JP2011516062A - アレイ表面における新規二本鎖核酸形成に基づく方法および装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 半永久的に共有結合して付着された官能基の表面を持つ基板と各々のオリゴヌクレオチドのほぼすべてのリン酸基の直接の非共有結合的リン酸表面への吸着接触により圧縮されたオリゴヌクレオチドの飽和膜として10から約24塩基長の変更されていない、一本鎖オリゴヌクレオチドの吸着した単分子層からなる生体分子ハイブリダイゼーション装置である。
【選択図】 図12
Description
ガラス表面のアミノシラン化
予め洗浄したガラス製のマイクロスライド(Gold Seal, Gold Seal Products) を脱イオン水で洗浄後、HPLCグレードのメタノールですすぎ45度で埃の無いオーブンで乾燥させた。スライドを82度の真空オーブンに移動し、3-アミノプロピルトリメトキシシラン(Aldrich社)とp-キシレン(Aldrich社)、1:2の比の混合液中で平衡化した。スライドはその後、27 mm Hgで一晩インキュベートし、続いて室温にて埃の無い条件下で保存した。
アレイの作成
全てのオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、 5’末端をCy3またはCy5蛍光色素で標識し、BioSource International (Camarillo社)でHPLC精製した。10mlシリンジを持つMicrolab 4200ロボット (Hamilton社)を使用しアミノシラン化したガラススライドに直径500mm、中心間の距離900mmのアレイエレメントごとに10nl、6X8フォーマットのアレイをプリントした。70%DMSO(Aldrich社)/30%溶液に適当な濃度で希釈されたオリゴデオキシリボヌクレオチドは384穴プレート(NUNC社) からプリントした。プリントする溶液のDMSOでの封入は乾燥行程を遅らせ、 水中でプローブを印刷する場合と比較し、より均一なプローブ濃度をもたらす。プリントした後、アレイを1分間NaOHで洗浄し、脱イオン水で数回すすぎ保管の為乾燥させた。全ての行程は室温で行った。
ハイブリダイゼーションとイメージング
ハイブリダイゼーションは次のハイブリダイゼーションバッファーを用い行った。12merのターゲットに対しては90mMの炭酸ナトリウム, 5X Denhardts溶液, pH=9.5を、24merのターゲットに対しては60mMの炭酸ナトリウム, 5X Denhardts溶液, 20% ホルムアミド, 0.6% ポリビニルアルコール, pH=9.5を用いた。pHは遊離アミノ基による表面への荷電を減らすべく常に9.5に保った。ハイブリダイゼーション前にアレイはターゲットを含まず1.5%ポリビニルアルコール(Aldrich社)を含む、各々のハイブリダイゼーションバッファーで前処理し、ブロッキング剤として使用した。全行程は室温で行った。10分間ハイブリダイズした後、スライドを各々のハイブリダイゼーションバッファーで洗浄し、脱イオン水で数回すすぎ乾燥させスキャナーでイメージを取り込んだ。
ターゲットとプローブの比率の計算
これらの実験には、高いターゲットとプローブの比率を得る事が重要である。したがって特に記述のない限り、12‐merのターゲットは5mM濃度でハイブリダイズさせ、24-merのターゲットは3mM濃度でハイブリダイズさせた。そのようなターゲット濃度はハイブリダイズから5分後にそれらのシグナルが特異的なプローブで飽和状態にあるかどうか、時間経過と濃度依存的な実験により明らかにした。ターゲットとプローブの比率は、プローブのハイブリダイゼーション前のCy5シグナル、およびターゲットのハイブリダイゼーション後のCy3シグナルの解析より分子数の計算、そしてCy3とCy5標識したオリゴデオキシリボヌクレオチドの標準曲線に基づき判断した(図1A)。
プローブ分子数=10^[(log(Cy5シグナル)-yo)/a]=10^[(log(332)+13.1)/1.58]=7.7*10^9であると求めることができた。同様に、ハイブリダイゼーション後のターゲットの分子数はそれぞれCy3-野生型-24-s3は8*10^9、anそしてCy3-野生型-12-sは7.8*10^9であった。よって24塩基長のプローブに対するターゲットとプローブの比率およびは12塩基長のターゲットのハイブリダイゼーションの比率は各々0.5と1であった。劇的にバックグラウンドが増加するため24塩基長のターゲットの濃度は3mM以上にはしなかった。5mM濃度が12塩基のターゲットに用いられたという事実は、より長い塩基はより多くの負の電荷を持つため、正に荷電するアレイ表面により強く結着するという事実により説明する事が可能である。(ターゲットとプローブ比率が1に近い値で)正に荷電した表面にあるオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブが核酸ターゲットに特異的にハイブリダイズする吸着能は近年ターゲットの放射性標識により示された(Belosludtsev YY et al., 2001, Anal. Biochem. 292:250-256)。
分離実験
ハイブリダイゼーション後、スライドを5回、1.5%ポリビニルアルコールを含むそれぞれに対応するハイブリダイゼーションバッファーで洗浄した。それから様々な時間、60mM炭酸水素ナトリウム, 20%ホルムアミド(12-merプローブの場合)、35%ホルムアミド(24-merプローブの場合), 5XDenhardts溶液, 0.6%ポリビニルアルコール, pH=9.5を含んだ洗浄バッファー内で室温でインキュベートした。
DNaseプロテクションアッセイ
ハイブリダイゼーション後、、スライドを2回ポリビニルアルコールを含むそれぞれに対応するハイブリダイゼーションバッファーで洗浄し、50mの塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、20mMのTris-塩酸、pH=8.0を含むDNase消化バッファーで短時間処理した。スライドは0、0.1、1.0または10 u/mlの濃度でDNase I (Roche社)を含む上記のバッファー中で室温にて20分間インキュベートした。その後、1.5%ポリビニルアルコールを含むそれぞれに対応するバッファーで8回すすぎ脱イオン水で洗い乾燥させイメージングした。
アミノシラン化したガラス表面へのオリゴデオキシリボヌクレオチドの吸着
Cy5(インドジカルボシアニン、1(ex)max=651 nm、1(em)max=651 nm、赤)蛍光標識した12塩基長(12-mer)と24-merのオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)プローブをアミノシラン化したガラス表面に印刷した。吸着しなかったオリゴヌクレオチドは室温にて洗い取り除いた。結合したCy5オリゴヌクレオチドシグナルはプリントしたオリゴヌクレオチドの濃度1mMから飽和し始めた。標準曲線(図1A)を参照することにより結合したオリゴヌクレオチドごとの表面領域は添加したプローブの全ての濃度の関数とし計算可能であった。
吸着したオリゴヌクレオチドへのDNAの特異的ハイブリダイゼーション
DNAが特異的にそのような高密度で単分子層に吸着させたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするかどうかを確認するため、6つのCy5標識したオリゴヌクレオチドプローブ(赤色)を持つマイクロアレイを作成し、アミノプロピルシラン表面上にそれぞれ4回、プローブ吸着の飽和量をわずかに下回る量(添加プローブの0.3mM)づつプリントし、また飽和状態にあるプローブ濃度3mMでもプリントした。図2Aはプロトタイプを示す。12merのプローブ(図2A‐2C、アレイの左側)と24のプローブ(図2Aー2C、アレイの右側)には、3つのプローブシークエンスホモログ(野生型参考シークエンス(wt)、12塩基毎に一つの変化したヌクレオチドを持つもの、そして無作為にスクランブルされた異性体(scr)。)を使用した。実験に用いたCy3とCy5標識したオリゴデオキシリボヌクレオチドシークエンス(Biosource International社) は表1に示した。
二本鎖らせんの対称性に対する議論の明確な論述
図3Aで示されるように、正に荷電するアミノシラン化表面への一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの強固でほぼ不可逆的な吸着はバックボーンリン酸基とその表面との間の複数の静電相互作用の存在を示唆するものである。アミノシラン単分子層は、密接に圧縮された(パッキングされた)アミン基の平面を溶液に対し提供する(図3D)。通常の10塩基対ピッチ(3C図)による回転対称の二重らせんの形成の間、プローブのリボン状リン酸バックボーン(図3A)は、引き込まれてくるターゲット鎖を包み込むため、その高密度に荷電した表面から、一時的に分離される。対照的に、表面からのプローブの脱離は、図3Bで示すような非らせん形二本鎖の形成を説明する必要は無い。
アミノシラン化されたガラス表面で形成されるDNA二本鎖の非対称分離
図4A-4Bは実験的な解離解析を示し、それは図2A-2Cの平衡結合実験の形式と同様の解離速度実験である。簡潔に述べると、図2A-2Cで述べたように、Cy3標識した12-merターゲット(左)またはCy3標識した24-ターゲット(右)をCy5標識したオリゴヌクレオチドプローブのマイクロアレイにハイブリダイズした。ターゲットは、それから時間に応じて、厳しい洗浄によりプローブから解離させた。各時点において、結合シグナルは、二本鎖に結合したシグナル(黄色)をCy3ターゲット(緑)とCy5プローブ(赤)という2つの構成要素にデコンボリューションすることにより蛍光定量的に定量化された。
アミノシラン化したガラス表面で形成されるDNA二本鎖からの非対称のデオキシリボヌクレアーゼI消化
第3の方法によって観察された鎖の非対称を確かめるため、表面結合した二本鎖が定量的デオキシリボヌクレアーゼI消化により解析された(図6A-6B)。簡潔に述べると、実験は図4A-4Bのように正確に計画したが解離速度を観察するというよりはむしろ、結合した二本鎖の各々の濃度勾配(それぞれ、0、0.1、1.0、10ユニットのDNaseIからなるアレイ2-5)のデオキシリボヌクレアーゼIによる20分間の室温での消化を観察した。(アレイ1と5の) 直接の比較から見られるように、 結合した12-mer(6A図)または24-mer(図6B)のターゲットの90%以上がデオキシリボヌクレアーゼIで消化された条件下で、吸着されたプローブからの蛍光シグナルはデオキシリボヌクレアーゼIによる崩壊から(おそらく表面のアミンに対する直接的なリン酸バックボーン相互作用のため)完全に保護されている。しかし、以前に最高濃度でDNaseIで消化したアレイを使用しての再ハイブリダイゼーション(アレイ2対アレイ6を比較)におけるターゲットに結合するプローブの能力の消失は少なく限られていることを示唆する。そして、蛍光物質により同定されたように、それはデオキシリボヌクレアーゼIによるプローブ崩壊が遅いが限りのある比率であることを反映し、表面とプローブとの関係性を変えるという訳ではない。
B‐らせんの2つ以上のらせん折り返しの長さにより形成される二本鎖
分離速度とデオキシリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの両方が高い対称性を持つ二重らせん構造を示唆し、通常、対称性二重らせん構造と一致しないが、もし研究対象の二本鎖が表面にプローブ結合がなされる間、完全に形成されるのであれば、データのそのような単純な解釈は可能となる。この疑問に答えるべく、様々な長さの一組10個のCy3標識した(緑)ターゲットオリゴヌクレオチドを合成し、図2Aで記述されるアレイにハイブリダイズした。厳しいハイブリダイゼーションと洗浄の条件下、相補的24-merプローブへの結合安定性を同定し、アミノシラン化した表面に0.3mMで印刷し、 完全なプローブ長24塩基(図7)の長さまでターゲットの長さを増加させ、その後レベルを計測した。その間、塩基対合特性は、24-merのプローブにつき2つの塩基変化のレベルで維持された。この比較的単純な結果は、平均的に24塩基のプローブ鎖の全体にわたりシークエンス特異的な二本鎖が形成されていることを示唆し、結果として生じる産物が標準B-形らせん構造である場合、2回強のらせん形折り返しと一致するものである。
反復可能な、信頼できる吸着マイクロアレイ作成とハイブリダイゼーションのためのプロトコル:
吸着表面の調製
顕微鏡スライドを脱イオン水できれいにし、ちりのないオーブンで乾燥させた。吸着表面は、82°Cで、一晩中27mm Hgで真空オーブンで吸着表面の材料を平衡化し、ガラス表面に付着させた。
予め合成したリンカーのないオリゴヌクレオチドを脱イオン水に溶解した。吸着表面を均一な単分子層にするためジメチルスルホキシド(DMSO)を用い、オリゴヌクレオチドを均一に乾燥させた。オリゴヌクレオチドの表面飽和限界を標識したオリゴヌクレオチドを用いて算出したところ、オリゴヌクレオチド濃度は飽和限界を超え維持されていた。
制御されたロボット機械を用いてハイブリダイゼーション装置ごとの誤差が1%以下の範囲内で微量のヌクレオチド溶液の既知量を表面に吸着させた。
吸着したオリゴヌクレオチドを、5Xデンハート溶液と1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、リン酸塩バッファー(一塩基リン酸カリウム、リン酸ナトリウム二塩酸、pH 8.0)を含むプレハイブリダイゼーション溶液で15分インキュベートした。
ハイブリダイゼーションは興味のあるのサンプルを蛍光標識したターゲット(全長mRNAまたはcDNA)を20μL添加し行い、湿った条件下で、室温で一晩インキュベートした。12時間ハイブリダイゼーションさせた後、結合バッファーと比較しDenhardt’s溶液無しでモル濃度が少なくとも半分となる(150 mM)リン酸バッファーで洗浄した。
蛍光イメージを出すために、洗浄後のスライドは、遠心分離または熱により乾燥させ、レーザーかCCDに基づくスキャナーを使い蛍光イメージを作成した。蛍光画像強度はアレイスポットに格子を当てはめるか、または自動的にスポットを検出するアルゴリズムを用いマイクロアレイ上のスポットの蛍光を測定する事により得た。
比較例
Cy3標識した50-merのDNAの最初のセットは、実施例1によって蒸着を使用し均一な陽イオン表面に直接吸着させた。Cy3標識した50-merのDNAの第2セットは、Cel Associates(CSA-25; http://www.cel-1.com/)の溶液ディップ法によって、均一な陽イオン表面に吸着させた。表面は、それから実施例16の洗浄バッファーで5分または24時間洗浄した。洗浄の後、表面に直接付着して残留するDNA、すなわちCy3標識したオリゴデオキシリボヌクレオチドの蛍光強度は図8A‐8Dと表2に示した。5分間の洗浄後の蛍光強度は、洗浄を行わない場合とほぼ同じである。しかしながら洗浄時間0分におけるバックグラウンドは、検知されなかった。
ハイブリダイゼーションにおけるキャッピングの影響
1.0μMで印刷した40-merのDNAプローブは、40-merの完全に対応するターゲットにハイブリダイズした。40-merのターゲットは9.1μMのCy3標識したターゲットからなる合計濃度1.0μMでハイブリダイズさせた。二つのキャッピング法がここでは用いられた。化学的キャッピングは、DMF中の0.5Mの無水酢酸で50℃で水銀25インチ気圧で16時間処理し、室温でDMF中で9.5Mのコハク無水物の液相に1時間処理する気相式法によって行った。一方、界面活性剤キャッピングは、プレハイブリダイゼーションバッファーにSDSを使用し行った。ブロッキング効率を高めるべく、約40のプレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションバッファーの組み合せをテストした。すべての組み合わせにおいて十分なブロッキング効率を観察した。好ましい組合せのうちの8つの組み合わせを、表3と図9A-9Bに示す。
吸着マイクロアレイによる溶液状態のcDNAの検出
プローブは予め決定した60-merの配列(マウスp53関連の遺伝子に由来する)で、実施例13のようにガラス表面上へ吸着させた。マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのターゲットは、以下の通りに調製した。 - 無照射または放射線照射を受けたマウス胸腺組織よりグアニジン-イソチオシアン酸塩法を修飾した方法(Qiagen、バレンシア、CA、USA)によりトータルRNAを抽出した。RNAの質および濃度は、分光光度計および染料テスト(インビトロゲン、カールズバッド、CA、USA)を用い確認した。未照射のマウス胸腺組織からの10mgのトータルRNAは、Cy3染料(アマシャムBiosciences、Piscataway、NJ)の存在下でMMLV-RT(Clontech、パロアルト、CA、USA)により逆転写し、Cy3標識した未照射のマウス胸腺からのmRNAを得た。γ照射を受けたマウス胸腺組織から抽出した10mgのトータルRNAを、MMLV-RTキットのClontech社により供給される逆転写プロトコルを用いCy5染料(アマシャムBiosciences、Piscataway、NJ)の存在下でMMLV-RT(Clontech社、パロアルト、CA、USA)を用い逆転写し、未照射のマウス胸腺からCy5標識したmRNAを得た。
ポリT配列により挟まれたHLA-Bバリアントの吸着プローブ
ヒトHLA-B遺伝子のエクソン2のコドン67近傍、すなわちコドン65からコドン69の最初の2塩基を中心とした14塩基の一連のプローブを表4に示した。シーケンスは、EMBL-EPI HLAデータベースシーケンスアライメントツール(イントロンを含まない)から引用したヌクレオチドコーディング配列(CDS)である。ヒトHLA-B遺伝子のヌクレオチドシークエンスの265-278番目の塩基におけるバリアントであるこれらの14塩基長のシーケンスは8つのチミンまたはポリT配列により両側が挟まれ、それが 14-merの中心領域の核酸ターゲットとの結合能力を失う事無く、プローブの表面吸着を高める為の領域を挟むインサートとして使われ、全長30塩基のプローブとなる。これらの30mersが有するHLA-B遺伝子の既知のシーケンスバリアントに特異的な 中央部分における各々の塩基変化は太字で示した。実施例8で行ったように、図11A-11Eはこれらのプローブのシークエンスプロフィルとハイブリダイゼーションを示す。
金属酸化物で表面を被覆したスライド:一般的な方法
金属酸化物で表面被覆したスライドはアガロースマトリックス中で混合した粘土と金属酸化物粒子を用い作成した。通常、金属酸化物粒子は、20mg/mlの粒子濃度で、10mMのNa2B4O7、50mMのホウ酸、10mMのフッ化ナトリウムの溶液中で混和する。別の容器の中でアガロースを2%の濃度で10mMの四ホウ酸ナトリウム、50mMのホウ酸、10mMのフッ化ナトリウムの溶液に溶解し、沸騰させるため加熱した。アガロース溶液は恒温槽中で80-90℃で静置し、1容量の20mg/mlの金属酸化物懸濁液を添加し、よく混和する。スライドは1’x3’のスライドの1x2’領域の上にアガロース金属酸化物懸濁液の1mLを塗抹し作成し、その後このアガロース懸濁液を冷却しゲル化した。ゲルがスライド上で完全に崩壊し乾燥するまで、スライドはそれから周囲の温度と湿気条件の下で乾燥させた。
酸化アルミニウムで表面コートされたカオリン粒子は、50mMの塩酸、2mMの塩化アルミニウム溶液中で20mg/mlの濃度で酸で洗浄したカオリンを混合し合成した。この金属塩化物/カオリン懸濁混合物に同等量の2Mの水酸化アンモニウムを加え素早く混ぜ、混合液を室温で1時間インキュベートした。カオリン粒子は、遠心分離(3分間の1500xg)により回収した。上清を捨て、粒子は水に20mg/mlとなるよう再懸濁し、遠心分離(3分間の1500xg)により粒子をペレットにした。この行程を上清のpHが流入洗浄水(5から8の間)と同じになるまで繰り返した。これらの粒子のペレットは、それから100mMの炭酸ナトリウム溶液中に再懸濁し、一晩インキュベートした。粒子とアガロースを混合する前に、粒子は炭酸塩バッファーからペレットにし、20mg/mLの濃度で2回水で洗浄した(再懸濁とペレット化)。
酸化アルミニウム(Al2O3)で被覆された表面は、フェライト(Fe304)すなわち磁鉄鉱、粒子が、50mMの塩酸、2mMの塩化アルミニウム溶液中に20mg/mLの濃度で磁鉄鉱を懸濁し作成した。この溶液に等量の2Mの水酸化アンモニウムを加え、素早く混合し、その混合液を室温で1時間インキュベートした。粒子は磁場により収集し、上澄みを捨て、磁気粒子は20mg/mlの濃度で水に再懸濁した。洗浄行程は、2度繰り返した。続いてペレットを100mMの炭酸ナトリウムに再懸濁し、少なくとも一晩インキュベートし、本例で解説されるようにスライドが完成するまでこのバッファー中にて保存した。粒子とアガロースを混合する前に、粒子は炭酸塩バッファーから磁気によりペレット化し、20mg/mLの濃度で2回水で洗浄した(再懸濁とペレット化)。
HLA-Bのエクソン2に由来するCy3標識したアンプリコンのハイブリダイゼーション
スライドはハイブリダイゼーションの為、1時間2XSSCでスライドを湿らし、その後風乾した。50mMのホウ酸、10mMの四ホウ酸ナトリウム、10mMのフッ化ナトリウム、1mMのリン酸二水素一ナトリウム、0.1%のTween-20、ニシン精子DNAの100ug/mLと5XDenhardts溶液、3XSSCからなるプレハイブリダイゼーション溶液40uLを、スライドに室温で2時間塗布した。プローブは50mMのホウ酸、10mMのホウ砂、10mMのフッ化ナトリウム、1mMののリン酸二水素一ナトリウム、0.1%のTween-20、ニシン精子DNAの100ug/mLを含む5XDenhardtsの溶液に混合した。このプローブ混合物を40μl、各々のスライドに塗布後、ガラスのカバーグラスを被せ、16時間室温で湿気チャンバー内でインキュベートした。スライドは水ですすぎ、風乾させ、そして、スライドは40uL(ガラスのカバーグラスの下で)でハイブリダイズした。15uLのPCR溶液(ターゲット)を2XSSC、10%のDenhardts試薬、100ugのニシン精液DNA、0.01%のナトリウムラウロイルサルコシンの最終濃度となるようハイブリダイゼーション溶液に加えた。マイクロアレイのハイブリダイゼーション後、2XSSCに20分間、1XSSCに5分間、0.2XSSCに2分間浸し処理した。
当該技術に精通する当業者は本発明が目的を実行にうつし、これまで述べた予想される結果と利点とを、ここに示す固有の目的、結論、利点と同様に達成し得るのに非常に適していると直ちに評価するであろう。当業者に生じうる要求の範囲によって定義されるように、本発明の精神の範囲内で変更と他への使用が包含される。
Claims (37)
- 生体分子ハイブリダイゼーション装置であって、
該生体分子ハイブリダイゼーション装置が、
半永久的に共有結合する官能基の表面を有する基板と、そして
各オリゴヌクレオチドのほぼ全てのリン酸基の直接的な非共有結合性のリン酸と表面との吸着接触により表面上に圧縮されたオリゴヌクレオチドの飽和膜として10から約24塩基長の修飾されない全ての一本鎖オリゴヌクレオチドの吸着単一分子層とを含み、
圧縮された各オリゴヌクレオチド塩基表面が、オリゴヌクレオチドの塩基平面の提示の変更を伴わず、そして表面からのオリゴヌクレオチドリン酸基の解離を伴わない非対称の非らせん塩基対合により相補的な一本鎖核酸に解離的にハイブリダイズするのに効果的な方法で表面から提示されることを特徴とする生体分子ハイブリダイゼーション装置。 - オリゴヌクレオチドの5’または3’末端の一方または両方でハイブリダイズしないポリT配列をさらに包含し、吸着したオリゴヌクレオチドが各々約30塩基長となることを特徴とする請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面に処理されたキャッピング材をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記キャッピング材が界面活性剤または酸無水物であることを特徴とする請求項3に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面に吸着する10〜約24の塩基対の長さの非らせん形の二本鎖としてオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズする一本鎖核酸をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記核酸がDNAまたはRNAであることを特徴とする請求項5に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記リン酸基が約0.5から1平方nm未満の表面当たり、1つのリン酸基という密度で、表面に吸着することを特徴とする請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記官能基が、正に荷電する、極性の、又は負に荷電する親水性表面を形成するか又は疎水性の表面を形成することを特徴とする請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記正に荷電する表面がアミノシランであることを特徴とする請求項8に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面が有機材料または無機材料を含むことを特徴とする請求項8に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記有機材料がアミノ酸、脂質、ヌクレオチド、炭水化物、炭化水素またはイソプレノイドであることを特徴とする請求項10に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記無機材料が水素結合供与体である金属酸化物であることを特徴とする請求項10に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記金属酸化物がフェライト、二酸化アルミニウムまたは二酸化チタンあるいは、アルミニウム、チタン、ジルコニウム、バリウム、カルシウム、カドミウム、コバルト、鉄、マグネシウム、ニッケルまたは亜鉛の酸化物で被覆されるフェライトであることを特徴とする請求項12に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記基板の形態がスライドまたはビーズであることを特徴とする請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- ハイブリダイゼーション可能な条件下で少なくとも1つの溶液状態の核酸ターゲットと、請求項1に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置とを接触する工程を含み、非らせん形の、非対称のプローブ-ターゲット二本鎖が形成されることを特徴とする溶液状態のターゲット核酸をプローブ核酸にハイブリダイズする方法。
- 結合可能な状況下でのヌクレオチド結合タンパク質と請求項5に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置を接触する工程と、
約1Mから約5MのNaCl水溶液のイオン強度を備える食塩水を用いて前記表面から形成される二本鎖タンパク質複合体を溶出する工程と、そして、溶出させた二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖をシークエンスする工程とを含むことを特徴とするヌクレオチド-結合タンパク質に結合するヌクレオチド配列を同定する方法。 - 生体分子ハイブリダイゼーション装置であって、
該生体分子ハイブリダイゼーション装置が、
半永久的に共有結合する官能基の表面を有する基板と、そして、
各オリゴヌクレオチドのほぼ全てのリン酸基の直接的な非共有結合性のリン酸と表面との吸着接触により表面上に圧縮されたオリゴヌクレオチドの飽和膜として約30塩基長の修飾されない全ての非修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの吸着単一分子層とを含み、
圧縮されたオリゴヌクレオチドの夫々がターゲットとされ、ハイブリダイズする10から約24塩基の領域と、5'または3'末端の片側または両側の隣接する塩基のターゲットとされずハイブリダイズしない領域を持ち、これにより、前記ターゲット領域中の圧縮された各オリゴヌクレオチド塩基平面が、オリゴヌクレオチドの塩基平面の提示の変更を伴わず、そして表面からのオリゴヌクレオチドリン酸基の解離を伴わない非対称の非らせん塩基対合により相補的な一本鎖核酸に解離的にハイブリダイズするのに効果的な方法で表面から提示されることを特徴とする生体分子ハイブリダイゼーション装置。 - 前記表面に処理されたキャッピング材をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記キャッピング材が界面活性剤または酸無水物であることを特徴とする請求項18に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面に吸着する10〜約24の塩基対の長さの非らせん形の二本鎖としてオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズする一本鎖核酸をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記核酸がDNAまたはRNAであることを特徴とする請求項20に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- ターゲットとされずハイブリダイズしない領域の塩基がポリT配列または他の挿入塩基配列であることを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記吸着単一分子層が非修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの約二倍の飽和量から形成されることを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記リン酸基が約0.5から1平方nm未満の表面当たり、1つのリン酸基という密度で、表面に吸着することを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記官能基が、正に荷電する、極性の、又は負に荷電する親水性表面を形成するか又は疎水性の表面を形成することを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記正に荷電する表面がアミノシランであることを特徴とする請求項25に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面が有機材料または無機材料を含むことを特徴とする請求項25に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記有機材料がアミノ酸、脂質、ヌクレオチド、炭水化物、炭化水素またはイソプレノイドであることを特徴とする請求項27に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記無機材料が水素結合供与体である金属酸化物であることを特徴とする請求項27に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記金属酸化物がフェライト、二酸化アルミニウム、二酸化チタニウムあるいはアルミニウム、チタニウム、ジルコニウム、バリウム、カルシウム、カドミウム、コバルト、鉄、マグネシウム、ニッケルまたは亜鉛の酸化物で被覆されたフェライトであることを特徴とする請求項29に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記基板の形態がスライドまたはビーズであることを特徴とする請求項17に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 半永久的に共有結合しアミノシラン化された表面を有する基板と、
表面の約0.5から1平方ナノメートル未満当たり一つのリン酸基の密度で、各オリゴヌクレオチドのほぼ全てのリン酸基の直接的な非共有結合性のリン酸と表面との吸着接触により表面上に圧縮されたオリゴヌクレオチドの飽和膜としてアミノシラン化した表面に吸着された10から24塩基長の全ての非修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの吸着単一分子層とを含み、
圧縮された各オリゴヌクレオチド塩基表面が、オリゴヌクレオチドの塩基平面の提示の変更を伴わず、そして表面からのオリゴヌクレオチドリン酸基の解離を伴わない非対称の非らせん塩基対合により相補的な一本鎖核酸に解離的にハイブリダイズするのに効果的な方法で表面から提示されることを特徴とする生体分子ハイブリダイゼーション装置。 - オリゴヌクレオチドの5’または3’末端の一方または両方でハイブリダイズしないポリT配列をさらに包含し、吸着したオリゴヌクレオチドが各々約30塩基長となることを特徴とする請求項32に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面に処理されたキャッピング材をさらに含むことを特徴とする請求項32に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記キャッピング材が界面活性剤または酸無水物であることを特徴とする請求項34に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記表面に吸着する10〜約24の塩基対の長さの非らせん形の二本鎖としてオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズする一本鎖のDNAまたはRNAをさらに含むことを特徴とする請求項33に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
- 前記基板の形態がスライドまたはビーズであることを特徴とする請求項33に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
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