JP2011184429A - Composition containing low-molecular antioxidant and high-molecular formed, cyclic nitroxide radical compound - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、活性酸素やフリーラジカル消去能及び抗酸化能を有する組成物に関する。より具体的には、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物及び抗酸化剤を含む組成物に関する。 The present invention relates to a composition having active oxygen and free radical scavenging ability and antioxidant ability. More specifically, it relates to a composition comprising a polymerized cyclic nitroxide radical compound and an antioxidant.
近年、活性酸素やラジカル種（ＲＯＳ）による酸化的ストレスが、血管を障害し、老化や癌化を促進するだけでなく、様々な疾病の原因となることが明らかになりつつある。実際に、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病（非特許文献１）等の脳疾患のみならず、様々な虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（非特許文献２）または癌もしくは加齢等の広範な疾患に関与していることが明らかになるかまたは明らかになりつつある。また、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下は、活性酸素やフリーラジカル種による細胞障害によりもたらされることが知られている。そこで、ＲＯＳを効率よく消去するため、天然物もしくは合成物質等様々な抗酸化剤が検討されている。その中で、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）などのようなさまざまな低分子抗酸化物質の開発がおこなわれているものの、腎臓からの急速な排泄などの問題点を有していた。このような背景を考慮し、本発明者らは最近、ＲＯＳに対する反応性を制御する材料設計に際し、生体適合性高分子にＴＥＭＰＯ様ニトロキシラジカルを結合し、その自己組織化を利用したナノ粒子を形成すると、これまでに提案されてきた低分子化合物に比較して極めて長時間生体内で安定に存在することを見出した（非特許文献３））。例えば、低分子のＴＥＭＰＯは血中投与後最短測定時間の２分後での検出は不可能であるのに対し、本発明者らの提供したナノ粒子封入ＴＥＭＰＯ等は半減期が数時間以上と圧倒的な安定性を示した（非特許文献４）。このラジカルナノ粒子（ＲＮＰ）を脳虚血再灌流によるダメージに適用したところ、大きな酸化ストレス障害抑制効果が見られ、効果的なＲＯＳ抑制効果を示した。本発明者らは以上の成果をまとめて特許出願も行った（特許文献１）。 In recent years, it has become clear that oxidative stress caused by active oxygen and radical species (ROS) not only damages blood vessels and promotes aging and canceration, but also causes various diseases. Actually involved not only in brain diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease (Non-Patent Document 1) but also in various diseases such as various ischemia-reperfusion disorders or mitochondrial disorders (Non-Patent Document 2) or cancer or aging. It is clear or is becoming clear. In addition, it is known that a decrease in cell function caused by a nonsteroidal analgesic / antipyretic such as indomethacin is caused by cell damage caused by active oxygen or free radical species. Therefore, various antioxidants such as natural products or synthetic substances have been studied in order to efficiently eliminate ROS. Among them, although various low-molecular antioxidants such as 2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxy radical (TEMPO) have been developed, rapid excretion from the kidney, etc. Had problems. In view of such a background, the present inventors recently designed a nanoparticle utilizing a self-organization by binding a TEMPO-like nitroxy radical to a biocompatible polymer when designing a material for controlling the reactivity to ROS. As a result, it has been found that it is stably present in a living body for a very long time as compared with the low-molecular compounds proposed so far (Non-patent Document 3)). For example, low molecular weight TEMPO cannot be detected 2 minutes after the shortest measurement time after administration in blood, whereas nanoparticle-encapsulated TEMPO provided by the present inventors has a half-life of several hours or more. It showed overwhelming stability (Non-Patent Document 4). When this radical nanoparticle (RNP) was applied to damage caused by cerebral ischemia / reperfusion, a large oxidative stress disorder inhibitory effect was observed, indicating an effective ROS inhibitory effect. The present inventors collectively filed the above results and filed a patent application (Patent Document 1).
他方、ＴＥＭＰＯ等以外の多種多様な低分子抗酸化剤も医療をはじめとする種々の分野で実用されているが、抗酸化能が一定の目的上十分でないか、中には、水難溶解性であるために利用分野が限定され、また、効果が制限されるものもある。 On the other hand, a wide variety of low-molecular antioxidants other than TEMPO have been put into practical use in various fields including medical treatment, but the antioxidant ability is not sufficient for a certain purpose. For this reason, the field of use is limited, and the effect is limited.
ＴＥＭＰＯ等では、それらを特定の高分子化合物を用いて高分子化することにより所期の目的を達成することに成功した。しかし、このような高分子化したＴＥＭＰＯであっても、さらにその機能を高めることができれば当該技術分野により一層貢献できるであろう。また、ＴＥＭＰＯ以外の低分子抗酸化剤のうち、特に、水難溶解性であるが故に、利用分野が限定され、また、効果が制限される抗酸化剤の機能を高めることに対するニーズは低分子ＴＥＭＰＯに対するのと同様に存在するであろう。 TEMPO and the like succeeded in achieving the intended purpose by polymerizing them using a specific polymer compound. However, even such a polymerized TEMPO could contribute further to the technical field if its function can be further enhanced. In addition, among low-molecular antioxidants other than TEMPO, there is a need for enhancing the functions of antioxidants that have limited fields of use and are limited in their effects because of their poor solubility in water. Will exist as well.
本発明では、今ここに、低分子抗酸化剤を短に高分子化するのでなく、上記の高分子化ＴＥＭＰＯ等と組み合わせて使用することにより、低分子化抗酸化剤の利用分野を拡張できるとともに、高分子化ＴＥＭＰＯ等の抗酸化活性を有意に向上できることが見出された。 In the present invention, the application field of the low molecular weight antioxidant can be expanded by using the low molecular weight antioxidant in combination with the above high molecular weight TEMPO or the like instead of short polymerizing the low molecular weight antioxidant. At the same time, it was found that the antioxidant activity such as polymerized TEMPO can be significantly improved.
すなわち、本発明によれば、低分子抗酸化剤と高分子化ＴＥＭＰＯをはじめとする高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物、およびこのような組成物の活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害の予防もしくは治療分野での使用が提供される。 That is, according to the present invention, a composition comprising a polymerized cyclic nitroxide radical compound including a low-molecular antioxidant and polymerized TEMPO, and the active oxygen or radical species of such a composition are mediated. Use in the field of prevention or treatment of (or involved) disease or disorder is provided.
該組成物によると、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物の抗酸化能をさらに向上させることができることのみならず、また、低分子抗酸化剤が水難溶解性である場合には、その抗酸化能を保持したまま、それらを水可溶性にすることができる。 According to the composition, not only can the antioxidant ability of the polymerized cyclic nitroxide radical compound be further improved, but also when the low molecular weight antioxidant is poorly soluble in water, the antioxidant ability thereof is reduced. They can be made water soluble while retaining.
したがって、本願明細書は下記の態様の発明を提供することにより上記課題を解決することができる。 Therefore, this specification can solve the above-mentioned problems by providing the invention of the following aspect.
態様１：低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を含んでなる組成物。 Embodiment 1: A composition comprising a low molecular weight antioxidant and a polymerized cyclic nitroxide radical compound.
態様２：低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれ、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、一般式（ＩＩ） Aspect 2: The low molecular weight antioxidant is vitamin E, β-carotene, ubiquinone (coenzyme Q), bilirubin, catechin, resveratrol, tannin, ebselen, aminosteroid, probucol, vitamin E analog, eicosanoid metabolism inhibitor, catenoloid, A polymerized cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of retinoid, rebamipide and piperine is represented by the general formula (II)
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−
Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、上記組成物。
In which A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkoxy, and when substituted, the substituent represents a formyl group or a group of formula R 1 R 2 CH—, wherein R 1 and R 2 is independently C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 together are —OCH 2 CH 2 O—, —
Represents O (CH 2 ) 3 O— or —O (CH 2 ) 4 O—,
L 1 represents a linking group selected from the group consisting of an atomized bond, — (CH 2 ) c S—, —CO (CH 2 ) c S—, wherein c is 1 to 5, preferably 2. An integer,
L 2 represents a linking group selected from the group consisting of methylimino, methyliminomethyl, methyloxy, methyloxymethyl, methyl ester and methyl ester methyl,
In R, at least 50% of the total number n of R is 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl-3- Yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4- Represents a residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of trimethyl-1,3-thiazolidine-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl-imidazolindin-3-oxyl-2-yl; When present, the remaining R is a hydrogen atom, a halogen atom or a hydroxy group;
m represents an integer of 20 to 5,000, and n represents an integer of 3 to 1,000.
Represented by
The above composition which is a compound.
態様３：低分子抗酸化剤が、ビタミンＥ、レバミピド及びピペリンよりなる群から選ばれる、上記組成物。 Aspect 3: The above composition, wherein the low molecular weight antioxidant is selected from the group consisting of vitamin E, rebamipide and piperine.
態様４：高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が高分子ミセルの形態をしており、かつ、低分子抗酸化剤が該高分子ミセルに内包されている、上記態様１〜３のいずれかの組成物。 Aspect 4: The composition according to any one of Aspects 1 to 3, wherein the polymerized cyclic nitroxide radical compound is in the form of a polymeric micelle and the low molecular antioxidant is encapsulated in the polymeric micelle. .
態様５：上記態様１〜４のいずれかを有効成分として含んでなる、活性酸素もしくはラジカル種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するための製薬学的製剤。 Aspect 5: A pharmaceutical preparation for treating or preventing a disease or disorder involving or involving active oxygen or radical species, comprising any of the above aspects 1 to 4 as an active ingredient.
以下、本発明で使用できる低分子抗酸化剤及び高分子化環状ニトキシドラジカル化合物についてより具体的に記述する。 Hereinafter, the low molecular weight antioxidant and the polymerized cyclic nitroxide radical compound that can be used in the present invention will be described more specifically.
低分子抗酸化剤にいう、低分子とは、高分子化環状ニトキシドラジカル化合物にいう高分子と対比しうる概念を表すものとして用いている。したがって、重合体は排除される。この様な低分子抗酸化剤としては、抗酸化作用を示し、本発明の目的に沿うものであれば限定されるものでないが、ムコスタ（レバミピド）及びその類延体（Ｍａｓａｔｅｒｕ Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１１（２００６）２７−３４、参照）、ビタミンＥ、β−カロテン、ユビキノン（コエンザイムＱ）、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンＥ類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、ピペリン、等の水難溶解性の抗酸化剤、ならびに
ビタミンＣ（アスコルビン酸）、グルタチオン、フラボノイド、尿酸、等の水溶性抗酸化剤、ならびに
スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、セルロプラスミン、メタロチオネイン、チオレドキシン、等のタンパク質性抗酸化剤、ならびに
白金コロイド、フラーレン、等の粒子状抗酸化剤
を挙げることができる。
The term “small molecule” as used in the low-molecular antioxidant is used to represent a concept that can be compared with the polymer as used in the polymerized cyclic nitroxide radical compound. Thus, the polymer is excluded. Such a low molecular weight antioxidant is not limited as long as it exhibits an antioxidant action and meets the object of the present invention. However, Mucosta (rebamipide) and its analogs (Masateru Miyake et al.,). Journal of Controlled Release 111 (2006) 27-34), vitamin E, β-carotene, ubiquinone (coenzyme Q), bilirubin, catechin, resveratrol, tannin, ebselen, aminosteroid, probucol, vitamin E analogues, eicosanoid metabolism Water-soluble antioxidants such as inhibitors, catenoloids, retinoids, piperines, and water-soluble antioxidants such as vitamin C (ascorbic acid), glutathione, flavonoids, uric acid, and superoxide dismutase, cata Over Ze, it can be mentioned peroxidase, glutathione peroxidase, ceruloplasmin, metallothionein, thioredoxin, protein antioxidants etc., as well as colloidal platinum, fullerene, a particulate anti-oxidants and the like.
一方、高分子化環状ニトキシドラジカル化合物としては、上記特許文献１に記載された環状ニトロキシドラジカル化合物を安定化するために高分子化したものであって、本発明の目的に沿うものであれば限定されることなく種々の高分子化合物により高分子化されたものも挙げることができる（特許文献１の全内容は、ここに引用することにより本明細書に取り込まれる）。このような安定化の典型的な方法について採録すれば、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基と該共重合体の反応性基を介して共有結合せしめる工程を含んでなる方法である。該方法において、具体的には、該官能基がアミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基であり、そして前記ブロック共重合体は該環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合された形態において水性溶媒中で高分子ミセルを形成できるものである。 On the other hand, as the polymerized cyclic nitroxide radical compound, the cyclic nitroxide radical compound described in Patent Document 1 above is polymerized in order to stabilize the composition, so long as it meets the object of the present invention. The polymer may be polymerized with various polymer compounds without limitation (the entire contents of Patent Document 1 are incorporated herein by reference). Taking a typical method for such stabilization, a cyclic nitroxide radical compound is converted into a block copolymer comprising a poly (ethylene glycol) chain segment and a hydrophobic chain segment carrying a reactive group, and the radical of the compound. This is a method comprising a step of covalently bonding via a functional group other than the above and a reactive group of the copolymer. In this method, specifically, the functional group is an amino group, an aminomethyl group, a hydroxy group, a hydroxymethyl group, a carboxyl group or a carbomethyl group, and the reactive group is a halogen atom, a carboxyl group or an isocyanate residue. Isothiocyanate residue, ester residue, acid anhydride residue, boronic acid residue, maleimide residue or epoxy group, and the block copolymer is in a form in which the cyclic nitroxide radical compound is covalently bonded. Polymer micelles can be formed in an aqueous solvent.
このような安定化方法により得ることのできる高分子化ニトロキシドラジカル化合物としては、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、上記高分子化ニトロキシドラジカル化合物を挙げることができる。 Polymerized nitroxide radical compounds obtainable by such a stabilization method include poly (ethylene glycol) chain segments having 15 to 10,000 ethylene glycol repeating units and 3 to 3,000 repeating units of styrene. Of poly (styrene) chain segments and at least 10%, preferably 30%, more preferably 50%, even more preferably 80%, of styrene repeating units in the poly (styrene) chain segment, in particular preferably -CH 2 NH 100% in the 4-position of the phenyl group -, - CH 2 NHCH 2 - , - CH 2 O -, - CH 2 OCH 2 -, - CH 2 OCO- , and -CH 2 OCOCH 2 - from The residue of the cyclic nitroxide radical compound is covalently bonded through a linking group selected from the group consisting of If present, the rest of the 4-position is a halogen atom, a hydrogen atom or a hydroxyl group, and the residue of the cyclic nitroxide radical compound is 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl -4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl-3-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4 -Trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4-trimethyl-1,3-thiazolidin-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl-imidazoline- The polymerized nitroxide radical compound selected from the group consisting of 3-oxyl-2-yl can be mentioned.
より具体的には、特許文献１に記載の一般式（ＩＩ） More specifically, the general formula (II) described in Patent Document 1
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子価結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−及び−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物であることができる。さらに、一般式（ＩＩ）において、Ｌ１が原子価結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
In which A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkoxy, and when substituted, the substituent represents a formyl group or a group of formula R 1 R 2 CH—, wherein R 1 and R 2 is independently, C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 are -OCH 2 CH 2 O together -, - O (CH 2) 3 O- or -O (CH 2) 4 O -
L 1 represents a linking group selected from the group consisting of valence bond, — (CH 2 ) c S— and —CO (CH 2 ) c S—, wherein c is an integer of 1 to 5, preferably 2. And
L 2 represents a linking group selected from the group consisting of methylimino, methyliminomethyl, methyloxy, methyloxymethyl, methyl ester and methyl ester methyl,
In R, at least 50% of the total number n of R is 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl-3- Yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4- Represents a residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of trimethyl-1,3-thiazolidine-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl-imidazolindin-3-oxyl-2-yl; When present, the remaining R is a hydrogen atom, a halogen atom or a hydroxy group;
m represents an integer of 20 to 5,000, and n represents an integer of 3 to 1,000.
Represented by
It can be a compound. Furthermore, in general formula (II), L 1 is a valence bond or —CH 2 CH 2 S—, L 2 is methylimino or methyliminomethyl, and all of R are
式中、Ｒ’はメチル基である、
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、これらの化合物から形成できる高分子ミセルの安定化にｐＨ応答性を付与する点でも特に好ましいものとして提供される。
In the formula, R ′ is a methyl group.
The polymerized nitroxide radical compound, which is a residue of the cyclic nitroxide radical compound represented by any of the above, is particularly preferable in that it provides pH responsiveness to the stabilization of polymer micelles that can be formed from these compounds. Provided.
上記の各基または部分の定義において、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシのアルキル部分は、直鎖または分岐のアルキルであることができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ドデカニル等を挙がることができる。また、Ａが、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−で置換されたアルコキシ基を表し、かつ、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す場合には、このような置換基は酸性条件下で容易に開裂してホルミル基に転化できるので、タンパク質もしくはペプチド（例えば、抗体その他のリガンド）等をそのアミノ基を介して容易に共有結合できる。かような置換基は、存在する場合には、アルコキシ基の未結合末端に存在するのが好ましい。これらの置換基は、例えば、上記特許文献２及び３に記載のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントの生成方法を参照して導入できる。 In the definition of each group or moiety above, the alkyl portion of C 1 -C 12 alkoxy can be straight chain or branched alkyl, such as methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, iso-butyl. , S-butyl, t-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, dodecanyl and the like. A represents an alkoxy group substituted with the formula R 1 R 2 CH—, and R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 together. -OCH 2 CH 2 O -, - O (CH 2) 3 O- or -O when (CH 2) represents a 4 O-is, such substituents formyl group readily cleaved under acidic conditions Therefore, a protein or peptide (for example, an antibody or other ligand) can be easily covalently bonded via its amino group. Such a substituent, if present, is preferably present at the unbound end of the alkoxy group. These substituents can be introduced with reference to the method for producing a poly (ethylene glycol) chain segment described in Patent Documents 2 and 3, for example.
また、上記ブロック共重合体における、連結基Ｌ１は、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとポリ（スチレン）をどのように結合させるかにより代わり得るので限定され
るものでない。例えば、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントをアニオンリビング重合で生成し、次いで、ハロメチルスチレンのリビング重合を継続する場合には、Ｌ１は原子価結合となる。ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントのω−末端に硫黄原子を持つポリ（エチレングリコール）誘導体を用意した場合は、該誘導体の存在下にハロメチルスチレンのラジカル重合を行うことで連結基が、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−または−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−となり得る。
In addition, the linking group L 1 in the block copolymer is not limited because it can be replaced by how the poly (ethylene glycol) chain segment and poly (styrene) are bonded. For example, when a poly (ethylene glycol) chain segment is produced by anionic living polymerization and then living polymerization of halomethylstyrene is continued, L 1 becomes a valence bond. When a poly (ethylene glycol) derivative having a sulfur atom at the ω-terminal of the poly (ethylene glycol) chain segment is prepared, radical polymerization of halomethylstyrene is performed in the presence of the derivative to form a linking group such as —CH It can be 2 CH 2 S— or —COCH 2 CH 2 S—.
本発明に従う組成物は、上記低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物を、必要により、希釈剤または他の製薬学的に常用されている賦形剤の存在下で混合することにより調製できる。低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物の混合比率は、限定されるものでないが、重量基準で、１：９９〜９９：１、好ましくは、３：９７〜６０：４０である。 In the composition according to the present invention, the low molecular weight antioxidant and the polymerized cyclic nitroxide radical compound are mixed in the presence of a diluent or other pharmaceutically commonly used excipient, if necessary. Can be prepared. The mixing ratio of the low molecular weight antioxidant and the polymerized cyclic nitroxide radical compound is not limited, but is 1:99 to 99: 1, preferably 3:97 to 60:40 on a weight basis. .
上記のような高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物は、緩衝化水溶液または水混和性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、アセトニトリル等を含有していてもよい水性媒体中で自己組織化することによってコア領域にニトロキシドラジカル部分が担持されるかもしくは存在し、シェル領域にポリ（エチレングリコール）鎖が存在するとみなせる数十ないし数百ナノメーター（ｎｍ）範囲内の粒子径を有する高分子ミセルを形成する。このような高分子ミセル形成の際に、または形成後に、低分子抗酸化剤、特に、水難溶解性抗酸化剤を水性媒体中で共存させておけば、該抗酸化剤を高分子ミセル中に内包させることができる。本発明の組成物の好ましいものとしては、低分子抗酸化剤を該高分子ミセルに内包したものを挙げることができる。このような形態をした本発明の組成物は、環状ニトロキシドラジカル化合物と低分子抗酸化剤が一体となって働き易く、また、低分子抗酸化剤が水難溶解性である場合はそれを水性媒体中で可溶化した状態にすることができる。 The polymerized cyclic nitroxide radical compound as described above is formed in the core region by self-assembly in a buffered aqueous solution or an aqueous medium that may contain a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, acetonitrile, and the like. A nitroxide radical moiety is supported or present, and polymer micelles having a particle size in the range of several tens to several hundreds of nanometers (nm) that can be regarded as having poly (ethylene glycol) chains in the shell region are formed. When such a polymer micelle is formed or after the formation, a low molecular weight antioxidant, in particular, a poorly water soluble antioxidant is allowed to coexist in an aqueous medium. Can be included. Preferable examples of the composition of the present invention include those in which a low molecular weight antioxidant is encapsulated in the polymer micelle. In the composition of the present invention having such a form, the cyclic nitroxide radical compound and the low molecular antioxidant easily work together, and if the low molecular antioxidant is poorly soluble in water, it is used as an aqueous medium. It can be in a solubilized state.
こうして形成する高分子ミセルは、ミセル形成水性液中で、例えば遠心または透析により分離、精製でき、また、凍結乾燥品としても提供できる。このような高分子ミセル内の低分子抗酸化剤と高分子化環状ニトキシドラジカル化合物の含有比率は、抗酸化剤対高分子化環状ニトキシドラジカル化合物に担持される環状ニトキシドラジカル化合物のモル比で、１：１〜１：１００００、好ましくは、１：４〜１：１００、より好ましくは１：５であることができる。 The polymer micelles thus formed can be separated and purified in a micelle-forming aqueous solution, for example, by centrifugation or dialysis, and can also be provided as a lyophilized product. The content ratio of the low molecular weight antioxidant and the polymerized cyclic nitroxide radical compound in such a polymer micelle is the molar ratio of the cyclic nitroxide radical compound supported by the antioxidant to the polymerized cyclic nitroxide radical compound. The ratio can be 1: 1 to 1: 10000, preferably 1: 4 to 1: 100, more preferably 1: 5.
こうして水難溶解性抗酸化剤の少なくとも一部が内包された高分子ミセルまたは組成物は、水性媒体中で可溶化でき、従来、水難溶解性のため利用分野が限定されていた抗酸化剤の用途を大きく拡張できる。また、該高分子ミセルに内包された抗酸化剤は、仮に、それら自体が生体に対して強力な毒性を有している場合であってもその毒性を有意に軽減できる。一方、抗酸化剤が水溶性抗酸化剤であっても、高分子化ニトロキシドラジカル化合物と抗酸化剤を共存させるかまたは組み合わせることにより調製した組成物は、該高分子ミセルと同様に、高分子化ニトロキシドラジカル化合物が本来有している活性酸素もしくはラジカル種の作用の抑制効果を初めとする抗酸化作用を相乗的にまたは質的に増強することができる。質的に増強とは、例えば、ニトロキシドラジカルによる抗酸化作用等とそれと組み合わされる抗酸化剤による抗酸化作用、抗炎症作用、胃粘膜保護作用等のそれぞれの異なる作用が、相互に悪影響を受けることなく両作用を発揮し、例えば、酸化過程より複雑な機序による場合には、かような酸化過程全体を効果的に抑制できる等の作用を意味する。 Thus, the polymeric micelle or composition containing at least a part of the poorly water-soluble antioxidant can be solubilized in an aqueous medium, and the use of an antioxidant that has heretofore been limited in application fields due to poor water solubility. Can be greatly expanded. Further, the antioxidants encapsulated in the polymer micelle can significantly reduce the toxicity even if they themselves have a strong toxicity to the living body. On the other hand, even if the antioxidant is a water-soluble antioxidant, a composition prepared by coexisting or combining a polymerized nitroxide radical compound and an antioxidant is a polymer similar to the polymer micelle. It is possible to synergistically or qualitatively enhance the antioxidant action including the effect of suppressing the action of the active oxygen or radical species inherent to the nitroxide radical compound. Qualitative enhancement means that different actions such as antioxidant action by nitroxide radical and antioxidant action combined with it, anti-inflammatory action, gastric mucosa protecting action are adversely affected each other. For example, in the case of a mechanism that is more complicated than the oxidation process, it means that the entire oxidation process can be effectively suppressed.
該高分子ミセルまたは組成物は、限定されるものでないが、全体として低毒性であり、また、水可溶性である等の性質を有することから、経口投与用及び非経口投与用の医薬製剤中の有効成分として都合よく利用できる。また、該高分子ミセルまたは組成物は、後述する実施例で明らかにされるとおりに全く異なる抗酸化等について試験するモデル実験で
高い効果を奏し、また、上述したとおり、高分子化ニトロキシドラジカル化合物が本来有している活性酸素もしくはラジカル種の作用の抑制効果を初めとする抗酸化作用を相乗的にまたは質的に増強することができるので、活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する広範な疾患もしくは障害の予防もしくは治療用の有効成分として利用できる。
The polymer micelle or composition is not limited, but has low toxicity as a whole and water-soluble properties. Therefore, the polymer micelle or composition is used in pharmaceutical preparations for oral administration and parenteral administration. It can be conveniently used as an active ingredient. In addition, the polymer micelle or composition is highly effective in a model experiment for testing for completely different antioxidants, etc. as will be clarified in Examples described later, and as described above, the polymerized nitroxide radical compound Since it is possible to synergistically or qualitatively enhance the antioxidant action, including the effect of suppressing the action of active oxygen or radical species inherent in the active oxygen, radical oxygen species are mediated (or involved) It can be used as an active ingredient for the prevention or treatment of a wide range of diseases or disorders.
活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病もしくはパーキンソン病等の脳疾患、心筋梗塞などの虚血再灌流障害もしくはミトコンドリア障害（例えば、潰瘍性大腸炎）、癌もしくは加齢（紫外線照射による皮膚の老化、シワの形成）、動脈硬化、糖尿病、肺気腫や炎症性皮膚疾患等の医学的または皮膚科学的な疾患または障害を挙げることができる。また、インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤による細胞の機能低下等に起因する、ＮＳＡＩＤｓによる消化管障害や腎機能不全も挙げることができる。 Diseases or disorders mediated by (or involved in) active oxygen or radical species include, but are not limited to, brain diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease, ischemia-reperfusion disorders such as myocardial infarction or mitochondrial disorders (for example, Ulcerative colitis), cancer or aging (skin aging by UV irradiation, formation of wrinkles), arteriosclerosis, diabetes, emphysema, inflammatory skin diseases and other medical or dermatological diseases or disorders it can. In addition, gastrointestinal dysfunction and renal dysfunction due to NSAIDs caused by non-steroidal analgesic and antipyretic agents such as indomethacin can also be mentioned.
このよう該高分子ミセルまたは組成物は、多岐にわたる疾患もしくは障害の治療または予防に効果を発揮する有効成分として利用できるので、使用対象に応じて適切な剤形（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で、それぞれの治療有効量を製薬学的に許容されるキャリヤー、希釈剤もしくは賦形剤とともに含む製剤として提供できる。このような剤形としては、経口的、直腸的、局所的、経皮的、体内埋植的または非経口的注射による投与に適する単位剤形を挙げることができる。これらの製剤は、有効成分としての該高分子ミセルまたは組成物を、キャリヤー、希釈剤もしくは賦形剤とともに、それ自体既知の調剤方法により調製できる。例えば、経口剤形を調製するには、経口剤を調製すのに常用されている製剤媒質、例えば、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤及び液剤等の経口液状製剤の場合には、水、グリコール、油脂、アルコール等、あるいは散剤、丸薬、カプセル剤及び錠剤の場合には、固形キャリヤー、例えば、澱粉、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を使用できる。非経口剤形、特に、注射用液剤もしくは懸濁剤を調製するには、キャリヤーもしくは希釈剤は、主として滅菌水または生理食塩水であることができ、必要により、懸濁化剤を含めることができ、また生理食塩水とともにもしくは独立して、グルコース等の糖溶液を用いることができる。経皮投与剤形にあっては、キャリヤーは、経皮投与に適するキャリヤー及び、必要に応じ、皮膚浸透促進剤もしくは湿潤剤を含めることができる。また、局所的投与剤形は、クリーム剤、ゼリー剤、ローション剤、軟膏剤であることができる。 Such polymer micelles or compositions can be used as active ingredients that are effective in the treatment or prevention of a wide variety of diseases or disorders, so that each treatment can be performed in an appropriate dosage form according to the intended use. It can be provided as a formulation comprising an effective amount together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. Such dosage forms can include unit dosage forms suitable for administration by oral, rectal, topical, transdermal, implantable or parenteral injection. These preparations can be prepared by a known preparation method of the polymeric micelle or composition as an active ingredient together with a carrier, diluent or excipient. For example, to prepare an oral dosage form, a pharmaceutical medium commonly used for preparing oral preparations, such as water in the case of oral liquid preparations such as suspensions, syrups, elixirs and solutions, In the case of glycols, oils and fats, alcohols, etc., or powders, pills, capsules and tablets, solid carriers such as starch, sugar, kaolin, lubricants, binders, disintegrants and the like can be used. For preparing parenteral dosage forms, particularly for injectable solutions or suspensions, the carrier or diluent can be primarily sterile water or saline, optionally containing a suspending agent. A sugar solution such as glucose can be used together with or independently of physiological saline. In the transdermal dosage form, the carrier can include a carrier suitable for transdermal administration and optionally a skin penetration enhancer or wetting agent. Topical dosage forms can also be creams, jellies, lotions, ointments.
このような剤形は、該有効成分の投与を必要とする患者に対し、それぞれの剤形に適する投与経路で対象とする疾患もしくは障害の治療有効量を投与することにより、活性酸素もしくはラジカル種が媒介（もしくは関与）する疾患もしくは障害の治療または予防をすることができる。有効量は、対象とする疾患もしくは障害、それらの重篤度、年齢、体重等により最適量が変動するので限定できないが、専門家が臨床試験等の試験の結果に基づいて判断できるであろう。 Such a dosage form is obtained by administering a therapeutically effective amount of a target disease or disorder to a patient in need of administration of the active ingredient by an administration route suitable for each dosage form. Can treat or prevent a disease or disorder mediated by (or involved). The effective amount cannot be limited because the optimal amount varies depending on the target disease or disorder, their severity, age, weight, etc., but experts can judge based on the results of clinical trials and other tests .
該有効成分は、他の有効成分、すなわち、対象とする疾患もしくは障害の治療もしくは予防に既に使用されているか、または使用することが提案されている医薬と、同時に、または前後して投与できる。 The active ingredient can be administered simultaneously with or before or after another active ingredient, ie a medicament already used or proposed to be used for the treatment or prevention of the disease or disorder of interest.
本発明をより具体的に説明するために、特定の高分子化ニトロキシドラジカル化合物として特許文献１の製造例１〜３（下記に採録する）に従って製造したメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−ｏ−ＴＥＭＰＯ（以下、ＲＮＰという）と低分子抗酸化剤としてムコスタを用いて本発明に従う組成物を調製した例について説明する。 In order to describe the present invention more specifically, methoxy-PEG-b-PCMS-o-TEMPO prepared according to Preparation Examples 1 to 3 (collected below) of Patent Document 1 as a specific polymerized nitroxide radical compound An example of preparing a composition according to the present invention using (hereinafter referred to as RNP) and Mucosta as a low molecular weight antioxidant will be described.
製造例１：α―末端にアセタール基を有するポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の合成
アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
Production Example 1 : Synthesis of polyethylene glycol-b-polychloromethylstyrene (acetal-PEG-b-PCMS) having an acetal group at the α-terminal Acetal-PEG-b-PCMS was synthesized according to the following synthesis scheme 1:
α―末端にアセタール基、ω―末端にチオール基を有しているヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（アセタール−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：４，６００；０．０２ｍｍｏｌ，９２ｍｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１ｍＬのアゾビスイソブチロニトリル／ベンゼン（０．０１ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液とクロロメチルスチレン（１ｍｍｏｌ，０．１３８ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をヘキサン中に流し込んだところ、白い沈殿が生じた。ポリクロロメチルスチレンホモポリマーを除去するために、得られた沈殿物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、１３４ｍｇであり、収率は５５．１％であった。得られたアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定の結果から、二峰性の分布が確認された。生成物の情報を得るために、ＳＥＣを用いてこの２つの分布を分別し、それぞれのフラクションの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した。 Heterobifunctional polyethylene glycol (acetal-PEG-SH) (Mn: 4,600; 0.02 mmol, 92 mg) having an acetal group at the α-terminus and a thiol group at the ω-terminus was added to the reaction vessel. . Next, after the inside of the reaction vessel was evacuated, the operation of blowing nitrogen gas was repeated three times to make the inside of the reaction vessel a nitrogen atmosphere. 1 mL of an azobisisobutyronitrile / benzene (0.01 mmol / mL) solution and chloromethylstyrene (1 mmol, 0.138 mL) were added to the reaction vessel, heated to 60 ° C., and stirred for 24 hours. The reaction mixture was poured into hexane and a white precipitate formed. In order to remove the polychloromethylstyrene homopolymer, the obtained precipitate was washed three times with diethyl ether, which is a good solvent for the polychloroethylstyrene homopolymer, and then freeze-dried with benzene. And a white powder was obtained. The yield was 134 mg, and the yield was 55.1%. From the result of size exclusion chromatography (SEC) measurement of the obtained acetal-PEG-b-PCMS block copolymer, a bimodal distribution was confirmed. In order to obtain product information, the two distributions were fractionated using SEC, and the 1 H NMR spectrum of each fraction was measured.
その結果、二つのフラクションのＰＥＧとＰＣＭＳの成分比率がほぼ同じであることが明らかとなった。また、得られたブロック共重合体中のＰＣＭＳセグメントの分子量を算出するために、ＳＥＣより決定したアセタール−ＰＥＧ−ＳＨの分子量に基づき１Ｈ ＮＭＲスペクトルを解析ところ、ＰＣＭＳセグメントの分子量は、それぞれ３，３００、６，６００であることが明らかとなった）。これらの結果により、二峰性の分布は、一方がジブロック共重合体の生成物であり、他方がトリブロック共重合体の生成物であることが明らかとなった。これは、テロメリゼーション中のジブロック共重合体同士の再結合により、トリブロック共重合体が生成したということが示唆される。また、ピークフィッティングにより、ジブロック共重合体とトリブロック共重合体の成分比は、２３％と７７％であることが確認された。 As a result, it became clear that the component ratios of PEG and PCMS in the two fractions were almost the same. Moreover, in order to calculate the molecular weight of the PCMS segment in the obtained block copolymer, the 1 H NMR spectrum was analyzed based on the molecular weight of acetal-PEG-SH determined from SEC, and the molecular weight of the PCMS segment was 3 respectively. , 300, 6,600). From these results, it became clear that one of the bimodal distributions is a product of a diblock copolymer and the other is a product of a triblock copolymer. This suggests that a triblock copolymer was formed by recombination of diblock copolymers during telomerization. Moreover, it was confirmed by peak fitting that the component ratio of the diblock copolymer and the triblock copolymer was 23% and 77%.
製造例２：イミノ結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；４０ｍｇ，５．２μｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（８８ｍｇ，５２０ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、７６．３％であった。
Production Example 2 : Synthesis of block polymer having TEMPO bonded via imino bond (acetal-PEG-b-PCMS-N-TEMPO) Acetal-PEG-b-PCMS (Mn: 7,900; 40 mg) in a reaction vessel , 5.2 μmol). Next, 4-amino-TEMPO (88 mg, 520 mmol) was dissolved in 2 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO), added to the reaction vessel, and stirred at room temperature for 5 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was poured into 2-propanol cooled to −15 ° C., then reprecipitated three times with 2-propanol, and then lyophilized with benzene. The yield was 76.3%.
１Ｈ ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた。またサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分取し、各フラクションにおけるＥＳＲシグナルを測定した。その結果、再沈殿の回数が増すごとに２０
分〜２７分に見られる未反応アミノ−ＴＥＭＰＯのＥＳＲシグナルが消失したことから、未反応のアミノ−ＴＥＭＰＯが精製によって完全除去されていることが確認された。
From the result of 1 H NMR measurement, it was confirmed that the chloromethyl group reacted 100% and TEMPO was introduced. Moreover, it fractionated using size exclusion chromatography and measured the ESR signal in each fraction. As a result, every time the number of reprecipitation increases, 20
Since the ESR signal of unreacted amino-TEMPO seen in minutes to 27 minutes disappeared, it was confirmed that unreacted amino-TEMPO was completely removed by purification.
製造例３：エーテル結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；２００ｍｇ，３０．６μｍｏｌ）を加え、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬに溶解した。次に、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（２６０ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）とＮａＨ（７０．３ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＦに溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、目的のメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを得た。収率は、７０．０％であった。
Production Example 3 : Synthesis of block polymer having TEMPO bonded via ether bond (methoxy-PEG-b-PCMS-O-TEMPO) In a reaction vessel, methoxy-PEG-b-PCMS (Mn: 7,900; 200 mg) , 30.6 μmol) was added and dissolved in 1 mL of dimethylformamide (DMF). Next, 4-hydroxy-TEMPO (260 mg, 1.53 mmol) and NaH (70.3 mg, 3 mmol) were dissolved in 2 mL of DMF, added to the reaction vessel, and stirred at room temperature for 5 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was poured into 2-propanol cooled to −15 ° C., then re-precipitated three times with 2-propanol, lyophilized with benzene, and subjected to the desired methoxy-PEG- b-PCMS-O-TEMPO was obtained. The yield was 70.0%.
製造例４：メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯのナノ粒子の調製方法
非特許文献３に記載された透析方法により製造例３で得られたメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ（以下、ニトロキシラジカル含有ポリマーともいう）からラジカルナノ粒子（ｒａｄｉｃａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；以下、ＲＮＰと略記する）を調製した。概述すると、４００ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを１００ｍＬのＤＭＦに溶解した。こうして得られたポリマー溶液を膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ ｓｉｚｅ：
３，５００， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， ＵＳＡ）中に移し、次いで、２Ｌの水に対して２４時間透析した（水は２時間、５時間、８時間及び２０時間後に交換した。）。こうして得られたＲＮＰ含有液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を実施し、ＲＮＰの直径を決定した。ＲＮＰ溶液の濃度を調節するために、得られたＲＮＰ溶液を遠心エバポレーターによりほぼ６０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した後、濃縮したＲＮＰのＤＬＳ測定を行い、濃縮後のＲＮＰのサイズを確認した。
Production Example 4 : Preparation Method of Nanoparticles of Methoxy-PEG-b-PCMS-O-TEMPO Methoxy-PEG-b-PCMS-O-TEMPO Obtained in Production Example 3 by the Dialysis Method described in Non-Patent Document 3 Radical nanoparticles (hereinafter referred to as RNP) were prepared from (hereinafter also referred to as nitroxy radical-containing polymer). In general, 400 mg of methoxy-PEG-b-PCMS-O-TEMPO was dissolved in 100 mL of DMF. The polymer solution thus obtained was added to a membrane tube (Spectra / Por, molecular-weight cutoff size:
3,500, Spectrum, USA) and then dialyzed against 2 L of water for 24 hours (water was changed after 2, 5, 8 and 20 hours). The RNP-containing liquid thus obtained was subjected to dynamic light scattering (DLS) measurement to determine the RNP diameter. In order to adjust the concentration of the RNP solution, the obtained RNP solution was concentrated to approximately 60 mg / ml with a centrifugal evaporator, and then DLS measurement of the concentrated RNP was performed to confirm the size of the RNP after the concentration.
ＲＮＰを用いたムコスタの溶解性向上
スクリュー管に１．２ｍｇから８．４ｍｇまで０．６ｍｇ間隔でムコスタを量りとり、ＰＢＳ３ｍｌを加え、マグネティクスターラーを用いて２４時間撹拌した。同様の量をスクリュー管に量りとったものにＰＢＳ中の製造例４に従い製造されたＲＮＰの溶液６ｍｇ／ｍｌを３ｍｌ加え、２４時間撹拌した。撹拌後、０．２μｍのフィルターを通し、溶解していないムコスタを除去した後、二倍に希釈して、ムコスタ由来のＵＶ吸収を確認した。結果を図１に示す。図１から理解できるように、ＲＮＰを用いることでムコスタの溶解度がおよそ２倍程度に上昇したことが確認された。さらにムコスタ濃度２．０ｍｇ／ｍｌ時の粒径を下記に示す。
Improvement of Solubility of Mucosta Using RNP Mucosta was weighed into a screw tube from 0.6 mg to 8.4 mg at intervals of 0.6 mg, added with 3 ml of PBS, and stirred for 24 hours using a magnetic stirrer. 3 ml of a 6 mg / ml solution of RNP prepared according to Preparation Example 4 in PBS was added to a similar amount measured in a screw tube and stirred for 24 hours. After stirring, the solution was passed through a 0.2 μm filter to remove undissolved mucosta, and then diluted twice to confirm UV absorption derived from mucosta. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, it was confirmed that the use of RNP increased the solubility of Mucosta to about twice. Further, the particle size at a mucosta concentration of 2.0 mg / ml is shown below.
ムコスタ内包後の粒子径分布と内包確認
動的光散乱法で測定したところ、図２示されるとおり、単分散な粒径分布が得られたことが確認できた。粒子径は内包前、後ともに約４０ｎｍで変化は見られなかった。
Particle size distribution after inclusion of Mucosta and confirmation of inclusion When measured by a dynamic light scattering method, it was confirmed that a monodispersed particle size distribution was obtained as shown in FIG. The particle size was about 40 nm before and after the encapsulation and no change was observed.
ＰＤ１０カラムに流しフラクションごとにムコスタ由来である、３５０ｎｍのＵＶ吸収を確認したところミセルと同じフラクションにピークを確認することができた（図３参照）。このことより、ムコスタがＲＮＰ粒子に内包されていることが示唆される。 When flowing through a PD10 column and confirming the UV absorption at 350 nm, which is derived from Mucosta, for each fraction, a peak could be confirmed in the same fraction as the micelle (see FIG. 3). This suggests that Mucosta is encapsulated in RNP particles.
ＲＮＰとムコスタ内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果
インドメタシンのような非ステロイド性鎮痛解熱剤は、ミトコンドリアに障害を与え、ミトコンドリア外へ活性酸素を漏出し、細胞及び／または組織障害を惹起することが知られている。そこで、ここでは、ＲＯＳ産生による細胞障害モデルとして用い、ＲＮＰもしくは、ムコスタ内包ＲＮＰの細胞毒性抑制効果を調べた。
Non-steroidal analgesic and antipyretic drugs such as indomethacin are known to cause damage to mitochondria, leak active oxygen out of mitochondria, and cause cell and / or tissue damage. Yes. Therefore, the cytotoxicity-inhibiting effect of RNP or Mucosta-encapsulated RNP was examined here as a model of cytotoxicity caused by ROS production.
９６ｗｅｌｌプレートにＲＧＭ１細胞を５×１０３個播種し、２４時間培養した。培養後、ＲＮＰを培地にＴＥＭＰＯの終濃度が、１ｍＭ，０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭ，０．０２５ｍＭ，０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。同様に、ムコスタ内包ＲＮＰもＴＥＭＰＯ終濃度が、１ｍＭ，０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭ，０．０２５ｍＭ，０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。直後、さらにインドメタシンを終濃度が５００μＭとなるよう細胞に添加し、２４時間インキューベーターで培養後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙを行い、細胞生存率を求めた。結果を図４に示す。図４からＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にインドメタシンの毒性を抑制することが確認された。さらに、ムコスタを内包することで、ＲＮＰを単独で用いる（空のＲＮＰともいう）より、毒性を抑制することが確認された。 A 96-well plate was seeded with 5 × 10 3 RGM1 cells and cultured for 24 hours. After culture, RNP was added to the medium so that the final concentrations of TEMPO were 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.1 mM, 0.05 mM, 0.025 mM, and 0.01 mM. Similarly, Mucosta-encapsulated RNP was also added to the medium so that the final TEMPO concentrations were 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.1 mM, 0.05 mM, 0.025 mM, and 0.01 mM. Immediately after that, indomethacin was further added to the cells so that the final concentration was 500 μM, and after culturing in an incubator for 24 hours, WST-8 assay was performed to determine cell viability. The results are shown in FIG. From FIG. 4, it was confirmed that the toxicity of indomethacin was suppressed depending on the TEMPO concentration of RNP. Furthermore, it was confirmed that the inclusion of mucosta suppresses toxicity from using RNP alone (also referred to as empty RNP).
抗酸化剤ビタミンEの内包と内包薬物の効果
５−１） ビタミンＥの内包
ニトロキシルラジカル含有ポリマー３６ｍｇとビタミンＥ（１０、５、１、０．１ｍｇ）をＤＭＦに対して透析を行った。結果を、図５に示す。図５から、ニトロキシルラジカル含有ポリマーとビタミンＥを一緒に透析処理することにより単分散な粒径分布のビタミンＥ内包ＲＮＰが得られ、粒子径は内包前、後ともに約４０ｎｍで変化は見られなかった。
Encapsulation of Antioxidant Vitamin E and Effect of Encapsulated Drug 5-1) Encapsulation of Vitamin E 36 mg of a nitroxyl radical-containing polymer and vitamin E (10, 5, 1, 0.1 mg) were dialyzed against DMF. The results are shown in FIG. From FIG. 5, a nitroxyl radical-containing polymer and vitamin E are dialyzed together to obtain a monodispersed vitamin E-encapsulated RNP having a particle size distribution, and the particle size changes at about 40 nm before and after the encapsulation. There wasn't.
５−２） ＲＮＰとビタミンE内包ＲＮＰによる細胞毒性抑制効果
実施例４に記載のＲＯＳ産生による細胞障害モデル実験に準じて、ムコスタの代わりにビタミンＥを用い、ＲＮＰもしくは、ビタミンＥ内包ＲＮＰの細胞毒性抑制効果を調べた。結果を図６に示す。図６から、ＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にインドメタシンの毒性を抑制することが確認された。さらに、ビタミンＥを内包することで、ＲＮＰを単独で用いるより、ビタミンＥの濃度依存的に上記毒性を抑制することが確認された。
5-2) Cytotoxicity suppression effect by RNP and vitamin E-encapsulated RNP According to the cytotoxicity model experiment by ROS production described in Example 4, using vitamin E instead of Mucosta, RNP or vitamin E-encapsulated RNP cells The toxicity control effect was investigated. The results are shown in FIG. From FIG. 6, it was confirmed that the toxicity of indomethacin was suppressed depending on the TEMPO concentration of RNP. Furthermore, it was confirmed that inclusion of vitamin E suppresses the toxicity in a vitamin E concentration-dependent manner rather than using RNP alone.
アルツハイマー治療薬 ピペリンの内包と内包薬物の効果 Alzheimer's drug Piperine inclusion and the effect of the drug
６−１） Ａβアミロイド（１−４２）によるヒト神経芽細胞種株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）
アルツハイマー型障害の構築
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種株は、国立大学法人筑波大学の礒田博子（本願発明の発明者の一人）研究室より入手した。該細胞を、ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ； Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）の混合物と１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）、１％非必須ＭＥＭアミノ酸及び１％ペニシリン（５０００μｇ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０００ＩＵ／ｍＬ）溶液を補足したハムのＦ−１２栄養混合物（Ｈａｍ’ｓＦ−１２ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）１：１（Ｖ／Ｖ）を用い、種々の目的に応じ、フラスコ中または６ｗｅｌｌ、２４ｗｅｌｌ、４８ｗｅｌｌもしくは９６ｗｅｌｌ上で、９５％加湿空気及び５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。なお、上記細胞は研究の目的で用いることを条件に、上記研究室に第三者の請求があれば自由に分譲される。細胞毒性アッセイには、イーグルの最少必須培地の血清不含改変培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いた。この実験では、細胞の付着のために、ヒト血漿から精製されたフィフロネクチン（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）５０μｇ／ｍＬで一昼夜プレートを前処理した。細胞集合を得る目的で、Ａβ１−４２を培地に溶解し、使用前に７２時間３７℃でインキュベートした。培養の２４−４８時間後、細胞（ほぼ８０％コンフルエントに達した）を培地で３度洗浄し、その後、異なる濃度のＡβ１−４２の存在下で血清を含まないダルベッコのＭＥＭ培地で４８時間インキュベートした。結果を図７に示す。ＴＥＭＰＯＬの保護効果を試験するために設計した実験では、４８時間Ａβ１−４２に曝す前に細胞を異なる濃度のＴＥＭＰＯＬとともに一昼夜処理した。図７より、本実験系ではＡβ１−４２の添加量を増すごとに神経芽細胞障害がみられた。
6-1) Human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) with Aβ amyloid (1-42)
Construction of Alzheimer-type disorder The human SH-SY5Y neuroblastoma cell line was obtained from the laboratory of Hiroko Hamada (one of the inventors of the present invention) at the University of Tsukuba. The cells were mixed with Dulbecco's minimal essential medium (DMEM; Sigma, USA) and 15% fetal calf serum (FBS; Sigma, USA), 1% non-essential MEM amino acid and 1% penicillin (5000 μg / mL) -streptomycin (5000 IU). / ML) Ham's F-12 Nutrient Mix 1: 1 (V / V) supplemented with solution, in flask or 6well, 24well, 48well or 96well depending on various purposes Above, it was cultured at 37 ° C. in 95% humidified air and 5% CO 2 incubator. The cells are freely distributed if requested by a third party to the laboratory, provided that the cells are used for research purposes. Eagle's minimal essential medium serum free modified medium (OPTI-MEM Gibco BRL) was used for the cytotoxicity assay. In this experiment, the plates were pretreated overnight with 50 μg / mL of fibronectin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) purified from human plasma for cell attachment. In order to obtain cell populations, Aβ1-42 was dissolved in the medium and incubated for 72 hours at 37 ° C. before use. After 24-48 hours in culture, the cells (which have reached approximately 80% confluence) are washed three times with medium and then incubated for 48 hours in Dulbecco's MEM medium without serum in the presence of different concentrations of Aβ1-42. did. The results are shown in FIG. In experiments designed to test the protective effect of TEMPOL, cells were treated overnight with different concentrations of TEMPOL before being exposed to Aβ1-42 for 48 hours. As shown in FIG. 7, in this experimental system, neuroblastic cell damage was observed every time the addition amount of Aβ1-42 was increased.
６−２） ＲＮＰによるアルツハイマーモデルの低減効果
９６ｗｅｌｌプレートにＲＧＭ１細胞を１×１０４個播種し、２４時間培養した。培養後、ＲＮＰを培地にＴＥＭＰＯの終濃度が、５ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭとなるように培地に添加した。同時に、Ａβ１-４２（１０％（ｖ／ｖ），１０μＬ）となるように培地に添加した。２４時間インキューベーターで培養後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙを行い、細胞生存率を求めた。結果を図８に示す。図８より、ＲＮＰのＴＥＭＰＯ濃度依存的にＡβ１-４２の毒性を抑制することが確認された。また、図８に示されるようにＲＮＰの０．０１ｍＭから１ｍＭまでの濃度で細胞生存率が向上している。３ｍＭ以上では毒性が出て効果があまり変わらない。
6-2) Reduction effect of Alzheimer model by RNP 1 × 10 4 RGM1 cells were seeded on a 96-well plate and cultured for 24 hours. After culturing, RNP was added to the medium so that the final concentration of TEMPO was 5 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, 0.5 mM, 0.1 mM, 0.01 mM. At the same time, Aβ1-42 (10% (v / v), 10 μL) was added to the medium. After culturing in an incubator for 24 hours, WST-8 assay was performed to determine cell viability. The results are shown in FIG. From FIG. 8, it was confirmed that the toxicity of Aβ1-42 was suppressed depending on the TEMPO concentration of RNP. In addition, as shown in FIG. 8, the cell viability is improved at a concentration of RNP from 0.01 mM to 1 mM. At 3mM or more, toxicity appears and the effect does not change much.
６−３） ＲＮＰ＋ピペリンのＡβ１−４２障害細胞に対する効果
６−２)と同様にＲＮＰ単独の代わりにＲＮＰにピペリンを加えて評価を行った。結果を図９及び図１０に示す。
6-3) Effect of RNP + piperine on Aβ1-42-damaged cells In the same manner as in 6-2), evaluation was performed by adding piperine to RNP instead of RNP alone. The results are shown in FIGS.
図９では０．１−１０μＭまで抗酸化効果がみられるが、２０μＭ以上では毒性がみられる。一方、図１０では、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、特にＲＮＰ１ｍＭではピペリン１００μＭでも全く毒性が見られず、Ａｂ１−４２障害をほぼ完全に消去していることが理解できる。 In FIG. 9, the antioxidant effect is observed up to 0.1-10 μM, but toxicity is observed at 20 μM or more. On the other hand, in FIG. 10, it can be understood that when RNP + piperine is used in combination, the toxicity of AbNP-42 is almost completely eliminated, especially with RNP of 1 mM even when piperine is 100 μM.
６−４）
図１１には、ＮＢＴ法を用いて測定したスーパーオキシド産生量を示した。ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にヒドロキシルラジカル産生を抑制し、ＲＮＰ単独よりもスーパーオキシド産生量を抑制することが理解できる。また図１２には、ヒドロキシラジカル産生量を示す。ヒドロキシラジカル産生量は、デオキシリボース分解法により測定を行った。図１２からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にヒドロキシルラジカル産生を抑制し、ＲＮＰ単独よりもスーパーオキシド産生量を抑制することが理解できる。
6-4)
FIG. 11 shows the amount of superoxide production measured using the NBT method. It can be understood that when RNP + piperine is used in combination, hydroxyl radical production is significantly suppressed, and the production amount of superoxide is suppressed more than RNP alone. FIG. 12 shows the amount of hydroxy radical produced. Hydroxy radical production was measured by the deoxyribose decomposition method. As can be seen from FIG. 12, it can be understood that when RNP + piperine is used in combination, hydroxyl radical production is significantly suppressed, and the amount of superoxide produced is suppressed more than RNP alone.
６−５）
通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞はアポトーシスを惹起し、図１３に示すように、ＤＮＡの断片化（Enrichment factor）を引き起こす。Camptothecinは、アポトーシスを誘発する化合物として知られており、図１３からもわかるとおり、ＤＮＡの断片化が生じている。一方、ＲＮＰ単独やＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、ＤＮＡの断片化がほとんど生じていないことが分かり、このことからアポトーシスを抑制していることが理解できる。
6-5)
Usually, human neuroblasts added with Aβ amyloid induce apoptosis and cause DNA fragmentation (Enrichment factor) as shown in FIG. Camptothecin is known as a compound that induces apoptosis, and DNA fragmentation occurs as can be seen from FIG. On the other hand, when RNP alone or RNP + piperine is used in combination, it can be seen that DNA fragmentation hardly occurs, and from this, it can be understood that apoptosis is suppressed.
６−６）
図１４には、チオバルビツール酸法を用いて測定した脂質過酸化の定量結果を示した。通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１４に示すように、脂質過酸化(ＭＤＡ＋ＨＡＥ)の量が増加する。一方、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意に脂質過酸化の量を抑制し、ＲＮＰ単独よりも脂質過酸化の量を抑制することが理解できる。また図１５には、タンパク質が酸化された指標となるカルボニル化蛋白（プロテインカルボニル）の定量結果を示す。通常、Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１５に示すように、カルボニル化蛋白の量が増加する。カルボニル化蛋白の量は、ELISA法により測定を行った。図１５からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意にカルボニル化蛋白の量を抑制し、ＲＮＰ単独よりもカルボニル化蛋白の量を抑制することが理解できる。また同様に、図１６には、核酸が酸化された指標となる８−ＯＨｄＧの定量結果を示す。Ａβアミロイドを添加したヒト神経芽細胞は、図１６に示すように、８−ＯＨｄＧの量が増加する。図１６からもわかるように、ＲＮＰ＋ピペリンを併用した場合、有意に８−ＯＨｄＧの量を抑制し、ＲＮＰ単独よりも８−ＯＨｄＧの量を抑制することが理解できる。
6-6)
FIG. 14 shows the quantitative results of lipid peroxidation measured using the thiobarbituric acid method. Usually, the amount of lipid peroxidation (MDA + HAE) increases in human neuroblasts added with Aβ amyloid, as shown in FIG. On the other hand, when RNP + piperine is used in combination, it can be understood that the amount of lipid peroxidation is significantly suppressed and the amount of lipid peroxidation is suppressed more than that of RNP alone. FIG. 15 shows the quantification result of a carbonylated protein (protein carbonyl) that is an index of protein oxidation. Normally, human neuroblasts to which Aβ amyloid has been added have an increased amount of carbonylated protein as shown in FIG. The amount of carbonylated protein was measured by ELISA. As can be seen from FIG. 15, it can be understood that when RNP + piperine is used in combination, the amount of carbonylated protein is significantly suppressed, and the amount of carbonylated protein is suppressed more than RNP alone. Similarly, FIG. 16 shows the quantitative results of 8-OHdG, which is an index of oxidized nucleic acid. In human neuroblasts to which Aβ amyloid has been added, the amount of 8-OHdG increases as shown in FIG. As can be seen from FIG. 16, it can be understood that when RNP + piperine is used in combination, the amount of 8-OHdG is significantly suppressed, and the amount of 8-OHdG is suppressed more than that of RNP alone.
６−７）
図１７に、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を示す。また図１８には、細胞内のカタラーゼ（ＣＡＴ）の活性を示す。グルタチオンペルオキシダーゼやカタラーゼは、Ａβアミロイドを神経芽細胞に添加しても活性が増加することはない。またＲＮＰ単独でもＧＰｘ活性及びＣＡＴ活性ともにないのに対し、ピペリンを加えると高い活性が生じる。これらの結果は、ＲＮＰがスーパーオキシド及びヒドロキシラジカルの還元に極めて有効なのに対し、ピペリンは過酸化水素の還元を効果的に行う。このため、ＲＮＰ＋ピペリンはアルツハイマー疾患に対して高い活性を示す。
6-7)
FIG. 17 shows the activity of glutathione peroxidase (GPx). FIG. 18 shows intracellular catalase (CAT) activity. The activity of glutathione peroxidase and catalase does not increase even when Aβ amyloid is added to neuroblasts. In addition, RNP alone has neither GPx activity nor CAT activity, whereas high activity occurs when piperine is added. These results indicate that RNP is extremely effective in reducing superoxide and hydroxy radicals, whereas piperine effectively reduces hydrogen peroxide. For this reason, RNP + piperine exhibits high activity against Alzheimer's disease.
本発明により提供される高分子ミセルまたは組成物は、水溶液に対して難溶解性の薬剤の溶解性を向上させることができるだけでなく、ＲＮＰと組み合わせることにより極めて高い抗酸化能を有する薬剤として機能するため、活性酸素もしくはラジカル種（ＲＯＳ）が媒介（または関与）疾患または障害の治療または予防に有効である。したがって、限定されるものでないが、医薬、化粧品または食品の製造業で利用できる。 The polymer micelle or composition provided by the present invention can not only improve the solubility of a drug that is hardly soluble in an aqueous solution, but also functions as a drug having extremely high antioxidant ability when combined with RNP. Therefore, reactive oxygen or radical species (ROS) are effective in the treatment or prevention of mediated (or involved) diseases or disorders. Therefore, it is not limited, but can be used in the manufacture of pharmaceuticals, cosmetics or foods.
Claims (9)
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、請求項１記載の組成物。 Low molecular weight antioxidants include vitamin E, β-carotene, ubiquinone (coenzyme Q), bilirubin, catechin, resveratrol, tannin, ebselen, aminosteroids, probucol, vitamin E analogues, eicosanoid metabolism inhibitors, catenoloids, retinoids, rebamipide And a polymerized cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of piperine and general formula (II)
L 1 represents a linking group selected from the group consisting of an atomized bond, — (CH 2 ) c S—, —CO (CH 2 ) c S—, wherein c is 1 to 5, preferably 2. An integer,
L 2 represents a linking group selected from the group consisting of methylimino, methyliminomethyl, methyloxy, methyloxymethyl, methyl ester and methyl ester methyl,
In R, at least 50% of the total number n of R is 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl-3- Yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4- Represents a residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of trimethyl-1,3-thiazolidine-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl-imidazolindin-3-oxyl-2-yl; When present, the remaining R is a hydrogen atom, a halogen atom or a hydroxy group;
m represents an integer of 20 to 5,000, and n represents an integer of 3 to 1,000.
Represented by
The composition of claim 1 which is a compound.
種の媒介または関与する疾患または障害を治療または予防するための製薬学的製剤。 Treat or treat diseases or disorders involving active oxygen or radical species comprising a low molecular weight antioxidant as an active ingredient and a polymerized cyclic nitroxide radical compound and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent or Pharmaceutical formulation for prevention.
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物である、請求項４記載の製薬学的製剤。 Low molecular weight antioxidants include vitamin E, β-carotene, ubiquinone (coenzyme Q), bilirubin, catechin, resveratrol, tannin, ebselen, aminosteroids, probucol, vitamin E analogues, eicosanoid metabolism inhibitors, catenoloids, retinoids, rebamipide And a polymerized cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of piperine and general formula (II)
L 1 represents a linking group selected from the group consisting of an atomized bond, — (CH 2 ) c S—, —CO (CH 2 ) c S—, wherein c is 1 to 5, preferably 2. An integer,
L 2 represents a linking group selected from the group consisting of methylimino, methyliminomethyl, methyloxy, methyloxymethyl, methyl ester and methyl ester methyl,
In R, at least 50% of the total number n of R is 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl-3- Yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4- Represents a residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of trimethyl-1,3-thiazolidine-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl-imidazolindin-3-oxyl-2-yl; When present, the remaining R is a hydrogen atom, a halogen atom or a hydroxy group;
m represents an integer of 20 to 5,000, and n represents an integer of 3 to 1,000.
Represented by
The pharmaceutical preparation according to claim 4, which is a compound.
た炎症、高血圧、高脂血症、肥満動脈硬化等の医学的または皮膚科学的な疾患または障害からなる群から選ばれる請求項５〜８のいずれか一項に記載の製薬学的製剤。 The disease or disorder is Alzheimer's disease or Parkinson's disease, brain disease such as cerebral infarction, ischemia reperfusion disorder such as myocardial infarction or mitochondrial disorder (eg, ulcerative colitis), cancer or aging (skin aging due to ultraviolet irradiation) , Wrinkle formation), gastrointestinal tract disorders and renal dysfunction caused by non-steroidal analgesic antipyretic drugs such as indomethacin, and medical or such as inflammation, hypertension, hyperlipidemia, obesity arteriosclerosis The pharmaceutical preparation according to any one of claims 5 to 8, which is selected from the group consisting of dermatological diseases or disorders.
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Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013058627A2 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Composition including rebamipide as an active ingredient for preventing or treating obesity |
| WO2013111801A1 (en) * | 2012-01-24 | 2013-08-01 | 国立大学法人筑波大学 | Triblock copolymer and use thereof |
| WO2013118783A1 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | 国立大学法人筑波大学 | Organic-inorganic hybrid complex of high-molecular-weight nitroxide compound and inorganic particle |
| WO2013177599A1 (en) * | 2012-05-22 | 2013-11-28 | Lunar Pharmaceuticals (Pty) Ltd | Nutricosmetic composition |
| WO2014021637A1 (en) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Composition comprising rebamipide as active ingredient for preventing or treating hyperlipemia and diseases associated therewith |
| WO2014199982A1 (en) * | 2013-06-11 | 2014-12-18 | 国立大学法人筑波大学 | Composition including polycationic triblock copolymer, polyanionic polymer, and biologically active peptide |
| JP2016117818A (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-30 | 昭和電工株式会社 | Fullerene composition, resin additive and resin composition |
| JP2017088531A (en) * | 2015-11-07 | 2017-05-25 | 国立大学法人 筑波大学 | Preparation for treating skin damage comprising polymerized cyclic nitroxide radical |
| WO2017094691A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | 国立大学法人筑波大学 | Nitroxy-radical-containing copolymer having phosphate residue, and use thereof |
| JP2018057300A (en) * | 2016-10-04 | 2018-04-12 | 小川香料株式会社 | Flavor degradation inhibitor for beer taste beverage, and flavor degradation inhibiting method |
| JP2019001786A (en) * | 2017-06-19 | 2019-01-10 | 国立大学法人 筑波大学 | Therapeutic drug for infectious disease |
| CN112494488A (en) * | 2020-06-17 | 2021-03-16 | 中国药科大学 | Application of rebamipide in preventing alopecia and growing hair |
-
2010
- 2010-06-10 JP JP2010133296A patent/JP2011184429A/en active Pending
Cited By (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013058627A3 (en) * | 2011-10-21 | 2013-07-04 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Composition including rebamipide as an active ingredient for preventing or treating obesity |
| WO2013058627A2 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Composition including rebamipide as an active ingredient for preventing or treating obesity |
| US9849186B2 (en) | 2012-01-24 | 2017-12-26 | University Of Tsukuba | Triblock copolymer and use therefor |
| WO2013111801A1 (en) * | 2012-01-24 | 2013-08-01 | 国立大学法人筑波大学 | Triblock copolymer and use thereof |
| JPWO2013111801A1 (en) * | 2012-01-24 | 2015-05-11 | 国立大学法人 筑波大学 | Triblock copolymer and use thereof |
| WO2013118783A1 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | 国立大学法人筑波大学 | Organic-inorganic hybrid complex of high-molecular-weight nitroxide compound and inorganic particle |
| JPWO2013118783A1 (en) * | 2012-02-07 | 2015-05-11 | 国立大学法人 筑波大学 | Organic-inorganic hybrid composite of polymerized nitroxide compound and inorganic particles |
| EP2813546A4 (en) * | 2012-02-07 | 2015-09-16 | Univ Tsukuba | Organic-inorganic hybrid complex of high-molecular-weight nitroxide compound and inorganic particle |
| US9333265B2 (en) | 2012-02-07 | 2016-05-10 | University Of Tsukuba | Organic-inorganic hybrid composite of polymerized nitroxide compound and inorganic particles |
| WO2013177599A1 (en) * | 2012-05-22 | 2013-11-28 | Lunar Pharmaceuticals (Pty) Ltd | Nutricosmetic composition |
| WO2014021637A1 (en) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Composition comprising rebamipide as active ingredient for preventing or treating hyperlipemia and diseases associated therewith |
| CN104768551A (en) * | 2012-07-31 | 2015-07-08 | 天主教大学产学协力团 | Composition comprising rebamipide as active ingredient for preventing or treating hyperlipemia and diseases associated therewith |
| JP2015525779A (en) * | 2012-07-31 | 2015-09-07 | ザ カトリック ユニバーシティ オブ コリア インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション | Composition for preventing or treating hyperlipidemia and related diseases comprising rebamipide as an active ingredient |
| JPWO2014199982A1 (en) * | 2013-06-11 | 2017-02-23 | 国立大学法人 筑波大学 | Composition comprising polycationic triblock copolymer, polyanionic polymer and bioactive peptide |
| US9918935B2 (en) | 2013-06-11 | 2018-03-20 | University Of Tsukuba, A Japanese National University | Composition containing polycationic triblock copolymer, polyanionic polymer and physiologically active peptide |
| WO2014199982A1 (en) * | 2013-06-11 | 2014-12-18 | 国立大学法人筑波大学 | Composition including polycationic triblock copolymer, polyanionic polymer, and biologically active peptide |
| JP2016117818A (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-30 | 昭和電工株式会社 | Fullerene composition, resin additive and resin composition |
| JP2017088531A (en) * | 2015-11-07 | 2017-05-25 | 国立大学法人 筑波大学 | Preparation for treating skin damage comprising polymerized cyclic nitroxide radical |
| JPWO2017094691A1 (en) * | 2015-11-30 | 2018-09-13 | 国立大学法人 筑波大学 | Nitroxy radical-containing copolymer having phosphate residues and use thereof |
| WO2017094691A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | 国立大学法人筑波大学 | Nitroxy-radical-containing copolymer having phosphate residue, and use thereof |
| US10398803B2 (en) | 2015-11-30 | 2019-09-03 | University Of Tsukuba | Nitroxylradical-containing copolymer which has phosphoric acid residue, and the use of the same |
| JP2018057300A (en) * | 2016-10-04 | 2018-04-12 | 小川香料株式会社 | Flavor degradation inhibitor for beer taste beverage, and flavor degradation inhibiting method |
| JP2021112209A (en) * | 2016-10-04 | 2021-08-05 | 小川香料株式会社 | Flavor degradation inhibitor for beer taste beverage, and flavor degradation inhibiting method |
| JP7212715B2 (en) | 2016-10-04 | 2023-01-25 | 小川香料株式会社 | Flavor Deterioration Inhibitor for Beer-Taste Beverage and Method for Suppressing Flavor Deterioration |
| JP2019001786A (en) * | 2017-06-19 | 2019-01-10 | 国立大学法人 筑波大学 | Therapeutic drug for infectious disease |
| JP7116428B2 (en) | 2017-06-19 | 2022-08-10 | 国立大学法人 筑波大学 | Infectious disease drug |
| CN112494488A (en) * | 2020-06-17 | 2021-03-16 | 中国药科大学 | Application of rebamipide in preventing alopecia and growing hair |
| CN112494488B (en) * | 2020-06-17 | 2022-01-18 | 中国药科大学 | Application of rebamipide in preventing alopecia and growing hair |
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