JP2011178728A - Ampk activator, glut4 activator and pharmaceutical drug and food and drink using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性型プロテインキナーゼ[AMP-activated protein kinase]）活性化剤、ＧＬＵＴ４（インスリン依存性糖輸送担体[glucose transporter 4] ）活性化剤、およびそれらを用いた医薬品・飲食品に関するものである。 The present invention relates to an AMPK (adenosine monophosphate activated protein kinase) activator, a GLUT4 (insulin-dependent sugar transporter 4) activator, and a pharmaceutical using the same.・ It relates to food and drink.
肥満の予防および治療は、健康の維持・増進において非常に重要な課題である。肥満は、２型糖尿病、高血圧症、高脂血症等を引き起こす。さらにこれらの疾病は、脳卒中や虚血性心疾患等の基礎疾患でもある。現在、これらの疾病は、肥満によって引き起こされるインスリン抵抗性を基盤とする、一連の代謝異常状態と解されている。近年の分子生物学的研究により、肥満・インスリン抵抗性に関与する様々な因子の存在が明らかになりつつある。
The prevention and treatment of obesity is a very important issue in maintaining and improving health. Obesity causes
生体内の糖・脂質代謝に大きく関与する脂肪細胞には、主にＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４といった輸送担体（glucose transporter ：ＧＬＵＴ）が発現している。その中でも、特にＧＬＵＴ４は、脂肪細胞の膜上におけるグルコースの取込み活性における主要な役割を果たしていることが知られている。ＧＬＵＴ４は、インスリン感受型ＧＬＵＴと呼ばれ、通常は脂肪細胞及び筋肉細胞における細胞内小胞に存在し、インスリンの刺激を受けると、細胞膜上に移行（トランスロケーション）し、グルコースを取り込める状態とする。ＧＬＵＴ４のトランスロケーションは、インスリンが受容体に結合し、受容体のβサブユニットが自己リン酸化することが情報伝達の開始となり、その後インスリン受容体基質（ＩＲＳ）のリン酸化、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化、Akt ／Protein Kinase Bの活性化（およびプロテインキナーゼＣの活性化）という経路を介して細胞内の小胞体から細胞膜へのエキソサイトーシスにより、移行が完了する（特許文献１参照）。
A transport cell (glucose transporter: GLUT) such as GLUT1 and GLUT4 is mainly expressed in adipocytes that are greatly involved in sugar and lipid metabolism in vivo. Among them, it is known that GLUT4 particularly plays a major role in glucose uptake activity on the membrane of adipocytes. GLUT4 is called insulin-sensitive GLUT and is usually present in intracellular vesicles in adipocytes and muscle cells. When stimulated by insulin, GLUT4 moves to the cell membrane (translocation) and makes glucose available. . The translocation of GLUT4 is triggered by the binding of insulin to the receptor and the phosphorylation of the β subunit of the receptor, followed by phosphorylation of the insulin receptor substrate (IRS),
しかし、内臓脂肪細胞に蓄積された中性脂肪が分解されて放出される遊離脂肪酸や、内臓脂肪細胞から分泌されるＴＮＦ−αによる、ＰＩ３−キナーゼ活性の抑制が生じると、ＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行が抑制され、上記のようなインスリンによるグルコース代謝に異常が生じ、糖尿病を発症するおそれがある。糖尿病患者数は、肥満の増加を反映して増える傾向にある。そして、糖尿病は、いったん発症するとなかなか完治しづらいばかりか、合併症を発症させるおそれもある。具体的には、プロテインキナーゼＣ等の酵素の働きが異常に亢進して細胞機能が低下したり、高血糖の持続により酵素などの蛋白質にグルコースが化学結合して酵素機能が低下したり、高血糖による代謝障害のためにソルビトール（糖アルコール）が細胞内に蓄積して細胞障害を起こし、それにより、細小血管の細胞や血液細胞に異常が生じ、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害といった合併症を発症する。 However, when the suppression of PI3-kinase activity by free fatty acids released by breaking down neutral fat accumulated in visceral fat cells and TNF-α secreted from visceral fat cells, the cell membrane surface of GLUT4 is released. The above-mentioned transition is suppressed, glucose metabolism by insulin as described above is abnormal, and there is a risk of developing diabetes. The number of diabetic patients tends to increase reflecting an increase in obesity. Diabetes is difficult to cure once it develops, and it may cause complications. Specifically, the function of an enzyme such as protein kinase C is abnormally enhanced and cell function is decreased, or glucose is chemically bound to a protein such as enzyme due to the persistence of hyperglycemia, and the enzyme function is decreased. Sorbitol (sugar alcohol) accumulates in cells due to metabolic disorders due to blood sugar, causing cell damage, resulting in abnormalities in small blood vessel cells and blood cells, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetes Develop complications such as neuropathy.
一方、インスリンによらないグルコース代謝方法として、筋肉や肝臓にあるＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性型プロテインキナーゼ[AMP-activated protein kinase]）を活性化させる方法がある。ＡＭＰＫは、細胞での糖や脂質代謝の流れを調節する酵素であり、ＧＬＵＴ４を細胞表面に移行させて、筋肉がエネルギーを作るためのグルコースを取り込ませたり、脂肪を燃焼させたりする働きがある。 On the other hand, as a glucose metabolism method not using insulin, there is a method of activating AMPK (adenosine monophosphate activated protein kinase) in muscle or liver. AMPK is an enzyme that regulates the flow of sugar and lipid metabolism in the cell, and moves GLUT4 to the cell surface, and has the function of taking up glucose for muscles to make energy and burning fat. .
しかし、上記のようにＡＭＰＫを活性化させるには、運動による筋収縮が必要である。そこで、近年、薬剤投与によりＡＭＰＫを活性化させ、それによる「運動疑似効果」を通じて、糖代謝や高脂血症を改善し抗動脈硬化作用を発揮させる手法が検討されている。このような薬剤としては、例えば、メトホルミン（ビグアナイド薬）、チアゾリジン誘導体等が有用であることが知られている。 However, in order to activate AMPK as described above, muscle contraction due to exercise is required. Therefore, in recent years, a technique for activating AMPK by drug administration and improving glucose metabolism and hyperlipidemia and exerting an anti-arteriosclerotic effect through the “exercise mimic effect” has been studied. As such drugs, for example, metformin (biguanide drug), thiazolidine derivatives and the like are known to be useful.
ところが、これらの薬剤は、副作用を伴うものも多く、そのため、日常的な飲食品に含有させることが好ましいものは少ないのが実情である。そのようななか、近年、葡萄の葉又はその抽出物を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献２）、ローズマリーやセージの抽出物を含有するＡＭＰＫ活性化剤（特許文献３）、グレープフルーツ由来のヌートカトンを含有するＡＭＰＫ活性化剤（特許文献４）といったものも提案されており、食品として従来から用いられている植物を由来とするものであることから、日常的な飲食品への適用においても安全性が高いと考えられる（特許文献２〜４参照）。
However, many of these drugs have side effects, and therefore there are few drugs that are preferably contained in daily foods and drinks. Among them, in recent years, an AMPK activator comprising a bamboo leaf or an extract thereof as an active ingredient (Patent Document 2), an AMPK activator containing an extract of rosemary or sage (Patent Document 3), derived from grapefruit An AMPK activator containing nootkaton (Patent Document 4) has also been proposed, and since it is derived from a plant conventionally used as a food, in application to daily foods and drinks Are considered to be highly safe (see
しかしながら、従来からある植物由来のＡＭＰＫ活性化剤は、実際には、ＡＭＰＫ活性作用はあまり高くなく、化学薬品であるメトホルミン等の性能に比べると、かなり劣る。そのため、更なる研究による活性能の向上が期待されている。 However, a conventional plant-derived AMPK activator does not actually have a very high AMPK activity, and is considerably inferior to the performance of a chemical such as metformin. Therefore, the improvement of activity ability is expected by further research.
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果が得られる薬剤、およびこれら各効果に伴う糖尿病・肥満等の改善効果等が期待できる医薬品・飲食品の提供をその目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and is an agent that is gentle to the human body and produces AMPK activity effect and GLUT4 activity effect without causing side effects, and improvement effects such as diabetes and obesity associated with these effects. The purpose is to provide medicines and foods that can be expected.
上記の目的を達成するために、本発明は、下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有するＡＭＰＫ活性化剤を第１の要旨とする。
また、本発明は、下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有するＧＬＵＴ４活性化剤を第２の要旨とする。
また、本発明は、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤のいずれか一つの医薬品であって、上記第１の要旨の薬剤や第２の要旨の薬剤を含有する医薬品を第３の要旨とする。 The present invention is also a pharmaceutical product of any one of an anti-diabetic agent, an anti-obesity agent, a visceral accumulated fat reducing agent, and a visceral fat accumulation inhibiting agent, wherein the drug of the first aspect and the drug of the second aspect The third gist is a pharmaceutical product containing.
また、本発明は、上記第１〜第３の要旨の薬剤を含有する飲食品を第４の要旨とする。 Moreover, this invention makes the 4th summary the food / beverage products containing the chemical | medical agent of the said 1st-3rd summary.
すなわち、本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた。その研究の過程で、各種の生理作用が報告されているプロアントシアニジンに着目した。プロアントシアニジンは、エピカテキン（またはエピガロカテキン）の重合体であり、２量体，３量体，４量体，５量体等の多重合体が存在し、さらに、これらには、結合位置の違うものや、各種の立体異性体も存在する。そして、これらは、それぞれ生理作用も異なるものである。本発明者らは、このようなプロアントシアニジンに関する研究を更に進めた。その結果、ＡＭＰＫの活性効果，ＧＬＵＴ４の活性効果において、上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として用いたとき、有利な効果が認められることを、実験により新たに突き止めた。なお、ＧＬＵＴ４の活性化は、ＡＭＰＫの活性化によりなされる以外にも、インスリン情報伝達経路の全部または一部によりなされる場合も含まれる。また、これらの作用効果を発揮すると、それに関連し、特に、肥満・糖尿病等の改善効果等も得られることから、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途にも適用することができることを見いだした。さらに、上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンは、副作用を生じることがないことから、安全性が高く、日常的な飲食品に含有させるのに好適なものとなり得ることから、所期の目的が達成できることを見いだし、本発明に到達した。 That is, the present inventors have intensively studied to solve the above problems. In the course of the research, we focused on proanthocyanidins, which have been reported to have various physiological effects. Proanthocyanidins are polymers of epicatechin (or epigallocatechin), and there are polymers such as dimers, trimers, tetramers, pentamers, and the like. There are different and various stereoisomers. These have different physiological effects. The inventors further advanced research on such proanthocyanidins. As a result, it was newly found by experiments that an advantageous effect was observed when proanthocyanidins represented by the above general formula (1) were used as active ingredients in the activity effects of AMPK and GLUT4. In addition, the activation of GLUT4 includes not only the activation of AMPK but also the case where it is performed by all or part of the insulin information transmission pathway. In addition, when these effects are exerted, in particular, an improvement effect such as obesity / diabetes can be obtained, and therefore anti-diabetic agents, anti-obesity agents, visceral accumulated fat reducing agents, visceral fat accumulation inhibiting agents It was found that it can also be applied to the use of pharmaceuticals such as Furthermore, since the proanthocyanidins represented by the above general formula (1) do not cause side effects, the proanthocyanidins have high safety and can be suitable for inclusion in daily foods and drinks. The present invention has been achieved by finding that the above-described object can be achieved.
以上のように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、上記一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用を有するものである。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、上記一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＧＬＵＴ４活性作用を有するものである。これらの薬剤は、それぞれの用途においてその作用が有為に発揮できるよう、その作用を阻害する物質の不含化等が考慮されたものであり、また、それぞれの用途においてその作用が充分に発揮できるよう、有効成分であるプロアントシアニジンの含有割合等が規定されたものである。これにより、上記薬剤は、それぞれ、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果，およびこれに関連する各種疾病等の予防・改善効果を発揮することができる。 As described above, the AMPK activator of the present invention contains proanthocyanidins having a specific structure represented by the general formula (1) as an active ingredient and has an AMPK activity. The GLUT4 activator of the present invention also contains proanthocyanidins having a specific structure represented by the general formula (1) as an active ingredient and has a GLUT4 activity. These drugs are considered to be free of substances that inhibit their action, etc., so that their actions can be demonstrated effectively in their respective applications. The content ratio of proanthocyanidins, which are active ingredients, is defined so as to be able to. Thus, each of the above-mentioned drugs is gentle to the human body without causing side effects, and can exhibit the effects of preventing and improving AMPK activity effect, GLUT4 activity effect, and various diseases related thereto.
特に、上記各作用効果を良好に発揮することができると、肥満，糖尿病等の改善効果等に優れた効果を発揮することができる。したがって、上記薬剤は、特に、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途に有利に適用することができる。 In particular, if each of the above effects can be exhibited well, excellent effects such as obesity and diabetes can be exhibited. Therefore, the above drugs can be advantageously applied to pharmaceutical uses such as antidiabetic agents, antiobesity agents, visceral fat accumulation reducing agents, visceral fat accumulation inhibitors.
そして、上記特定構造のプロアントシアニジンを有効成分する上記薬剤を含有する飲食品とする場合、このものを通常の飲食品と同様に継続して飲食することにより、ＡＭＰＫ活性効果、ＧＬＵＴ４活性効果、およびそれに伴う肥満・糖尿病等の改善効果等が得られるようになる。 And when setting it as the food / beverage products containing the said chemical | medical agent which contains the proanthocyanidins of the said specific structure as an active ingredient, by continually eating / drinking this like a normal food / beverage product, AMPK activity effect, GLUT4 activity effect, and As a result, the effect of improving obesity, diabetes and the like can be obtained.
つぎに、本発明の実施の形態を詳しく説明する。 Next, embodiments of the present invention will be described in detail.
先に述べたように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、下記の一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用を有するものである。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、下記の一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＧＬＵＴ４活性作用を有するものである。これらの薬剤は、それぞれの用途においてその作用が有為に発揮できるよう、その作用を阻害する物質の不含化等が考慮されたものであり、また、それぞれの用途においてその作用が充分に発揮できるよう、有効成分であるプロアントシアニジンの含有割合等が規定されたものである。 As described above, the AMPK activator of the present invention contains proanthocyanidins having a specific structure represented by the following general formula (1) as an active ingredient and has an AMPK activity. The GLUT4 activator of the present invention also contains proanthocyanidins having a specific structure represented by the following general formula (1) as an active ingredient and has a GLUT4 activity. These drugs are considered to be free of substances that inhibit their action, etc., so that their actions can be demonstrated effectively in their respective applications. The content ratio of proanthocyanidins, which are active ingredients, is defined so as to be able to.
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンのなかでも、特に、下記の一般式（１’）で表される特定構造のプロアントシアニジン（プロシアニジン）を有効成分として含有すると、他のプロアントシアニジンに比べ、極めて高いＡＭＰＫ活性効果、ＧＬＵＴ４活性効果が得られるようになるため、好ましい。 Among the proanthocyanidins represented by the above general formula (1), in particular, when proanthocyanidins (procyanidins) having a specific structure represented by the following general formula (1 ′) are contained as active ingredients, other proanthocyanidins In comparison, an extremely high AMPK activity effect and GLUT4 activity effect can be obtained, which is preferable.
そして、上記一般式（１’）において、ｎは、好ましくは、１，２または３であり、より好ましくは、１または２である。ｎ＝１のとき、上記一般式（１’）は、下記の化学式（２）で表されるプロシアニジンＣ１を示す。また、ｎ＝２のとき、上記一般式（１’）は、下記の化学式（３）で表されるシナムタンニンＡ２を示す。 In the general formula (1 ′), n is preferably 1, 2 or 3, more preferably 1 or 2. When n = 1, the general formula (1 ′) represents procyanidin C1 represented by the following chemical formula (2). Further, when n = 2, the general formula (1 ′) represents synamtannin A2 represented by the following chemical formula (3).
そして、上記のプロアントシアニジンは、自然界に存在する生物が保有または産生する組成物の中から精製し抽出したものであっても、エピカテキンやカテキンの重合促進等を行うことにより化学的に合成することによって調製したものであって、微生物などを利用する生物学的方法により得たものであってもよい。 The proanthocyanidins described above are chemically synthesized by promoting the polymerization of epicatechin or catechin even if they are purified and extracted from compositions possessed or produced by living organisms that exist in nature. It may be prepared by a biological method using microorganisms or the like.
上記特定構造のプロアントシアニジンは、植物では、黒大豆種皮、リンゴ、カカオ、ブドウ、シナモン、ムタンバ、サンザシ、ブニノキ、ゴレンシ、マザーワート、ケクロピア、コーラ（コーラナッツ）、茶等に多く含まれる。これらの植物に対する上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出方法としては、例えば、抽出溶媒に上記植物を浸漬することにより行われる。上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出溶媒としては、例えば、水や、メタノール, エタノール, イソプロパノール, ｎ−プロパノール, アセトン等の水溶性溶媒が用いられるが、特に、黒大豆種皮を原料とする場合、黒大豆種皮には１〜３０量体程度の各種プロアントシアニジンが含まれることから、高濃度の低級アルコールやアセトンで抽出すると、高重合度のプロアントシアニジンが混入してしまう。したがって、この場合、水や０．１〜３０％の含水エタノールが、所望のプロアントシアニジンを高純度で抽出することができるものとして好適に用いられる。また、上記抽出溶媒による抽出温度は、７０℃以下であることが、純度および安定性の点から好ましい。 In plants, proanthocyanidins having the above specific structure are often contained in black soybean seed coat, apple, cacao, grape, cinnamon, mutamba, hawthorn, bunoki, carambola, mother wort, keclopia, cola (cola nut), tea and the like. As a method for extracting proanthocyanidins having the specific structure from these plants, for example, the plant is immersed in an extraction solvent. As the extraction solvent for proanthocyanidins having the above specific structure, for example, water or a water-soluble solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, and acetone is used. Since soybean seed coat contains various proanthocyanidins of about 1 to 30 mer, extraction with a high concentration of lower alcohol or acetone results in mixing of proanthocyanidins with a high degree of polymerization. Therefore, in this case, water and 0.1 to 30% hydrous ethanol are suitably used as those capable of extracting the desired proanthocyanidins with high purity. Moreover, it is preferable from the point of purity and stability that the extraction temperature by the said extraction solvent is 70 degrees C or less.
そして、このようにして得られた抽出液から、所望のプロアントシアニジンを高純度で含有する画分を、吸着処理，樹脂精製処理，ゲル濾過処理，イオン交換処理，膜分離処理，塩析出処理等により抽出し、それを、乾燥、濃縮することにより、目的とするプロアントシアニジンを得ることができる。 From the extract thus obtained, a fraction containing the desired proanthocyanidins with high purity is subjected to adsorption treatment, resin purification treatment, gel filtration treatment, ion exchange treatment, membrane separation treatment, salt precipitation treatment, etc. The desired proanthocyanidins can be obtained by extraction with the above, followed by drying and concentration.
本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、そのＡＭＰＫ活性作用の有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジン含量が０．０１〜１００重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１００重量％の範囲である。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤は、そのＧＬＵＴ４活性作用の有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジン含量が０．０１〜１００重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１００重量％の範囲である。 The AMPK activator of the present invention preferably has a proanthocyanidin content of the specific structure in the range of 0.01 to 100% by weight, more preferably 1 from the viewpoint of the effectiveness of its AMPK activity. It is in the range of ˜100% by weight. In addition, the GLUT4 activator of the present invention preferably has a proanthocyanidin content of the specific structure in the range of 0.01 to 100% by weight, more preferably from the viewpoint of the effectiveness of the GLUT4 activity. 1 to 100% by weight.
さらに、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、その有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量が１〜２０００ｍｇの範囲になるよう、その分量を設定することが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍｇの範囲である。本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、その有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量が１〜２０００ｍｇの範囲になるよう、その分量を設定することが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍｇの範囲である。 Furthermore, the amount of the AMPK activator of the present invention is preferably set so that the daily intake of proanthocyanidins having the specific structure is in the range of 1 to 2000 mg, from the viewpoint of effectiveness. Preferably it is the range of 10-1000 mg. From the viewpoint of effectiveness, the GLUT4 activator of the present invention is preferably set in an amount so that the daily intake of proanthocyanidins having the specific structure is in the range of 1 to 2000 mg, more preferably The range is 10 to 1000 mg.
また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤およびＧＬＵＴ４活性化剤には、前記特定構造のプロアントシアニジンとともに、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）を含有することにより、そのＡＭＰＫ活性効果およびＧＬＵＴ４活性効果をさらに向上させることができるため好ましい。なお、Ｃ３Ｇは、アントシアニンの一種であり、上記特定構造のプロアントシアニジンを抽出した各種植物にも多く含まれる物質である。そして、Ｃ３Ｇの抽出方法は、上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出方法（分離精製方法）に準じる。 Further, the AMPK activator and GLUT4 activator of the present invention contain cyanidin-3-glucoside (C3G) together with the proanthocyanidin having the specific structure, thereby further improving the AMPK activity effect and the GLUT4 activity effect. It is preferable because it can be used. Note that C3G is a kind of anthocyanin, and is a substance contained in a large amount in various plants from which proanthocyanidins having the specific structure are extracted. And the extraction method of C3G is based on the extraction method (separation and purification method) of proanthocyanidins having the specific structure.
本発明のＡＭＰＫ活性化剤におけるＣ３Ｇ含量は、その有効性の観点から、０．１〜４０重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１０重量％の範囲である。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤におけるＣ３Ｇ含量は、その有効性の観点から、０．１〜４０重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１０重量％の範囲である。 From the viewpoint of effectiveness, the C3G content in the AMPK activator of the present invention is preferably in the range of 0.1 to 40% by weight, more preferably in the range of 1 to 10% by weight. The C3G content in the GLUT4 activator of the present invention is preferably in the range of 0.1 to 40% by weight, more preferably in the range of 1 to 10% by weight, from the viewpoint of its effectiveness. is there.
なお、本発明のＡＭＰＫ活性化剤およびＧＬＵＴ４活性化剤は、それらの作用効果を良好に発揮することにより、肥満・糖尿病等の予防・改善効果に優れた効果を発揮することができるため、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途に適用する場合も、上記特定構造のプロアントシアニジンの含量および上記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量は、上記各薬剤に規定された割合に準じる。 In addition, since the AMPK activator and GLUT4 activator of the present invention can exert an excellent effect of preventing and improving obesity, diabetes and the like by exhibiting their action and effects well, Even when applied to pharmaceutical applications such as diabetics, anti-obesity agents, visceral fat accumulation reducing agents, visceral fat accumulation inhibitors, the content of proanthocyanidins with the above specific structure and the daily intake of proanthocyanidins with the above specific structure Corresponds to the ratio prescribed for each of the above drugs.
また、本発明の上記各薬剤においては、先のプロアントシアニジン抽出物をそのまま直接使用してもよいが、一般的には、上記抽出物を、適当な液状担体に溶解あるいは分散させたり、適当な粉末担体に混合させたものを使用する。 In addition, in the respective drugs of the present invention, the above proanthocyanidin extract may be directly used as it is. However, in general, the extract is dissolved or dispersed in a suitable liquid carrier, What was mixed with the powder carrier is used.
薬理学的に許容される担体としては、例えば、固形製剤における賦形剤，滑沢剤，結合剤および崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤，溶解補助剤，懸濁化剤，等張化剤，緩衝剤および無痛化剤等があげられる。 Examples of pharmacologically acceptable carriers include excipients, lubricants, binders and disintegrants in solid preparations, or solvents, solubilizers, suspending agents, and isotonic agents in liquid preparations. , Buffering agents and soothing agents.
また、本発明の薬剤は、その製剤化の際に、通常製剤化に用いられる各種の成分が任意に使用されるが、その例としては、例えば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等があげられる。 In addition, in the preparation of the drug of the present invention, various components usually used for the preparation are arbitrarily used in the preparation. Examples thereof include starch, dextrin, lactose, corn starch, inorganic salts, and the like. Can be given.
本発明の薬剤の剤型としては、例えば、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等があげられる。 Examples of the dosage form of the drug of the present invention include ampoules, tablets, capsules, granules, fine granules, powders, infusions, and drinks.
さらに、本発明の薬剤は、それを飲食品に関与させた形態としても提供することができる。上記飲食品としては、例えば、健康食品（タブレット、粉末、顆粒、濃縮液体）、清涼飲料、特定保健用食品、ドリンク、お茶、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、ワイン、焼酎、日本酒、ドレッシング、煮豆、豆腐、納豆、豆乳、煎り豆、乾燥豆、味噌等があげられる。そして、これらの飲食品を、通常の飲食品と同様に継続して飲食することにより、肥満抑制効果が得られるようになる。 Furthermore, the chemical | medical agent of this invention can be provided also as a form which made it relate to food-drinks. Examples of the foods and drinks include health foods (tablets, powders, granules, concentrated liquids), soft drinks, foods for specified health use, drinks, tea, milk, pudding, jelly, rice cake, gum, yogurt, chocolate, soup, cookies , Snacks, wine, shochu, sake, dressing, boiled beans, tofu, natto, soy milk, roasted beans, dried beans, miso, etc. And the obesity suppression effect comes to be obtained by eating and drinking these food and drink similarly to normal food and drink.
本発明の薬剤は、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果，およびこれに関連する各種疾病（特に、肥満や糖尿病）等の予防・改善効果を発揮することができる。また、ヒトのみでなく、ペットや家畜等の動物においても上記効果が得られるものであり、その投与量は、投与対象とする生物の違い、投与される者の性別、体重、年齢等の条件に応じて適宜設定される。そして、上記のように、本発明の薬剤は、ペットや家畜等の動物においても肥満抑制効果等が得られるものであることから、ペットフードや飼料に関与させた形態としても提供することもできる。 The drug of the present invention is gentle to the human body without causing side effects, and can exhibit the effect of preventing / ameliorating AMPK activity effect, GLUT4 activity effect, and various diseases (particularly obesity and diabetes) related thereto. . Moreover, the above-mentioned effects can be obtained not only in humans but also in animals such as pets and livestock, and the dose is determined based on conditions such as differences in organisms to be administered, sex of persons to be administered, weight, age, etc. It is set appropriately according to And as above-mentioned, since the chemical | medical agent of this invention can obtain the obesity suppression effect etc. also in animals, such as a pet and livestock, it can also provide as a form related to pet food and feed. .
つぎに、実施例について説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Next, examples will be described. However, the present invention is not limited to these examples.
〔Ｌ６骨格筋細胞におけるプロアントシアニジンの活性実験〕
＜試験用のＬ６骨格筋細胞の作製＞
Ｌ６筋芽細胞の濃度が２×１０4 ／ｍＬになるようにＭＥＭ培地〔１０％ｖ／ｖ牛胎児血清（ＦＢＳ）含有〕で調製して得られたＬ６筋芽細胞懸濁液を、２４穴組織培養プレートに１穴当たり５００μＬ播種し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記細胞を２日間培養した。上記細胞がコンフルエントになった後、培地をＭＥＭ培地（２％ｖ／ｖＦＢＳ含有）に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記細胞を５日間培養することにより、Ｌ６骨格筋細胞を作製した。そして、さらに培地をＭＥＭ培地〔０．２％ｗ／ｖ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有〕に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記Ｌ６骨格筋細胞を１８時間培養し、この細胞を、実施例１における後記の糖取り込み測定等に用いた。一方、Ｌ６筋芽細胞の濃度が３×１０4 ／ｍＬとなるようにＭＥＭ培地（１０％ｖ／ｖＦＢＳ含有）で調製して得られたＬ６筋芽細胞懸濁液を、６０ｍｍ培養皿に１枚当たり４ｍＬ播種し、上記と同様の条件で骨格筋細胞を作製した後、培地をＭＥＭ培地〔０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有〕に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記Ｌ６骨格筋細胞を１８時間培養し、この細胞を、実施例１における後記のウェスタンブロット解析に用いた。
[Experimental activity of proanthocyanidins in L6 skeletal muscle cells]
<Preparation of L6 skeletal muscle cells for testing>
An L6 myoblast suspension obtained by preparing in MEM medium (containing 10% v / v fetal bovine serum (FBS)) so that the concentration of L6 myoblasts is 2 × 10 4 / mL is 24 500 μL per well was seeded in a well tissue culture plate, and the cells were cultured for 2 days in a 37 ° C. 5% carbon dioxide incubator. After the cells became confluent, the medium was changed to MEM medium (containing 2% v / v FBS), and the cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 5 days. Produced. Further, the medium was changed to a MEM medium (containing 0.2% w / v bovine serum albumin (BSA)), and the L6 skeletal muscle cells were cultured for 18 hours in a 37% 5% carbon dioxide incubator. Was used for the sugar uptake measurement and the like described later in Example 1. On the other hand, the L6 myoblast suspension obtained by preparing in MEM medium (containing 10% v / v FBS) so that the concentration of L6 myoblasts is 3 × 10 4 / mL is placed in a 60 mm culture dish. After seeding 4 mL per plate and preparing skeletal muscle cells under the same conditions as described above, the medium was changed to MEM medium (containing 0.2% w / v BSA), and the above L6 in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. Skeletal muscle cells were cultured for 18 hours, and the cells were used for the Western blot analysis described later in Example 1.
＜プロアントシアニジン（ＰＡ）の調製＞
黒大豆種皮抽出物（製品名：クロノケア、フジッコ社製）を４５％メタノール水溶液に溶解し、セファデックスＬＨ−２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体としたゲル濾過カラムに通してプロシアニジンを吸着させ、１．２倍カラム容量の４５％メタノール水溶液、１．２倍カラム容量の５５％メタノール水溶液の順に洗浄した。その後、２倍カラム容量の７０％アセトン水溶液を通液、回収、濃縮乾層することによりプロシアニジン粗画分を得た。この粗画分は、酢酸メチル/アセトン＝８０/２０（ｖ/ｖ）溶液に溶解し、濾過操作により沈殿を除去し、再度濃縮乾燥することによりプロシアニジン精製物を得た。本プロシアニジン精製物を４５％メタノールに溶解し、再度セファデックスＬＨ−２０カラムに供し、メタノール濃度４５％から７５％までの濃度勾配によりプロシアニジン２、３及び４量体の各粗画分を分離した。この各粗画分を、逆層液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ-Ｃ１８、液層：０．１％ギ酸水溶液とアセトニトリル、アセトニトリルの比率が５％〜２０％までの濃度勾配）により２、３及び、４量体プロシアニジンの各画分を分離、濃縮乾固することにより、下記一般式（４）においてｎ＝０で表されるプロシアニジンの２量体（プロシアニジンＢ２）、下記一般式（４）においてｎ＝１で表されるプロシアニジンの３量体（プロシアニジンＣ１）、および、下記一般式（４）においてｎ＝２で表されるプロシアニジンの４量体（シナムタンニンＡ２）を分離精製した。
<Preparation of proanthocyanidins (PA)>
Black soybean seed coat extract (product name: Chronocare, manufactured by Fujicco Co., Ltd.) is dissolved in 45% aqueous methanol solution, and procyanidins are passed through a gel filtration column using Sephadex LH-20 (GE Healthcare Biosciences) as a carrier. The sample was adsorbed and washed sequentially with a 1.2-fold column volume of 45% aqueous methanol solution and a 1.2-fold column volume of 55% methanol aqueous solution. Thereafter, a crude procyanidin fraction was obtained by passing, collecting, and concentrating and drying a 70% aqueous acetone solution having a double column volume. This crude fraction was dissolved in a methyl acetate / acetone = 80/20 (v / v) solution, the precipitate was removed by filtration, and concentrated and dried again to obtain a purified procyanidin product. The purified product of procyanidin was dissolved in 45% methanol and again applied to a Sephadex LH-20 column, and each crude fraction of
＜Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み促進作用の確認試験＞
先に準備した、プロアントシアニジンの２量体であるプロシアニジンＢ２（ＰＡ２）、３量体であるプロシアニジンＣ１（ＰＡ３）、４量体であるシナムタンニンＡ２（ＰＡ４）を、それぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、これを用いて、３０μＭのプロアントシアニジン（ＰＡ）を含有するKrebs-Ringer-Hepes（ＫＲＨ）緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ4 ）を調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞が入った２４穴組織培養プレートに、これらの調製緩衝液を１穴当たり３００μＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。また、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有する緩衝液を調製し、それを陰性対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。また、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）を１００ｎＭ含有するＫＲＨ緩衝液を調製し、それを陽性対照として用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。
<Confirmation test for promoting glucose uptake in L6 skeletal muscle cells>
The previously prepared procyanidin B2 (PA2), which is a dimer of proanthocyanidins, and procyanidin C1 (PA3), which is a trimer, and synamtannin A2 (PA4), which is a tetramer, are respectively dimethyl sulfoxide (DMSO). This was used to dissolve Krebs-Ringer-Hepes (KRH) buffer (50 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.85 mM CaCl 2 ) containing 30 μM proanthocyanidins (PA). , 1.3 mM MgSO 4 ). Then, 300 μL of these preparation buffers were added per well to the 24-well tissue culture plate containing L6 skeletal muscle cells prepared in advance, and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 15 minutes. In addition, a buffer containing 0.1% v / v DMSO was prepared and used as a negative control, and L6 skeletal muscle cells were cultured in the same manner as described above. In addition, a KRH buffer containing 100 nM of insulin (Insulin) was prepared and used as a positive control, and L6 skeletal muscle cells were cultured in the same manner as described above.
その後、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、［ 3Ｈ］で標識された２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を、終濃度として６．５ｍＭ（１８．５μＣｉ）となるように添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で５分間、Ｌ６骨格筋細胞を培養した。このようにして培養したＬ６骨格筋細胞を、氷冷したＫＲＨで４回洗浄し、細胞内に取り込まれなかった２ＤＧを除去した。続いて、Ｌ６骨格筋細胞から完全にＫＲＨを取り除き、この細胞を０．０５Ｎ ＮａＯＨ２５０μＬで可溶化して、それをシンチレーションカクテルの入ったバイアルビンに回収した。さらに組織培養プレートの各ウェル（穴）を、ＫＲＨ２００μＬで２回洗浄して、この洗液も合わせてバイアルビンに回収した。このようにして回収して得られた液体を、液体シンチレーションシステムＬＳＣ−５０００シリーズ（アロカ社製) を用いて分析し、Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（糖取り込み活性）を測定した。なお、非特異的な取り込み量は、グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンＢを用いて、上記回収した液体を処理（２０μＭ サイトカラシンＢで１５分間処理）した後、上記と同様の方法で取り込み活性を測定し、その値を「非特異的な取り込み量」とした。 Thereafter, 2-deoxyglucose (2DG) labeled with [ 3 H] is added to the medium in each well (hole) of the tissue culture plate to a final concentration of 6.5 mM (18.5 μCi). Then, L6 skeletal muscle cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 5 minutes. The L6 skeletal muscle cells cultured in this way were washed 4 times with ice-cooled KRH to remove 2DG that was not taken up into the cells. Subsequently, KRH was completely removed from the L6 skeletal muscle cells, the cells were solubilized with 250 μL of 0.05N NaOH and collected in a vial containing a scintillation cocktail. Further, each well (hole) of the tissue culture plate was washed twice with 200 μL of KRH, and this washing solution was also collected and collected in a vial bottle. The liquid thus obtained was analyzed using a liquid scintillation system LSC-5000 series (manufactured by Aloka), and [ 3 H] labeled with 2DG incorporated into L6 skeletal muscle cells. Radioactivity (sugar uptake activity) was measured. The non-specific uptake amount was obtained by treating the collected liquid with cytochalasin B, which is an inhibitor of glucose transport (treatment with 20 μM cytochalasin B for 15 minutes), and then taking up in the same manner as described above. The activity was measured, and the value was defined as “non-specific uptake”.
＜Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み促進作用の確認試験結果＞
プロアントシアニジンによる糖取り込み促進活性（Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（見かけの糖取り込み活性）から、非特異的な取り込み量を引いた値（真の糖取り込み活性、図中では２ＤＧ uptakeと表示）の結果は、図１のグラフに示す通りである。図おいて、＊は、有意水準５％で有意差があったことを示しており、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに糖取り込み活性が認められたが、特に、ＰＡ３、ＰＡ４で有意に糖取り込み活性を促進していた。特に、ＰＡ４は、インスリンと同等の糖取り込み促進効果が認められた。なお、上記の手法に準じ、ＰＡ４の濃度依存的な糖取り込み促進効果も測定・評価した。その結果を図２のグラフに示す。図２より、ＰＡ４は濃度依存的に糖取り込みを促進し、１０μＭ以上で有意差が認められた。
<Results of confirmation test of glucose uptake promoting action in L6 skeletal muscle cells>
From proanthocyanidins by labeled in 2DG incorporated into glucose uptake promoting activity (L6 skeletal muscle intracellular of [3 H] radioactivity (apparent glucose uptake activity), minus the non-specific uptake (true The results of the sugar uptake activity of (indicated as 2DG uptake in the figure) are as shown in the graph of Fig. 1. In the figure, * indicates that there was a significant difference at a significance level of 5%, Although sugar uptake activity was observed in all of PA2, PA3, and PA4, sugar uptake activity was significantly promoted particularly in PA3 and PA4, and in particular, PA4 showed a sugar uptake promoting effect equivalent to that of insulin. The concentration-dependent sugar uptake promoting effect of PA4 was also measured and evaluated in accordance with the above method, and the results are shown in the graph of Fig. 2. From Fig. 2, PA4 promotes sugar uptake in a concentration-dependent manner, A significant difference was observed at 10 μM or more.
＜ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認試験＞
先に準備したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを用いて、１０μＭまたは３０μＭのＰＡを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）を調製した。また、対照として、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）、および、インスリン（１００ｎＭ）を含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）も調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞の培養皿にこれらの調製培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。その後、細胞を、ＫＲＨ緩衝液により培養皿１枚当たり１ｍＬで２回洗浄し、所定の方法（非特許文献である、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007 を参照）により細胞膜画分を調製した。このようにして得られた細胞膜画分のタンパク質量を測定し、その２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ブロッキング試薬であるBlocking one（ナカライテスク社製）でブロッキングした。ＰＶＤＦメンブレンをTris-buffered saline-Tween〔ＴＢＳＴ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０. １５Ｍ ＮａＣｌ、０. ０５％ Ｔｗｅｅｎ２０〕溶液（ＴＢＳＴ溶液）で数回洗浄した後、１次抗体として抗ＧＬＵＴ４抗体を、２次抗体としてhorseradish peroxidase標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を反応させた。メンブレン上の免疫複合体をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質（ロッシュ社製) と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させることにより、細胞膜移行したＧＬＵＴ４を検出した。
<Confirmation test of GLUT4 cell membrane migration>
The previously prepared PA2, PA3, and PA4 were each dissolved in DMSO and used to prepare MEM medium (containing 0.2% w / v BSA) containing 10 μM or 30 μM PA. As controls, MEM medium (containing 0.2% w / v BSA) containing 0.1% v / v DMSO and MEM medium (containing 0.2% w / v BSA) containing insulin (100 nM) are also included. Prepared. Then, 4 mL of each of these prepared media was added to the previously prepared culture dish of L6 skeletal muscle cells, and cultured for 15 minutes in a 37 ° C. 5% carbon dioxide incubator. Thereafter, the cells were washed twice with 1 mL per culture dish with KRH buffer (see non-patent literature, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007). Thus, a cell membrane fraction was prepared. The amount of protein in the cell membrane fraction thus obtained was measured, and 2 μg thereof was subjected to SDS-PAGE to separate the protein. The separated protein was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane and blocked with Blocking one (manufactured by Nacalai Tesque) as a blocking reagent. The PVDF membrane was washed several times with Tris-buffered saline-Tween [TBST: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20] solution (TBST solution), and then anti-antibody as a primary antibody. The GLUT4 antibody was reacted with a horseradish peroxidase-labeled anti-goat IgG antibody as a secondary antibody. The immune complex on the membrane was reacted with Lumi-Light Plus Western blotting substrate (Roche) and exposed to an X-ray film to detect GLUT4 that migrated to the cell membrane.
＜ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認試験結果＞
ＧＬＵＴ４の細胞膜移行をウェスタンブロット法により確認した結果は、図３に示す通りである。図３より、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の存在量を増加させる作用が認められたが、特に糖取り込み促進作用の高かったＰＡ３、ＰＡ４は、細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の存在量を増加させる作用も高いことを示した。また、３０μＭＰＡ４によるＧＬＵＴ４の存在量増加は、インスリンによるＧＬＵＴ４の存在量増加と同程度であった。このことから、特に、ＰＡ３、ＰＡ４は、ＧＬＵＴ４の活性化剤としての作用に優れていることがわかる。
<Results of confirming GLUT4 cell membrane migration>
The results of confirming GLUT4 cell membrane migration by Western blotting are as shown in FIG. FIG. 3 shows that PA2, PA3, and PA4 have an effect of increasing the abundance of GLUT4 in the cell membrane fraction, but PA3 and PA4, which have a particularly high sugar uptake promoting effect, have a GLUT4 abundance in the cell membrane fraction. The effect of increasing was also shown to be high. Further, the increase in the amount of GLUT4 present by 30 μMPA4 was similar to the increase in the amount of GLUT4 present by insulin. This indicates that PA3 and PA4 are particularly excellent in the action as an activator of GLUT4.
＜プロアントシアニジン（ＰＡ）の作用機構の確認試験＞
先に準備したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを用いて、１０μＭまたは３０μＭのＰＡを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）を調製した。また、対照として、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）、および、インスリン（１００ｎＭ）を含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）も調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞の培養皿にこれらの調製培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。その後、細胞を、ＫＲＨ緩衝液により培養皿１枚当たり１ｍＬで２回洗浄し、所定の方法（非特許文献である、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007 を参照）により全タンパク質画分を得た。得られた全タンパク質画分のタンパク質量を測定し、その２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Blocking oneでブロッキングした。ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ溶液で数回洗浄した後、１次抗体として抗ｐ−Ａｋｔ抗体、ｐ−ＡＭＰＫ抗体またはＡＭＰＫ抗体を、２次抗体としてhorseradish peroxidase標識した１次抗体に対応した抗体を反応させた。メンブレン上の免疫複合体をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させることにより、それぞれのタンパク質のリン酸化および発現量を検出した。
<Confirmation test of action mechanism of proanthocyanidins (PA)>
The previously prepared PA2, PA3, and PA4 were each dissolved in DMSO and used to prepare MEM medium (containing 0.2% w / v BSA) containing 10 μM or 30 μM PA. As controls, MEM medium (containing 0.2% w / v BSA) containing 0.1% v / v DMSO and MEM medium (containing 0.2% w / v BSA) containing insulin (100 nM) are also included. Prepared. Then, 4 mL of each of these prepared media was added to the previously prepared culture dish of L6 skeletal muscle cells, and cultured for 15 minutes in a 37 ° C. 5% carbon dioxide incubator. Thereafter, the cells were washed twice with 1 mL per culture dish with KRH buffer (see non-patent literature, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007). To obtain a total protein fraction. The amount of protein in the obtained total protein fraction was measured, and 20 μg thereof was subjected to SDS-PAGE to separate proteins. The separated protein was transferred to a PVDF membrane and blocked with Blocking one. After washing the PVDF membrane several times with TBST solution, anti-p-Akt antibody, p-AMPK antibody or AMPK antibody was used as the primary antibody, and the antibody corresponding to the primary antibody labeled with horseradish peroxidase was used as the secondary antibody. . The immune complex on the membrane was reacted with Lumi-Light Plus Western blotting substrate and exposed to an X-ray film to detect phosphorylation and expression level of each protein.
つぎに、ＡＭＰＫの阻害剤であるＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ（Ｓｉｇｍａ社製）を、ＤＭＳＯに溶解して、３０μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃを含有するＫＲＨ緩衝液を調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞が入った２４穴組織培養プレートに、上記調製緩衝液を１穴当たり３００μＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で３０分培養した。また、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＫＲＨ緩衝液を調製し、この緩衝液を上記Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ含有緩衝液に代えて用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。その後、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、ＤＭＳＯ、インスリン、ＡＭＰＫの活性化剤である５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、ＰＡ４のいずれかを添加した。なお、上記ＤＭＳＯは、その濃度が０．１％ｖ／ｖとなるように添加したものであり、上記インスリンは、その濃度が１００ｎＭとなるように添加したものであり、上記ＡＩＣＡＲは、その濃度が５００μＭとなるように添加したものであり、上記ＰＡ４は、ＤＭＳＯに溶解させ、ＰＡ４の終濃度が１０μＭとなるように添加したものである。 Next, Compound C (manufactured by Sigma), which is an inhibitor of AMPK, was dissolved in DMSO to prepare a KRH buffer containing 30 μM Compound C. Then, 300 μL of the above preparation buffer was added per well to the 24-well tissue culture plate containing the previously prepared L6 skeletal muscle cells, and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 30 minutes. In addition, a KRH buffer containing 0.1% v / v DMSO was prepared, and this buffer was used instead of the Compound C-containing buffer, and L6 skeletal muscle cells were cultured in the same manner as described above. Thereafter, DMSO, insulin, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR), which is an activator of AMPK, or PA4 was added to the medium in each well (hole) of the tissue culture plate. The DMSO was added to a concentration of 0.1% v / v, the insulin was added to a concentration of 100 nM, and the AICAR was added to the concentration. The PA4 is dissolved in DMSO and added so that the final concentration of PA4 is 10 μM.
続いて、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、［ 3Ｈ］で標識された２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を、終濃度として６．５ｍＭ（１８．５μＣｉ）となるように添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で５分間、Ｌ６骨格筋細胞を培養した。このようにして培養したＬ６骨格筋細胞を、氷冷したＫＲＨで４回洗浄し、細胞内に取り込まれなかった２ＤＧを除去した。続いて、Ｌ６骨格筋細胞から完全にＫＲＨを取り除き、この細胞を０．０５Ｎ ＮａＯＨ２５０μＬで可溶化して、それをシンチレーションカクテルの入ったバイアルビンに回収した。さらに組織培養プレートの各ウェル（穴）を、ＫＲＨ２００μＬで２回洗浄して、この洗液も合わせてバイアルビンに回収した。このようにして回収して得られた液体を、液体シンチレーションシステムＬＳＣ−５０００シリーズ（アロカ社製) を用いて分析し、Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（糖取り込み活性）を測定した。なお、非特異的な取り込み量は、グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンＢを用いて、上記回収した液体を処理（２０μＭ サイトカラシンＢで１５分間処理）した後、上記と同様の方法で取り込み活性を測定し、その値を「非特異的な取り込み量」とした。 Subsequently, 2-deoxyglucose (2DG) labeled with [ 3 H] is added to the medium in each well (hole) of the tissue culture plate so that the final concentration is 6.5 mM (18.5 μCi). Then, L6 skeletal muscle cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 5 minutes. The L6 skeletal muscle cells cultured in this way were washed 4 times with ice-cooled KRH to remove 2DG that was not taken up into the cells. Subsequently, KRH was completely removed from the L6 skeletal muscle cells, the cells were solubilized with 250 μL of 0.05N NaOH and collected in a vial containing a scintillation cocktail. Further, each well (hole) of the tissue culture plate was washed twice with 200 μL of KRH, and this washing solution was also collected and collected in a vial bottle. The liquid thus obtained was analyzed using a liquid scintillation system LSC-5000 series (manufactured by Aloka), and [ 3 H] labeled with 2DG incorporated into L6 skeletal muscle cells. Radioactivity (sugar uptake activity) was measured. The non-specific uptake amount was obtained by treating the collected liquid with cytochalasin B, which is an inhibitor of glucose transport (treatment with 20 μM cytochalasin B for 15 minutes), and then taking up in the same manner as described above. The activity was measured, and the value was defined as “non-specific uptake”.
＜ＰＡの作用機構の確認試験結果＞
タンパク質のリン酸化および発現量をウェスタンブロット法により確認した結果は図４に示す通りである。図より、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに（特にＰＡ４）、ＡＭＰＫのリン酸化を促進していたが、インスリンのように、Ａｋｔのリン酸化には影響を及ぼしていなかった。また、図５のグラフに示すように、ＡＭＰＫの阻害剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）を作用させた条件下でのＰＡ４の糖取り込み活性を測定した結果、ＡＭＰＫの活性化剤であるＡＩＣＡＲと同様、上記阻害剤によりＰＡ４の糖取り込み活性が抑制されたことから、ＰＡ４はＡＭＰＫを介して糖取り込みを促進することを示した。このことから、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４は、ＡＭＰＫの活性化剤としての作用を奏することがわかる。
<Confirmation test results of PA action mechanism>
The results of confirming the phosphorylation and expression level of the protein by Western blotting are as shown in FIG. From the figure, PA2, PA3, and PA4 (particularly PA4) promoted AMPK phosphorylation, but did not affect Akt phosphorylation like insulin. Further, as shown in the graph of FIG. 5, as a result of measuring the sugar uptake activity of PA4 under the condition where an AMPK inhibitor (Compound C) was acted, the inhibition was similar to that of AICAR, which is an AMPK activator. Since the sugar uptake activity of PA4 was suppressed by the agent, it was shown that PA4 promotes the sugar uptake through AMPK. From this, it is understood that PA2, PA3, and PA4 have an effect as an activator of AMPK.
〔筋管細胞におけるプロアントシアニジンの活性実験〕
＜試験用の筋管細胞の作製＞
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Dulbecco’s modified eagle’s medium, high glucose、ＳＩＧＭＡ社製）を用い、ＣＯ2 インキュベーター内（３７℃、ＣＯ2 濃度５％）で培養した。上記細胞が８０％コンフルエントになったところで継代し、ついで、その培養皿から培地を除去し、２％ＨＳ（ウマ血清、ＳＩＧＭＡ社製）含有のＤＭＥＭ培地（分化用培地）に交換した。その２日後、上記分化用培地を再度交換し、さらに２日後、同様に培地交換し、１〜２日培養した。このようにして得られた、分化後５日目あるいは６日目の筋管細胞を、実施例２における後記の各試験に使用した。
[Experimental activity of proanthocyanidins in myotubes]
<Preparation of myotube cells for testing>
Mouse myoblast C2C12 was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., CO 2 concentration 5%) using a DMEM medium containing 10% FBS (Dulbecco's modified eagle's medium, high glucose, manufactured by SIGMA). When the cells became 80% confluent, they were subcultured, and then the medium was removed from the culture dish and replaced with DMEM medium (differentiation medium) containing 2% HS (horse serum, manufactured by SIGMA). Two days later, the differentiation medium was changed again, and another two days later, the medium was changed in the same manner and cultured for 1-2 days. The myotube cells obtained on the 5th or 6th day after differentiation were used in the tests described in Example 2 below.
＜筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験＞
上記筋管細胞の培地を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換し、約３時間培養した。これを、２４穴組織培養プレートの各ウェル内に１ｍＬずつ入れた。つぎに、実施例１で使用したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを上記培養プレートの各ウェル内の培地に添加した（ＰＡ濃度１０μＭ）。また、対照となる培地には、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯのみを添加した。そして、これら各成分の存在下、筋管細胞を１０分間培養した。その後、溶解バッファー（50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 % Triton X-100, 2 mM sodium metavanadate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and a protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ）中に細胞を回収し、軽く混合した後、遠心処理に供し、上清を回収した。このようにして回収した上清中のタンパク質についてウエスタンブロットで解析し、ＡＭＰＫの活性を調べた。ウェスタンブロットでは、一次抗体として、Ｐ−ＡＭＰＫα（Thr172）抗体（Phospho-AMPKα antibody ）（Cell Signaling社製）、ＡＭＰＫα抗体を使用し、二次抗体として、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ抗体（Cell Signaling社製）を使用した。
<Confirmation test of AMPK activation action of proanthocyanidins (PA) in myotube cells>
The medium of myotube cells was replaced with DMEM containing 1% bovine serum albumin (BSA) and cultured for about 3 hours. 1 mL of this was placed in each well of a 24-well tissue culture plate. Next, PA2, PA3 and PA4 used in Example 1 were each dissolved in DMSO and added to the medium in each well of the culture plate (
また、得られたタンパク質の発現強度の測定のために化学発光試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により発光させて、その強度を検出し（ＬＡＳ−３０００、富士フィルム社製）、Gauge Ver 3.0 Densitograph Software （富士フィルム社製）により定量した。それぞれの定量値を元にしてｐ−ＡＭＰＫαの発現強度をＡＭＰＫαの発現強度で除して、コントロール（０. １％ＤＭＳＯ）に対する上昇率で表した。これにより、上記プロアントシアニジン（ＰＡ）の違いによるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）を測定した。 Moreover, in order to measure the expression intensity of the obtained protein, it was made to emit light with a chemiluminescence reagent (GE Healthcare Bioscience), and its intensity was detected (LAS-3000, Fuji Film), Gauge Ver 3.0 Quantification was performed by Densitograph Software (Fuji Film). Based on the respective quantitative values, the expression intensity of p-AMPKα was divided by the expression intensity of AMPKα, and expressed as a rate of increase relative to the control (0.1% DMSO). Thereby, the AMPK activation level (P-AMPK / AMPK) due to the difference in the proanthocyanidins (PA) was measured.
＜筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験結果＞
ウェスタンブロット法によるＰ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果は、図６に示す通りである。また、プロアントシアニジン（ＰＡ）の違いによるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の結果は、図７のグラフに示す通りである。図７の結果より、ＰＡ２投与群よりもＰＡ３投与群の方が、ＰＡ３投与群よりもＰＡ４投与群の方が、ＡＭＰＫ活性化レベルの上昇が大きかった。したがって、ＰＡは重合度が高いものほどＡＭＰＫ活性化作用が強いことが示唆された。
<Results of confirmation test of AMPK activation action of proanthocyanidins (PA) in myotubes>
The detection results of P-AMPKα and AMPKα by Western blotting are as shown in FIG. Moreover, the result of the AMPK activation level (P-AMPK / AMPK) by the difference in proanthocyanidins (PA) is as showing in the graph of FIG. From the results in FIG. 7, the increase in the AMPK activation level was greater in the PA3 administration group than in the PA2 administration group and in the PA4 administration group than in the PA3 administration group. Therefore, it was suggested that PA has a higher AMPK activating effect as the degree of polymerization is higher.
また、上記図７の結果より、ＡＭＰＫ活性化作用が強いと予想されるＰＡ４に着目し、ＰＡ４投与によるＡＭＰＫ活性化レベルの経時変化、さらに、それに伴うアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化について検討した。図８は、１０μＭ ＰＡ４投与群におけるＰ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図９のグラフは、１０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の経時変化を示したものである。また、図１０は、上記と同様の試験を５０μＭ ＰＡ４投与群に対しても行い、上記１０μＭ ＰＡ４投与群結果とともに、Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図１１のグラフは、これら１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の経時変化を併記したものである。さらに、先のＡＣＣのリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化を検討するに際し、一次抗体として、Ｐ−ＡＭＰＫα抗体、ＡＭＰＫα抗体に代えて、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）抗体、ホスホ−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ(Ser79) （Ｐ−ＡＣＣ）抗体（Cell Signaling社製）を用いる以外は、上記「筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験」と同様の試験を、１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群に対して行った。そして、図１２は、１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＰ−ＡＣＣおよびＡＣＣの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図１３のグラフは、これら１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＣＣのリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化を併記したものである。 From the results of FIG. 7, paying attention to PA4, which is expected to have a strong AMPK activation effect, the time-dependent change in AMPK activation level by PA4 administration, and the accompanying phosphorylation level of acetyl CoA carboxylase (ACC) ( The time course of P-ACC / ACC) was examined. FIG. 8 shows the results of detection of P-AMPKα and AMPKα in the 10 μM PA4 administration group (time course change by Western blotting), and the graph of FIG. 9 shows the AMPK activation level (P−) in the 10 μM PA4 administration group. The change with time of AMPK / AMPK) is shown. FIG. 10 shows the results of detection of P-AMPKα and AMPKα (change over time by Western blotting) together with the results of the 10 μM PA4 administration group as well as the results of the 10 μM PA4 administration group. The graph of FIG. 11 shows the time course of the AMPK activation level (P-AMPK / AMPK) in these 10 μM and 50 μM PA4 administration groups. Further, when examining the temporal change in the phosphorylation level of ACC (P-ACC / ACC), the acetyl-CoA carboxylase (ACC) antibody, phospho-acetyl instead of P-AMPKα antibody and AMPKα antibody as primary antibodies were used. Except for using CoA carboxylase (Ser79) (P-ACC) antibody (manufactured by Cell Signaling), a test similar to the above-mentioned “confirmation test of AMPK activation action of proanthocyanidins (PA) in myotube cells” was performed at 10 μM and The test was performed on the 50 μM PA4 administration group. FIG. 12 shows the detection results of P-ACC and ACC in the 10 μM and 50 μM PA4 administration groups (temporal change by Western blotting), and the graph in FIG. 13 shows the graph in these 10 μM and 50 μM PA4 administration groups. The change with time of the phosphorylation level of ACC (P-ACC / ACC) is also shown.
以上の結果から、ＰＡ４投与直後から筋管細胞のＡＭＰＫ活性化レベルの上昇が見られ、投与から３時間が経過してもＡＭＰＫの活性化が持続されていた。また、ＰＡ４投与直後のものにはＡＣＣリン酸化レベルの増大が確認された。この結果から、ＰＡはＡＭＰＫの活性化を介してＡＣＣのリン酸化を促進することが明らかになった。なお、ＡＭＰＫは主に赤筋や肝臓に発現しており、これが活性化されるとＡＣＣのリン酸化（不活性化）を介してミトコンドリアでの脂肪酸酸化が促進されることが知られている。 From the above results, an increase in myotube cell AMPK activation level was observed immediately after PA4 administration, and AMPK activation was maintained even after 3 hours from administration. In addition, an increase in ACC phosphorylation level was confirmed in those immediately after PA4 administration. From this result, it became clear that PA promotes phosphorylation of ACC through activation of AMPK. It is known that AMPK is mainly expressed in red muscle and liver, and when activated, mitochondrial fatty acid oxidation is promoted through phosphorylation (inactivation) of ACC.
＜筋管細胞へのＰＡ４投与による遺伝子発現量変化（ＰＰＡＲα）の確認試験＞
上記作製した試験用の筋管細胞（分化後５日目あるいは６日目の細胞を筋管細胞）を使用し、ＰＡ４投与の約３時間前に培地を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換した。所定の濃度の各成分存在下、筋管細胞を５時間さらに培養した。
<Confirmation test of gene expression change (PPARα) by administration of PA4 to myotubes>
Using the prepared myotube cells for test (cells on the 5th or 6th day after differentiation were myotube cells), the medium was DMEM containing 1% bovine serum albumin (BSA) about 3 hours before PA4 administration. Was replaced. Myotube cells were further cultured for 5 hours in the presence of each component at a predetermined concentration.
（核酸の回収）
ＰＡ４投与の５時間後、培地を取り除き、細胞を、phosphate buffered saline （ＰＢＳ）で洗浄した後に、１ウェルあたり１ｍＬのＱＩＡＺＯＬ（キアゲン社製）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収し、全量を滅菌済みの１．５ｍＬ容チューブに加えてヴォルテックスミキサーでよく混合して５分間室温で静置した。その後、２００μＬのクロロホルムを加えてヴォルテックスミキサーでよく混合した後、そのまま室温で５分間静置した。次に、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、その水層を、新しい１. ５ｍＬ容チューブに回収した。回収した液に同量のイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で５分間静置した。次に、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を取り除いた。さらに１ｍＬの冷７０％エタノールを加えてよく混合した後、１２０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を取り除いた。そのまま沈殿を室温で５分間風乾させた。次に、沈殿にジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水（ＤＥＰＣ処理水）４０μＬを加えてピペッティングを行い、よく混合した。分光光度計（NanoDrop ND-1000）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度を定量した。
(Recovery of nucleic acid)
5 hours after PA4 administration, the medium was removed, and the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), then 1 mL of QIAZOL (Qiagen) was added per well, and the cells were collected with a cell scraper, and the entire amount was sterilized. In addition to the already prepared 1.5 mL tube, it was mixed well with a vortex mixer and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Thereafter, 200 μL of chloroform was added and mixed well with a vortex mixer, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, the mixture was centrifuged at 12000 × g and 4 ° C. for 15 minutes, and the aqueous layer was collected in a new 1.5 mL tube. The recovered solution was mixed with the same amount of isopropanol and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, the mixture was centrifuged at 12000 × g and 4 ° C. for 15 minutes, and the supernatant was removed. Further, 1 mL of cold 70% ethanol was added and mixed well, followed by centrifugation at 12000 × g and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was removed. The precipitate was allowed to air dry at room temperature for 5 minutes. Next, 40 μL of water (DEPC-treated water) treated with diethylpyrocarbonate (DEPC) was added to the precipitate for pipetting and mixed well. Using a spectrophotometer (NanoDrop ND-1000), the absorbance at 260 nm was measured to quantify the RNA concentration.
（ｃＤＮＡ合成）
アプライドバイオシステムズ社のHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて行った。
得られたＲＮＡ１μｇを含む１３．２μＬのＤＥＰＣ処理水に、２μｍＬの10×reverse transcription buffer（アプライドバイオシステムズ社製）、０．８μＬの１００ｍＭ 25×dNTP Mixture （アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬの２０Ｕ／μＬ ribonuclease inhibitor（アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬの５０Ｕ／μＬ MuLV reverse transcriptase（アプライドバイオシステムズ社製）、２μＬの５０μＭ 10×random primer （アプライドバイオシステムズ社製）を加え（計２０μＬ）、雰囲気温度を所定の条件に制御（２５℃で１０分間、次いで３７℃で１２０分間、次いで８５℃で５秒間）することにより反応させ、ｃＤＮＡを合成した。
(CDNA synthesis)
This was performed using Applied Biosystems' High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
In 13.2 μL of DEPC-treated water containing 1 μg of the obtained RNA, 2 μmL of 10 × reverse transcription buffer (Applied Biosystems), 0.8 μL of 100 mM 25 × dNTP Mixture (Applied Biosystems), 1 μL of 20 U / ΜL ribonuclease inhibitor (Applied Biosystems), 1 μL of 50 U / μL MuLV reverse transcriptase (Applied Biosystems), 2 μL of 50 μM 10 × random primer (Applied Biosystems) (total 20 μL), atmosphere The reaction was carried out by controlling the temperature to a predetermined condition (25 ° C. for 10 minutes, then 37 ° C. for 120 minutes, then 85 ° C. for 5 seconds) to synthesize cDNA.
（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量）
得られたｃＤＮＡ１μｇを含む１０．７５μＬのＤＥＰＣ処理水に、１２．５μＬのTakara premix Ex Taq（タカラバイオ社製）、０．５μＬのROX reference dye （タカラバイオ社製）及び１．２５μＬのTaqman(R) Gene expression Assays〔Peroxisome proliferator activated receptor (PPARα) (Assay ID : Mm00440839#m1) 、Ribosomal protein , large P2(Assay ID : Mm00782638#s1)を含有〕（アプライドバイオシステムズ社製）を加え（計２５μＬ）、7300 real-time PCRシステム（アプライドバイオシステムズ社製）のプロトコールに従ってreal-time PCR による遺伝子発現量測定を行なった。ＰＰＡＲα遺伝子発現量のｍＲＮＡ量と内因性コントロールとしてRibosomal protein , large P2遺伝子発現量のｍＲＮＡ量を測定し、ＰＰＡＲα遺伝子発現量のｍＲＮＡ量をRibosomal protein , large P2遺伝子発現量のｍＲＮＡ量で割って補正した値をＰＰＡＲαの発現量とした。
(Quantification of mRNA by real-time PCR)
In 10.75 μL of DEPC-treated water containing 1 μg of the obtained cDNA, 12.5 μL Takara premix Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.), 0.5 μL ROX reference dye (manufactured by Takara Bio Inc.) and 1.25 μL Taqman (manufactured by Takara Bio Inc.) R) Gene expression Assays (containing Peroxisome proliferator activated receptor (PPARα) (Assay ID: Mm00440839 # m1), Ribosomal protein, large P2 (Assay ID: Mm00782638 # s1)) (Applied Biosystems) added (total 25 μL) The gene expression level was measured by real-time PCR according to the protocol of 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems). Measure mRNA level of PPARα gene expression level and Ribosomal protein, large P2 gene expression level as intrinsic control, and divide PPARα gene expression level mRNA level by Ribosomal protein, large P2 gene expression level to correct The obtained value was defined as the expression level of PPARα.
＜筋管細胞へのＰＡ４投与による遺伝子発現量変化（ＰＰＡＲα）の確認試験結果＞
β１サブユニットを有するＡＭＰＫが活性化されるとＡＣＣの不活性化を介して脂肪酸酸化が促進される。これに対しβ２サブユニットを有するＡＭＰＫが活性化されると、活性化ＡＭＰＫは核内に移行してＰＰＡＲαの遺伝子発現を増大することでぺルオキシソームにおける脂肪酸酸化が促進される。これまでの結果から、ＰＡはＡＭＰＫの活性化を介してＡＣＣのリン酸化を促進することが明らかになったが、それとは別にＡＭＰＫの下流因子として調整を受けるＰＰＡＲαの遺伝子発現がＰＡの投与によってどのような変化を受けるか検討した。その結果を、図１４に示す。ＰＡ４投与群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＰＰＡＲαの遺伝子発現が濃度依存的に上昇しており、５０μＭ ＰＡ４投与群においては有意な差が確認された。したがって、ＰＡ４は筋組織において、ＰＰＡＲαの発現や、ＡＣＣのリン酸化などの脂肪代謝関連酵素の活性化により、脂肪代謝が促進されることがわかる。
<Results of Confirmation Test of Gene Expression Change (PPARα) by PA4 Administration to Myotubes>
When AMPK having β1 subunit is activated, fatty acid oxidation is promoted through inactivation of ACC. In contrast, when AMPK having the β2 subunit is activated, the activated AMPK is transferred into the nucleus and increases the gene expression of PPARα, thereby promoting fatty acid oxidation in the peroxisome. The results thus far revealed that PA promotes ACC phosphorylation through the activation of AMPK, but the gene expression of PPARα, which is regulated as a downstream factor of AMPK, is regulated by administration of PA. We examined what kind of change it would take. The result is shown in FIG. In the PA4 administration group, the PPARα gene expression increased in a concentration-dependent manner compared to the Control group, and a significant difference was confirmed in the 50 μM PA4 administration group. Therefore, it can be seen that PA4 promotes fat metabolism in muscle tissue by activation of fat metabolism-related enzymes such as PPARα expression and ACC phosphorylation.
〔ＫＫ−Ａy マウスへ黒大豆抽出物を摂取させた時の血清グルコース濃度、血清トリグリセリド濃度低下作用〕
＜実験動物および飼育方法＞
［実験動物］
ＫＫ−Ａy マウス（２型糖尿病モデルマウス）の雄（４週齢）
室温２４℃、明暗調製８〜２０時、給水ビンによる給水で飼育を行った。
［投与物質］
黒大豆抽出成分の市販品であるクロノケア（ＢＥ）（フジッコ社製）
クロノケア（ＢＥ）中、プロアントシアニジン（ＰＡ）含量５９％、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）含量９％。
［試験食の調製］
通常飼料としては、日本クレア社製の配合飼料粉末ＣＥ−２を使用した。そして、上記粉末ＣＥ−２と、ＢＥを混合し、２．２％ＢＥ食（Ｃ３Ｇ含量として０．２％になるように計算された添加量）を調製した。
［飼育スケジュール］
(i) ４週齢マウスを購入し飼育を開始した。
(ii)予備飼育４日間飼料は、粉末ＣＥ−２（日本クレア配合飼料）を摂食させた。
(iii) 予備飼育後、体重、血糖値の平均値がほぼ等しくなるようにＣｏｎｔｒｏｌ群、ＢＦ群（ｎ＝８）に分け、Ｃｏｎｔｒｏl 群にはＣＥ−２食、ＢＥ群にはＣＥ−２食＋２．２％ＢＥ食を自由摂取させた（試験食摂食開始を試験０週目とした）。
(iv)１週間毎に体重測定・採血を行い、血清グルコース濃度を測定した。
(v) 試験６週目にマウスを屠殺した。血液はエッペンチューブに採取し、４℃, ５０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を分離し、−８０℃で冷凍保存した。
[Reducing effect of serum glucose concentration and serum triglyceride concentration when KK-A y mouse is ingested with black soybean extract]
<Experimental animals and breeding methods>
[Experimental animals]
Male KK-A y mouse (
Breeding was carried out by water supply using a water supply bottle at room temperature of 24 ° C. and light / dark preparation at 8 to 20:00.
[Dosage substance]
Chronocare (BE), a commercial product of black soybean extract component (Fujicco)
In Chronocare (BE), proanthocyanidin (PA) content 59%, cyanidin-3-glucoside (C3G) content 9%.
[Preparation of test meal]
As a normal feed, a mixed feed powder CE-2 manufactured by CLEA Japan was used. And the said powder CE-2 and BE were mixed and 2.2% BE food (addition amount calculated so that it might become 0.2% as C3G content) was prepared.
[Catching schedule]
(i) A 4-week-old mouse was purchased and reared.
(ii) The pre-bred 4-day feed was fed with powdered CE-2 (Japanese Claire formula feed).
(iii) After preliminary breeding, the control group and the BF group (n = 8) are divided so that the average values of body weight and blood glucose level are almost equal. The control group has CE-2 diet and the BE group has CE-2 diet. A + 2.2% BE diet was ad libitum (the start of test diet intake was defined as
(iv) Body weight was measured and blood was collected every week, and the serum glucose concentration was measured.
(v) Mice were sacrificed at 6 weeks of study. The blood was collected in an Eppendorf tube, centrifuged at 4 ° C. and 5000 rpm for 10 minutes to separate the serum, and stored frozen at −80 ° C.
＜１週間毎の採血方法＞
(i) 採血日の午前９時から１時間絶食させた。
(ii)尾静脈を剃刀で切りエッぺンチューブに血液を取り、数分間室温に置いた後氷中に置いた。
(iii) ４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。
(iv)上清（血清）を採取して別のエッペンチューブに移し氷中に置いた。
(v) 得られた血清を用いて血糖値を測定した。
<Week sampling method>
(i) Fasted for 1 hour from 9 am on the day of blood collection.
(ii) The tail vein was cut with a razor, blood was taken into an Eppendorf tube, allowed to stand at room temperature for several minutes, and then placed on ice.
(iii) Centrifugation was performed at 4 ° C., 5000 rpm, and 10 minutes.
(iv) The supernatant (serum) was collected, transferred to another Eppendorf tube, and placed on ice.
(v) The blood glucose level was measured using the obtained serum.
＜血清グルコース濃度の測定＞
１週間毎の採血から採取した上清（血清）のグルコース濃度を、グルコースＣII−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、測定した。
<Measurement of serum glucose concentration>
The glucose concentration of the supernatant (serum) collected from blood collection every week was measured using Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the attached protocol.
＜血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度、血清インスリン濃度の測定＞ 試験６週目のマウスを検体として、血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度の測定を行った。なお、血清トリグリセライド濃度は、トリグリセライドＥ−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。また、血清総コレステロール（血中総コレステロール）濃度は、コレステロールＥ−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。また、血清インスリン（血中インスリン）濃度は、モリナガインスリン測定キット（森永生科学研究所社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。 <Measurement of Serum Triglyceride Concentration, Serum Total Cholesterol Concentration, and Serum Insulin Concentration> Serum triglyceride concentration and serum total cholesterol concentration were measured using mice at 6 weeks of test as specimens. The serum triglyceride concentration was measured using Triglyceride E-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the attached protocol. The serum total cholesterol (blood total cholesterol) concentration was measured using cholesterol E-test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the attached protocol. Serum insulin (blood insulin) concentration was measured using a Morinaga insulin measurement kit (manufactured by Morinaga Bioscience Institute) according to the attached protocol.
＜組織における特定タンパク質の定量＞
屠殺したマウスの解剖時に採取した肝臓、骨格筋におけるＡＭＰＫα, およびＰ−ＡＭＰＫα(Thr 172) のタンパク量の定量を行った。また、骨格筋においては、Whole lysate (細胞全体からの抽出液), Plasma membrane fraction(細胞膜画分） , Cytosol fraction （細胞膜画分以外の細胞質由来抽出液）のサンプルを回収し、Whole lysateにおけるＡＭＰＫの活性化レベルと、それぞれのサンプルにおけるＧｌｕｔ４の発現量について検討した。詳しくは、採取した組織をタンパク抽出用バッファでホモゲナイズし、４℃, １８０００×ｇ, ３０分間遠心分離して得られた上清を採取し、ウェスタンブロッティングにより各タンパク質を検出した。Plasma membrane fractionの採取はNishiumi&Ashida の方法（ＢＢＢ ２００７，７１ (９)2343-2346）に従った。Ｇｌｕｔ４に対する抗体はCell Signaling社の製品を用いた。二次抗体としてAnti-rabbit IgG, HRP-linked antibody（Cell Signaling）を使用した。
<Quantification of specific proteins in tissues>
The amounts of AMPKα and P-AMPKα (Thr 172) proteins in liver and skeletal muscle collected at the time of dissection of sacrificed mice were quantified. In skeletal muscle, samples of Whole lysate (extract from whole cell), Plasma membrane fraction (cell membrane fraction), Cytosol fraction (extract from cytoplasm other than cell membrane fraction) are collected and AMPK in Whole lysate. The activation level and the expression level of Glut4 in each sample were examined. Specifically, the collected tissue was homogenized with a protein extraction buffer, the supernatant obtained by centrifugation at 4 ° C., 18000 × g, 30 minutes was collected, and each protein was detected by Western blotting. The plasma membrane fraction was collected according to the method of Nishiumi & Ashida (BBB 2007, 71 (9) 2343-2346). As an antibody against Glut4, a product of Cell Signaling was used. Anti-rabbit IgG and HRP-linked antibody (Cell Signaling) were used as secondary antibodies.
〔実施例３の試験結果〕 [Test results of Example 3]
＜食餌摂取量、体重、血清グルコース濃度の１週間毎の推移＞
図１５および図１６のグラフより、食餌摂取量、体重は、飼育期間を通じて両群の間に有意な差は認められなかった。しかしながら、図１７のグラフより、血清グルコース濃度は、試験４週目以降において、ＢＥ投与群での有意な低下が認められた。
<Weekly changes in food intake, body weight, and serum glucose concentration>
From the graphs of FIGS. 15 and 16, there was no significant difference between the two groups in food intake and body weight throughout the breeding period. However, from the graph of FIG. 17, the serum glucose concentration was significantly decreased in the BE administration group after the 4th week of the test.
＜血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度、血清インスリン濃度の測定結果＞
図１８のグラフより、血清トリグリセライド濃度に関しては、ＢＥ群の血清トリグリセライド濃度は有意に低下した。また、図１９のグラフより、血清総コレステロール濃度は、ＢＥ群において、Ｃｏｎｔｒｏl 群と比べて有意な低下が確認された。また、図２０のグラフより、血清インスリン濃度に関しては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、ＢＥ群の血清インスリン濃度が有意に低下していた。
<Measurement results of serum triglyceride concentration, serum total cholesterol concentration, and serum insulin concentration>
From the graph of FIG. 18, regarding the serum triglyceride concentration, the serum triglyceride concentration in the BE group was significantly reduced. Further, from the graph of FIG. 19, it was confirmed that the serum total cholesterol concentration significantly decreased in the BE group as compared with the Control group. From the graph of FIG. 20, regarding the serum insulin concentration, the serum insulin concentration in the BE group was significantly lower than that in the Control group.
＜組織における特定タンパク質の定量結果＞
ＢＥ摂取による血糖値上昇抑制作用は、ＡＭＰＫの活性化、およびインスリン感受性の改善を介したＧｌｕｔ４のトランスロケーションの増大がその一端を担っているのではないかと考え、先に示したように、Whole lysate (Whole) , Plasma membrane fraction (PM), Cytosol fraction (Cytosol)の３種のサンプルを回収し、Whole lysateにおけるＡＭＰＫの活性化レベルと、それぞれのサンプルにおけるＧｌｕｔ４の発現量について検討した。その結果、図２１のグラフに示すように、ＢＥ摂取によるＡＭＰＫ活性化レベル（ＡＭＰＫαＴｈｒ１７２リン酸化）の有意な上昇が確認された。また、図２２のグラフに示すように、Whole lysate (Whole), Cytosol fraction (Cytosol)においては両群の間でＧｌｕｔ４の発現量に差が見られなかったが、Plasma membrane fraction(PM)においては、ＢＥ群のＧｌｕｔ４の発現が有意に上昇していた。
<Quantitative results of specific proteins in tissues>
The inhibitory action on the increase in blood glucose level by ingestion of BE is thought to be partly due to the increase in translocation of Glut4 through the activation of AMPK and the improvement of insulin sensitivity. Three types of samples, lysate (Whole), Plasma membrane fraction (PM), and Cytosol fraction (Cytosol) were collected, and the activation level of AMPK in Whole lysate and the expression level of Glut4 in each sample were examined. As a result, as shown in the graph of FIG. 21, a significant increase in the AMPK activation level (AMPKαThr172 phosphorylation) due to BE intake was confirmed. Moreover, as shown in the graph of FIG. 22, there was no difference in the expression level of Glut4 between the two groups in Whole lysate (Whole) and Cytosol fraction (Cytosol), but in Plasma membrane fraction (PM). , The expression of Glut4 in the BE group was significantly increased.
以上より、上記各実施例において、ＰＡ３（プロシアニジンＣ１）およびＰＡ４（シナムタンニンＡ２）が、高いＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を示すことが確認された。なお、前記一般式（４）のプロアントシアニジンにおいて、そのｎの値が３〜６の整数であるものにおいても、上記と同様、高いＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を示すことを実験により確認している。また、これらのプロアントシアニジンほどではないが、前記一般式（１）で表される本発明に規定のプロアントシアニジンに該当するものであれば、上記ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用において有意な効果が認められることを実験により確認している。また、ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用は、肥満や糖尿病等の予防・改善と密接に関与することから、本実施例品である上記特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、上記各作用を発揮することができる薬剤は、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，または内臓脂肪蓄積抑制剤として使用しても、有利な作用効果が認められると推測される。また、これらの薬剤は、実質的に何ら副作用を示すことがないことから、飲食品に含有させることもできる。なお、前記一般式（４）に示すプロアントシアニジンであっても、ｎの値が７以上の整数のものでは、上記作用効果において有意な結果が得られていない。 From the above, it was confirmed that PA3 (procyanidin C1) and PA4 (synamtannin A2) exhibited high AMPK activity and GLUT4 activity in the above Examples. In addition, in the proanthocyanidins of the general formula (4), even when the value of n is an integer of 3 to 6, it was confirmed by experiments that the same high AMPK activity and GLUT4 activity were exhibited as described above. Yes. Further, although not as much as these proanthocyanidins, if they correspond to the proanthocyanidins defined in the present invention represented by the general formula (1), significant effects are recognized in the above AMPK activity action and GLUT4 activity action. It has been confirmed by experiment. Moreover, since the AMPK activity action and the GLUT4 activity action are closely related to the prevention and improvement of obesity, diabetes and the like, the proanthocyanidins having the above specific structure which is the product of this example are contained as active ingredients, It is presumed that an advantageous action and effect is recognized even when a drug that can be exerted is used as an anti-diabetic agent, anti-obesity agent, visceral fat accumulation reducing agent, or visceral fat accumulation inhibitor. Moreover, since these chemical | medical agents do not show a side effect substantially, they can also be contained in food-drinks. In addition, even if it is the proanthocyanidins shown to the said General formula (4), the significant result is not obtained in the said effect, when the value of n is an integer greater than or equal to 7.
本発明の薬剤は、特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を有するものであり、実質的に何ら副作用を示すことなく、これらの作用が効果的になされるため、安全性に優れており、産業上有用である。また、これらの作用に基づき、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、内臓脂肪蓄積抑制剤等に使用することも可能である。また、上記薬剤を含有する飲食品は、あらゆる飲食品に適用し得るため、飲食品に機能的付加価値をつける意味でも、産業上有用である。さらに、家畜・ペット用飼料等への応用も可能である。 The drug of the present invention contains proanthocyanidins having a specific structure as an active ingredient and has an AMPK activity action and a GLUT4 activity action, and these actions are effectively performed without showing any side effects. Therefore, it is excellent in safety and is industrially useful. Further, based on these actions, it can be used as an antidiabetic agent, an antiobesity agent, a visceral accumulated fat reducing agent, a visceral fat accumulation inhibiting agent, or the like. Moreover, since the food / beverage products containing the said chemical | medical agent can be applied to all food / beverage products, it is industrially useful also in the meaning which gives a functional added value to food / beverage products. Furthermore, application to livestock and pet feed is also possible.
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