JP2011205929A - 歯肉上皮由来の新規幹細胞およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、歯肉上皮から単離された非胚性組織から得られ、イン・ビトロで自己再生し、分化することができる、幹細胞を提供する。
【選択図】図3
Description
したがって、本発明は、歯肉上皮再生に有用な新規幹細胞およびその製造方法を提供することをその目的とする。
また、本発明の別の態様によれば、歯肉上皮から単離された非胚性組織から、α6β4インテグリンを発現し、CD71を発現しない幹細胞を選択すること
を含んでなる、幹細胞の製造方法が提供される。
本発明の幹細胞は、歯肉上皮組織由来の幹細胞であって、α6β4インテグリンを発現し、CD71を発現しないことを一つ特徴としている。ヒト歯肉上皮由来の幹細胞が、α6β4インテグリンを発現し、CD71を発現しないというマーカー発現パターンを示すことは、当業者にとって意外な事実である。
また、本発明の幹細胞は、p63およびサイトケラチン19を発現し、サイトケラチン10およびインボルクリンを発現しない。
上記マーカーの発現はいずれも、例えば、後述する例3の免疫蛍光染色法に従って検出することができる。
また、本発明の幹細胞は、好ましくはヒト細胞である。
また、本発明の幹細胞は、歯肉上皮から単離された非胚性組織から、α6β4インテグリンを発現し、CD71を発現しない細胞を選択することにより製造することができる。
一つの態様によれば、上記選択工程は、前記非胚性組織と、α6β4インテグリンに対する抗体とを反応させ、α6β4インテグリンに対する抗体に結合した細胞を選択し、α6β4インテグリンに対する抗体に結合した細胞と、CD71に対する抗体とを反応させ、CD71に対する抗体に結合しない幹細胞を選択することを含んでなる。
磁気選択を用いる場合には、α6β4インテグリンに対する抗体およびCD71に対する抗体は、磁気ビーズに結合されてなるものが好適に使用される。高グラジエント磁気選択は、細胞死を起こさず、かつ少数の細胞母集団から効率的に細胞を取得する上で特に有利である。
また、高グラジエント磁気選択の具体的な手法は、例えば、Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells. Ohyama M, Terunuma A, Tock CL, Radonovich MF, Pise-Masison CA, Hopping SB, Brady JN, Udey MC, Vogel JC. J Clin Invest.2006;116:249-60に記載されており、この引用文献の全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明の幹細胞は、歯肉上皮細胞に効率的に分化しうるものであり、歯肉再生医療において有利に利用できる。したがって、本発明の別の態様によれば、上記幹細胞を含んでなる医薬組成物が提供される。また、本発明の別の態様によれば、医薬組成物の製造における、上記幹細胞の使用が提供される。また、本発明の好ましい態様によれば、上記医薬組成物は、歯肉上皮治療に用いられる。
したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、上記幹細胞を含んでなる、歯肉上皮治療用移植材料が提供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、歯肉上皮治療用移植材料の製造における、上記幹細胞の使用が提供される。
また、フルオレセインイソシアネート(FITC)に結合した、α6 β4 インテグリンに対するマウスモノクローナル抗体 [450-30A] (Abcam(商標)、東京、日本) は、10 μl/105 細胞個の濃度でフローサイトメトリーに用い、かつ、1: 200 の希釈濃度にて免疫蛍光染色に用いた。
また、免疫蛍光染色に用いるマウス一次抗体のうち、p63抗体は抗 p63マウスモノクローナル抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA)、抗サイトケラチン19抗体は抗サイトケラチン19マウスモノクローナル抗体 (Abcam(商標), 東京, 日本)、抗サイトケラチン10抗体は抗サイトケラチン10マウスモノクローナル抗体( Acris GmbH, Hertford, ドイツ)、抗インボルクリン抗体は抗インボルクリンマウスモノクローナル抗体 (Sigma-Aldrich(商標),ドイツ)を用い、これら抗体はいずれも、免疫蛍光染色において1: 200の希釈濃度にて用いた。マウス一次抗体を検出するための二次抗体としては、Alexa Fluor(商標) 568-結合ロバ抗マウスIgG(Invitrogen(商標), Eugene, Oregon, USA)を用いた。
また、核染色にはSYBR Green 1 (Trevigen)は用いた。
また、磁気ソーティングにおけるα6β4を指標とする分離工程では、マウス抗α6β4抗体に対する二次抗体として、ヤギ抗マウスIgG マイクロビーズ(Miltenyi Biotec Inc., CA, USA)を用いた。また、磁気ソーティングにおけるCD71を指標とする分離工程では、マイクロビーズに結合した抗ヒトCD71モノクローナル抗体(isotype mouse IgG2a) (Miltenyi Biotec Inc., CA, USA)を20 μl/105 細胞個の濃度で用いた。
上皮細胞の単離および培養
口腔粘膜組織を、抜歯した患者から採取し、採取後2時間以内に以下の処理を行った。上皮細胞におけるマーカー発現に酵素処理が影響を及ぼすことを防止するため、以下の確立された手法を用いた。まず、採取した口腔粘膜組織はPBSで洗浄して小片にし、この小片を用いて、4mg/mL ジスパーゼ II (Sigma, St. Louis, MO, USA)および 3mg/mL コラゲナーゼ (Sigma, St. Louis, MO, USA) を用いた細胞分離処理を4℃、24時間実施した。処理後、上皮細胞を含有するシートを、結合組織から分離した。生存する上皮細胞を得るため、上皮細胞を含有するシートは、37℃で30分間、0.05% トリプシンで処理した。得られた上皮由来細胞は、1.2mM カルシウム、EpiLife(商標) Defined Growth Supplements (EDGS) (Cascade Biologics)、0.250 μg/mL フンギゾンおよび0.250mg/mL カナマイシンで補足された EpiLife(商標)メディウム (Cascade Biologics, Portland, OR)で懸濁した。得られた上皮細胞は、ヒトコラーゲンタイプ IV (20 μg/mL) (Sigma, St. Louis, MO, USA)でプレコートされた直径35 mm皿で、5%CO2、36℃にて培養した。
上皮細胞は0.025% トリプシン溶液でトリプシン処理した後、適切な一次抗体で, 1時間室温にて標識し、さらに、Alexa Fluor(商標) 568-結合二次抗体で標識した。サンプルは、抗体標識毎にPBSで3回洗浄した。非標識細胞は、ネガティブコントロールとして用いた。それぞれの実験において、2,000個の細胞をGuava EasyCyte フローサイトメトリー (Guava Technologies, USA)で分析した。データ取得およびその処理は、Guava CytoSoft ソフトウェアを用いた。
上記培養した細胞は、FITCに結合した、α6 β4 インテグリンに対するマウスモノクローナル抗体 [450-30A]でインキュベートした。過剰な抗体を除去した後、細胞は、ヤギ抗マウスIgG マイクロビーズでさらにインキュベートした。得られた細胞懸濁液は、MACS(商標)セパレーター (Miltenyi Biotec Inc., CA, USA)のマグネティックフィールドに設置されたカラムに担持させた。
カラムを通過した非標識細胞のフラクションは、α6β4 ネガティブ細胞フラクション(α6β4 neg)として、以下の実験に用いた。
また、カラム内に保持された、磁気標識細胞のフラクションは、α6β4 ポジティブ細胞フラクション(α6β4 pos)として、以下の実験に用いた。
また、1回目の磁気ソーティングから2〜3日後、α6β4 ポジティブ細胞フラクション(α6β4 pos)に関して、抗ヒトCD71モノクローナル抗体の結合したマイクロビーズを用いた磁気ソーティングを行った。
磁気標識され、カラム内に保持されたCD71ポジティブ(CD71 pos)なフラクションはα6β4 ポジティブCD71ポジティブ(α6β4 pos CD71 pos)細胞フラクションとして、以下の実験に用いた。
また、カラムを通過したCD71 ネガティブ細(CD71 neg)なフラクションは、α6β4 ポジティブCD71ネガティブ(α6β4 pos CD71neg )フラクションとして以下の実験に用いた。
磁気ソーティングにより分離された細胞フラクション、α6β4 pos CD71neg、α6β4 pos CD71 pos、およびα6β4negについてそれぞれ、幹細胞マーカーであるp63およびサイトケラチン19、および、角化細胞マーカーであるサイトケラチン10およびインボルクリンの発現を、以下の免疫染色により確認した。
すわなち、上皮組織を10%ホルマリン固定後パラフィン包埋し約4μmの切片を作製した。切片は、一次抗体(抗p63抗体、抗サイトケラチン19抗体、抗サイトケラチン10抗体または抗インボルクリン抗体)で標識し、次いで、Alexa Fluor(商標) 568-結合二次抗体で標識した。また、核はSYBR Green 1 (Trevigen)で染色した。
得られた蛍光抗体染色切片は、共焦点スキャニングレーザー蛍光顕微鏡(Leica TCS SP:チャンネル2)で観察した。
図2A〜Lの写真において、楕円形の蛍光は細胞核に相当し、その周りの蛍光は各マーカーに相当する。
A〜Lに示される通り、いずれも細胞核の蛍光は確認された。
一方、各マーカーの蛍光に関し、α6β4 pos CD71neg細胞では、AおよびDに示される通り、幹細胞マーカー(p63およびサイトケラチン19)の蛍光が確認され、GおよびJに示される通り、角化細胞マーカー(サイトケラチン10およびインボルクリン)の蛍光は確認されなかった。
また、α6β4 pos CD71pos細胞では、EおよびFに示される通り、サイトケラチン19およびサイトケラチン10の蛍光が確認され、Bに示される通り、p63は確認されなかった。
また、α6β4 neg細胞では、IおよびLに示される通り、角化細胞マーカー(サイトケラチン10およびインボルクリン)の蛍光が確認され、CおよびFに示される通り、幹細胞マーカー(p63およびサイトケラチン19)の蛍光が確認されなかった。
磁気ソーティングにより得られた、α6β4 pos CD71neg 細胞およびα6β4 pos CD71pos細胞を、 200 μlのGuava(商標)細胞サイクル試薬(核DNAを染色し、細胞サイクルの異なるステージを区別するためのヨウ化プロピジウムを含んでいる)で10分間インキュベートし、 Guava EasyCyte フローサイトメトリーを用いて分析した。データ取得およびその処理は、Guava CytoSoft ソフトウェアを用いた。
α6β4 pos CD71neg細胞には、α6β4 pos CD71pos細胞よりも、静止細胞(G0/G1 フェーズ)が多く含まれていた(65.9 ± 1.1 vs. 51.8 ± 0.6、p<0.01; ANOVA テスト)。また、α6β4 pos CD71pos細胞には、α6β4 pos CD71neg細胞フラクションよりも、活動周期細胞が多く含まれていた(S フェーズ: 24.4 ± 0.5 vs. 16.16 ± 0.2、 p<0.01 ANOVA テスト; G2/Mフェーズ: 20 ± 1.4 vs. 10.18 ± 0.5、p<0.01 ANOVA テスト)。
この結果から、α6β4 pos CD71neg細胞は、幹細胞に特徴的な細胞サイクルを示すことが確認された。
磁気分離された5000個の細胞(α6β4 pos CD71neg、α6β4 pos CD71pos およびα6β4 neg 細胞フラクション) をヒトタイプIV コラーゲン (20 μg/mL) (Sigma, St. Louis, MO, USA)で予めコートされた6ウェルプレート ( Costar, Corning, USA)に播いた。次に、細胞は、10日間、EDGSと共に EpiLife(商標) で培養し、4%パラホルムアルデヒドで固定化し、2% クリスタルバイオレットで染色した。20 個以上のコロニーは、それぞれ独立にCell Analyst(商標) (AssaySoft, Inc., Fountain Valley, CA, USA)でカウントした。アッセイは、2週間で計5回行った。
図4Aの写真に示される通り、増殖コロニーは、α6β4 pos CD71 posおよびα6β4neg細胞よりも、α6β4 pos CD71neg細胞において多く観察された。
また、図4Bに示される通り、α6β4 pos CD71neg細胞のコロニー数は、α6β4 pos CD71 pos細胞のコロニー数よりも有意に多かった(126.2 ± 21.7 vs. 32.8 ± 4.5 、p<0.01、ANOVA テスト) 。また、α6β4 pos CD71neg細胞のコロニー数は、α6β4neg細胞のコロニー数よりも有意に多かった(126.2 ± 21.7 vs. 12.4 ± 2.1、p<0.01、ANOVA テスト)。
この結果から、α6β4 pos CD71neg細胞は、他の細胞と比較して高い、幹細胞に特徴的なコロニー形成能を示すことが確認された。
光学顕微鏡を用いて、α6β4 pos CD71neg、α6β4 pos CD71pos およびα6β4 neg 細胞フラクションの写真を撮影し、イメージ画像をCell Analyst(商標)(AssaySoft, Inc., Fountain Valley, CA, USA)を用いて分析した。このアッセイは5回行い、それぞれの回において、50個の細胞を独立してカウントした。
この結果から、α6β4 pos CD71neg細胞は、他の細胞と比較して小さい、幹細胞に特徴的な細胞サイズを示すことが確認された。
この結果から、α6β4 pos CD71neg細胞は、幹細胞に特徴的な細胞サイズとコロニー形性能とを併せて有することが確認された。
精製コラーゲン溶液を含むトランスウェルシステム(Transwel(商標) Permeable supports, Costar Life Sciences, NY, USA)に、5X104 /ウェルのヒト歯肉線維芽細胞を播種し、DMEM中、10% FBSにて7日間培養してゲル収縮させた。次に、5 X 104/ウェルのα6β4 pos CD71neg 細胞をコラーゲンゲル上に播種し、EDGS を補足したEpiLife(商標)中で4日間インキュベートし、その10日後に気−液界面の存在を確認した。得られたサンプルに対してヘマトキシリン・エオシン(HE)染色を行った。
例7で得られた歯肉上皮組織における、角化細胞マーカー(インボルクリン)および幹細胞マーカー(サイトケラチン19)の発現を、抗インボルクリン抗体および抗サイトケラチン19抗体を用い、例3と同様の免疫蛍光染色方法により確認した。なお、角化細胞マーカー(インボルクリン)の検出には、共焦点スキャニングレーザー蛍光顕微鏡(Leica TCS SP)のチャンネル1を用い、幹細胞マーカー(サイトケラチン19)の検出には、チャンネル2を用いた。
Claims (14)
- 歯肉上皮から単離された非胚性組織から得られ、イン・ビトロで自己再生し、分化することができる、幹細胞。
- α6β4インテグリンを発現し、CD71を発現しない、請求項1に記載の幹細胞。
- 歯肉上皮に分化することができる、請求項1に記載の幹細胞。
- ヒト細胞である、請求項1に記載の幹細胞。
- p63およびサイトケラチン19を発現し、サイトケラチン10およびインボルクリンを発現しない、請求項1に記載の幹細胞。
- 請求項1に記載の幹細胞を含んでなる、医薬組成物。
- 歯肉上皮治療に用いられる、請求項6に記載の組成物。
- 請求項1に記載の幹細胞を含んでなる、歯肉上皮治療用移植材料。
- 歯肉上皮から単離された非胚性組織から、α6β4インテグリンを発現し、CD71を発現しない幹細胞を選択すること
を含んでなる、幹細胞の製造方法。 - 前記選択が、α6β4インテグリンに対する抗体およびCD71に対する抗体を用いて行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記選択が、前記非胚性組織と、α6β4インテグリンに対する抗体とを反応させ、α6β4インテグリンに対する抗体に結合した細胞を選択し、
α6β4インテグリンに対する抗体に結合した細胞と、CD71に対する抗体とを反応させ、CD71に対する抗体に結合しない前記幹細胞を選択すること
を含んでなる、請求項10に記載の方法。 - α6β4インテグリンに対する抗体およびCD71に対する抗体が、蛍光色素または磁気ビーズに結合されてなる、請求項10に記載の方法。
- 前記選択工程が、フローサイトメトリーまたは高グラジエント磁気選択を用いて行われる、請求項9に記載の方法。
- 請求項9に記載の方法により得られる、幹細胞。
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