JP2011517442A - Trpv6カルシウムチャネル活性阻害による癌治療のためのペプチド組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のペプチドは、原発腫瘍部位における癌細胞または二次的な癌部位における転移癌細胞に対する抗癌活性を示す。これらのペプチドは、リンパ節に優勢に局在するが、また、肺、肝臓および腎臓にも局在し、これらは、転移性癌が位置する一般的な部位である(図7)。
配列番号1のうちのいずれかの全部または一部を含み、麻痺活性のないカルシウムチャネル阻害活性(TRPV6阻害活性)を示す単離ペプチドは、癌を治療するのに有用なペプチドである。アミノ酸を、本発明のペプチドに付加することができるが、アミノ酸を加えた単離ペプチドは、典型的には、35または30以下のアミノ酸長であり、場合により27、25、20、15または13未満のアミノ酸長であり、場合により少なくとも9アミノ酸長である。最大で、例えば、30、35、40または45アミノ酸長であり得るペプチドを作製するために、多様な追加のアミノ酸をSorC27配列に付加することによって、より長いペプチドを容易に作製することができる(例えば、C末端アミノ酸(SILARPAELNTETCILEC、配列番号2)のうちの1つもしくは複数等のソリシジンのアミノ酸配列に対応する追加のアミノ酸、標的配列、またはその他のアミノ酸)。
Miller, W.およびLipman, D.J. (1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.」、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402頁;Zhang, J.およびMadden, T.L. (1997)「PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation.」、Genome Res. 7:649〜656頁が挙げられる。
本明細書に記載する配列番号1の全部または一部等の本発明のペプチドは、このペプチドをヒトに投与することによって、細胞増殖を低下させ、細胞アポトーシスを誘導し、癌を予防または治療するのに有用である。
また、本発明は、癌を治療するための医薬品を調製するための本発明のペプチドの使用も含む。本発明の単離ペプチドを、場合により、in vivoにおいて投与するのに適している生物学的適合性のある形態で対象に投与するための医薬組成物に製剤化する。「in vivoにおいて投与するのに適している生物学的適合性のある形態」とは、治療効果が、任意の毒性作用を上回る、投与しようとする物質の形態を意味する。この物質は、ヒトおよび動物を含めた生存生物体に投与することができる。
このペプチドに対する抗体は、試験試料中のこのペプチドの存在を同定するのに有用である。ペプチドの密度/場所を伝える抗体を標識する方法はいずれも有用であろう(例えば、放射標識ペプチドまたは蛍光タグ付きペプチド)。抗体は、典型的には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。また、これらの抗体は、ペプチドの免疫精製のためにも役立つ。例えば、抗体と抗体が認識するペプチドとの間の免疫学的複合体の形成を可能にし、免疫学的複合体の有無を検出する条件下で、生物学的試料を抗体と接触させることができ、それによって、試料中の本発明のペプチドが検出される。また、本発明は、好ましくは、抗体、抗体と抗体が認識するペプチドとの間で免疫学的複合体を形成させるのに適している媒体、および本発明のペプチドまたは類似のペプチドの存在を究明するために、免疫学的複合体を検出することができる試薬を含む組成物も含む。
本発明のペプチドは、神経筋接合部およびイオンチャネルを探索するための研究プロトコールにおいて有用である。特定のイオンチャネルまたはイオンチャネルのクラスを変化させる能力は、神経筋接合部を予測可能に撹乱させる別のツールを選択的に提供する。これによって、神経筋の機能およびプロセスにおける感受性ペプチド標的の役割が同定される。本発明は、イオンチャネルの麻痺性ペプチドに対する応答を決定する方法を含み、この方法は、チャネルまたはチャネルを含む細胞を、本発明のペプチドまたはその誘導体と接触させるステップと、これらのチャネルがイオンを輸送するかどうか、またはイオンの輸送(例えば、Ca2+)が低下しているかどうかを決定するステップとを含む。
本発明のペプチド(切断体、類似体等を含む)を、化学合成または組換えDNA法を使用することによって調製することができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を有する核酸分子を含む。これらの配列は、当技術分野で公知の手順に従って、ペプチドの良好な発現を確実にする適切な発現ベクター内に容易に組み込まれる。発現ベクターとして、これらに限定されないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)が挙げられるが、ただし、ベクターは、使用する宿主細胞と適合性がある。「宿主細胞の形質転換に適しているベクター」という表現は、発現ベクターが、本発明の核酸分子、および発現のために使用しようとする宿主細胞に基づいて選択された調節配列を含有することを意味し、これらの調節配列は、核酸分子に作動可能に連結されている。
以下の実施例によって、本発明の実施形態を例証するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
ソリシジン由来カルシウムチャネル阻害剤のアミノ酸配列の分離
ソリシジンのカルボキシル末端領域由来のアミノ酸配列を合成した。これらのセグメントを、(ソリシジンのC末端の13個のアミノ酸に対して配列同一性を示す)SorC13および(ソリシジンのC末端の27個のアミノ酸に対して配列同一性を示す)SorC27と名付けるに至った。SorC13およびSorC27のアミノ酸配列、ならびにそれらの物理的および生理学的な特性のうちのいくつかの概要をTable 1(表1)に示す。(実施例22に示すように)SorC13およびSorC27の半減期は、Sor54の半減期よりも短かった。
SorC13およびSorC27の、カルシウムイオン取込みの一過性受容体電位(バニロイド)6(TRPV6)を通した強力な阻害
ヒトTRPV6bをコードするヌクレオチドを含有する発現ベクター(pCAGS-IRES-hTRPV6b)(Boddingら、2003年)を、ヒトリンパ節前立腺癌(LnCaP、ATCC CRL-1740)内にトランスフェクトし、このベクターをそれによって発現させた。全細胞電流を得るパッチクランプを使用して、このチャネルを通るカルシウム電流を測定した。細胞を処置し、貯蔵カルシウム作動性電流(calcium store operated current)(Isoc)を、SorC13(n=90)またはSorC27(n=30)のいずれかを用いて、閉回路灌流中、0(ベースライン)、100 nM、500nM、1μM、30μMおよび100μMの累積濃度のうちのいずれかで3分間測定した。洗い流しの灌流を、2mL/分で3分間行った。使用した正の対照は、公知の貯蔵作動性チャネル(store operated channel)(SOC)阻害剤MRS-1845(N-プロパルギルニトレンジペン、Sigma Aldrichから入手)、5μMであり、この系においては、カルシウム電流の阻害を示した。SorC13およびSorC27の作用の概要を、図1に示す。これらのC-ペプチドの両方が、カルシウムのTRPV6チャネルを通る流れを強力に阻害したことが明らかである。データを双曲線関数に適合させることによって、SorC13(Isoc-50=0.10μM)およびSorC27(Isoc-50=0.14μM)について、SOCの50%阻害をもたらす濃度の計算が可能となった。さらに、両方のC-ペプチドは、TRPV6チャネルを通るカルシウム電流の非常に強力な阻害剤でもあり、阻害定数は100nMの範囲にある。
SorC13およびSorC27の、ヒトの乳癌細胞系および卵巣癌細胞系、特にTRPV6癌細胞系におけるアポトーシス誘導
本発明のペプチドは、in vitroおよびin vivoにおいて、細胞、特に、Table 3(表3)に列挙する細胞系等の癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有用である。ヒト乳癌およびヒト卵巣癌をモデル化するために使用する細胞系を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させた。
これらの細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で培養した。使用した培地を、各細胞系について、以下に列挙する。
アポトーシス誘導のレベルおよび細胞生存率を、単一試料の測定を多重化することによって決定した。Promega製のCellTiter BlueおよびAPO-ONEアッセイによって、細胞数に相関させた細胞生存率、およびアポトーシス誘導の決定が可能となる。このプロトコールは、カスパーゼ3およびカスパーゼ7についてのペプチド認識配列を含有する蛍光発生ペプチドを使用し、アポトーシスカスケードのタンパク質分解酵素を開始させる。ペプチド溶液またはビヒクルの添加直後に、CellTiter Blue試薬を、試験下の細胞を含有する、96ウエルプレート中のウエルに添加した。前日に、約5000個の細胞をウエル内に蒔いた。選ばれた時間(1日目、2日目等)に、560nmで励起した後、蛍光を590nm(発光)で測定した。同じウエル中で、120μLのApo-ONE試薬の添加後にカスパーゼ3/7活性を測定し(励起、485 nm/発光、527 nm)、-80℃で1時間凍結破壊し、室温で1時間インキュベートした。
--SorC13は、4種のうちの3種の癌細胞系において、統計学的に有意なレベルで、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる。
--SorC13は、T 47D(Table 4(表4)、図3B)においては、統計学的に有意なレベルで、アポトーシスを誘導する。
--SorC13は、2種の対照、非癌性細胞系(MCA 10AおよびMCA 12A)においては、アポトーシスを誘導しなかった。
--処置した3種の卵巣癌細胞系が、「未処置」の対照を有意に上回るアポトーシスカスケードの誘導を示した(正: CaOV3、OVCAR3、SKOV3)。
--SorC27を用いて処置した4種の癌性の乳癌細胞系は、SorC27に対する曝露に応答して有意なアポトーシス応答を示す(正:MB 416、MB 468、MB 231、MCF 7)。
--非癌性の乳房細胞系(MCA 10AおよびMCA 12A)は、SorC27によって影響を受けなかった。
--4種の卵巣癌細胞系(OV90、OVCAR3、SKOV3、HEYC2)が、SorC27を用いて処置した後にアポトーシス誘導を示した。それらの作用は、未処置の対照条件よりも1.9倍〜6.3倍大きかった。
転移性ヒト乳癌細胞系のアポトーシス誘導における、SorC13およびSorC27の、パクリタキセルと比べた解析
両方のC型ペプチドの作用を、乳癌に対して現在使用されている最も信頼できる基準の治療(パクリタキセル)に対して評価するために、SorC13、SorC27およびパクリタキセル(10μM)を比較した。APO-ONEアッセイ(Promega)およびCellTiter Blueの両方を、乳癌細胞系のパネル上で使用した。データを平均応答に関して直接比較し、有意差について検定した。
転移性ヒト乳癌細胞系におけるアポトーシス誘導の増強に関する、SorC13およびSorC27の、パクリタキセルを用いた解析
両方のC型ペプチドの作用を、乳癌に対して現在使用されている最も信頼できる基準の治療(パクリタキセル)に対して評価するために、ヒト乳癌細胞系MCF7(ATCC HTB-22由来)およびT47D(ATCC HTB-133由来)において、SorC13(10および100μM)、SorC27(10および100μM)、ならびにパクリタキセル(10μM)の組合せを比較する。これらの細胞系は、ATCCの方法に従って調製する。APO-ONEアッセイ(Promega)およびCellTiter Blueの両方を、乳癌細胞系のパネル上で使用する。処置群を以下に示す:
(処置当たりn=8)
1)処置なし(対照)
2)パクリタキセル(10μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
5)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
6)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
転移性ヒト卵巣癌細胞系のアポトーシス誘導における、SorC13およびSorC27の、パクリタキセル/カルボプラチンのカクテルと比べた解析
これら2種のSorC-ペプチドの作用を、卵巣癌のための最も信頼できる基準の治療と比較するために、SorC13またはSorC27を、カルボプラチンおよびタキソール(CAT)のカクテル(10μMパクリタキセル、20mMカルボプラチン)を用いた処置と、カスパーゼ3およびカスパーゼ7を組み合わせた活性を測定するAPO-ONEアッセイを使用して比較した。混合処置(CAT)であることから、作用を、処置:対照の比に関して比較した。作用が認められない場合には、比=1であった。処置:対照の比の比較を、スチューデントt検定を用いて、95%の信頼水準で調べた。1の値より大きい比は、正の作用を示した。これらの作用を、図5に示す。SorC27の卵巣細胞系のうちの1種に対する濃度効果を、図6に示す。これらの図は、以下のことを示す:
--SorC27(10μMおよび100μM)は、SKOV3、OVCAR3においては、アポトーシスをCATカクテルよりも早くかつ強く起こし、CaOV3およびOV90においては、CATに類似していた。
--SorC13は、SKOV3、CaOV3、OVCa3およびOV90については、アポトーシスカスケードを、CATカクテルよりも早くかつ強く起こした。
転移性ヒト卵巣癌細胞系のアポトーシス誘導における、SorC13およびSorC27の、パクリタキセル/カルボプラチンのカクテルを用いた解析
これら2種のC-ペプチドの作用を、卵巣癌のための最も信頼できる基準の治療と比較するために、SorC13およびSorC27を、カルボプラチンおよびタキソール(CAT)のカクテル(10μMパクリタキセル、20mMカルボプラチン)を用いた処置と、APO-ONEアッセイを使用して比較した。2種のヒト卵巣腺癌腫瘍細胞系SKOV3(ATCC HTB-77由来)およびNIH:OVCAR-3(ATCC HTB-161由来)を使用し、ATCCの方法に従って調製する。混合処置(CAT)であることから、作用を、処置:対照の比に関して比較する。作用が認められない場合には、比=1である。処置:対照の比の比較を調べる。1の値より大きい比は、正の作用を示す。処置群を以下に示す:
(処置当たりn=8)
1)処置なし(対照)
2)パクリタキセル(10μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
5)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
6)単一の用量のパクリタキセル(10μM)および2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
--CATカクテルと組み合わせたSorC27(10μMおよび100μM)は、SKOV3およびNIH:OVCAR-3の卵巣癌細胞系においては、アポトーシスを、いずれの単独処置よりも早くかつ強く増強する。
-- CATカクテルと組み合わせたSorC13 (10μMおよび100μM)は、SKOV3およびNIH:OVCAR-3の卵巣癌細胞系においては、アポトーシスを、いずれの単独処置よりも早くかつ強く増強する。
SorC13およびSorC27の組織分布
SorC13およびSorC27を、近赤外プローブCy5.5を用いて標識した。SorC13を、リジン-1およびリジン-8において、赤外蛍光プローブcy5.5を用いて、Cy5.5 NHSエステル活性化プロセスを用いる反応によって標識した。SorC27を、単一のシステインのチオールにおいて、Cy5.5マレイミド活性化反応を用いて標識した。標識ペプチドを、サイズ排除クロマトグラフィーおよびHPLCの組合せを用いて精製した。標識Cy5.5は、走査型レーザーを用いて励起すると、赤外領域において蛍光を発する。低いエネルギーのレーザーは、動物に約1cmまで貫通することが可能であり、したがって、腹臥位および仰臥位を走査することによって、タグ付きペプチドの存在を三次元で定量化することができる。
-- C-ペプチドはいずれも、血管脳関門を越えて移動しなかった。
--タグ付きのSorC13およびSorC27は、リンパ節、肺、肝臓および腎臓中に優性に局在する。
--タグ付きのSorC13およびSorC27は、灌流後24時間目においても依然として、これらの組織中で検出可能であった。
-- Cy5.5はペプチド/Cy5.5付加体よりも短い生存期間を有することから、種々の臓器中の蛍光の生存期間の測定によって、標識ペプチドの代謝は、肝臓および腎臓中でなされるようであることが示された。
ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘍細胞における、SorC13およびSorC27によるアポトーシス誘導
C-ペプチドの転移性ヒト肺癌細胞に対する作用を研究する。上記の組織分布データから、C-ペプチドが肺中に蓄積し、リンパ節中に局在することが示された。SorC13およびSorC27を利用して、in vitroにおける研究を、転移性リンパ節由来細胞系中で実施して、ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)系のH1437(ATCC CRL-5872由来)およびH2087(ATCC CRL-5922由来)に対するそれらの作用を決定する。これらの細胞系の両方が、転移部位(リンパ節)に由来する腺癌であり、段階1のNSCLC肺癌に由来する。本発明のペプチドを用いて有用に治療される、対象とする主要なリンパ管は、浅頚節、腋窩節、上腕節、腸間膜節および鼠径節を含む。
1)処置なし
2)2種の用量のSorC13(10、100μM)を用いた処置
3)2種の用量のSorC27(10、100μM)を用いた処置
多様なヒト癌細胞系における、C-ペプチドの作用の評価
SorC13およびSorC27の処置の、いくつかの癌細胞系に対する作用を、in vitroにおいて試験する。上記したように、C-ペプチドは、乳癌細胞系および卵巣癌細胞系の両方において、アポトーシスを誘導した。また、C-ペプチドは、in vitroにおいて、その他の癌細胞においても、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる能力を示す。以下の実施例10〜13では、SorC13およびSorC27を、選択された多様なヒト癌系においてアポトーシスを誘導するそれらの能力を判定する。それらは、PC3、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)K-562、ヒト急性骨髄性白血病(AML) MV-4-11、バーキットリンパ腫細胞系Daudiを含む。
ヒト前立腺癌細胞系における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系PC3(ATCC CRL-1435由来)およびLnCaPクローンFGC(ATCC CRL-1740由来)をAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手し、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させた。これらの細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で培養した。
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
バーキットリンパ腫細胞系における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系Daudi(ATCC CCL-213由来)を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。この細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で増殖させた。
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
ヒト慢性骨髄性白血病(CML)細胞系K-562における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系K-562(ATCC CCL-243由来)を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。この細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で増殖させた。
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
ヒト急性骨髄性白血病(AML)細胞系MV-4-11における、C-ペプチドのアポトーシス誘導
細胞系MV-4-11(ATCC DRL-9591由来)を、ATCC推奨条件下およびATCCが推奨する培地中で増殖させる。この細胞系を、無菌条件下、加湿5%CO2雰囲気中37℃で増殖させた。
--SorC27は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させ、
--SorC13は、アポトーシスを誘導し、細胞生存率を減少させる
ことである。
in vivoにおけるSorC-ペプチドの示す抗腫瘍活性
異種移植モデルでC-ペプチドを利用するin vivoにおける研究を実施して(実施例14〜20)、げっ歯類(マウス)モデルにおける、ヒト癌細胞系の異種移植片の、処置に対する応答を評価した。SorCペプチドは、in vivoにおいて抗腫瘍活性を示す。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト卵巣腺癌腫瘍細胞に対する、単独およびCAT(カルボプラチンとパクリタキセルとのカクテル)と組み合わせた場合のSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト卵巣腺癌細胞系のSKOV3(ATCC番号:HTB-77)およびNIH:OVCAR-3(ATCC番号:HTB-161)を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
SKOV3細胞系
SKOV3系のための基本培地は、ATCC処方のマッコイ5a培地(改変)(ATCCカタログ番号:30-2007)である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に37℃で添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度(空気95%、二酸化炭素(CO2)5%)。SKOV3を細胞培養するための、ATCCの継代培養プロトコールに従う。
NIH-OVCAR-3細胞系のための基本培地は、ATCC処方のRPMI-1640培地(ATCCカタログ番号: 30-2001)である。完全増殖培地を作製するために、NIH-OVCAR-3を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
液体窒素中に凍結保存されていた細胞を、37℃で迅速に解凍し、増殖培地を含有する組織培養フラスコに移し、次いで、5% CO2のインキュベーター中、37℃でインキュベートする。細胞系を拡大増殖するために、培養物を、等しい体積の新鮮な増殖培地を添加することによって、1:2で3日に1回継代して、5×106細胞/mlの密度とする。フラスコが、およそ10×106細胞/mlの密度に達したら、上記の継代プロセスを、マウス内への移植に十分な細胞が得られるまで繰り返す。
SorC13/SorC27
SorC13およびSorC27を製剤化するために、10 mg/Kgマウスおよび100mg/Kgマウスを送達するための最終溶液を構成するのに適した量の化合物を、生理的に緩衝化されている食塩水(pH7.0〜7.4、25℃)中に溶解させることによって、試験物品の保存液を調製する。保存液は、毎週調製し、-20℃で貯蔵し、投与のために毎日新たに希釈する。全ての溶液を、その後の操作の前に、0.22μmのフィルターを用いてろ過滅菌する。ろ過滅菌ユニットを、少量の滅菌蒸留水を用いて、あらかじめ洗浄した。
カルボプラチンおよびパクリタキセルをそれぞれ20mMおよび10μM含有する保存液を調製する。カルボプラチンおよびパクリタキセルは、Sigma-Aldrichから入手する。全ての溶液を、その後の操作の前に、0.22μmのフィルターを用いてろ過滅菌する。
場合により、NIH-OVCAR-3腫瘍細胞またはSKOV3腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウス内に移植するために、細胞培養物を遠心分離して、細胞をペレット化し、上清を吸引し、この細胞ペレットを10mlの増殖培地中に再懸濁させ、血球計数器を使用して細胞数を決定する。次いで、これらの細胞を、適切な培地中で洗浄し、培地中に5×107細胞/mlの濃度で再懸濁させる。27ゲージの針および1ccのシリンジを使用して、0.1 mlの細胞懸濁液を、マウスの側腹部内に皮下注射する。次いで、腫瘍を、in vivoにおいて大部分の腫瘍体積が100〜200 mm3に達するまで発達させ、これは、典型的には、移植後1〜2週間を要する。これらの腫瘍を使用して、NOD/SCIDマウス内の皮下組織に移植し、その2日後に、試験ペプチドまたはCATのいずれかを用いて処置する。
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)参照化合物CAT投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
4)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス、
5)1回用量のSorC13およびCAT投与腫瘍移植マウス、
6)1回用量のSorC27およびCAT投与腫瘍移植マウス。
長方形の非常に小型または大型の腫瘍を有する動物を破棄し、研究のために、一貫した増殖速度を示す腫瘍を担持する動物のみを選択する。腫瘍体積(V)を、ノギスで測定することによって、腫瘍の幅(VV)、長さ(L)および厚み(T)の標準的な測定値を使用して計算する。動物を処置群に無作為化し、その結果、各群の腫瘍体積の中央値は、投与開始時において類似する。有効性の尺度として、%T/C値を決定する。式中、Cは、対照または未処置の腫瘍の体積を指し、Tは、処置した腫瘍の体積を指す。
動物に、この製剤を、体重1kg当たり10mlでスケジュールに従って腹腔内(i.p.)注射する。
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13およびSorC27の400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、NIH-OVCAR-3細胞およびSKOV3細胞の増殖速度を実質的に減少させる。この作用は、体重が安定しており、ストレス症状(下痢、あえぎ呼吸、逆立った毛皮)を欠くことによって示されるように、毒性を伴わない。
SKOV3細胞を、ATCCから入手し、培養し、適切な数になるまで拡大増殖して、マウス内で異種移植片を確立し、次いで、ゲルペレットに配合し、腫瘍を確立するために、代理NOD/SCIDマウスの腎臓莢膜下に移植した。次いで、腫瘍をin vivoにおいて大部分の腫瘍体積が100〜200 mm3に達するまで発達させ、これは、典型的には、移植後1〜2週間を要する。異種移植片が確立したら、これらを収集し、複数の均一な小片に切断する。実験のために、16〜18片を各NOD/SCIDマウスの皮下に移植した。2日後、動物を、試験ペプチドまたはCATまたは組合せのいずれかを用いて処置する。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト乳癌細胞に対する、単独およびパクリタキセルと組み合わせた場合のSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系のMCF7(ATCC番号:HTB-22)およびT47D(ATCC番号:HTB-133)を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)参照化合物パクリタキセル投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
4)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス、
5)1回用量のSorC13およびパクリタキセル投与腫瘍移植マウス、
6)1回用量のSorC27およびパクリタキセル投与腫瘍移植マウス。
パクリタキセル参照溶液
10μMのパクリタキセルを含有する保存液を調製する。パクリタキセルは、Sigma-Aldrichから入手する。
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MCF7細胞およびT47D細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)腫瘍細胞[K-562(ATCC番号:CCL-243)]に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト慢性骨髄性白血病(CML)細胞系K-562 (ATCC番号:CCL-243)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
K-562系のための基本培地は、ATCC処方のイスコフ改変ダルベッコ培地、カタログ番号:30-2005である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度。完全増殖培地を作製するために、K-562を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、K-562細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、毒性を伴わない。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト前立腺癌腫瘍細胞LnCaPクローンFGCに対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト前立腺癌細胞系LnCaPクローンFGC(ATCC CRL-1740由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
LnCaPクローンFGC系のための基本培地は、ATCC処方である。
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、LnCaP細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト乳癌腫瘍細胞MCF7に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系MCF-7(ATCC HTB-22由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
NOD/SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MCF7細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト乳癌腫瘍細胞MDA-MB-231に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
MDA-MB-231細胞系のための基本培地は、ATCC処方のレイボビッツL-15培地、カタログ番号:30-2008である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度。完全増殖培地を作製するために、MDA-MB-231を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
細胞の調製、SorC13/SorC27の製剤化手順、移植手順、測定および処置手順は、実施例14の記載に従う。
SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MDA-MB-231細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
マウス異種移植モデルにおける、ヒト急性骨髄性白血病(AML)腫瘍細胞MV-4-11に対するSorC13およびSorC27の抗腫瘍活性
ヒト乳癌細胞系MV-4-11(ATCC CRL-9591由来)を、American Type Culture Collectionから入手する。これらの細胞を、ATCC完全増殖培地を用いて調製した増殖培地中で培養する。
MV-4-11細胞系のための基本培地は、ATCC処方のイスコフ改変ダルベッコ培地、カタログ番号:30-2005である。完全増殖培地を作製するために、以下の成分を、基本培地に添加する:ウシ胎仔血清、10%の最終濃度。完全増殖培地を作製するために、MV-4-11を細胞培養するための、ATCCの増殖プロトコールに従う。
実施例14の記載に従う。
典型的には、以下の群を含む:
1)ビヒクル投与腫瘍移植マウス、
2)1回用量のSorC13投与腫瘍移植マウス、
3)1回用量のSorC27投与腫瘍移植マウス。
SCIDマウスにおいて、SorC13またはSorC27の場合により200〜400 mg/kg体重の用量を用いた処置は、MV-4-11細胞の増殖速度を実質的に減少させ、%T/C値は、<100%である。この作用は、研究のコースにわたる%T/Cの低下によって示されるように、毒性を伴わない。
C-ペプチドの検出および検出限界
逆相HPLCを使用して、SorC13およびSorC27を検出および定量化した。Phenomenex Gemini、5μ、C-18逆相カラム(250×4.60 mm)を、解析手順のために使用した。溶媒系は、アセトニトリルと水との勾配であり、それぞれが、0.1%v/vトリフルオロ酢酸を含有した。HPLCを、30.0℃のカラム温度で実施した。溶媒系は、40分にわたる、1.0mL/分の流速における、90%〜40%の水(0.1%TFA)を有する10%〜60%のアセトニトリル(0.1%TFA)勾配であった。検出は、224nmにおいて行った。ペプチドの保持時間は、SorC13およびSorC27について、それぞれ11.5分および14.7分であった。
ラットおよびヒトの血漿中におけるC-ペプチドの分解速度
ラット血漿を、屠殺したラット(Sprague-Dawley)から採血した血液から得、ヘパリン処置ガラス製バイアルに入れて、凝固を防止した。全血を8000×gで5分間遠心分離して、細胞を沈降させ、血漿を上清として残した。健康なヒトからのヒト全血試料を、リチウム-ヘパリン処置真空チューブ中に採血した。試料を2.0mLの微遠心分離用チューブ中に入れ、8000×gで5分間遠心分離した。血漿を赤血球細胞から注意深く分離し、直ちに使用した。
--SorC27は、ラット血漿中では21分の半減期で分解し、ヒト血漿中では20分の半減期で分解し、
--SorC13は、ラット血漿中では58分の半減期で分解し、ヒト血漿中では56.6分の半減期で分解する
ことが示された。
SorC13およびSorC27の毒性の研究
SorC13およびSorC27の急性毒性
以下に記載するように、CD-1マウスにおいて、急性静脈内ボーラス注射を単回投与した後、5日の観察期間にわたり毒性研究を行った。SorC13およびSorC27のそれぞれの3つの用量を使用した(10、100および500mg/Kg)。注射後の最初の4時間は1時間毎に調べ、5日にわたり毎日ケージの外から調べた。解析の一部として、以下の判定を行った:投与前および終了時の体重、全動物の剖検(骨髄の塗抹標本を含む)、全動物から得た臓器重量。
反復投与による毒性を調査するために、食塩水中に配合した400mg/kgのSorC27を、NOD/SCIDマウスに、毎日12日間(i.p.)注射した。動物を、毎日ケージの外から観察し、実験期間の終わりに検査した。食塩水を単独で注射した対照マウスと比較して、毒性作用、体重減少、または剖検上の臓器の変化は示されなかった。
SorC13およびSorC27の薬物動態(PK)プロファイル
急性静脈内ボーラス注射の単回投与によるPK研究を、SorC13およびSorC27のそれぞれの3つの用量(3mg/Kg、30mg/Kgおよび150mg/Kg)を使用し、投与群当たり少なくとも3匹のマウスを使用して実施する。血液試料を、6つの時点、すなわち、投与後の5分、15分、1時間、2時間および4時間において採血する。次いで、試料を、SorC13またはSorC27の存在についてアッセイする。
血液区画からのクリアランス速度と、血漿中の酵素による酵素分解とを組み合わせると、30分未満の半減期を有する、血液区画からの移動が得られる。
異なる細胞系における、TRPV6 mRNAの存在とC-ペプチドのアポトーシス活性との比較
表9に列挙する細胞系のうちのそれぞれにおける、TRPV6のmRNAの存在を、RT-PCRを使用して試験した。使用したTRPV6プライマー(アンプリコンのサイズ:寒天ゲル上で約400bp)は、5'-CTGCCTATGGAGCAAGTTCTG(順方向プライマー)、および
5'-TCAGATGTCATGGGCTCAAAG(逆方向プライマー)であった。増幅反応のために使用したサーモサイクラーのプログラムは、94℃で3分間、次いで、94℃で30秒間、53℃で30秒間、72℃で1分30秒間の30サイクル、および72℃で7分間であった。増幅反応を、標準的な寒天ゲル電気泳動によってモニターした。
Table 9(表9)に、種々の乳癌細胞系および卵巣癌細胞系におけるC-ペプチドのアポトーシス誘導能力と、TRPV6のmRNAの存在との間のいくつかの対応を示す。これらのtrpv6遺伝子を発現する細胞系は、C-ペプチド誘導性アポトーシスに対して感受性であることが明らかである。
Claims (32)
- アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)の全部または一部を含む単離ペプチドであって、カルシウムチャネル活性を阻害するペプチド。
- アミノ酸配列KEFLHPSKVD LPRを含む、請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)を含む、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項2または3に記載のペプチドに対して少なくとも80%の配列同一性を備える単離ペプチド。
- 請求項2または3に記載のペプチドのうちの少なくとも9つのアミノ酸を含む単離ペプチド。
- 前記少なくとも9つのアミノ酸がHP SKVDLPRを含み、カルシウムチャネル活性を阻害する、請求項5に記載のペプチド。
- 前記カルシウムチャネルが、TRPV6カルシウムチャネルを含む、請求項1に記載のペプチド。
- 癌細胞によるカルシウムの取込みを阻害する方法であって、アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)を含むペプチドの全部または一部を前記細胞に投与するステップを含み、前記ペプチドが、前記癌細胞によるカルシウムの取込みを阻害する方法。
- 癌細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)を含むペプチドの全部または一部を前記細胞に投与するステップを含み、前記ペプチドが、前記癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
- 前記癌が、乳癌または卵巣癌を含む、請求項8または9に記載の方法。
- 前記癌が乳癌である、請求項8または9に記載の方法。
- 前記癌が、卵巣癌、血液癌、脳癌、網膜癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、前立腺癌または子宮内膜癌である、請求項8または9に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を備える、請求項8または9に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のうちの少なくとも9つのアミノ酸を含む、請求項8または9に記載の方法。
- 前記少なくとも9つのアミノ酸がHP SKVDLPRを含み、前記ペプチドがカルシウムチャネル活性を阻害する、請求項14に記載の方法。
- 前記カルシウムチャネルが、TRPV6カルシウムチャネルを含む、請求項8に記載の方法。
- 癌治療を必要とする動物において癌を治療する方法であって、アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)を含むペプチドの全部または一部を、癌治療を必要とする前記動物に投与するステップを含み、前記ペプチドが、前記癌細胞によるカルシウムの取込みを阻害する方法。
- 癌治療を必要とする動物において癌を治療する方法であって、アミノ酸配列:EGKLSSNDTE GGLCKEFLHP SKVDLPR(配列番号1)を含むペプチドの全部または一部を、癌治療を必要とする前記動物に投与するステップを含み、前記ペプチドが、前記癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
- 前記ペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を備える、請求項17または18に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のうちの少なくとも9つのアミノ酸を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記少なくとも9つのアミノ酸がHP SKVDLPRを含み、前記ペプチドがカルシウムチャネル活性を阻害する、請求項20に記載の方法。
- 前記カルシウムチャネルが、TRPV6カルシウムチャネルを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌または卵巣癌である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記動物が哺乳動物を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記動物がヒトを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記少なくとも9つのアミノ酸がHP SKVDLPRを含み、前記ペプチドがカルシウムチャネル活性を阻害する、請求項20に記載の方法。
- 前記カルシウムチャネルが、TRPV6カルシウムチャネルを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記癌が転移性癌を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記転移性癌が、リンパ節、肺組織、腎臓組織または肝臓組織中に位置する、請求項28に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド、および担体を含む医薬組成物。
- 細胞中のカルシウムチャネルを阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を治療する際に使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド。
- 細胞中のカルシウムチャネルを阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつ/または癌を治療するための医薬品の調製において使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド。
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