JP2011217708A - Nucleic acid linker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸リンカー、核酸リンカー−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体、これらタンパク質複合体の製造方法、プロテインアレイ、これを用いたタンパク質間相互作用解析方法、標的分子結合タンパク質同定方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid linker, a nucleic acid linker-protein complex, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex, an mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex, a method for producing these protein complexes, a protein array, and a protein using the same The present invention relates to a method for analyzing interaction between proteins and a method for identifying a target molecule binding protein.
新規機能ペプチド・タンパク質の取得に際しては、ペプチド・タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法と、膨大な種類の分子が存在するランダムライブラリーから目的の機能を有する分子を取得する進化分子工学的手法とが主流になっている。
特に近年では、ファージディスプレイ法に代表される進化分子工学の要素技術である遺伝子型−表現型対応付け技術の進歩により、短期間で機能タンパク質を取得することが可能となった。
When acquiring new functional peptides / proteins, protein engineering methods designed by human knowledge based on peptide / protein structure information, and evolutionary molecules that acquire molecules with the desired functions from a random library containing a huge variety of molecules Engineering methods have become mainstream.
Particularly in recent years, it has become possible to acquire functional proteins in a short period of time due to advances in genotype-phenotype association technology, which is an elemental technology of evolutionary molecular engineering represented by the phage display method.
細胞を利用した遺伝子型−表現型対応付け技術としては、ファージディスプレイ法以外に大腸菌や酵母等を用いた細胞ディスプレイ法が挙げられる。これらはいずれも機能ペプチド・タンパク質を取得する上で有益な方法であるが、単位体積あたりの細胞数が制限されるため１０８／ｍｌ以上のライブラリーサイズをもつことは不可能であり、このため、スクリーニング効率が低いという欠点があった。
この課題を克服するために無細胞翻訳系を利用した遺伝子型−表現型の対応付けの方法が開発された。これらの代表的な例としては、リボソームを介してｍＲＮＡと前記ｍＲＮＡを翻訳したタンパク質を連結する「リボソームディスプレイ」やｍＲＮＡと前記ｍＲＮＡをコードしたタンパク質を連結する「ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法」が挙げられる。これらを用いることにより、１０１２／ｍｌ以上のライブラリーサイズをもち、ファージディスプレイ法が細胞を利用することから生ずる細胞毒性、膜透過性等の課題が解消することからスクリーニング効率の飛躍的な向上が可能となった。
さらに、核酸リンカーが、タンパク質と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡと、を結ぶｃＤＮＡディスプレイ法が開発された。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。
Examples of cell-based genotype-phenotype matching techniques include cell display methods using Escherichia coli, yeast, and the like in addition to the phage display method. These are all useful methods for obtaining functional peptides and proteins. However, since the number of cells per unit volume is limited, it is impossible to have a library size of 10 8 / ml or more. Therefore, there was a drawback that the screening efficiency was low.
In order to overcome this problem, a genotype-phenotype association method using a cell-free translation system has been developed. Typical examples of these include “ribosome display” in which mRNA and a protein obtained by translating the mRNA are linked via a ribosome, and “in vitro virus method” in which mRNA and a protein encoding the mRNA are linked. By using these, the library size is 10 12 / ml or more, and the problems such as cytotoxicity and membrane permeability resulting from the use of cells by the phage display method are eliminated. Became possible.
Furthermore, a cDNA display method has been developed in which a nucleic acid linker connects a protein, mRNA encoding the protein, and reverse-transcribed cDNA. Since the mRNA / cDNA-protein conjugate structure is very stable, it has become possible to carry out screening in various environments.
ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する。
以下、ｃＤＮＡディスプレイ法について説明する。
ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを結合させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成すると、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生ずる（非特許文献１参照）。
次に、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製し、所望の機能をもつタンパク質を選択する。選択したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択する前でもよく、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−を形成した後にタンパク質を合成してもよい。
The cDNA display method is characterized by puromycin that is contained in a nucleic acid linker that links a protein and a polynucleotide encoding the protein (see Patent Document 1).
Puromycin is a protein synthesis inhibitor having a structure similar to the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA, and specifically binds to the 3 ′ end of a growing protein on a ribosome under certain conditions.
Hereinafter, the cDNA display method will be described.
A complex in which a nucleic acid linker having puromycin is bound to mRNA and a protein is synthesized from mRNA using a cell-free translation system, and the synthesized protein and mRNA encoding the same are bound via puromycin. (MRNA-nucleic acid linker-protein complex) is generated (see Non-Patent Document 1).
Next, a library of the mRNA-nucleic acid linker-protein complex is prepared, and a protein having a desired function is selected. The selected mRNA-nucleic acid linker-protein complex is reverse transcribed with a reverse transcriptase, cDNA is synthesized, and the protein is identified by analyzing the base sequence of the cDNA. The timing of reverse transcription may be before the protein is selected, or the protein may be synthesized after forming the mRNA / cDNA-nucleic acid linker.
上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質チップは、網羅的解析により、短期間で機能タンパク質を取得するためのツールとして重要である。このような網羅的解析をするにあたり、チップを構成する個々のタンパク質が、基板上に適当量固定されている必要がある。さらに、タンパク質相互作用解析や感度を必要とする繊細なアッセイを行う場合には、基板上のタンパク質に高純度が要求される場合がある。 A protein chip in which the library of the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex is immobilized on a substrate is important as a tool for obtaining a functional protein in a short period of time by comprehensive analysis. For such a comprehensive analysis, it is necessary that an appropriate amount of each protein constituting the chip is fixed on the substrate. Furthermore, when performing a delicate assay that requires protein interaction analysis or sensitivity, the protein on the substrate may be required to have high purity.
これに対して、Ｈｉｓ（ヒスチヂン）タグやＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグといったアミノ酸配列からなるタグ配列を精製すべきタンパク質に挿入し、融合タンパク質をアフィニティー精製により得るという手法が行われている。 On the other hand, there is a technique in which a tag sequence consisting of an amino acid sequence such as a His (histidine) tag or a GST (glutathione-S-transferase) tag is inserted into a protein to be purified, and a fusion protein is obtained by affinity purification. .
しかしながら、このような手法は、精製に用いられるビーズ（担体樹脂）が有する特定のアミノ酸配列との親和性を利用したものであるため、類似するアミノ酸配列を有する夾雑タンパク質を除去することが難しく、精製度の点で難がある。特に合成量の少ない無細胞翻訳系を用いた場合には適していない。
また、あらかじめタグ配列が挿入されたｍＲＮＡを作製しなければならない点で手間である。
However, since such a technique utilizes affinity with a specific amino acid sequence of beads (carrier resin) used for purification, it is difficult to remove contaminating proteins having a similar amino acid sequence, There are difficulties in terms of purity. In particular, it is not suitable when a cell-free translation system with a low synthesis amount is used.
Moreover, it is troublesome in that it is necessary to prepare mRNA in which a tag sequence is inserted in advance.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、網羅的なタンパク質相互作用解析等に用いられる、純度の高いタンパク質を精製できる核酸リンカーを提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the said situation, Comprising: It aims at providing the nucleic acid linker which can refine | purify highly purified protein used for a comprehensive protein interaction analysis etc.
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーの３’末端にポリｄＡ（ポリデオキシアデニン）を導入することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１７）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリｄＡ配列及び前記ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方が結合していることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記ポリｄＡ配列の塩基数が２０以上４０以下であることが好ましい。
（３）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記２本のポリヌクレオチド鎖が、前記一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に結合している光反応架橋剤により架橋されていることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記光反応架橋剤が、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）であることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記タンパク質の連結部が、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなることが好ましい。
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記アーム部が、前記アーム部を切断するための光切断部位または１本鎖核酸切断酵素部位を含むことが好ましい。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the problem can be solved by introducing poly dA (polydeoxyadenine) at the 3 ′ end of the nucleic acid linker. One embodiment of the present invention provides the following (1) to (17).
(1) The nucleic acid linker in one embodiment of the present invention is a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein encoded by the mRNA,
The nucleic acid linker is composed of two polynucleotide strands having mutually complementary sequences on the 5 ′ end side,
The two polynucleotide strands are hybridized via the sequence;
One polynucleotide chain has a single-stranded polynucleotide portion capable of hybridizing to the sequence on the 3 ′ end side of the mRNA, and a linking portion of the protein at the end branched from the single-stranded polynucleotide portion. An arm portion, and
The other polynucleotide chain is characterized in that a poly dA sequence is attached to the 3 ′ end and one of two specific molecules that specifically bind to the end of the poly dA sequence.
(2) In the nucleic acid linker according to an embodiment of the present invention, the poly dA sequence preferably has 20 to 40 bases.
(3) In the nucleic acid linker according to one embodiment of the present invention, the two polynucleotide chains are preferably cross-linked by a photoreactive cross-linking agent bonded to the 5 ′ end of the one polynucleotide chain. .
(4) In the nucleic acid linker according to one embodiment of the present invention, the photoreactive crosslinking agent is preferably psoralen.
(5) In the nucleic acid linker according to one embodiment of the present invention, the protein linking part may be puromycin, 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside, or 3′-N-aminoacyl adenosine amino at the end of the arm part. It is preferable that a nucleoside is bound.
(6) In the nucleic acid linker according to one embodiment of the present invention, the arm part preferably includes a photocleavage site or a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme site for cleaving the arm part.
（７）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記一方のポリヌクレオチド鎖が、標識物質を有することが好ましい。
（８）本発明の一実施態様における核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする。
（９）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
(7) In the nucleic acid linker according to one embodiment of the present invention, the one polynucleotide chain preferably has a labeling substance.
(8) The nucleic acid linker-protein complex in one embodiment of the present invention is characterized in that the nucleic acid linker described above and the protein encoded by the mRNA are linked.
(9) In the mRNA-nucleic acid linker-protein complex in one embodiment of the present invention, the mRNA and the protein encoded by the mRNA are linked via the nucleic acid linker described above. Features.
(10) The mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex in one embodiment of the present invention comprises the mRNA / cDNA complex comprising the mRNA and cDNA complementary to the mRNA via the nucleic acid linker described above, In addition, the protein encoded by the mRNA is linked.
(11) The method for producing a protein complex according to one embodiment of the present invention includes an mRNA-nucleic acid linker in which the mRNA and the protein encoded by the mRNA are linked via the nucleic acid linker described above. A method for producing a protein complex comprising the steps of:
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(D) The oligo dA possessed by the mRNA-nucleic acid linker-protein complex is bound to the oligo dT on the carrier to immobilize the complex to the carrier, and the immobilized complex is purified. And a step of performing.
（１２）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されている核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
（１３）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されているｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｆ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
（１４）本発明の一実施態様におけるプロテインアレイは、先に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されていることを特徴とする。
（１５）本発明の一実施態様における解析方法は、先に記載のプロテインアレイを標的分子と接触させ、前記標的分子とタンパク質複合体との相互作用を解析することを特徴とする。
（１６）本発明の一実施態様における標的分子結合タンパク質の同定方法は、標的分子と結合するタンパク質を同定する方法であって、
（ｇ）先に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されているプロテインアレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする。
（１７）本発明の一実施態様における標的分子結合タンパク質の同定方法は、前記工程（ｈ）が、表面プラズモン共鳴法により行われる工程であることが好ましい。
(12) A method for producing a protein complex in one embodiment of the present invention is a method for producing a nucleic acid linker-protein complex in which the nucleic acid linker described above is linked to the protein encoded by the mRNA. Because
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(E) decomposing said mRNA using RNase to produce a nucleic acid linker-protein complex;
(D) A step of immobilizing the complex to the carrier by binding the oligo dA included in the nucleic acid linker-protein complex and the oligo dT on the carrier, and purifying the immobilized complex. It is characterized by having.
(13) A method for producing a protein complex according to an embodiment of the present invention includes the mRNA / cDNA complex comprising the mRNA and the cDNA complementary to the mRNA via the nucleic acid linker described above, and the mRNA. A method for producing an mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex to which encoded proteins are linked, comprising:
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(F) subjecting the mRNA-nucleic acid linker-protein complex to a reverse transcription reaction to produce an mRNA / cDNA-nucleic acid linker complex;
(D) The oligo dA possessed by the mRNA / cDNA-nucleic acid linker complex is bound to the oligo dT on the carrier, thereby immobilizing the complex to the carrier and purifying the immobilized complex. And a step of performing.
(14) The protein array according to one embodiment of the present invention is characterized in that the protein complex described above is immobilized on a substrate.
(15) The analysis method in one embodiment of the present invention is characterized in that the protein array described above is brought into contact with a target molecule, and the interaction between the target molecule and the protein complex is analyzed.
(16) The method for identifying a target molecule-binding protein in one embodiment of the present invention is a method for identifying a protein that binds to a target molecule,
(G) contacting a protein array in which the protein complex described above is immobilized on a substrate with a target molecule;
(H) analyzing the interaction between the target molecule and the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex;
(I) recovering mRNA / cDNA from the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex bound to the target molecule, and determining the nucleotide sequence of the recovered cDNA.
(17) In the method for identifying a target molecule-binding protein in one embodiment of the present invention, the step (h) is preferably a step performed by a surface plasmon resonance method.
本発明によれば、網羅的なタンパク質相互作用解析等に用いられる、純度の高いタンパク質を精製できる核酸リンカーが得られる。 According to the present invention, a nucleic acid linker that can be used for comprehensive protein interaction analysis or the like and that can purify a highly pure protein can be obtained.
≪核酸リンカー≫
本実施形態の核酸リンカーは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと、これらがコードするタンパク質とを連結するためのリンカーである。本実施形態の核酸リンカーの構造について、図１を用いて説明する。
図１中、Ｐｕはピューロマイシン、Ｆはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＡＴＣＧはＤＮＡシーケンスを示している。また、Ｓｐｃ１８はアーム部を構成するスペーサーを示し、ｄＡはデオキシアデニンを示している。
≪Nucleic acid linker≫
The nucleic acid linker of this embodiment is a linker for linking mRNA or mRNA / cDNA and the protein encoded by them. The structure of the nucleic acid linker of this embodiment will be described with reference to FIG.
In FIG. 1, Pu represents puromycin, F represents fluorescein, and ATCG represents a DNA sequence. Spc18 represents a spacer constituting the arm part, and dA represents deoxyadenine.
本実施形態の核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖（Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅ及びＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅ）からなり、前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズし、２本鎖を形成している。 The nucleic acid linker of the present embodiment is composed of two polynucleotide strands (Puro side and PolyA side) having sequences complementary to each other on the 5 ′ end side, and the two polynucleotide strands are arranged via the sequence. To form a double strand.
２本のポリヌクレオチド鎖は，ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。修飾ＤＮＡとしては、ホスホルアミダイト、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど，当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。 The two polynucleotide chains may be DNA or a nucleic acid derivative such as PNA (polynucleopeptide), and modified DNA imparted with nuclease resistance is preferred. Examples of the modified DNA include any modified DNA known in the art, such as DNA having an internucleoside bond such as phosphoramidite and phosphorothioate, and DNA having a sugar modification such as 2′-fluoro and 2′-O-alkyl. It may be used.
本実施形態の核酸リンカーを構成する一方のポリヌクレオチド鎖Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅは、１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分に結合している末端にタンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含む。
前記１本鎖ポリヌクレオチド部分は、５’末端側にＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅの５’末端側と相補する配列を有し、３’側の領域にスクリーニングすべきｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる配列を有している。
また、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分は、５’末端に光反応架橋剤を有し、前記２本のポリヌクレオチド鎖が、前記光反応架橋剤により架橋されていることが好ましい。これにより、Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅ及びＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅ間の結合を強固なものとすることができる。
One polynucleotide chain Puroside that constitutes the nucleic acid linker of the present embodiment is a single-stranded polynucleotide part, and an arm part having a protein linking part at the end bonded to the single-stranded polynucleotide part, including.
The single-stranded polynucleotide portion has a sequence complementary to the 5 ′ end side of PolyA side on the 5 ′ end side, and hybridizes with the sequence on the 3 ′ end side of mRNA to be screened in the 3 ′ side region. Has a possible sequence.
The single-stranded polynucleotide portion preferably has a photoreactive cross-linking agent at the 5 ′ end, and the two polynucleotide chains are cross-linked by the photoreactive cross-linking agent. Thereby, the coupling | bonding between Puro side and PolyA side can be strengthened.
架橋とは、例えば塩基同士を共有結合で結ぶことを意味する。
光反応架橋剤としては、芳香族アジド系化合物（例、多環芳香族アジド系化合物、等）やベンゾフラン系化合物等が挙げられ、ベンゾフラン系化合物としては、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）が好適に用いられる。ソラレンは、前記２本のポリヌクレオチド鎖が有する相補的な５’- ＴＡ配列に特異的にインターカレーションし、ＵＶ光（３５０ｎｍ）照射によりチミン残基同士に共有結合をつくり２本鎖を架橋する。
Crosslinking means, for example, connecting bases with a covalent bond.
Examples of the photoreactive crosslinking agent include aromatic azide compounds (eg, polycyclic aromatic azide compounds) and benzofuran compounds, and psoralen is preferably used as the benzofuran compound. Psoralen specifically intercalates with the complementary 5'-TA sequence of the two polynucleotide strands, and forms a covalent bond between thymine residues by UV light (350 nm) irradiation to crosslink the two strands. To do.
Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅのアーム部分は、ｍＲＮＡとタンパク質連結部分とを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部分の５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端側の箇所で１本鎖ポリヌクレオチド部分と結合し、アーム部分の３’末端はタンパク質連結部分を有する。 The arm portion of Puro side functions as a spacer that holds the mRNA and the protein linking portion at a desired distance. The 5 'end of the arm portion binds to the single-stranded polynucleotide portion at a position on the 3' end side of the single-stranded polynucleotide portion, and the 3 'end of the arm portion has a protein linking portion.
１本鎖ポリヌクレオチド部分とアーム部分との連結は、１本鎖ポリヌクレオチド部分上の連結箇所に存在する修飾ヌクレオチド（例えばアミノ基がスペーサを介して塩基部分に導入されたヌクレオチド）と、アーム部分の末端に存在する修飾ヌクレオチド（例えばチオールを５’末端にもつヌクレオチド）とを二官能性試薬を用いて架橋することにより行うことができる。
後述するようにスクリーニングすべきｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、アーム部分の５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端から数塩基上流の位置で１本鎖ポリヌクレオチド部分と結合し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。逆転写の際に１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端がプライマーとして機能するからである。
The linkage between the single-stranded polynucleotide portion and the arm portion consists of a modified nucleotide (for example, a nucleotide in which an amino group is introduced into the base portion via a spacer) present at the connecting position on the single-stranded polynucleotide portion, and the arm portion. Can be carried out by crosslinking with a modified nucleotide existing at the end of the nucleotide (for example, a nucleotide having a thiol at the 5 ′ end) using a bifunctional reagent.
When it is necessary to reverse transcribe mRNA to be screened as described later, the 5 ′ end of the arm portion is a single-stranded polynucleotide portion at a position several bases upstream from the 3 ′ end of the single-stranded polynucleotide portion. And a T-shaped structure is preferably formed. This is because the 3 ′ end of the single-stranded polynucleotide moiety functions as a primer during reverse transcription.
また、スクリーニングすべきｍＲＮＡを逆転写させる必要がない場合には、１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端が標識物質を用いて標識されてもよい。標識物質は、蛍光色素や放射性物質等から適宜選択される。蛍光色素としては、フルオロセインが代表的である。これにより核酸リンカーが蛍光標識され、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体及びｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を容易に検出することができる。 When there is no need to reverse transcribe the mRNA to be screened, the 3 'end of the single-stranded polynucleotide portion may be labeled with a labeling substance. The labeling substance is appropriately selected from fluorescent dyes, radioactive substances, and the like. A typical fluorescent dye is fluorescein. Thereby, the nucleic acid linker is fluorescently labeled, and the mRNA-nucleic acid linker complex and the mRNA-nucleic acid linker-protein complex can be easily detected.
アーム部分の３’末端にはタンパク質の連結部が存在する。タンパク質連結部分とは，所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質の連結部としては，伸張中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドなどのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
アーム部分は、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。アーム部分にはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や，複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。
There is a protein junction at the 3 'end of the arm. The protein linking moiety means a structure having a property of specifically binding to the 3 ′ end of the extending protein on the ribosome under a predetermined condition, and puromycin is representative.
Puromycin is a protein synthesis inhibitor having a structure similar to the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA. As the protein linking portion, any substance can be used as long as it has a function of specifically binding to the 3 ′ end of the extending protein, and 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside or 3′- A puromycin derivative such as N-aminoacyl adenosine aminonucleoside can be used.
The arm part may be composed of a nucleic acid or a nucleic acid derivative as long as it functions as a spacer, and may be composed of a polymer such as polyethylene glycol. The arm portion may further be attached with a modification for enhancing the stability of puromycin and a label for detecting the complex.
本実施形態の核酸リンカーのアーム部は、前記アーム部を切断するための光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位を含んでいてもよい。
このことにより、タンパク質と標的物質との結合を解離させることなく、タンパク質と対応づけられるｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を回収することができる。
光切断性部位とは，紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、光分解(ＳＢＩＰ)手法による鎖切断などが挙げられる。
光切断性部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよい。また，１本鎖核酸切断酵素切断部位とは，デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。
The arm part of the nucleic acid linker of this embodiment may include a photocleavable site or a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme cleavage site for cleaving the arm part.
Thereby, mRNA (or cDNA) associated with the protein can be recovered without dissociating the binding between the protein and the target substance.
The photocleavable site refers to a group having a property of being cleaved when irradiated with light such as ultraviolet rays. For example, PC Linker Phosphoramidite (Glen research), a composition for photocleavage of nucleic acid containing fullerene (nucleic acid) And photocleavage composition: JP-A-2005-245223), chain cleavage by photolysis (SBIP) technique, and the like.
As the photocleavable site, any group that is commercially available or known in the art may be used. The single-stranded nucleic acid cleaving enzyme cleavage site refers to a nucleic acid group that can be cleaved by a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme such as deoxyribonuclease or ribonuclease, and includes nucleotides and derivatives thereof.
本実施形態の核酸リンカーを構成する他方のポリヌクレオチド鎖ＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅは、５’末端側にＰｕｒｏ ｓｉｄｅの５’末端側と相補する配列を有し、３’末端にポリｄＡ配列を有する。
ｃＤＮＡディスプレイ法においては、無細胞翻訳系でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した後、ｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成する際に、無細胞翻訳系に由来する夾雑物質が存在すると逆転写の効率が低くなるため、逆転写反応の前にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を精製することもできる。
前記複合体は、ＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅの３’末端にポリｄＡ配列が結合しているので、無細胞翻訳系でｍＲＮＡからタンパク質を合成した後に、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をポリｄＡ配列を介してＯｌｉｇｏ ｄＴカラムに結合させて回収し、溶出し、逆転写することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を無細胞翻訳系から容易に精製することができる。
The other polynucleotide chain PolyA side constituting the nucleic acid linker of the present embodiment has a sequence complementary to the 5 ′ end side of Puro side on the 5 ′ end side and a poly dA sequence on the 3 ′ end.
In the cDNA display method, after synthesizing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in a cell-free translation system and then synthesizing cDNA from the mRNA by reverse transcription, reverse transcription occurs when there is a contaminant derived from the cell-free translation system. Therefore, the mRNA-nucleic acid linker-protein complex can be purified before the reverse transcription reaction.
Since the complex has a poly dA sequence bound to the 3 ′ end of PolyA side, after synthesizing a protein from mRNA in a cell-free translation system, the mRNA-nucleic acid linker-protein complex is passed through the poly dA sequence. The mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex can be easily purified from a cell-free translation system by binding to an Oligo dT column, recovering, eluting, and reverse transcription.
本実施形態の核酸リンカーが有するポリｄＡ配列の塩基数は、精製に用いられるＯｌｉｇｏ ｄＴカラムとの適度な親和性（結合及び解離）の観点から、２０以上、４０以下であることが好ましく、２５以上、３５以下であることがより好ましい。 The number of bases of the poly dA sequence possessed by the nucleic acid linker of this embodiment is preferably 20 or more and 40 or less from the viewpoint of appropriate affinity (binding and dissociation) with the Oligo dT column used for purification. More preferably, it is 35 or less.
本実施形態の核酸リンカーを構成する他方のポリヌクレオチド鎖ＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅは、ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方（以下、親和性物質）が結合している。親和性物質を導入することにより、各種タンパク質複合体を固相（支持体）に容易に結合させることができる。
親和性物質としては、ビオチン、スクシンイミジル基等の活性エステル基、マレイミド基、ヨウ化アセチル基、各種の抗原又は抗体、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等が挙げられ、ビオチンが好ましく用いられる。これにより、後述するｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をストレプトアビジンが結合されている基板上に固定することができる。
In the other polynucleotide chain PolyA side that constitutes the nucleic acid linker of this embodiment, one of the two specific molecules that specifically bind (hereinafter referred to as an affinity substance) is bound to the end of the poly dA sequence. . By introducing an affinity substance, various protein complexes can be easily bound to a solid phase (support).
Examples of the affinity substance include an active ester group such as biotin and a succinimidyl group, a maleimide group, an acetyl iodide group, various antigens or antibodies, a FLAG tag, and a His tag, and biotin is preferably used. Thereby, the mRNA-nucleic acid linker-protein complex described later can be immobilized on the substrate to which streptavidin is bound.
本実施形態の核酸リンカーによれば、その３’末端にポリｄＡと親和性物質（例えば、ビオチン）がタンデムに連結していることにより、後述するタンパク質複合体の精製にポリｄＡを用いることができ、かつ基板への固定化に前記親和性物質を用いることができる。ポリｄＡ又は親和性物質のどちらか一方のみを有する核酸リンカーを用いた場合には、基板上にタンパク質複合体を固定した後に、夾雑タンパク質を除去するための洗浄をする必要がある。しかしながら、本実施形態に用いられるようなタンパク質間相互作用を解析する装置においては、フローセルに夾雑タンパク質を含むタンパク質複合体をインジェクションする段階で、流路が詰まり適切な解析を行うことができない。本実施形態は、上記構成を有するためこのような問題点を解決することができる。 According to the nucleic acid linker of this embodiment, poly dA and an affinity substance (for example, biotin) are linked to the 3 ′ end in tandem, so that poly dA can be used for purification of a protein complex described later. The affinity substance can be used for immobilization on a substrate. When a nucleic acid linker having only one of poly dA and affinity substance is used, it is necessary to wash the protein complex after fixing the protein complex on the substrate. However, in the apparatus for analyzing the protein-protein interaction used in the present embodiment, the flow channel is clogged at the stage of injecting the protein complex containing the contaminating protein into the flow cell, and appropriate analysis cannot be performed. Since this embodiment has the above-described configuration, it is possible to solve such a problem.
≪ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体及びその製造方法≫
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカーを用いて製造される。
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
以下、各工程について説明する。
<< mRNA-nucleic acid linker-protein complex and method for producing the same >>
The mRNA-nucleic acid linker-protein complex of this embodiment is produced using the mRNA-nucleic acid linker of this embodiment.
The production method of the mRNA-nucleic acid linker-protein complex of this embodiment is as follows:
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(D) The oligo dA possessed by the mRNA-nucleic acid linker-protein complex is bound to the oligo dT on the carrier to immobilize the complex to the carrier, and the immobilized complex is purified. And a step of performing.
Hereinafter, each step will be described.
工程（ａ）において、ｍＲＮＡと核酸リンカーとをアニールさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡの調製について説明する。
ｍＲＮＡは、スクリーニングすべきタンパク質をコードするＤＮＡを調製し、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、標的分子との結合に関して調べたい任意のＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
転写前のＤＮＡの３’末端に共通のタグ配列を挿入し、転写後のｍＲＮＡの３’側が、本実施形態の核酸リンカーのＰｕｒｏ ｓｉｄｅの３’側の領域とハイブリダイズするように設計しておく。
In step (a), the mRNA and nucleic acid linker are annealed. First, preparation of mRNA used in step (a) will be described.
mRNA is obtained by preparing DNA encoding the protein to be screened and transcribed with RNA polymerase. Examples of the RNA polymerase include T7 RNA polymerase.
As the DNA, any DNA or DNA library to be examined for binding to a target molecule can be used. For example, a cDNA library obtained from a sample tissue, a DNA library obtained by randomly synthesizing a sequence, a DNA library obtained by mutating a part of the sequence, and the like can be used.
A common tag sequence is inserted into the 3 ′ end of the DNA before transcription, and the 3 ′ side of the mRNA after transcription is designed to hybridize with the 3 ′ side region of Puro side of the nucleic acid linker of this embodiment. deep.
次にｍＲＮＡの３’末端領域と本実施形態の核酸リンカーのＰｕｒｏ ｓｉｄｅの３’側の領域とをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡを変性させた後、１時間かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡが核酸リンカーに確実にハイブリダイズされる。 Next, the 3 ′ end region of mRNA and the 3 ′ side region of Puro side of the nucleic acid linker of this embodiment are annealed. For example, after heating to 90 ° C. to denature the mRNA, cooling to 25 ° C. over 1 hour ensures that the mRNA is hybridized to the nucleic acid linker.
次に工程（ｂ）において、前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーのＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅの５’末端とをライゲーションさせる。ライゲーションに際し、前記ｍＲＮＡの３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。 Next, in step (b), the 3 'end of the mRNA and the 5' end of PolyA side of the nucleic acid linker are ligated. At the time of ligation, it is necessary to phosphorylate the 3 ′ end of the mRNA using an enzyme such as T4 polynucleotide kinase. As an enzyme used for ligation, RNA ligase is preferable, and for example, T4 RNA ligase can be mentioned.
次に工程（ｃ）において、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーのタンパク質連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する。 Next, in step (c), mRNA-nucleic acid linker-protein in which the C-terminal of the protein is bound to the protein linking part of the nucleic acid linker by synthesizing the protein from the mRNA using a cell-free protein translation system. A composite is produced.
無細胞翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子等、翻訳に必要な要素が含まれている。このような無細胞翻訳系として、大腸菌抽出、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が一般的に用いられる。
このような系を用いることにより、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が製造される。
A cell-free translation system is a protein translation system consisting of components that have the ability to synthesize proteins extracted from appropriate cells. This system contains elements necessary for translation, such as ribosomes, translation initiation factors, and translation elongation factors. It is. As such a cell-free translation system, Escherichia coli extraction, rabbit reticulocyte extract, wheat germ extract and the like are generally used.
By using such a system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex is produced.
次に工程（ｄ）において、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する。担体としては、核酸やタンパク質の精製に用いられるものであれば特に限定されないが、粒子状のものが好ましく、ビーズや磁気ビーズがより好ましい、タンパク質の純度を上げるためには前記ビーズが詰められたカラムが特に好ましい。
本実施形態においては、核酸の精製方法に用いられる手法をタンパク質の精製方法に利用している。そのため、担体上のオリゴｄＴは、オリゴｄＡを有するｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体に特異的に結合する。工程（ｄ）を用いることによって純度の高いタンパク質複合体を精製することができる。このようにして製造されたタンパク質複合体は、繊細な評価系、例えばビアコアを用いたタンパク質相互作用解析や、コンタミタンパク質の存在によってＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を充分に得られなくなってしまうようなアッセイ系に好適に用いられる。
Next, in the step (d), the complex was immobilized on the carrier by immobilizing the oligo dA of the mRNA-nucleic acid linker-protein complex and the oligo dT on the carrier. The complex is purified. The carrier is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid or protein purification, but is preferably in the form of particles, more preferably beads or magnetic beads. The beads are packed to increase the purity of the protein. A column is particularly preferred.
In the present embodiment, the technique used for the method for purifying nucleic acids is used for the method for purifying proteins. Therefore, oligo dT on the carrier specifically binds to the mRNA-nucleic acid linker-protein complex having oligo dA. By using the step (d), a highly pure protein complex can be purified. The protein complex produced in this way cannot obtain a sufficient S / N ratio (signal / noise ratio) due to protein interaction analysis using a delicate evaluation system such as Biacore and the presence of contaminant proteins. It is suitably used for such an assay system.
≪ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体及びその製造方法≫
本実施形態のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法に加えて工程（ｆ）を有する。工程（ｆ）において、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から逆転写によりｃＤＮＡを合成する。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
逆転写されたｃＤＮＡはｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のｍＲＮＡとハイブリッドを形成する。ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｍＲＮＡは、アプタマーとして非特異的相互作用する可能性が高いため、タンパク質間相互作用解析を行う場合には、このようなｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製しておくことが好ましい。
また、標的タンパク質と相互作用の確認されたタンパク質をコードするｃＤＮＡを解析するためには、この複合体の作製が必須である。
<< mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex and method for producing the same >>
The method for producing an mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex of this embodiment has a step (f) in addition to the above-described method for producing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex. In step (f), cDNA is synthesized from the mRNA-nucleic acid linker-protein complex described above by reverse transcription. As the reverse transcriptase used for reverse transcription, conventionally known ones are used, and examples include reverse transcriptase derived from Moloney Murine Leukemia Virus.
The reverse transcribed cDNA forms a hybrid with the mRNA of the mRNA-nucleic acid linker-protein complex. Since mRNA in the mRNA-nucleic acid linker-protein complex has a high possibility of non-specific interaction as an aptamer, such an mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex is used when analyzing a protein-protein interaction. It is preferable to prepare a body.
In addition, in order to analyze cDNA encoding a protein that has been confirmed to interact with the target protein, it is essential to produce this complex.
≪核酸リンカー−タンパク質複合体及びその製造方法≫
本実施形態の核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法に加えて工程（ｅ）を有する。工程（ｅ）において、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を生成する。
タンパク質間相互作用解析を行うためには、上述したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の場合と同様、ｍＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッドを形成させておくか、ＲＮａｓｅを用いてｍＲＮＡを分解させておくことが好ましい。ｍＲＮＡを分解した核酸リンカー−タンパク質複合体は、タンパク質間相互作用解析に好適に用いられる。
<< Nucleic acid linker-protein complex and method for producing the same >>
The method for producing a nucleic acid linker-protein complex of this embodiment has a step (e) in addition to the above-described method for producing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex. In step (e), the mRNA is degraded using RNase to generate a nucleic acid linker-protein complex.
In order to analyze the protein-protein interaction, as in the case of the above-mentioned mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex, either a hybrid of mRNA and cDNA is formed, or mRNA is degraded using RNase. It is preferable to keep. The nucleic acid linker-protein complex obtained by decomposing mRNA is suitably used for protein-protein interaction analysis.
≪プロテインアレイ≫
本実施形態のプロテインアレイ（プロテインチップ）は、上述したタンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化されてなるものである。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。本実施形態のタンパク質複合体には、固相結合部位が設けられており、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、タンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、スクシンイミジル基等の活性エステル基／アミノ基、ヨウ化アセチル基／アミノ基、マレイミド基／チオール基（‐ＳＨ）、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、使い勝手の良さからストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
≪Protein Array≫
The protein array (protein chip) of this embodiment is obtained by immobilizing the above-described protein complex on a microarray substrate. Examples of the substrate used include a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, and a metal substrate. The protein complex of this embodiment is provided with a solid-phase binding site, and the protein complex is converted using the binding between the solid-phase binding site and the solid-phase binding site recognition site bound to the substrate. Immobilize on the microarray substrate.
Such combinations of solid phase binding sites / solid phase binding site recognition sites include biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin / biotin, active ester groups such as succinimidyl groups / amino groups, acetyl iodide groups / amino groups, Maleimide group / thiol group (-SH), maltose binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, polyhistidine peptide / metal ions such as nickel or cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, DNA binding protein / DNA, antibody / Various receptor proteins such as antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin-binding peptide, ATP-binding protein / ATP, or estradiol receptor protein / estradiol Such as soil and the like.
Among these, combinations of solid phase binding site / solid phase binding site recognition site include biotin binding proteins such as avidin and streptavidin, maltose binding protein / maltose, polyhistidine peptide / metal ions such as nickel or cobalt, glutathione, etc. -S-transferase / glutathione, antibody / antigen molecule (epitope) and the like are preferable, and a combination of streptavidin / biotin is most preferable in terms of ease of use.
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。 In addition, the said combination can also be used by reversing a solid-phase binding site and a solid-phase binding site recognition site. The above-described immobilization means is an immobilization method using two substances having an affinity for each other. If the solid phase is a plastic material such as a styrene substrate, a known method is used as necessary. Some of the linkers can also be covalently linked directly to their solid phase (see Qiagen, LiquidChip Applications Handbook et al.).
≪プロテインアレイを用いたタンパク質間相互作用解析方法≫
本実施形態のプロテインアレイを用いて、例えば、配列既知のタンパク質と標的分子との相互作用を解析することができる。「標的分子」とは、本実施形態において合成されるタンパク質と相互作用するか否かを調べるための物質を意味し、有機化合物、無機化合物、あるいはこれらの複合体を示し、一例として、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。
解析方法としては、オーファンレセプター等の配列既知のタンパク質複合体からなるプロテインアレイを作製し、これに作用するリガンドや低分子化合物等をスクリーニングする方法が例示される。
≪Protein interaction analysis method using protein array≫
Using the protein array of this embodiment, for example, the interaction between a protein with a known sequence and a target molecule can be analyzed. The “target molecule” means a substance for examining whether or not it interacts with the protein synthesized in the present embodiment, and indicates an organic compound, an inorganic compound, or a complex thereof. Peptides, nucleic acids, low molecular compounds and the like can be mentioned.
Examples of the analysis method include a method of preparing a protein array composed of a protein complex with a known sequence such as an orphan receptor, and screening for a ligand, a low molecular compound or the like that acts on the protein array.
ここで用いられる標的分子は、標識物質により標識されてもよい。標識物質としては、蛍光色素や放射性物質等が挙げられ、標的分子と固定化されたタンパク質との間の相互作用に基づいて発生する信号の変化の測定、又は解析方法に適したものが適宜選択される。またこのような信号の変化を測定する手法としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法等が挙げられる。
また、表面プラズモン共鳴法は、標識を必要としない測定法であり、分子間の相互作用を微量のサンプルで迅速に解析できる優れた方法である。しかしながら、この測定方法を用いるためには高純度で夾雑物のないタンパク質が必要とされる。
本実施形態のプロテインアレイは、上述したような純度の高いタンパク質からなるため、表面プラズモン共鳴法のような感度の高い系において好適に用いられる。
The target molecule used here may be labeled with a labeling substance. Examples of the labeling substance include fluorescent dyes, radioactive substances, and the like, and those that are suitable for measuring or analyzing the change in signal generated based on the interaction between the target molecule and the immobilized protein are appropriately selected. Is done. In addition, as a technique for measuring such a signal change, fluorescence resonance energy transfer (FRET method), evanescent field molecular imaging method, fluorescence imaging analysis method, solid-phase enzyme immunoassay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)), Examples include fluorescence depolarization and fluorescence correlation spectroscopy.
The surface plasmon resonance method is a measurement method that does not require labeling, and is an excellent method that can quickly analyze the interaction between molecules with a very small amount of sample. However, in order to use this measurement method, a protein with high purity and no impurities is required.
Since the protein array of the present embodiment is composed of the high-purity protein as described above, it is preferably used in a highly sensitive system such as the surface plasmon resonance method.
≪標的分子結合タンパク質の同定方法≫
本実施形態の標的分子結合タンパク質の同定方法は、
（ｇ）上述したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が基板上に固定化されているタンパク質複合体アレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする。
以下、各工程について説明する。
≪Identification method of target molecule binding protein≫
The method for identifying a target molecule-binding protein of this embodiment is as follows:
(G) contacting the protein complex array in which the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex described above is immobilized on a substrate with a target molecule;
(H) analyzing the interaction between the target molecule and the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex;
(I) recovering mRNA / cDNA from the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex bound to the target molecule, and determining the nucleotide sequence of the recovered cDNA.
Hereinafter, each step will be described.
工程（ｇ）において、上述したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が基板上に固定化されているタンパク質複合体アレイを標的分子と接触させる。本実施形態の標的分子結合タンパク質の同定方法によれば、前述したプロテインアレイを用いたタンパク質間相互作用解析方法に加えて、配列未知のタンパク質と標的分子との相互作用を解析することができる。よって、工程（ｇ）で好適に用いられるタンパク質複合体はそのアミノ酸配列が未知のものである。また、標的分子としては上述したようなタンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。 In the step (g), the protein complex array in which the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex described above is immobilized on the substrate is brought into contact with the target molecule. According to the method for identifying a target molecule-binding protein of this embodiment, in addition to the protein-protein interaction analysis method using the protein array described above, the interaction between a protein whose sequence is unknown and the target molecule can be analyzed. Therefore, the protein complex suitably used in the step (g) has an unknown amino acid sequence. Examples of the target molecule include proteins, peptides, nucleic acids, low molecular compounds and the like as described above.
次に、工程（ｈ）において、前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する。この工程（ｈ）で用いられる測定方法としては、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法等が挙げられ、上述した理由から表面プラズモン共鳴法が好ましい。 Next, in step (h), the interaction between the target molecule and the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex is analyzed. The measurement method used in this step (h) includes surface plasmon resonance method, fluorescence resonance energy transfer (FRET method), evanescent field molecular imaging method, fluorescence imaging analysis method, solid phase enzyme immunoassay method (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ( ELISA)), fluorescence depolarization method, fluorescence correlation spectroscopy and the like, and the surface plasmon resonance method is preferred for the reasons described above.
次に、工程（ｉ）において、標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する。核酸リンカーのアーム部が、上述した光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位を含んでいる場合には、光照射や、酵素処理によりｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から切断されたｃＤＮＡを回収することにより、効率よくｃＤＮＡの塩基配列を解析することができる。 Next, in step (i), mRNA / cDNA is recovered from the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex bound to the target molecule, and the base sequence of the recovered cDNA is determined. When the arm portion of the nucleic acid linker contains the above-mentioned photocleavable site or single-stranded nucleic acid cleaving enzyme cleavage site, it is cleaved from the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex by light irradiation or enzymatic treatment. By collecting the cDNA, the base sequence of the cDNA can be efficiently analyzed.
本実施形態の標的分子結合タンパク質の同定方法によれば、配列未知のタンパク質からなるプロテインアレイから新規機能タンパク質を同定することができる。例えば、特定のリガンドに作用するレセプターの同定やがん細胞が細胞表面に有する特異的な抗原に作用する抗体の同定等に好適に用いられる。 According to the method for identifying a target molecule-binding protein of this embodiment, a novel functional protein can be identified from a protein array composed of proteins of unknown sequence. For example, it is suitably used for identification of a receptor that acts on a specific ligand, identification of an antibody that acts on a specific antigen that cancer cells have on the cell surface, and the like.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.
（核酸リンカーの合成）
１−１ 材料
以下に示す材料をジーンワールド社より購入した。
（１）Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅ
［配列：５’−（ＰＳ）−Ｘ−（Ｆ）−（Ｓｐｃ１８）−（Ｓｐｃ１８）−（Ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、Ｘは以下の配列を表す。
ＴＡＣＧＡＣＧＡＴＣＴＣＧＡＡＣＧＡＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣ（配列番号１：４４ｍｅｒ）
（２）ＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅ
［配列：５’−Ｚ−（Ｂ）−３’］
ここで、Ｚは以下の配列を表す。
ＣＣＣＧＴＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２：５６ｍｅｒ）
また、（ＰＳ）はＰｓｏｒａｌｅｎ、（Ｆ）はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｄＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、（Ｂ）は、ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ、（Ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）である。これらは、いずれもＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製である。
(Synthesis of nucleic acid linker)
1-1 Materials
The following materials were purchased from Gene World.
(1) Puro side
[Sequence: 5 '-(PS) -X- (F)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18) -CC- (Puro) -3']
Here, X represents the following sequence.
TACGACGATCTCGAACGAACCACCCCCCCCGCCGCCCCCCGTCC (SEQ ID NO: 44 mer)
(2) PolyA side
[Sequence: 5′-Z- (B) -3 ′]
Here, Z represents the following arrangement.
CCCGTGGTTCGTTCGACATCGTCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 56 mer)
Also, (PS) is Psoralen, (F) is Fluorescent-dT, (Puro) is Puromycin CPG, (B) is BiotinTEG, (Spc18) is (18-O-Dimethyltriethylethyleneglycol, 1- [e-cy) (N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite). These are all manufactured by Glen Research.
１−２ 合成、精製方法
Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）２０μｌ及びＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む)２５μｌに溶かした反応溶液を、Ｔ３ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いて、９０℃に加熱後、１時間かけて２５℃まで冷却した。
その後、Ｍｏｄｅｌ ＵＶＬ−５６ Ｂｌａｋ−ｒａｙ Ｌａｍｐを用いて反応溶液をＵＶ照射し（λ＝３６５ｎｍ、１５分）、Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅとＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅを架橋により結合させた。
1-2 Synthesis and Purification Method A reaction solution in which 20 μl of Puro side (100 pmol / μl) and 5 μl of PolyA side (100 pmol / μl) were dissolved in 25 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8, containing 200 mM NaCl) was added to T3 Thermocycler. (Biometra) was used to heat to 90 ° C. and then cooled to 25 ° C. over 1 hour.
Thereafter, the reaction solution was irradiated with UV using Model UVL-56 Black-ray Lamp (λ = 365 nm, 15 minutes), and Puro side and PolyA side were bonded by crosslinking.
（ｍＲＮＡの合成）
５’側にＴ７、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３’末端にリンカーのＤＮＡ部分と相補な配列をもち、終止コドンを削ったＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ（配列番号３：３７２ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。反応液を表１に記載の組成となるように調製し、９５℃で２分間保持した後、９５℃３０秒、６９℃２５秒、７２℃４０秒の３ステップＰＣＲを３０サイクル行い、７２℃で２分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（１） Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｗ Ｙ−ｔａｇ (２２ｍｅｒ、２０ｐｍｏｌ／μｌ)
［配列：５’− ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ−３’］（配列番号４）
（２）Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｗ ｌｅｆｔ (３３ｍｅｒ、２０ｐｍｏｌ／μｌ)
［配列：５’− ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ−３’］（配列番号５）
(Synthesis of mRNA)
Amplify B-domain (SEQ ID NO: 3: 372 bp) of Protein A having T7, Cap, Omega sequence, 5 ′ side, sequence complementary to the DNA part of the linker at 3 ′ end, and deletion of the stop codon. did. A reaction solution was prepared so as to have the composition shown in Table 1 and held at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 3-step PCR at 95 ° C. for 30 seconds, 69 ° C. for 25 seconds, 72 ° C. for 40 seconds For 2 minutes and then cooled at 4 ° C. The primer sequences used are shown below.
(1) Primer New Y-tag (22mer, 20 pmol / μl)
[Sequence: 5′-TTTCCCCCGCCCCCCCCCTCTC-3 ′] (SEQ ID NO: 4)
(2) Primer New left (33mer, 20 pmol / μl)
[Sequence: 5′-TTTCCCCCGCCCCCCCCCTCTC-3 ′] (SEQ ID NO: 5)
ＰＣＲにより得られたＤＮＡをＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて転写し、ｍＲＮＡを合成した。反応液を表２に記載の組成となるように調製し、３７℃で４時間インキュベーションした後、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１μｌ添加し、３７℃１５分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｅｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製を行った。 DNA obtained by PCR was transcribed using RiboMax Large Scale RNA production Systems (Promega) to synthesize mRNA. A reaction solution was prepared to have the composition shown in Table 2, and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Then, 1 μl of RQ1 RNase-Free DNase (Promega) was added and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After completion of the incubation, purification was performed using an RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (Qiagen).
（ｍＲＮＡと核酸リンカーの結合）
５’キャップ及び３’にタグ配列を持ったｍＲＮＡ ２０ｐｍｏｌに、核酸リンカーを２０ｐｍｏｌ、１０ｘＴ４ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）２μｌ、を加え２０μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。調製した反応溶液をＴ３ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いて、９０℃に加熱後、１時間かけて２５℃まで冷却した。その後、１５ｕｎｉｔ Ｔ４ Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ、１．０μｌ）、１００ｕｎｉｔ Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ、１．０μｌ）を加え、２５℃、３０分反応させた。サンプルをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｅｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。
上記に従って反応した産物を８Ｍ Ｕｒｅａの８％変性アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを用いて核酸を染色した。結果を図２に示す。
(Binding of mRNA and nucleic acid linker)
To 20 pmol of mRNA having a 5 ′ cap and 3 ′ tag sequence, 20 pmol of nucleic acid linker and 2 μl of 10 × T4 Ligation Buffer (TaKaRa) were added, and DEPC-treated water was added to a volume of 20 μl. The prepared reaction solution was heated to 90 ° C. using a T3 Thermocycler (Biometra) and then cooled to 25 ° C. over 1 hour. Then, 15 unit T4 Plynucleotide Kinase (TaKaRa, 1.0 μl) and 100 unit T4 RNA Ligase (TaKaRa, 1.0 μl) were added and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. The sample was purified with RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (Qiagen).
The product reacted according to the above was electrophoresed on 8M Urea 8% denaturing acrylamide gel. After electrophoresis, the nucleic acid was stained using SYBR Gold. The results are shown in FIG.
図２中、レーン１はＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎのＤＮＡ、レーン２はＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎのｍＲＮＡ、レーン３はＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎのｍＲＮＡと核酸リンカーをライゲーションしたもの（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ ｆｕｓｉｏｎ）、レーン４はリンカーのみを電気泳動したものを示す。
レーン３において、矢印はライゲーション産物（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ ｆｕｓｉｏｎ）を示す。未反応のＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎの量が少ないことから、本実施形態の核酸リンカーを用いた場合のライゲーション効率は高いことが分かる。
In FIG. 2, Lane 1 is Protein A B-domain DNA, Lane 2 is Protein A B-domain mRNA, Lane 3 is Protein A B-domain mRNA and nucleic acid linker ligated (mRNA-Linker fusion), Lane 4 shows the result of electrophoresis of only the linker.
In lane 3, the arrow indicates the ligation product (mRNA-Linker fusion). Since the amount of unreacted Protein A B-domain is small, it can be seen that the ligation efficiency is high when the nucleic acid linker of this embodiment is used.
図３に、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎへ、核酸リンカーを共有結合させたものの概略図を示す。図３中、Ｐｕはピューロマイシン、ＦはＦＩＴＣ、ＡＴＣＧｕはＤＮＡ、ＲＮＡシーケンスを示している。大文字で示した部分はＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡを示す。ＲＮＡの３’末端とＤＮＡの５’末端は“Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ”と示した部分でライゲートされている。 FIG. 3 shows a schematic view of a protein A covalently bound to B-domain of Protein A. In FIG. 3, Pu represents puromycin, F represents FITC, and ATCGu represents DNA and RNA sequences. The part indicated by capital letters indicates the DNA part, and the part indicated by small letters indicates the mRNA. The 3 ′ end of RNA and the 5 ′ end of DNA are ligated at the portion indicated as “T4 RNA Ligase”.
（無細胞翻訳系による翻訳）
上記のように合成した、核酸リンカーとｍＲＮＡの複合体に無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３０μｌ加え、３０℃、３０分翻訳反応を行った。その後、３Ｍ ＫＣｌを１０μｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２を３μｌ加えて３７℃で４０分間放置し、０．４Ｍ ＥＤＴＡを１０μｌ加え、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した。
(Translation by cell-free translation system)
30 μl of a cell-free translation system (Wheat Germ Extract Plus, Promega) was added to the nucleic acid linker / mRNA complex synthesized as described above, and a translation reaction was performed at 30 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 10 μl of 3M KCl and 3 μl of 1M MgCl 2 were added and left at 37 ° C. for 40 minutes, and 10 μl of 0.4M EDTA was added to synthesize mRNA-nucleic acid linker-protein complex.
（Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ＢｅａｄｓによるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の精製）
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ Ｂｅａｄｓ（Ｄｙａｎａｌ社）を使用量チューブに取り、添付のマニュアルに従い洗浄を行った。上記のように合成したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体に等量のＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＬｉＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、室温に置いた後、上記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した洗浄済みＯｌｉｇｏ ｄＴ Ｂｅａｄｓ液に加えた。室温で１時間ＴＨＥＲＭＯ ＢＬＯＣＫ ＲＯＴＡＴＥＲ（ＮＩＳＳＩＮ社）を用い、転倒混和した後、チューブを氷上に５分放置した。ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体及びＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの総量と等量のＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、転倒混和し、チューブをマグネット上に２〜３分置いた後、上清を取り除き、マグネットからチューブを外した。この洗浄操作をもう一度繰り返した後、ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒを加え、混和させ、室温で５分放置し、溶出させた。
上記に従って精製したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った。泳動後、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙを用いてタンパク質を染色した。また、上述したように核酸リンカーには、Ｐｕｒｏ ｓｉｄｅの３’末端がＦＩＴＣにより蛍光標識されているため、蛍光イメージを取得した。
結果を図４に示す。
(Purification of mRNA-nucleic acid linker-protein complex by Oligo dT Beads)
Oligo dT Beads (Dynal) was taken in a usage tube and washed according to the attached manual. An equal amount of Binding Buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA) was added to the mRNA-nucleic acid linker-protein complex synthesized as described above, and the mixture was allowed to stand at room temperature, and then the mRNA-nucleic acid linker- The protein complex was added to the washed Oligo dT Beads solution suspended in Binding Buffer. After inversion mixing using THERMO BLOCK ROTATER (NISSIN) for 1 hour at room temperature, the tube was left on ice for 5 minutes. Add the same amount of Washing Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM LiCl, 1 mM EDTA) to the total amount of mRNA-nucleic acid linker-protein complex and Binding Buffer, mix by inverting, and place the tube on the magnet for 2-3 minutes. After placement, the supernatant was removed and the tube was removed from the magnet. After repeating this washing operation once more, DEPC treated water was added, mixed, allowed to stand at room temperature for 5 minutes and eluted.
The mRNA-nucleic acid linker-protein complex purified according to the above was subjected to electrophoresis using SDS-PAGE. After electrophoresis, the protein was stained using SYPRO Ruby. Further, as described above, since the 3 ′ end of Puro side is fluorescently labeled with FITC on the nucleic acid linker, a fluorescent image was obtained.
The results are shown in FIG.
図４中、レーン１は翻訳反応前のｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ ｆｕｓｉｏｎ、レーン２は翻訳反応後のｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎ、レーン３は精製後のｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎである。矢印はｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ ｆｕｓｉｏｎ、またはｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎを示す。上段及び下段の電気泳動結果は、同一のゲルを異なるイメージング法を用いて解析したものである。上段は、ＦＩＴＣによる蛍光イメージを取得した結果であり、下段は、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙを用いてタンパク質を染色した結果である。
上段のレーン２及びレーン３において、ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎの蛍光強度は同程度である。その一方、下段のレーン２において検出される無細胞翻訳系に含まれる夾雑物が、レーン３においては全く検出されていない。これらのことから、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ Ｂｅａｄｓ用いて精製されたｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎの純度は非常に高いことが確認された。
In FIG. 4, lane 1 is the mRNA-Linker fusion before translation reaction, lane 2 is the mRNA-Linker-protein fusion after translation reaction, and lane 3 is the purified mRNA-Linker-protein fusion. Arrows indicate mRNA-Linker fusion or mRNA-Linker-protein fusion. The upper and lower electrophoresis results are obtained by analyzing the same gel using different imaging methods. The upper row shows the result of acquiring a fluorescence image by FITC, and the lower row shows the result of staining the protein using SYPRO Ruby.
In the upper lane 2 and lane 3, the fluorescence intensity of mRNA-Linker-protein fusion is comparable. On the other hand, no impurities contained in the cell-free translation system detected in the lower lane 2 are detected in the lane 3 at all. From these, it was confirmed that the purity of mRNA-Linker-protein fusion purified using Oligo dT Beads was very high.
（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のセンサーチップ上への固定化）
ＢｉａｃｏｒｅＪ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ ＳＡ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の固定化を行った。Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ ＳＡは、基板上にデキストランを介してストレプトアビジンが結合しているＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、表面プラズモン共鳴）用のセンサーチップである。これに対し、核酸リンカーにはＰｏｌｙＡ ｓｉｄｅの３’末端にビオチンが付されているため、ストレプトアビジンとビオチンの強い親和性を利用することができる。
まず、Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ ＳＡに共有結合によらず吸着したストレプトアビジン分子を洗い流し、ベースラインの安定化を図るため、１Ｍ ＮａＣｌを含有した５０ｍＭ ＮａＯＨを用いてＳｅｎｓｏｒｃｈｉｐ ＳＡ表面の洗浄を１分間、３回行った。
次に１００ｍＭ ＮａＣｌを含むｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をフローセルにインジェクションし、固定化を行った。Ｒｕｎｎｉｎｇ ＢｕｆｆｅｒとしてＨＢＳ−ＥＰ Ｂｕｆｆｅｒを用いた。
(Immobilization of mRNA-nucleic acid linker-protein complex on sensor chip)
The mRNA-nucleic acid linker-protein complex was immobilized on Sensorchip SA using BiacoreJ (GE Healthcare). Sensorchip SA is a sensor chip for SPR (Surface Plasmon Resonance) in which streptavidin is bound to a substrate via dextran. On the other hand, since the biotin is attached to the 3 ′ end of PolyA side in the nucleic acid linker, the strong affinity between streptavidin and biotin can be used.
First, in order to wash out the streptavidin molecules adsorbed to Sensorchip SA without any covalent bond and to stabilize the baseline, the surface of Sensorchip SA was washed 3 times for 1 minute using 50 mM NaOH containing 1M NaCl. .
Next, mRNA-nucleic acid linker-protein complex containing 100 mM NaCl was injected into the flow cell and immobilized. HBS-EP Buffer was used as the running buffer.
（ＩｇＧインジェクションによるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体とＩｇＧ間の相互作用解析）
ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎと強い相互作用を示すことが知られているＩｇＧをフローセルにインジェクションし、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎとの相互作用解析を行った。ＰＢＳに溶解させたラビット血清由来のＩｇＧを３つの濃度（２．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ）インジェクションし、相互作用解析を行った。結果を図１０２に示す。
(Interaction analysis between mRNA-nucleic acid linker-protein complex and IgG by IgG injection)
IgG, which is known to show a strong interaction with B-domain of Protein A, was injected into the flow cell, and interaction analysis with B-domain of Protein A was performed. Rabbit serum-derived IgG dissolved in PBS was injected at three concentrations (2.5 μg / ml, 10 μg / ml, and 20 μg / ml) for interaction analysis. The results are shown in FIG.
図５中、縦軸はＳｅｎｓｏｒｃｈｉｐ ＳＡ上の質量変化（レスポンス）を示し、横軸は経過時間を示す。ＩｇＧをインジェクションすることにより、レスポンスは上昇し、結合反応が起きていることが確認された。一方、インジェクションをやめＲｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒに切り替えると、解離反応により、レスポンスが徐々に減少することが確認された。更に、結合曲線の傾き及びＩｇＧの最大結合量が、ＩｇＧの濃度依存的であることから、ＩｇＧとＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎの特異的結合が確認された。このようなセンサーグラムからデータ解析ソフトウエア ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ を用いｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）を算出したところ、ｋａは２．９９ｘ１０５、ｋｄは５．６５ｘ１０−２であった。ｋａとｋｄより算出した解離定数ＫＤは１８９ｎＭであり、文献上報告されているＫＤ（１００ｎＭ）とほぼ一致していることが確認された。 In FIG. 5, the vertical axis indicates mass change (response) on Sensorchip SA, and the horizontal axis indicates elapsed time. By injecting IgG, the response increased and it was confirmed that a binding reaction occurred. On the other hand, when the injection was stopped and switched to Running Buffer, it was confirmed that the response gradually decreased due to the dissociation reaction. Furthermore, since the slope of the binding curve and the maximum binding amount of IgG were dependent on the concentration of IgG, specific binding between IgG and Protein A B-domain was confirmed. When ka (binding rate constant) and kd (dissociation rate constant) were calculated from such a sensorgram using data analysis software BIAevaluation, ka was 2.99 × 10 5 and kd was 5.65 × 10 −2 . dissociation constant, K D, calculated from the ka and kd is 189 nm, it was confirmed that substantially matches the K D (100 nM) to that reported in the literature.
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、無細胞翻訳系を用いて合成される少量のタンパク質を迅速に、かつ高純度で精製することができる。よって、本実施形態の核酸リンカーを用いて得られたタンパク質を用いてプロテインアレイを作製し、網羅的なタンパク質相互作用解析を行うことができることが明らかである。また、タンパク質間相互作用解析装置は、解析に用いるタンパク質に高い純度を要求するが、本実施形態の核酸リンカーを用いて作製したタンパク質は、このような要求を満たすものである。
また、本実施形態のタンパク質複合体の製造方法は、高純度なタンパク質を得るための画期的な方法であるため、アッセイ系においてコンタミタンパク質の混入を嫌うような系においても好適に用いられる。さらに、本実施形態のタンパク質複合体の製造方法を、近年改良されている無細胞翻訳系を用いたタンパク質の大量合成系と組み合わせることで、高純度なタンパク質を必要とするタンパク質の結晶化及びそれを用いた立体構造解析にも好適に用いられる。
From the above results, according to the nucleic acid linker of this embodiment, a small amount of protein synthesized using a cell-free translation system can be purified rapidly and with high purity. Therefore, it is clear that a protein array can be produced using the protein obtained by using the nucleic acid linker of this embodiment, and comprehensive protein interaction analysis can be performed. The protein-protein interaction analyzer requires high purity for the protein used for analysis, but the protein produced using the nucleic acid linker of this embodiment satisfies such a requirement.
In addition, since the protein complex production method of the present embodiment is an epoch-making method for obtaining a highly pure protein, it can be suitably used in a system that dislikes contamination protein contamination in an assay system. Furthermore, by combining the method for producing a protein complex of this embodiment with a mass protein synthesis system using a cell-free translation system that has been improved in recent years, crystallization of a protein that requires high-purity protein and its It is also suitably used for three-dimensional structure analysis using.
Claims (17)
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリｄＡ配列及び前記ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方が結合していることを特徴とする核酸リンカー。 a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein encoded by the mRNA,
The nucleic acid linker is composed of two polynucleotide strands having mutually complementary sequences on the 5 ′ end side,
The two polynucleotide strands are hybridized via the sequence;
One polynucleotide chain has a single-stranded polynucleotide portion capable of hybridizing to the sequence on the 3 ′ end side of the mRNA, and a linking portion of the protein at the end branched from the single-stranded polynucleotide portion. An arm portion, and
The nucleic acid linker, wherein the other polynucleotide chain has a poly dA sequence at the 3 ′ end and one of two specific molecules that specifically bind to the end of the poly dA sequence.
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。 A method for producing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the mRNA and a protein encoded by the mRNA are linked via the nucleic acid linker according to any one of claims 1 to 7. There,
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(D) The oligo dA possessed by the mRNA-nucleic acid linker-protein complex is bound to the oligo dT on the carrier to immobilize the complex to the carrier, and the immobilized complex is purified. A process for producing a protein complex comprising the steps of:
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。 A method for producing a nucleic acid linker-protein complex in which the nucleic acid linker according to any one of claims 1 to 7 and the protein encoded by the mRNA are linked,
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(E) decomposing said mRNA using RNase to produce a nucleic acid linker-protein complex;
(D) A step of immobilizing the complex to the carrier by binding the oligo dA included in the nucleic acid linker-protein complex and the oligo dT on the carrier, and purifying the immobilized complex. And a method for producing a protein complex.
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｆ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。 The mRNA / cDNA complex composed of the mRNA and the cDNA complementary to the mRNA and the protein encoded by the mRNA are linked via the nucleic acid linker according to any one of claims 1 to 7. A method for producing an mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex comprising:
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) ligating the 3 ′ end of the mRNA and the 5 ′ end of the nucleic acid linker;
(C) By synthesizing a protein from the mRNA using a cell-free protein translation system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex in which the C-terminus of the protein is bound to the protein junction of the nucleic acid linker Manufacturing process;
(F) subjecting the mRNA-nucleic acid linker-protein complex to a reverse transcription reaction to produce an mRNA / cDNA-nucleic acid linker complex;
(D) The oligo dA possessed by the mRNA / cDNA-nucleic acid linker complex is bound to the oligo dT on the carrier, thereby immobilizing the complex to the carrier and purifying the immobilized complex. A process for producing a protein complex comprising the steps of:
（ｇ）請求項１０に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されているプロテインアレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする標的分子結合タンパク質の同定方法。 A method for identifying a protein that binds to a target molecule, comprising:
(G) contacting the protein array in which the protein complex according to claim 10 is immobilized on a substrate with a target molecule;
(H) analyzing the interaction between the target molecule and the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex;
(I) recovering mRNA / cDNA from the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex bound to the target molecule, and determining the base sequence of the recovered cDNA; Protein identification method.
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