常に増大するだろう。
P450 BM-3 によるin vitroおよびin vivo基質酸化
in vitro(任意で30℃での温度調節)における典型的な反応では、1.5mLのインキューベーション混合物は、40mMリン酸緩衝液(pH8.0)、1μM P450BM-3、50μg/mLのカタラーゼを含むものとし、テルペン基質を1Mストック(エタノール溶液)として最終濃度2mMまで添加した。NADPHを典型的には最終濃度400μMまで添加し、反応速度は340nmでモニターできた。全てのNADPHが消費された後、該混合物を0.5mLのクロロホルムでボルテックスすることにより抽出し、遠心分離により相を分離し、有機相は実施例3に記載のプログラムを用いてGCにより分析できた。
Claims (10)
- 明細書に記載の表8に示されるアミノ酸配列からなる、P450BM-3の突然変異体を含むタンパク質であって、該突然変異体が47位および51位の活性部位におけるアミノ酸のより極性の低い側鎖を有するアミノ酸による置換を含む、上記タンパク質。
- P450BM-3の突然変異体が、突然変異 R47L-Y51Fを含む、請求項1に記載のタンパク質。
- P450BM-3の突然変異体が、42, 75, 87, 181, 263, 264 および 354位に1個以上の置換を含む、請求項1または2に記載のタンパク質。
- P450BM-3の突然変異体が、R47L-Y51F-F42A, R47L-Y51F-F42L, R47L-Y51F-F87A, R47L-Y51F-F87W, R47L-Y51F-I263A, R47L-Y51F-I263F, R47L-Y51F-I263L, R47L-Y51F-I263W, R47L-Y51F-A264V, R47L-Y51F-A264L, R47L-Y51F-A264I, R47L-Y51F-M354L, R47L-Y51F-M354A, R47L-Y51F-L181A, R47L-Y51F-L181W, R47L-Y51F-L75A-M354L, R47L-Y51F-L75A-M354A, R47L-Y51F-F87W-A264L, R47L-Y51F-F87W-A264I, R47L-Y51F-F87W-A264F, R47L-Y51F-I263F-A264L または R47L-Y51F-I263W-A264I から選択される突然変異を含む、請求項3に記載のタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれか1項に定義されるP450BM-3の突然変異体を発現する細胞。
- 環式テルペンである基質を酸化する方法であって、該基質をヘム含有酵素の突然変異体で酸化することを含み、該突然変異体は、より極性の低い側鎖を有するアミノ酸による活性部位のアミノ酸の置換を含み、該基質は請求項6に記載の細胞内で酸化される、上記方法。
- 環式テルペンである基質を酸化する方法であって、該基質を請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質を用いて酸化することを含む、上記方法。
- 前記テルペンが、モノテルペン、セスキテルペンおよびジテルペンより選択される、請求項7または8に記載の方法。
- 前記テルペンが、リモネン、ピネン、テルピネン、サビネン、ツジェン、ミルセン(mercene)、オシメン(ocimeme)、ネロール、ゲラニオール、アロマデンドレン、カリオフィレン、ロンギフォレン、バレンセン、イソバッザネン、シルフィネン、イシュワラン、イソパトククラ-3-エン(isopatchchoul-3-ene)、イソセスキカレン、カスベンおよびレチナールより選択される、請求項9に記載の方法。
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