JP2011195475A - Dance protein solution - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、安定性に優れるＤＡＮＣＥタンパク質溶液に関する。また、本発明はＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法に関する。 The present invention relates to a DANCE protein solution having excellent stability. The present invention also relates to a method for stabilizing a DANCE protein solution.
ヒトの生体組織の中でも肺や血管、皮膚等の組織は、弾性、伸縮性に富んだ組織であるが、加齢とともに血管が硬くなる、あるいは皮膚がたるむといった生体組織の弾性が失われていく加齢現象が生じる。これは、生体組織に存在する弾性線維という、ゴムのような柔軟性と弾力を有する線維組織が劣化してしまうためであると考えられている。この弾性線維は、劣化・分解しても再生されることはないとされており、このような弾性線維の再生についての研究が数多くなされている。 Among human biological tissues, tissues such as lungs, blood vessels, and skin are highly elastic and stretchable, but the elasticity of biological tissues such as blood vessels become harder or skin becomes sluggish with age. An aging phenomenon occurs. This is considered to be due to the deterioration of a fibrous tissue having flexibility and elasticity like rubber, which is an elastic fiber present in a living tissue. This elastic fiber is said not to be regenerated even when it is degraded or decomposed, and many studies have been conducted on the regeneration of such elastic fiber.
近年、弾性線維の形成能を有する細胞の無血清培養において、ＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）という分泌蛋白質を加えることにより効率よく弾性線維を再生できることが見出された（例えば、特許文献１参照）。 In recent years, in serum-free culture of cells having the ability to form elastic fibers, elastic fibers can be efficiently added by adding a secreted protein called DANCE (developmental arteries and neural epidermal growth factor (EGF) -like; also referred to as fibulin-5). It was found that it can be reproduced (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、このＤＡＮＣＥタンパク質を溶液にすると、経時的に活性が低下するという問題があった。 However, when this DANCE protein is made into a solution, there is a problem that the activity decreases with time.
本発明は、安定性に優れるＤＡＮＣＥタンパク質溶液を提供することを目的とする。また、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the DANCE protein solution excellent in stability. It is another object of the present invention to provide a method for stabilizing a DANCE protein solution.
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の物質が存在することでＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性が優れることを見いだした。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that the presence of a specific substance is excellent in the stability of the DANCE protein solution. Based on this knowledge, further studies have been made and the present invention has been completed.
即ち、本発明は下記のＤＡＮＣＥタンパク質溶液及びＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法を提供する。
項１．ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物及びＤＡＮＣＥタンパク質を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
項２．ゼラチンが、アルカリ処理ゼラチンである上記項１に記載のＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
項３．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液のｐＨが、５〜１４である上記項１又は２に記載のＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
項４．ＤＡＮＣＥタンパク質を含む溶液に、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とする、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法。
That is, the present invention provides the following DANCE protein solution and the method for stabilizing the DANCE protein solution.
Item 1. A DANCE protein solution comprising one or more compounds selected from the group consisting of gelatin, albumin and hydroxyethyl starch and DANCE protein.
Item 2. Item 2. The DANCE protein solution according to Item 1, wherein the gelatin is alkali-treated gelatin.
Item 3. Item 3. The DANCE protein solution according to Item 1 or 2, wherein the pH of the DANCE protein solution is 5 to 14.
Item 4. A method for stabilizing a DANCE protein solution, comprising adding one or more compounds selected from the group consisting of gelatin, albumin and hydroxyethyl starch to a solution containing DANCE protein.
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液は、安定性が良好で、ある一定時間経過後においても、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性を維持することができる。また、凍結融解を繰り返してもＤＡＮＣＥタンパク質の活性を維持することができるものである。 The DANCE protein solution of the present invention has good stability and can maintain the activity of the DANCE protein even after a certain period of time. Further, the activity of the DANCE protein can be maintained even after repeated freeze-thawing.
１．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液
「ＤＡＮＣＥタンパク質」とは、ｆｉｂｕｌｉｎ−５とも呼ばれる分泌蛋白質であり、弾性線維を構成する分子であることが知られている。
1. The DANCE protein solution “DANCE protein” is a secreted protein also called fibulin-5, and is known to be a molecule constituting an elastic fiber.
本発明で用いるＤＡＮＣＥタンパク質は、ヒト由来のヒトＤＡＮＣＥタンパク質、又は、そのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）を含む。 The DANCE protein used in the present invention includes a human-derived human DANCE protein, an ortholog thereof, or a mutant thereof (including SNP and haplotype).
ＤＡＮＣＥタンパク質のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス等が挙げられる。 The ortholog of the DANCE protein is not particularly limited, and can be derived from any animal, preferably a mammal. Examples of mammals include cattle, sheep, pigs, goats, monkeys, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, mice and the like.
ＤＡＮＣＥタンパク質については、例えば、国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット等に記載されている。 About DANCE protein, it describes in the international publication 2006/082763 pamphlet etc., for example.
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液におけるＤＡＮＣＥタンパク質濃度は、特に限定されるものではなく、所望の濃度にすることができるが、例えば、１〜１０μｇ／ｍＬ程度であることが好ましく、９〜１０μｇ／ｍＬ程度であることがより好ましい。ＤＡＮＣＥタンパク質濃度が前記範囲内にあることで、希釈しすぎることによって生じるＤＡＮＣＥタンパク質の変性や、活性再現性の低下を防ぐことができるため好ましい。 The DANCE protein concentration in the DANCE protein solution of the present invention is not particularly limited and can be a desired concentration, but is preferably about 1 to 10 μg / mL, for example, about 9 to 10 μg / mL. It is more preferable that It is preferable for the DANCE protein concentration to be within the above-mentioned range since it is possible to prevent the DANCE protein from being denatured and the activity reproducibility from being reduced by excessive dilution.
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液は、ＤＡＮＣＥタンパク質以外に、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物を含むものである。 The DANCE protein solution of the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of gelatin, albumin and hydroxyethyl starch in addition to the DANCE protein.
ゼラチンは、酸性、塩基性両アミノ酸を含む両性電解質であり、等電点４〜６程度のアルカリ処理ゼラチンであることが、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性の点から好ましい。より好ましいゼラチンの等電点は、５〜６程度である。 Gelatin is an ampholyte containing both acidic and basic amino acids, and is preferably alkali-treated gelatin having an isoelectric point of about 4 to 6 from the viewpoint of the stability of the DANCE protein solution. A more preferable isoelectric point of gelatin is about 5-6.
このようなアルカリ処理ゼラチンとしては、市販のものを好適に用いることができ、例えば、ゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製、等電点：５）、ニワトリゼラチン（ニッポンハム（株）製）等を挙げることができる。 As such alkali-treated gelatin, commercially available products can be suitably used. For example, gelatin powder (# 250, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd., isoelectric point: 5), chicken gelatin (Nippon Ham Co., Ltd.) )) And the like.
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液のｐＨは特に限定はされないが、５〜１４の弱酸性〜アルカリ性であることが好ましく、６〜１１がより好ましい。ｐＨがこの範囲にあることで、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性に優れるため好ましい。 The pH of the DANCE protein solution of the present invention is not particularly limited, but it is preferably 5 to 14 weakly acidic to alkaline, and more preferably 6 to 11. It is preferable for the pH to be in this range since the stability of the DANCE protein solution is excellent.
アルブミンは、卵白アルブミン、乳中のラクトアルブミン、血清アルブミン等を挙げることができるが、これらの中でも、血清アルブミンが好ましい。 Examples of albumin include ovalbumin, lactalbumin in milk, serum albumin, and the like. Among these, serum albumin is preferable.
また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質の由来は特に限定されるものではなく、牛、豚、魚、植物および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。 The origin of proteins such as gelatin and albumin is not particularly limited, and any of cows, pigs, fish, plants and genetically modified organisms can be used.
ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物の濃度としては特に限定されるものではないが、例えば、０．０５〜１０重量％程度であることが好ましく、０．１〜５重量％程度であることがより好ましい。 The concentration of one or more compounds selected from the group consisting of gelatin, albumin, and hydroxyethyl starch is not particularly limited, but is preferably about 0.05 to 10% by weight, for example. More preferably, it is about 1 to 5% by weight.
また、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水（蒸留水）、ＰＢＳ、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を挙げることができる。これらの中でも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好ましい。 The solvent used in the DANCE protein solution of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include water (distilled water), PBS, Carmody buffer, Tris buffer, and the like. Among these, water (distilled water) is preferable because impurities are not mixed.
２．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の製造方法
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液の製造方法は特に限定されるものではなく、ＤＡＮＣＥタンパク質、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物、及び溶媒を所定量混合することで製造することができる。
2. Method for Producing DANCE Protein Solution The method for producing the DANCE protein solution of the present invention is not particularly limited, and one or more compounds selected from the group consisting of DANCE protein, gelatin, albumin and hydroxyethyl starch, and a solvent are used. It can be manufactured by mixing a predetermined amount.
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液を作製するにあたり、ＤＡＮＣＥタンパク質を粉末のまま用いてもよいが、一旦溶媒等に溶かしてＤＡＮＣＥタンパク質を溶液とした後、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液とすることができる。 In preparing the DANCE protein solution of the present invention, the DANCE protein may be used as a powder. However, after the DANCE protein is dissolved in a solvent or the like to form a DANCE protein solution, the DANCE protein solution of the present invention can be obtained.
その際に用いる溶媒としては、特に限定されるものではなく、例えば、水（蒸留水）、ＰＢＳ、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を挙げることができる。これらの中でも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好ましい。 The solvent used in that case is not particularly limited, and examples thereof include water (distilled water), PBS, Carmody buffer, Tris buffer, and the like. Among these, water (distilled water) is preferable because impurities are not mixed.
その場合の濃度は、特に限定されるものではないが、１〜３０μｇ／ｍＬ程度が好ましく、１〜２０μｇ／ｍＬ程度が好ましい。濃度をこの範囲にすることで、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性を低下させることなく本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液とするための希釈をすることができるため好ましい。 The concentration in that case is not particularly limited, but is preferably about 1 to 30 μg / mL, and preferably about 1 to 20 μg / mL. By making the concentration within this range, it is preferable because the DANCE protein solution of the present invention can be diluted without reducing the activity of the DANCE protein.
３．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法
本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法に関する。
3. Stabilizing method invention of DANCE protein solution relates to a method stabilization of DANCE protein solution.
本発明の安定化方法は、ＤＡＮＣＥタンパク質を含む溶液に、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物を添加するという極めて簡単な方法により、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液を安定に保存することができるものである。 The stabilization method of the present invention stabilizes a DANCE protein solution by a very simple method of adding one or more compounds selected from the group consisting of gelatin, albumin and hydroxyethyl starch to a solution containing DANCE protein. It can be saved.
ＤＡＮＣＥタンパク質や、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物、又は溶媒等の種類や添加量等については、前述の通りである。 The type and amount of the DANCE protein, one or more compounds selected from the group consisting of gelatin, albumin, and hydroxyethyl starch, or the solvent are as described above.
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example are given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to these Examples.
製造例１（ＤＡＮＣＥ水溶液の調整方法）
凍結乾燥されたＤＡＮＣＥタンパク質（ヒト由来）の粉末４μｇを蒸留水で溶解し、１０μｇ／ｍＬのＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａを作製した。
Production Example 1 (Method for preparing DANCE aqueous solution)
4 μg of freeze-dried DANCE protein (human-derived) powder was dissolved in distilled water to prepare an aqueous solution A of 10 μg / mL DANCE protein.
実施例１
等電点が５（ｐＩ５）のゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製）を蒸留水で溶解して、０．３重量％ゼラチン水溶液（ｐＨ７）を作製した。
Example 1
Gelatin powder having an isoelectric point of 5 (pI5) (# 250, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3 wt% gelatin aqueous solution (pH 7).
前記ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）３ｍＬ中に、製造例１で調整したＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａ３０μＬを添加し、３７℃のインキュベーターで静置した。 To 3 mL of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7), 30 μL of the DANCE protein aqueous solution A prepared in Production Example 1 was added and allowed to stand in a 37 ° C. incubator.
実施例２
アルブミン（商品名：アルブミン牛血清製、コーンフラクションV、ｐＨ７．０、和光純薬工業（株）製）を蒸留水で溶解して、０．３重量％アルブミン水溶液を作製した。
Example 2
Albumin (trade name: manufactured by Albumin Bovine Serum, Corn Fraction V, pH 7.0, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3% by weight albumin aqueous solution.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、前記アルブミン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the albumin aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
実施例３
ヒドロキシエチルスターチ（ＳＩＧＭＡ製）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％ヒドロキシエチルスターチ水溶液を作製した。
Example 3
Hydroxyethyl starch (manufactured by SIGMA) powder was dissolved in distilled water to prepare a 0.3 wt% hydroxyethyl starch aqueous solution.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、前記ヒドロキシエチルスターチ水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the hydroxyethyl starch aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
実施例４
等電点が５（ｐＩ５）のゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製）を蒸留水で溶解して、０．３重量％ゼラチン水溶液（ｐＨ７）を作製した。
Example 4
Gelatin powder having an isoelectric point of 5 (pI5) (# 250, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3 wt% gelatin aqueous solution (pH 7).
前記ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）１ｍＬ中に、製造例１で調製したＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａ １０μＬを添加した。この溶液を−２０℃で０．５時間凍結し、その後３７℃で融解させ、この操作を１０回繰り返した。 To 1 mL of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7), 10 μL of the DANCE protein aqueous solution A prepared in Production Example 1 was added. This solution was frozen at −20 ° C. for 0.5 hour, then thawed at 37 ° C., and this operation was repeated 10 times.
比較例１
０．３重量％コラーゲン水溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ、新田ゼラチン（株）製）を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。
Comparative Example 1
A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a 0.3 wt% collagen aqueous solution (Cellmatrix Type IP, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was used.
比較例２
０．３重量％コラーゲン水溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ、新田ゼラチン（株）製）を蒸留水で希釈し、０．０３重量％コラーゲン水溶液を作製した。
Comparative Example 2
A 0.3 wt% collagen aqueous solution (Cellmatrix Type IP, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was diluted with distilled water to prepare a 0.03% wt collagen aqueous solution.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．０３重量％コラーゲン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a 0.03% by weight collagen aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
比較例３
デキストラン２００，０００（和光純薬工業（株）製：平均分子量１８０，０００〜２１０，０００）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％デキストラン水溶液を作製した。
Comparative Example 3
A powder of dextran 200,000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: average molecular weight 180,000-210,000) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3 wt% dextran aqueous solution.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％デキストラン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a 0.3 wt% dextran aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
比較例４
鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）を蒸留水に溶解して、０．３重量％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を作製した。
Comparative Example 4
Chicken crown-derived sodium hyaluronate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3% by weight sodium hyaluronate aqueous solution.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a 0.3% by weight sodium hyaluronate aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
比較例５
ヘパリン（和光純薬工業（株）製：１００，０００ｕｎｉｔｓ）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％ヘパリン水溶液を作製した。
Comparative Example 5
Heparin powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: 100,000 units) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3 wt% aqueous heparin solution.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％ヘパリン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a 0.3 wt% heparin aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
比較例６
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（和光純薬工業（株）製）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム水溶液を作製した。
Comparative Example 6
A powder of chondroitin sulfate C sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in distilled water to prepare a 0.3 wt% aqueous solution of chondroitin sulfate C sodium.
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。 A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a 0.3 wt% chondroitin sulfate C sodium aqueous solution was used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
比較例７〜９
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、蒸留水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−））、血清を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。
Comparative Examples 7-9
A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that distilled water, phosphate buffered saline (PBS (-)), and serum were used instead of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7).
比較例１０
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−））を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製し、実施例４と同様に凍結、融解させた。また、実施例４と同様にこの操作を１０回繰り返した。
Comparative Example 10
A DACNE protein solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that phosphate buffered saline (PBS (-)) was used in place of the pI5 gelatin aqueous solution (pH 7), and frozen and thawed in the same manner as in Example 4. I let you. In addition, this operation was repeated 10 times as in Example 4.
試験方法
実施例１〜３、比較例１〜９で得られたＤＡＮＣＥタンパク質溶液について、ＤＡＮＣＥタンパク質添加０時間、１日、３日、７日後に溶液を５００μＬずつ採取し、下記方法によりＤＡＮＣＥタンパク質濃度を測定した。
About the DANCE protein solutions obtained in Test Methods Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 9, 500 μL of the solutions were collected at 0 hour, 1 day, 3 days, and 7 days after addition of DANCE protein, and the concentration of DANCE protein was determined by the following method. Was measured.
また、参考実験として、上記実施例、比較例で用いた各種溶液について、ＤＡＮＣＥタンパク質なしのブランク試料についても、同様の測定をした。 In addition, as a reference experiment, the same measurement was performed on blank samples without DANCE protein for the various solutions used in the above Examples and Comparative Examples.
実施例４および比較例１０で得られたＤＡＮＣＥタンパク質溶液について、溶液を５００μＬずつ採取し、下記方法によりＤＡＮＣＥタンパク質濃度を測定した。
（測定方法）
抗体は、マウス抗ＤＡＮＣＥタンパク質ＩｇＧを用いた。測定キット（製造元：エヌビィ健康研究所）を用い、実施例１〜４、比較例１〜１０のＤＡＮＣＥタンパク質溶液のＤＡＮＣＥタンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。
（測定結果１）
実施例１〜３および比較例１〜９の測定結果を表１に示す。
About the DANCE protein solution obtained in Example 4 and Comparative Example 10, 500 μL of the solution was sampled and the DANCE protein concentration was measured by the following method.
(Measuring method)
Mouse anti-DANCE protein IgG was used as the antibody. Using a measurement kit (manufacturer: NU Health Laboratory), the DANCE protein concentrations of the DANCE protein solutions of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 10 were measured by ELISA.
(Measurement result 1)
The measurement results of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 9 are shown in Table 1.
（測定結果２）
実施例４で得られた溶液中のＤＡＮＣＥタンパク質の濃度は、凍結と融解を１回ずつ行った場合には２２．４ｎｇ／ｍｌ、１０回繰り返した場合には１６．７ｎｇ／ｍｌであった。これに対して比較例１０で得られた溶液中のＤＡＮＣＥタンパク質の濃度は、凍結と融解を１回ずつ行った場合には２．６ｎｇ／ｍｌ、１０回繰り返した場合には０．０ｎｇ／ｍｌであった。
(Measurement result 2)
The concentration of DANCE protein in the solution obtained in Example 4 was 22.4 ng / ml when frozen and thawed once, and 16.7 ng / ml when repeated 10 times. On the other hand, the concentration of DANCE protein in the solution obtained in Comparative Example 10 was 2.6 ng / ml when frozen and thawed once, and 0.0 ng / ml when repeated 10 times. Met.
実施例１〜３より、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液は、ＤＡＮＣＥ添加後７日を経過しても、充分なＤＡＮＣＥタンパク質濃度を有しており、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性が非常に高いことがわかる。 From Examples 1 to 3, it can be seen that the DANCE protein solution of the present invention has a sufficient DANCE protein concentration even after 7 days from the addition of DANCE, and the stability of the DANCE protein solution is very high. .
一方、比較例１〜８では、いずれもＤＡＮＣＥタンパク質濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以下にまで減少しており、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性が経時的に低下していることがわかる。 On the other hand, in each of Comparative Examples 1 to 8, the DANCE protein concentration decreased to 10 ng / mL or less, indicating that the activity of the DANCE protein decreased with time.
また、比較例９の血清については、そのブランク試験結果からも明らかなように、もともと血清中にＤＡＮＣＥタンパク質が存在するため、このような結果になったと考えられる。 In addition, as apparent from the blank test results, the serum of Comparative Example 9 is considered to have such a result because the DANCE protein originally exists in the serum.
実施例４と比較例１０から、ゼラチン溶液中にＤＡＮＣＥタンパク質を保持することによって、凍結、融解の繰り返しに対しても安定的に保存できることがわかった。 From Example 4 and Comparative Example 10, it was found that by keeping the DANCE protein in the gelatin solution, it can be stably stored against repeated freezing and thawing.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| J. CELL BIOLOGY, 2007, VOL.176, NO.7, P.1061-1071, JPN6014029619, ISSN: 0002855041 * |
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