JP2011172562A - Method for producing scab-resistant plant and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、赤かび病抵抗性植物の作製方法およびその利用に関する。 The present invention relates to a method for producing a head blight-resistant plant and use thereof.
糸状菌であるフザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）を原因菌とする麦類赤かび病は、コムギ、オオムギ、エン麦、トウモロコシ等の多くのイネ科主要穀物に感染する病害であり、最重要病害のひとつとして知られる。赤かび病菌は、ありふれた腐生菌で、世界中の麦作地帯に分布しており、特に開花期から登熟期に雨の多い地域で被害が大きい。この赤かび病菌が穂に感染することによって、粒の肥大の阻害や穂全体の枯れが引き起こされ、穀粒の商品価値が損なわれるのみならず、赤かび病菌が産生するトリコテセン系カビ毒が、食品の安全性の観点から問題とされている。 The wheat fungus caused by the fungus Fusarium graminearum is a disease that infects many major gramineous grains such as wheat, barley, oats and corn, and is the most important disease. Known as one. Fusarium head blight fungus is a common saprophytic fungus that is distributed in wheat regions around the world and is particularly damaging in areas where there is heavy rain from the flowering period to the ripening period. By infecting the ear of this mold, the growth of the grain and inhibition of the whole ear are caused, and not only the commercial value of the grain is impaired, but also the trichothecene fungal toxin produced by the mold is It is a problem from the viewpoint of food safety.
トリコテセン系カビ毒は、ｐＨの変化や熱に対して安定であるため無毒化することが困難であり、人畜が摂取すると吐き気、嘔吐、腹痛といった中毒症状を引き起こし、状況によっては死に至る極めて危険性の高い毒素である。トリコテセン系カビ毒は、非常に多様な分子種が存在し、その構造から大きく４つのグループに分けられる。赤かび病菌の中には数多くのstrainがあり、それぞれが産生するトリコテセン系カビ毒の分子種が決まっている。これらのうち、汚染の報告例が多いのはタイプＡとタイプＢの２つである。 Trichothecene fungus poison is difficult to detoxify because it is stable against changes in pH and heat, and when ingested by livestock, it causes poisoning symptoms such as nausea, vomiting, and abdominal pain, and it is extremely dangerous to death depending on the situation Is a high toxin. Trichothecene fungal toxins have a wide variety of molecular species, and can be roughly divided into four groups based on their structures. There are many strains in Fusarium head blight fungus, and the molecular species of trichothecene fungal venom produced by each strain is determined. Among these, there are two types of type A and type B that have many reports of contamination.
タイプＡには、非常に毒性の強いＴ２トキシン等が含まれるが、汚染範囲が限られている。一方、タイプＢのトリコテセン系カビ毒には、デオキシニバレノール（Deoxynivalenol；ＤＯＮ）やニバレノール（Nivalenol；ＮＩＶ）等が含まれる。タイプＢの毒性はタイプＡほど強くないが、汚染範囲が広範であるため、被害はより深刻である。例えば、我が国においては、２００２年５月、厚生労働省により小麦粒中に含まれるＤＯＮの濃度を１．１ｐｐｍ以下とする暫定基準値が設けられている。 Type A includes very toxic T2 toxin and the like, but has a limited contamination range. On the other hand, type B trichothecene mold poisons include deoxynivalenol (DON) and nivalenol (NIV). Type B toxicity is not as strong as type A, but the damage is more severe due to the wide range of contamination. For example, in Japan, in May 2002, the Ministry of Health, Labor and Welfare established a provisional standard value that sets the concentration of DON contained in wheat grains to 1.1 ppm or less.
このように、一定基準を超えてトリコテセン系カビ毒を含有する赤かび病罹病穀物は醸造、加工、飼料等いかなる形態でも利用することができず廃棄される。その一方で、食の安全性に対する意識が高まっているため、赤かび病発生を抑える農薬は極力使用しない栽培が求められている。 As described above, the grain afflicted with Fusarium head blight containing trichothecene mold toxin exceeding a certain standard cannot be used in any form such as brewing, processing, and feed, and is discarded. On the other hand, since the awareness of food safety is increasing, cultivation without using as much as possible the pesticide that suppresses the occurrence of head blight is required.
このような環境のなか、赤かび病の抵抗性品種の開発が世界規模で解決すべき緊急の課題となっており、既にいくつかの技術が報告されている。例えば、特許文献１には、二条性を示すオオムギ品種と六条性を示すオオムギ品種との交配分離世代を用い、これらの各個体の条性を正確に判定し、条性に関与する遺伝子および該遺伝子と連鎖する分子マーカーを用いて、二条あるいは六条性遺伝子と連鎖する赤かび病抵抗性を識別する技術が記載されている。 In such an environment, the development of resistant varieties of head blight is an urgent issue to be solved on a global scale, and several techniques have already been reported. For example, Patent Document 1 uses a cross-separation generation of barley varieties exhibiting double streak and barley varieties exhibiting six streak, accurately determining the streak of each of these individuals, and the genes involved in streak and the A technique for identifying resistance to Fusarium head blight that is linked to a double or hexagonal gene using a molecular marker linked to the gene is described.
しかしながら、赤かび病の抵抗性品種の開発はいまだ十分とはいえない。特に、汚染の深刻なタイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病菌に対する抵抗性品種の開発は強く求められている。 However, the development of resistant varieties of head blight is still not sufficient. In particular, there is a strong demand for the development of resistant varieties against Fusarium head blight fungi that produce highly contaminated type B trichothecene mold toxins.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、赤かび病に対して抵抗性を有する植物の作製方法およびその利用等を提供することにある。 This invention is made | formed in view of said problem, The objective is to provide the production method of the plant which has resistance to a red mold disease, its utilization, etc.
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、赤かび病菌、特にＤＯＮまたはＮＩＶ等のタイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病原菌に対する感受性または抵抗性に関与する遺伝子を複数見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の構成からなるものである。
（１）植物において、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制する工程を含む赤かび病抵抗性植物の作製方法。
（ａ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１９〜３０，４３〜４８に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（２）上記遺伝子の発現を抑制する工程は、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、遺伝子破壊法および共抑制法から選択されるいずれかの手法により行なわれる（１）に記載の赤かび病抵抗性植物の作製方法。
（３）上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制した植物細胞を作製する工程、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む（１）または（２）に記載の赤かび病抵抗性植物の作製方法。
（４）植物において、以下の（ｆ）〜（ｊ）のいずれかの遺伝子の発現を増大させる工程を含む赤かび病抵抗性植物の作製方法。
（ｆ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｈ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号３１〜３６に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｊ）上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の作製方法により得られた赤かび病抵抗性植物。
（６）植物において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が抑制されているか否かを判定する工程を含む赤かび病抵抗性植物の選抜方法。
（７）植物において、上記（ｆ）〜（ｊ）のいずれかの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が増大しているか否かを判定する工程を含む赤かび病抵抗性植物の選抜方法。
（８）赤かび病に罹病性の植物に対して、赤かび病菌が産生するタイプＢのトリコテセン系カビ毒を作用させ、当該植物における応答遺伝子を同定する第１の工程、第１の工程にて同定した遺伝子の変異体を用いて、上記タイプＢのトリコテセン系カビ毒に対する抵抗性を評価する第２の工程、第２の工程にて同定した遺伝子の変異体を用いて、上記タイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病菌に対する抵抗性を評価する第３の工程、を含む赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法。
（９）上記（ｆ）〜（ｊ）および下記（ｋ）〜（ｏ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ｋ）配列番号３７〜４２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｌ）配列番号３７〜４２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｍ）配列番号３７〜４２に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｎ）配列番号４３〜４８に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｏ）上記（ｋ）〜（ｎ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventors are involved in susceptibility or resistance to Fusarium head blight fungi, particularly red mold pathogens that produce type B trichothecene fungal toxins such as DON or NIV. A plurality of genes have been found and the present invention has been completed. That is, this invention consists of the following structures.
(1) A method for producing a head blight-resistant plant comprising a step of suppressing the expression of any of the following genes (a) to (e) in a plant:
(A) A gene encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42.
(B) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 12, 37 to 42, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and A gene encoding a protein involved in susceptibility to.
(C) A gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42 and involved in susceptibility to head blight.
(D) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 19-30 and 43-48.
(E) a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (a) to (d) above and encodes a protein involved in susceptibility to head blight .
(2) The step of suppressing the expression of the gene is performed by any method selected from RNAi method, antisense method, gene disruption method, and co-suppression method, Manufacturing method.
(3) The method according to (1) or (2), comprising a step of producing a plant cell in which the expression of any of the genes (a) to (e) is suppressed, and a step of regenerating a plant from the plant cell. A method for producing a plant resistant to head blight.
(4) A method for producing a head blight-resistant plant comprising a step of increasing the expression of any of the following genes (f) to (j) in a plant:
(F) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13-18.
(G) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 13 to 18, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and is resistant to head blight. A gene that codes for the protein involved.
(H) a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 13 to 18 and involved in resistance to head blight.
(I) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 31 to 36.
(J) It hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (f) to (i) above under stringent conditions and encodes a protein involved in resistance to head blight gene.
(5) A head blight-resistant plant obtained by the production method according to any one of (1) to (4).
(6) A method for selecting a head blight-resistant plant comprising a step of determining whether or not the gene of any of the above (a) to (e) is present in a plant or whether the expression of the gene is suppressed.
(7) A method for selecting a head blight-resistant plant comprising a step of determining whether or not the gene of any of the above (f) to (j) is present in a plant or whether the expression of the gene is increased.
(8) First and first steps of identifying a response gene in a plant by causing type B trichothecene fungal toxin produced by Fusarium head blight fungus to act on a plant susceptible to head blight The second step of evaluating resistance to the type B trichothecene fungal venom using the gene variant identified above, and using the gene variant identified in the second step, A method for identifying a gene involved in susceptibility to Fusarium head blight, comprising a third step of evaluating resistance to Fusarium head blight fungus that produces a trichothecene fungal toxin.
(9) A recombinant vector comprising any of the above genes (f) to (j) and the following (k) to (o).
(K) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 37 to 42.
(L) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 37 to 42, one or several amino acid residues are composed of amino acid sequences substituted, deleted, inserted and / or added, and are involved in susceptibility to head blight A gene that encodes a protein
(M) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 37 to 42 and involved in susceptibility to head blight.
(N) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 43 to 48.
(O) a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes of (k) to (n) and encodes a protein involved in susceptibility to head blight .
本発明によれば、赤かび病菌、特にＤＯＮやＮＩＶ等のタイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病菌に対する抵抗性を有する植物を得ることができるという効果を奏する。 Advantageous Effects of Invention According to the present invention, there is an effect that it is possible to obtain a plant having resistance to Fusarium head blight fungi, in particular, Fusarium head blight fungus that produces type B trichothecene mold toxins such as DON and NIV.
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。 Embodiments of the present invention will be described in detail below.
＜１．赤かび病抵抗性植物の作製方法＞
＜１−１．赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子を利用する方法＞
本発明に係る赤かび病抵抗性植物の作製方法は、植物において、以下に述べる（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制する工程を含むものであればよく、その他の工程、条件、材料等については特に限定されるものではない。
（ａ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１９〜３０，４３〜４８に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
<1. Production method of plant resistant to head mold>
<1-1. Method of Using Genes Involved in Susceptibility to Red Head Disease>
The method for producing a Fusarium head blight-resistant plant according to the present invention only needs to include a step of suppressing the expression of any of the genes (a) to (e) described below in the plant, and other steps. The conditions, materials, etc. are not particularly limited.
(A) A gene encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42.
(B) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 12, 37 to 42, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and A gene encoding a protein involved in susceptibility to.
(C) A gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42 and involved in susceptibility to head blight.
(D) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 19-30 and 43-48.
(E) a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (a) to (d) above and encodes a protein involved in susceptibility to head blight .
上記（ａ）〜（ｅ）の遺伝子は赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードしているため、植物においてこれらの遺伝子の発現を抑制することにより、植物の赤かび病に対する抵抗性を付与ないしは高めることができる。 Since the genes (a) to (e) above encode proteins that are involved in susceptibility to head blight, the expression of these genes in the plant is suppressed to impart resistance to plant head blight. Or can be increased.
まず、上記（ａ）の遺伝子について具体的に説明する。 First, the gene (a) will be specifically described.
配列番号１は、シロイヌナズナ由来のＲＰＳ２７ａ／ＵＢＱ１５タンパク質のアミノ酸配列を示す（AT1G23410）。ＲＰＳ２７ａ／ＵＢＱ１５タンパク質は、１５６アミノ酸からなるリボゾーマルタンパク質であり、ユビキチンドメインとリボゾーマルドメインを有する。ＲＰＳ２７ａ／ＵＢＱ１５タンパク質の機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する感受性に関与する機能を有することを見出した。なお、リボゾーマルドメインが、本機能に重要であると推測される。 SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of RPS27a / UBQ15 protein derived from Arabidopsis thaliana (AT1G23410). RPS27a / UBQ15 protein is a ribosomal protein consisting of 156 amino acids and has a ubiquitin domain and a ribosomal domain. Although the function of RPS27a / UBQ15 protein was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in susceptibility to head blight. The ribosomal domain is presumed to be important for this function.
配列番号２は、イネにおけるＲＰＳ２７ａ／ＵＢＱ１５タンパク質のオルソログのアミノ酸配列を示す（Os05g0160200）。本タンパク質は、１５５アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にユビキチンドメインとリボゾーマルドメインを有する。配列番号３は、オオムギにおけるＲＰＳ２７ａ／ＵＢＱ１５タンパク質のオルソログのアミノ酸配列を示す（M60176、Barley ubiquitin (mub2) gene, complete cds. CDS 750..1217）。本タンパク質は、１５５アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にユビキチンドメインとリボゾーマルドメインを有する。図１のアライメントに示すように、これら３つのタンパク質は非常に相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する感受性に関与する機能を有するといえる。 SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of an ortholog of RPS27a / UBQ15 protein in rice (Os05g0160200). This protein is a protein consisting of 155 amino acids and similarly has a ubiquitin domain and a ribosomal domain. SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of the ortholog of RPS27a / UBQ15 protein in barley (M60176, Barley ubiquitin (mub2) gene, complete cds. CDS 750..1217). This protein is a protein consisting of 155 amino acids and similarly has a ubiquitin domain and a ribosomal domain. As shown in the alignment of FIG. 1, these three proteins are very homologous. Therefore, it can be said that these orthologs also have a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号４は、シロイヌナズナ由来のタンパク質であって、ＡＮＡＣ０７４と呼ばれる全長３５２アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を示す（AT4G28530）。ＮＡＣドメインを有する。機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する感受性に関与する機能を有することを見出した。なお、ＮＡＣドメインが、本機能に重要であると推測される。 SEQ ID NO: 4 shows an amino acid sequence of a protein derived from Arabidopsis thaliana and consisting of a total length of 352 amino acids called ANAC074 (AT4G28530). Has a NAC domain. Although the function was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in susceptibility to head blight. Note that the NAC domain is presumed to be important for this function.
配列番号５は、イネにおけるＡＮＡＣ０７４のオルソログのアミノ酸配列を示す（Os04t0515900（Similar to NAM / CUC2-like protein））。本タンパク質は、２７８アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にＮＡＣドメインを有する。配列番号６は、オオムギにおけるＡＮＡＣ０７４のオルソログのアミノ酸配列を示す（AM500855、Hordeum vulgare subsp. vulgare mRNA for NAC transcription factor (nac1 gene). CDS 361..1275）。本タンパク質は、３０４アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にＮＡＣドメインを有する。図２のアライメントに示すように、ＮＡＣドメイン近辺において、これら３つのタンパク質は非常に相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する感受性に関与する機能を有するといえる。 SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of the orthologue of ANAC074 in rice (Os04t0515900 (Similar to NAM / CUC2-like protein)). This protein is a protein consisting of 278 amino acids and similarly has a NAC domain. SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of an ortholog of ANAC074 in barley (AM500855, Hordeum vulgare subsp. Vulgare mRNA for NAC transcription factor (nac1 gene). CDS 361..1275). This protein is a protein consisting of 304 amino acids and similarly has a NAC domain. As shown in the alignment of FIG. 2, these three proteins are very homologous near the NAC domain. Therefore, it can be said that these orthologs also have a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号７は、シロイヌナズナ由来のタンパク質であって、ＰＲＥ１と呼ばれる全長９２アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を示す（AT5G39860）。本タンパク質は、ｂＨＬＨ（basic Helix-Loop-Helix）ドメインを有する。機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する感受性に関与する機能を有することを見出した。 SEQ ID NO: 7 shows an amino acid sequence of a protein derived from Arabidopsis thaliana and consisting of a total length of 92 amino acids called PRE1 (AT5G39860). This protein has a bHLH (basic Helix-Loop-Helix) domain. Although the function was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号８は、イネにおけるＰＲＥ１のオルソログのアミノ酸配列を示す（Os03g0171300 (Similar to DNA-binding protein-like)）。本タンパク質は、９２アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にｂＨＬＨドメインを有する。配列番号９は、オオムギにおけるＰＲＥ１のオルソログのアミノ酸配列を示す（AK252900、Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA clone: FLbaf180m01, mRNA ）。本タンパク質は、８８アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にｂＨＬＨドメインを有する。図３のアライメントに示すように、これら３つのタンパク質は非常に相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する感受性に関与する機能を有するといえる。 SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of the ortholog of PRE1 in rice (Os03g0171300 (Similar to DNA-binding protein-like)). This protein is a protein consisting of 92 amino acids and similarly has a bHLH domain. SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of the ortholog of PRE1 in barley (AK252900, Hordeum vulgare subsp. Vulgare cDNA clone: FLbaf180m01, mRNA). This protein is a protein consisting of 88 amino acids and similarly has a bHLH domain. As shown in the alignment of FIG. 3, these three proteins are very homologous. Therefore, it can be said that these orthologs also have a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号１０は、シロイヌナズナ由来の、ＤＵＦ２９５−１と呼ばれる全長３５９アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を示す（AT5G54550）。また、配列番号１１は、シロイヌナズナ由来の、ＤＵＦ２９５−２と呼ばれる全長３６２アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を示す（AT5G52940）。配列番号１２は、シロイヌナズナ由来の、ＤＵＦ２９５−３と呼ばれる全長３５８アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を示す（AT5G53230）。これら３つのタンパク質は、いずれも機能未知のＤＵＦドメインを有するが、その機能については十分にわかっていなかった。今回本発明者らは、これら３つのタンパク質について、赤かび病に対する感受性に関与する機能を有することを見出した。 SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of a protein consisting of 359 amino acids, called DUF295-1, derived from Arabidopsis thaliana (AT5G54550). SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of a protein consisting of 362 amino acids, called DUF295-2, derived from Arabidopsis thaliana (AT5G52940). SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of a protein consisting of 358 amino acids, called DUF295-3, derived from Arabidopsis thaliana (AT5G53230). These three proteins all have DUF domains whose functions are unknown, but their functions have not been fully understood. The present inventors have found that these three proteins have a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号３７は、シロイヌナズナ由来のＥＲＦ０７１タンパク質のアミノ酸配列を示す（AT2G47520）。ＥＲＦ０７１タンパク質は、１７１アミノ酸からなるタンパク質である。ＥＲＦ０７１タンパク質の機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する感受性に関与する機能を有することを見出した。 SEQ ID NO: 37 shows the amino acid sequence of ERF071 protein derived from Arabidopsis thaliana (AT2G47520). The ERF071 protein is a protein consisting of 171 amino acids. Although the function of ERF071 protein was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号３８は、イネにおけるＥＲＦ０７１タンパク質のオルソログのアミノ酸配列を示す（Os01g0313300-01）。本タンパク質は、２０７アミノ酸からなるタンパク質であり、シロイヌナズナ由来のＥＲＦ０７１タンパク質の全長アミノ酸配列を用いてBlastPを行うと、本タンパク質がE-value 3e-21、Score 99でヒットする。配列番号３９は、オオムギにおけるＥＲＦ０７１タンパク質のオルソログのアミノ酸配列を示す（AK251681 Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA clone: FLbaf129h12, mRNA）。本タンパク質は、３６９アミノ酸からなるタンパク質であり、シロイヌナズナ由来のＥＲＦ０７１タンパク質の全長アミノ酸配列を用いてBlastPを行うと、本タンパク質がE-value 1e-28、Score 122でヒットする。これら３つのタンパク質は相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する感受性に関与する機能を有するといえる。 SEQ ID NO: 38 shows the amino acid sequence of the ortholog of ERF071 protein in rice (Os01g0313300-01). This protein is a protein consisting of 207 amino acids. When BlastP is performed using the full-length amino acid sequence of ERF071 protein derived from Arabidopsis thaliana, this protein hits with E-value 3e-21 and Score 99. SEQ ID NO: 39 shows the amino acid sequence of the orthologue of ERF071 protein in barley (AK251681 Hordeum vulgare subsp. Vulgare cDNA clone: FLbaf129h12, mRNA). This protein is a protein consisting of 369 amino acids. When BlastP is performed using the full-length amino acid sequence of ERF071 protein derived from Arabidopsis thaliana, this protein hits with E-value 1e-28 and Score 122. These three proteins are highly homologous. Therefore, it can be said that these orthologs also have a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号４０は、シロイヌナズナ由来のＡＮＡＣ０７９タンパク質のアミノ酸配列を示す（AT2G47520）。ＡＮＡＣ０７９タンパク質は、３２９アミノ酸からなるタンパク質である。ＡＮＡＣ０７９タンパク質の機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する感受性に関与する機能を有することを見出した。 SEQ ID NO: 40 shows the amino acid sequence of the ANAC079 protein derived from Arabidopsis thaliana (AT2G47520). The ANAC079 protein is a protein consisting of 329 amino acids. Although the function of the ANAC079 protein was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in susceptibility to head blight.
配列番号４１は、イネにおけるＡＮＡＣ０７９タンパク質のオルソログのアミノ酸配列を示す（Os04g0460600）。本タンパク質は、１８６アミノ酸からなるタンパク質であり、シロイヌナズナ由来のＡＮＡＣ０７９タンパク質の全長アミノ酸配列を用いてBlastPを行うと、本タンパク質がE-value 6e-77、Score 284でヒットする。配列番号４２は、オオムギにおけるＡＮＡＣ０７９タンパク質のオルソログのアミノ酸配列を示す（AK250475 Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA clone: FLbaf77e13, mRNA）。本タンパク質は、３０４アミノ酸からなるタンパク質であり、シロイヌナズナ由来のＡＮＡＣ０７９タンパク質の全長アミノ酸配列を用いてBlastPを行うと、本タンパク質がE-value 1e-51、Score 200でヒットする。これら３つのタンパク質は相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する感受性に関与する機能を有するといえる。 SEQ ID NO: 41 shows the amino acid sequence of an ortholog of the ANAC079 protein in rice (Os04g0460600). This protein is a protein consisting of 186 amino acids. When BlastP is performed using the full-length amino acid sequence of the ANAC079 protein derived from Arabidopsis thaliana, this protein hits with E-value 6e-77 and Score 284. SEQ ID NO: 42 shows the amino acid sequence of the orthologue of ANAC079 protein in barley (AK250475 Hordeum vulgare subsp. Vulgare cDNA clone: FLbaf77e13, mRNA). This protein is a protein consisting of 304 amino acids. When BlastP is performed using the full-length amino acid sequence of the ANAC079 protein derived from Arabidopsis thaliana, this protein hits with E-value 1e-51 and Score 200. These three proteins are highly homologous. Therefore, it can be said that these orthologs also have a function involved in susceptibility to head blight.
上記（ｂ）の遺伝子は、配列番号１〜１２，３７〜４２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に関して、機能的に同等（同一および／または類似）の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等を意図しており、赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、上記機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入法により欠失、置換、若しくは付加できる程度の数をいい、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内である。変異を導入したタンパク質が植物に所望の形質を付与するかどうかは、そのタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し、その植物が赤かび病に対して抵抗性を示すかどうか調べることにより判断できる。また、ここにいう「変異」は、主には部位特異的突然変異誘発法等により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。 The gene of (b) above is a functionally equivalent (identical and / or similar) mutant, derivative, variant or homolog, ortholog, etc. with respect to the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1-12, 37-42. The specific sequence is not limited as long as it is intended and encodes a protein involved in susceptibility to head blight. Here, the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is not limited as long as the above functions are not lost, but may be performed by known mutagenesis methods such as site-directed mutagenesis. It refers to the number that can be deleted, substituted, or added, and is usually within 30 amino acids, preferably within 20 amino acids, more preferably within 10 amino acids, and most preferably within 5 amino acids. Whether or not a protein with a mutation imparts a desired trait to a plant can be determined by suppressing the expression of the gene encoding the protein and examining whether the plant is resistant to head blight . The “mutation” here means a mutation artificially introduced mainly by site-directed mutagenesis or the like, but it may be a naturally occurring similar mutation.
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。 The amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids having amino acids (C, M), amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains The amino acids (H, F, Y, W) that can be used can be listed (the parentheses indicate the single letter of the amino acid). It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by other amino acids of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence maintains its biological activity. Yes.
上記（ｃ）の遺伝子も、配列番号１〜１２，３７〜４２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に関して、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等を意図しており、赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。アミノ酸配列の相同性は、アミノ酸配列全体（若しくは機能発現に必要な領域）で、少なくとも７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990) を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。 The gene (c) is also intended to be a functionally equivalent mutant, derivative, variant or homolog, ortholog, etc. with respect to the proteins having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42. The specific sequence is not limited as long as it encodes a protein involved in susceptibility to a disease. The homology of amino acid sequences is at least 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%) in the entire amino acid sequence (or a region necessary for functional expression). , 98%, 99% or more). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Yes. When analyzing a base sequence by BLASTN, parameters are set to score = 100 and wordlength = 12, for example. Further, when the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known. In order to align the base sequence or amino acid sequence to be compared with each other in an optimal state, addition or deletion (for example, a gap) may be allowed.
上記（ｄ）の遺伝子について、配列番号１９は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＲＰＳ２７ａ／ＵＢＱ１５タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（ＯＲＦ）を示す。以下、同様に、配列番号２０〜３０のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２〜１２に示すアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（ＯＲＦ）を示す。また、配列番号４３〜４８のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号３７〜４２に示すアミノ酸配列のタンパク質をコードする塩基配列（ＯＲＦ）を示す。 Regarding the gene (d) above, SEQ ID NO: 19 shows the base sequence (ORF) of the gene encoding the RPS27a / UBQ15 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Hereinafter, similarly, the polynucleotides of SEQ ID NOs: 20 to 30 represent the base sequences (ORFs) of genes encoding the proteins of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 12, respectively. Moreover, the polynucleotide of sequence number 43-48 shows the base sequence (ORF) which codes the protein of the amino acid sequence shown to sequence number 37-42, respectively.
上記（ｅ）遺伝子は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを意図している。 The gene (e) is intended to be a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the polynucleotides (a) to (d).
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。また、より具体的には、0.25M Na2HPO4, pH7.2, 7%SDS, 1mM EDTA, 1×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに20mM Na2HPO4, pH7.2, 1%SDS, 1mM EDTAからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができ、また、配列番号１等に示す塩基配列との相同性は、FASTA検索やBLAST検索により決定することができる。なお、ポリヌクレオチドの塩基配列は、Science, 214: 1205 (1981)に記載されたジデオキシ法により決定され得る。 Here, stringent conditions refer to conditions in which a so-called base sequence-specific double-stranded polynucleotide is formed and a non-specific double-stranded polynucleotide is not formed. In other words, conditions for hybridizing at a temperature ranging from the melting temperature (Tm value) of highly homologous nucleic acids, for example, perfectly matched hybrids, to 15 ° C, preferably 10 ° C, more preferably 5 ° C lower. It can be said. For example, the hybridization can be carried out in a general hybridization buffer at 68 ° C. for 20 hours. More specifically, the temperature is 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably in a buffer solution composed of 0.25M Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, 1 × Denhardt's solution. Is hybridized at 68 ° C. for 16 to 24 hours, and further in a buffer solution composed of 20 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA at a temperature of 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C. More preferably, there may be mentioned conditions in which washing is performed twice for 15 minutes under the condition of 68 ° C. Those skilled in the art can refer to Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)), etc. Such a gene can be easily obtained, and the homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the like can be determined by FASTA search or BLAST search. The nucleotide sequence of the polynucleotide can be determined by the dideoxy method described in Science, 214: 1205 (1981).
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。勿論、同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。 As used herein, the term “gene” is used interchangeably with “polynucleotide”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides. Here, the gene may be present in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or RNA (eg, mRNA). DNA or RNA may be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand). Further, the gene may be chemically synthesized, and the codon usage may be changed so that expression of the encoded protein is improved. Of course, substitution can be made between codons encoding the same amino acid.
また、本発明に利用する遺伝子・タンパク質を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；東洋紡績製，Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech製，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。 In addition, as a method for obtaining a gene / protein used in the present invention, a commonly used polynucleotide modification method may be used. That is, a polynucleotide having the genetic information of a desired recombinant protein can be produced by substituting, deleting, inserting and / or adding a specific base of the polynucleotide having the genetic information of the protein. As a specific method for converting the base of the polynucleotide, for example, a commercially available kit (KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit; Toyobo, Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech, QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene Or the use of polymerase chain reaction (PCR). These methods are known to those skilled in the art.
また、本発明に利用する遺伝子は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。 In addition, the gene used in the present invention may be composed only of a polynucleotide encoding the above protein, but other base sequences may be added thereto. The base sequence to be added includes, but is not limited to, a label (for example, histidine tag, Myc tag, or FLAG tag), a fusion protein (for example, streptavidin, cytochrome, GST, GFP, or MBP), a promoter sequence, and a signal Examples thereof include a base sequence encoding a sequence (eg, endoplasmic reticulum transition signal sequence, secretory sequence, etc.). The site to which these base sequences are added is not particularly limited and may be, for example, the N-terminus or C-terminus of the translated protein.
本発明の方法の対象となる植物としては、赤かび病に感染する植物であれば特に制限はなく、イネ科植物が好ましく、ムギ類植物がより好ましい。例えばイネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、アワ、モロコシ、シロイヌナズナ等を挙げることができる。 The plant to be subjected to the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a plant infected with head blight. Gramineae plants are preferable, and wheat plants are more preferable. Examples thereof include rice, wheat, barley, rye, corn, oat, millet, sorghum, and Arabidopsis.
また、本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、細胞、カルス、それを酵素処理して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the present invention, the plant material to be transformed is, for example, plant tissues such as roots, stems, leaves, seeds, embryos, ovules, ovary, shoot tips, buds, pollen, etc., sections thereof, cells, Examples include callus and plant cells such as proplasts obtained by removing the cell wall by enzyme treatment, but are not limited thereto.
「赤かび病」とは、フザリウム・グラミネアラムを原因菌とする麦類赤かび病を意図しているが、本発明は、特にタイプＢのトリコテセンカビ毒を産生する赤かび病菌が原因となる赤かび病に対する効果が高く、さらにはＤＯＮおよび／またはＮＩＶを産生する赤かび病菌が原因となる赤かび病に対する効果がより高いため、好ましい。 “Red mold” is intended to be wheat fungus caused by Fusarium graminearum. However, the present invention is particularly effective for red mold caused by type B trichothecene fungus poison. It is preferable because it has a high effect on mold rot, and further has a higher effect on mold rot caused by DON and / or NIV-producing mold.
「遺伝子の発現を抑制する」とは、対象とする植物内において、上記遺伝子がコードするタンパク質が産生されず、あるいは産生量が減少すればよく、発現抑制以外にも遺伝子破壊等を含む。また上記遺伝子のＤＮＡからｍＲＮＡへの転写工程を阻害するものであってもよいし、遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳工程を阻害するものであってもよい。また、その阻害の程度としても、特に制限はなく、結果として、上記遺伝子の発現抑制を受けた植物が、赤かび病に対する抵抗性を示すようになればよい。 “Suppressing gene expression” means that the protein encoded by the gene is not produced in the target plant, or the production amount may be reduced, and includes gene disruption in addition to expression suppression. Moreover, the transcription | transfer process from DNA of said gene to mRNA may be inhibited, and the translation process from mRNA of a gene to protein may be inhibited. Moreover, there is no restriction | limiting in particular also as the grade of the inhibition, As a result, the plant which received the expression suppression of the said gene should just show resistance to a head blight.
遺伝子の発現を抑制する手法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、共抑制法およびリボザイム法から選択されるいずれかの手法により行なわれることが好ましい。 The method for suppressing gene expression is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include RNAi method, antisense method, gene disruption method, co-suppression method and ribozyme method. It is preferably performed by any method.
ＲＮＡｉ法を利用する場合であれば、例えば、ＲＮＡｉベクターを用いて、上記遺伝子の発現時に、ＲＮＡｉ効果により、上記遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する方法を挙げることができる。かかる手法は、上記遺伝子の発現を該遺伝子の塩基配列と同一若しくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡによるRNA interference（ＲＮＡｉ）によって抑制するものである。 In the case of using the RNAi method, for example, there can be mentioned a method of introducing DNA encoding RNA that suppresses the expression of the gene by the RNAi effect at the time of expression of the gene using an RNAi vector. This technique suppresses the expression of the gene by RNA interference (RNAi) caused by double-stranded RNA having the same or similar sequence as the base sequence of the gene.
ＲＮＡｉベクターとしては、植物においてＲＮＡｉを引き起こすｄｓＲＮＡをヘアピン型ｄｓＲＮＡとして発現するベクターが好適に利用できる。これは数塩基以上のリンカー（スペーサー）配列の両端にＩＲ（inverted repeat：逆位反復）となるようにｄｓＲＮＡ形成部分に対応したＤＮＡ配列を配置し、植物体内で高発現するプロモーターによりヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写し、細胞内でｓｉＲＮＡを産生するシステムである。また、ｓｉＲＮＡ発現システムには上記のようなヘアピンタイプのほか、タンデムタイプも利用可能である。タンデムタイプでは、２つのプロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが転写され、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを産生する。ＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、配列番号１９〜３０の塩基配列中の連続した１５〜４９塩基、好ましくは１５〜３５塩基、さらに好ましくは２１〜３０塩基を含む塩基配列およびその相補配列が用いられる。 As the RNAi vector, a vector that expresses dsRNA that causes RNAi in plants as a hairpin dsRNA can be preferably used. In this method, a DNA sequence corresponding to a dsRNA forming portion is arranged at both ends of a linker (spacer) sequence of several bases or more so as to be IR (inverted repeat), and a hairpin type dsRNA by a promoter highly expressed in a plant body. Is a system for producing siRNA in a cell. In addition to the hairpin type as described above, a tandem type can be used for the siRNA expression system. In the tandem type, sense RNA and antisense RNA are transcribed from two promoters, and hybridize in cells to produce siRNA. The double-stranded RNA sequence causing RNAi is, for example, a base sequence comprising 15 to 49 bases, preferably 15 to 35 bases, more preferably 21 to 30 bases in the base sequence of SEQ ID NOs: 19 to 30 and its Complementary sequences are used.
例えば、本発明において用いるＲＮＡｉベクターとしては、配列番号１９〜３０のいずれかに示す塩基配列中の連続した１５〜４９塩基（好ましくは１５〜３５塩基、さらに好ましくは２１〜３０塩基）の塩基配列と該塩基配列の相補配列とを含むベクターや配列番号１〜１２のいずれかに示す塩基配列に相同なＤＮＡ配列を、スペーサーをはさんで１５〜４９塩基（好ましくは１５〜３５塩基、さらに好ましくは２１〜３０塩基）のＩＲとなるように同一のベクター上に含むものが好ましい。このようなＲＮＡｉベクターとして、例えば、COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANIZATION 社のベクター等が知られている（WO 99/53050、特表2002-511258、特開2002-51602、特開2004-52642）。 For example, as an RNAi vector used in the present invention, a base sequence of 15 to 49 bases (preferably 15 to 35 bases, more preferably 21 to 30 bases) in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 30 And a DNA sequence homologous to the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 12 or a vector containing the nucleotide sequence and a complementary sequence of the nucleotide sequence, 15 to 49 bases (preferably 15 to 35 bases, more preferably, sandwiching the spacer) Are preferably contained on the same vector so as to have an IR of 21 to 30 bases). As such RNAi vectors, for example, vectors of COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANIZATION, etc. are known (WO 99/53050, Special Tables 2002-511258, JP 2002-51602, JP 2004-52642).
上述したＲＮＡｉベクターの植物細胞への導入は、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等の公知の手法を用いることができ、形質転換されたタバコ属植物は、ベクター内に連結されたレポーター遺伝子や選抜マーカー遺伝子により容易に選抜される。 The RNAi vector described above can be introduced into plant cells using a known method such as the Agrobacterium method, polyethylene glycol method, electroporation method, etc. The transformed tobacco genus plant is ligated into the vector. It is easily selected by the reporter gene and the selection marker gene.
アンチセンス法を利用する場合であれば、上記遺伝子の転写産物の一部または全てと相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する方法を挙げることができる。かかる手法は、植物における上記遺伝子（以下、標的遺伝子という場合がある）の発現を、該遺伝子の転写産物の一部または全てと相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを導入して抑制するものである。 In the case of using the antisense method, a method of introducing a DNA encoding an antisense RNA complementary to a part or all of the transcription product of the gene can be mentioned. This technique suppresses the expression of the above-described gene (hereinafter sometimes referred to as a target gene) in a plant by introducing a DNA encoding an antisense RNA complementary to a part or all of the transcription product of the gene. It is.
植物内で、上記遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を発現させる方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の手法を適宜利用することができる。例えば、上記遺伝子の少なくとも一部を、プロモーターの下流にアンチセンス方向に連結した発現カセットを構築し、上記発現カセットを植物細胞内に導入する方法などが挙げられる。上記発現カセットの構築方法としては、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、植物内で転写可能なプロモーター配列、上記アンチセンスＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡ断片、および必要に応じて適宜ターミネーター配列等を連結することにより構築できる。また、上記発現カセットを植物細胞内に導入する方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等、当業者に公知の手法を利用できる。また、上記発現カセットは、ベクターを介して植物細胞内に導入されてもよい。例えば、適切なベクターに上記発現カセットをクローニングし、上記ベクターをアグロバクテリウムに取り込ませ、それを植物細胞に感染させることにより、上記発現カセットを植物細胞内に導入できる。 The method for expressing an antisense RNA strand complementary to at least a part of the mRNA of the above gene in a plant is not particularly limited, and methods known to those skilled in the art can be appropriately used. For example, a method of constructing an expression cassette in which at least a part of the gene is linked in the antisense direction downstream of the promoter and introducing the expression cassette into a plant cell can be mentioned. The method for constructing the expression cassette can be appropriately selected according to the purpose. For example, a promoter sequence that can be transcribed in a plant, a DNA fragment encoding the antisense RNA strand, and a terminator as necessary. It can be constructed by linking sequences and the like. Further, the method for introducing the expression cassette into plant cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, those skilled in the art such as microinjection method, electroporation method, particle gun method, etc. A known method can be used. Moreover, the said expression cassette may be introduce | transduced in a plant cell via a vector. For example, the expression cassette can be introduced into a plant cell by cloning the expression cassette into an appropriate vector, incorporating the vector into Agrobacterium, and infecting the plant cell with it.
アンチセンスＲＮＡが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成による転写開始阻害等、複数のものが知られており、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する。本発明において利用するアンチセンスＲＮＡは、上記いずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。 Antisense RNA suppresses target gene expression in several ways, including the inhibition of transcription initiation by triplex formation, and by inhibiting various processes such as transcription, splicing or translation, the target gene Suppresses the expression of The antisense RNA used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the above actions.
アンチセンスＲＮＡの塩基配列は、標的遺伝子の転写産物の一部または全てと相補的な配列であるのが好ましいが、標的遺伝子の発現を有効に抑制できる限り、完全に相補的でなくともよい。例えば、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの相補的ＤＮＡ鎖と標的遺伝子との配列同一性は好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。ここで配列同一性とは、比較対象の少なくとも２つの配列について適切に整列化させ、それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、次いで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、上記適合部位の数を割り、得られた数値に１００をかけることにより算出されうる値をいう。かかる配列同一性は、具体的には、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において、一般に利用可能であるＢＬＡＳＴアルゴリズムにより算出されうる。アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの長さは、特に限定はなく、所望により適宜決定すればよいが、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、さらには２．５ｋｂよりも短いことが好ましい。例えば、配列番号１９〜３０のいずれかに示す塩基配列中の連続した１００塩基以上からなる塩基配列をアンチセンス方向に含む遺伝子発現抑制用ベクターを挙げることができる。 The base sequence of the antisense RNA is preferably a sequence complementary to part or all of the transcript of the target gene, but may not be completely complementary as long as the expression of the target gene can be effectively suppressed. For example, the sequence identity between the complementary DNA strand of the DNA encoding the antisense RNA and the target gene is preferably 90% or more, more preferably 95% or more. Here, the sequence identity is determined by appropriately aligning at least two sequences to be compared, determining the same residues present in each sequence, determining the number of matching sites, and then comparing A value that can be calculated by dividing the number of matching sites by the total number of residues in the sequence region and multiplying the obtained value by 100. Specifically, such sequence identity can be calculated by a BLAST algorithm that is generally available, for example, at the home page address http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. The length of the DNA encoding the antisense RNA is not particularly limited and may be appropriately determined as desired. To effectively inhibit the expression of the target gene, the length of the antisense DNA is at least 15 bases. It is above, Preferably it is 100 bases or more, More preferably, it is 500 bases or more. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, and more preferably shorter than 2.5 kb. For example, the vector for gene expression suppression which contains the base sequence which consists of 100 or more continuous base sequences in the base sequence shown in either of sequence number 19-30 in an antisense direction can be mentioned.
遺伝子破壊法を利用する場合であれば、上記遺伝子の構造遺伝子領域、あるいは調節遺伝子領域に、塩基の置換、欠失、および／または挿入を生じさせることで、上記遺伝子の機能を破壊して発現を抑制させる方法を挙げることができる。 If the gene disruption method is used, the gene function is disrupted and expressed by causing base substitution, deletion, and / or insertion in the structural gene region or regulatory gene region of the gene. The method of suppressing can be mentioned.
上記遺伝子の構造遺伝子領域、或いは調節遺伝子領域（例えば、プロモーター等）に、塩基の挿入を生じさせる方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の手法を適宜利用することができ、例えば、Ｔ−ＤＮＡタギング法（Koncz Cら、（1989）Proc Natl Acad Sci USA. 86（21）:8467-71参照）等を利用することができる。上記Ｔ−ＤＮＡタギング法は、Ｔ−ＤＮＡを外部からゲノム遺伝子へ挿入し、その遺伝子の発現を抑える方法である。ここで、上記Ｔ−ＤＮＡは、少なくともその両端に、一定の境界領域（ＲＢ、ＬＢと称される約２５ｂｐからなる同一方向の反復配列）を含んでなるものであればよく、内部の遺伝子は他の遺伝子に置き換えられていてもよい。また、上記Ｔ−ＤＮＡタギング法に用いるベクターは、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＧＰＴＶ−ｂａｒ（Becker Dら，（1992）Plant Mol Biol.20:1195-1197参照）等を使用することができる。上記ベクターは、当業者に公知の手法により植物細胞内に導入することができ、例えば、上記ベクターをアグロバクテリウムに取り込ませ、それを植物細胞に感染させることにより、植物細胞内に導入することができる。 The method for causing base insertion in the structural gene region of the above gene or the regulatory gene region (for example, promoter) is not particularly limited, and methods known to those skilled in the art can be appropriately used. The T-DNA tagging method (see Koncz C et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA. 86 (21): 8467-71) can be used. The T-DNA tagging method is a method in which T-DNA is inserted into a genomic gene from the outside to suppress the expression of the gene. Here, the T-DNA may be any one as long as it comprises a fixed border region (repeated sequence of about 25 bp called RB, LB in the same direction) at both ends. It may be replaced with another gene. Moreover, the vector used for the T-DNA tagging method is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, pGPTV-bar (Becker D et al., (1992) Plant Mol Biol. 20: 1195- 1197) can be used. The vector can be introduced into a plant cell by a technique known to those skilled in the art. For example, the vector can be introduced into a plant cell by incorporating Agrobacterium and infecting the plant cell with the vector. Can do.
上記Ｔ−ＤＮＡタギング法により、Ｔ−ＤＮＡを、対象とする植物のゲノムにランダムに挿入し、得られた複数種の変異体の中から、赤かび病に対する抵抗性を示す変異体を選抜することにより、赤かび病に対する抵抗性植物を得ることができる。赤かび病に対する抵抗性を示す変異体を選抜する方法としては、特に制限はなく、例えば、実施例に記載したような、赤かび病や赤かび病毒素に対する感受性／抵抗性試験等を利用して選抜を行うことができる。 By the T-DNA tagging method, T-DNA is randomly inserted into the genome of the target plant, and a mutant exhibiting resistance to head blight is selected from the plurality of mutants obtained. Thus, a plant resistant to head blight can be obtained. There is no particular limitation on the method for selecting mutants exhibiting resistance to head blight, and for example, a sensitivity / resistance test for head blight and head blight toxin as described in the Examples is used. Can be selected.
また、上記遺伝子の構造遺伝子領域、或いは調節遺伝子領域（例えば、プロモーター等）に、塩基の置換又は欠失を生じさせる方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の手法を適宜利用することができる。例えば、放射線照射、中性子線照射等の手法を利用することができる。これらの手法により得られた複数種の変異体の中から、赤かび病に対する抵抗性を示す変異体を選抜することにより、赤かび病に対する抵抗性植物を得ることができる。 Moreover, there is no restriction | limiting in particular as a method of producing base substitution or deletion in the structural gene region of the said gene, or a regulatory gene region (for example, a promoter etc.), A technique well-known to those skilled in the art should be utilized suitably. Can do. For example, techniques such as radiation irradiation and neutron beam irradiation can be used. By selecting a mutant exhibiting resistance to head blight from a plurality of types of mutants obtained by these techniques, a plant resistant to head blight can be obtained.
共抑制法を利用する場合は、タンパク質の発現時に、共抑制効果により、上記タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する方法を挙げることができる。この手法は、植物における上記遺伝子の発現を該遺伝子の塩基配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡを植物に導入することによって生ずる共抑制によって抑制するものである。発現時に、共抑制効果により、上記遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、上記したような配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、それらのＤＮＡの変異体、誘導体、バリアントまたはホモログが挙げられる。共抑制に用いるＤＮＡの塩基配列は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。配列の同一性は上記方法により求められる。なお、共抑制法については、例えば、文献（Napoli, C. et al.(1990), Plant Cell 2, 279-289、Van Der Krol, A. R. et al (1990), Plant Cell 2, 291-299参照）を参考にできる。 When using the co-suppression method, a method of introducing DNA encoding RNA that suppresses the expression of the gene encoding the protein due to the co-suppression effect during protein expression can be mentioned. This technique suppresses the expression of the gene in a plant by co-suppression caused by introducing into the plant a DNA having the same or similar sequence as the base sequence of the gene. Examples of DNA encoding RNA that suppresses the expression of the gene at the time of expression due to a co-suppression effect include, for example, DNA encoding the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 12, and DNAs thereof Or mutants, derivatives, variants or homologues thereof. The base sequence of DNA used for co-suppression need not be completely identical to the target gene, but preferably has a sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more. Sequence identity is determined by the above method. For the co-suppression method, see, for example, literature (Napoli, C. et al. (1990), Plant Cell 2, 279-289, Van Der Krol, AR et al (1990), Plant Cell 2, 291-299. ).
リボザイム法を利用する場合は、上記遺伝子の転写産物を切断するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する方法を挙げることができる。リボザイムには種々の活性を有するものが存在する。例えば、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。これらのリボザイムを用いて、公知の方法に従って、標的遺伝子のｍＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムをコードするＤＮＡの設計が可能である。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムであれば、文献（Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989）を参酌できる。また、ヘアピン型リボザイムであれば、文献（Buzayan, Nature 323: 349,1986、Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, および菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992）が参考となる。 In the case of utilizing the ribozyme method, a method for introducing DNA encoding RNA having ribozyme activity that cleaves the transcription product of the above gene can be mentioned. There are ribozymes having various activities. For example, there are those having a size of 400 nucleotides or more, such as a group I intron type or M1 RNA contained in RNaseP, but there are also those having an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. Using these ribozymes, it is possible to design a DNA encoding a ribozyme that cleaves the mRNA of the target gene in a site-specific manner according to a known method. For example, for hammerhead ribozymes, the literature (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 228: 225, 1988, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990, Koizumi et. Al., Nucleic Acids. Res. 17: 7059, 1989). For hairpin ribozymes, the literature (Buzayan, Nature 323: 349, 1986, Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, and Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992) Become.
標的遺伝子のｍＲＮＡを切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターなどのプロモーターの下流に連結して用いればよい。その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Taira et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、Taira et. al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991）。 A ribozyme designed to cleave the mRNA of the target gene may be used by linking it downstream of a promoter such as the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter so that it can be transcribed in plant cells. At this time, if an extra sequence is added to the 5 'end or 3' end of the transcribed RNA, the ribozyme activity may be lost. In such a case, in order to accurately cut out only the ribozyme portion from the RNA containing the transcribed ribozyme, another trimming ribozyme acting in cis for trimming is arranged on the 5 ′ side or 3 ′ side of the ribozyme portion. (Taira et. Al., Protein Eng. 3: 733, 1990, Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989, Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19 : 3875, 1991, Taira et. Al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991).
さらに、本発明において遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。 Furthermore, suppression of gene expression in the present invention can also be achieved by transforming a gene having a dominant negative trait of the target gene into a plant. A gene having a dominant negative trait refers to a gene having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type gene inherent in a plant by expressing the gene.
本発明の方法では、上記のような態様で、上記（ａ）〜（ｅ）遺伝子に改変（破壊）をもたらし得るポリヌクレオチド、または上記（ａ）〜（ｅ）遺伝子の発現抑制をもたらし得るポリヌクレオチドを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、該細胞から形質転換植物を再生させることにより、赤かび病抵抗性植物を作製できる。すなわち、本発明の方法では、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制した植物細胞を作製する工程、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含むことが好ましい。 In the method of the present invention, in the above-described manner, a polynucleotide that can cause modification (disruption) in the genes (a) to (e), or a polynucleotide that can cause expression suppression of the genes (a) to (e). A plant resistant to head blight can be produced by inserting a nucleotide into an appropriate vector, introducing it into a plant cell, and regenerating a transformed plant from the cell. That is, the method of the present invention preferably includes a step of producing a plant cell in which the expression of any of the genes (a) to (e) is suppressed, and a step of regenerating a plant from the plant cell.
上述のように形質転換した植物細胞は、当業者に公知の手法により、植物個体に再生することができる。例えば、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法などが挙げられる。 Plant cells transformed as described above can be regenerated into plant individuals by techniques known to those skilled in the art. For example, there is a method in which callus-like transformed cells are transferred to a medium with different types and concentrations of hormones and cultured to form somatic embryos to obtain complete plants.
他にも、形質転換の対象とする植物材料として植物組織、例えばリーフディスクを用いた場合、アグロバクテリウム感染後、これらを無機塩類、ビタミン類、炭素源（エネルギー源としての糖類など）、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）やカナマイシン等の選抜薬剤等を加えて滅菌した再分化固型培地上で適当な光および温度条件の下、培養することによって茎葉を形成させることができる。次に、上記固型培地より植物生長調節物質を除いた培地（発根培地）上で茎葉を培養することにより不定根を誘導し、完全な植物体へと再生することができる。なお、使用する培地としては、例えば、ＬＳ培地、ＭＳ培地などの一般的なものが挙げられる。 In addition, when plant tissues, such as leaf discs, are used as plant materials to be transformed, after infection with Agrobacterium, these are treated with inorganic salts, vitamins, carbon sources (such as sugars as energy sources), plants It is possible to form foliage by culturing under appropriate light and temperature conditions on a regenerated solid medium sterilized by adding growth regulators (plant hormones such as auxin and cytokinin) and selective drugs such as kanamycin. it can. Next, adventitious roots can be induced by culturing the foliage on a medium (rooting medium) obtained by removing the plant growth regulator from the solid medium, and regenerated into a complete plant body. In addition, as a culture medium to be used, common things, such as LS culture medium and MS culture medium, are mentioned, for example.
＜１−２．赤かび病に対する抵抗性に関与する遺伝子を利用する方法＞
本発明に係る赤かび病抵抗性植物の作製方法の他の態様としては、植物において、以下の（ｆ）〜（ｊ）のいずれかの遺伝子の発現を増大させる工程を含むものであればよく、その他の工程、条件、材料等については特に限定されるものではない。
（ｆ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｈ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号３１〜３６に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｊ）上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
<1-2. Method of Using Genes Involved in Resistance to Red Head Disease>
As another aspect of the method for producing a head blight-resistant plant according to the present invention, any plant may be used as long as it includes a step of increasing the expression of any of the following genes (f) to (j). Other processes, conditions, materials, etc. are not particularly limited.
(F) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13-18.
(G) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 13 to 18, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and is resistant to head blight. A gene that codes for the protein involved.
(H) a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 13 to 18 and involved in resistance to head blight.
(I) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 31 to 36.
(J) It hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (f) to (i) above under stringent conditions and encodes a protein involved in resistance to head blight gene.
上記（ｆ）〜（ｊ）の遺伝子は赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードしているため、植物においてこれらの遺伝子の発現を増大させることにより、植物の赤かび病に対する抵抗性を高めることができる。 Since the genes (f) to (j) above encode proteins involved in resistance to head blight, increasing the expression of these genes in the plant makes the plant resistance to head blight. Can be increased.
まず、上記（ｆ）の遺伝子について具体的に説明する。 First, the gene (f) will be specifically described.
配列番号１３は、シロイヌナズナ由来のCaleosin-related proteinと称される、全長１９２タンパク質のアミノ酸配列である（At1g70680）。このタンパク質は、Caleosin-relatedドメインを有する。このタンパク質の機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する抵抗性に関与する機能を有することを見出した。 SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of the full-length 192 protein called Caleosin-related protein derived from Arabidopsis thaliana (At1g70680). This protein has a Caleosin-related domain. Although the function of this protein was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in resistance to head blight.
配列番号１４は、イネにおけるCaleosin-related proteinのオルソログのアミノ酸配列を示す（Os06t0254700 (Caleosin related family protein)）。本タンパク質は、２１５アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にCaleosin-relatedドメインを有する。配列番号１５は、オオムギにおけるCaleosin-related proteinのオルソログのアミノ酸配列を示す（AK252155、Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA clone: FLbaf146k04, mRNA）。本タンパク質は、２１４アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にCaleosin-relatedドメインを有する。図４のアライメントに示すように、これら３つのタンパク質は非常に相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する抵抗性に関与する機能を有するといえる。 SEQ ID NO: 14 shows the amino acid sequence of the ortholog of Caleosin-related protein in rice (Os06t0254700 (Caleosin related family protein)). This protein is a protein consisting of 215 amino acids and similarly has a Caleosin-related domain. SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of the ortholog of Caleosin-related protein in barley (AK252155, Hordeum vulgare subsp. Vulgare cDNA clone: FLbaf146k04, mRNA). This protein is a protein consisting of 214 amino acids and similarly has a Caleosin-related domain. As shown in the alignment of FIG. 4, these three proteins are very homologous. Therefore, it can be said that these orthologs also have a function involved in resistance to head blight.
配列番号１６は、シロイヌナズナのMATH domain-containing proteinと称される、全長３７０タンパク質のアミノ酸配列である（At3g28220）。このタンパク質は、ＭＡＴＨドメインを有する。このタンパク質の機能については十分にわかっていなかったが、今回本発明者らは、赤かび病に対する抵抗性に関与する機能を有することを見出した。ＭＡＴＨドメインが本機能に重要であると推測される。 SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence of the full-length 370 protein called Arabidopsis MATH domain-containing protein (At3g28220). This protein has a MAT domain. Although the function of this protein was not fully understood, the present inventors have now found that it has a function involved in resistance to head blight. It is speculated that the MAT domain is important for this function.
配列番号１７は、イネにおけるMATH domain-containing proteinのオルソログのアミノ酸配列を示す（Os12t0489100(Similar to Ubiquitin-specific protease 12)）。本タンパク質は、５５１アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にＭＡＴＨドメインを有する。配列番号１８は、オオムギにおけるMATH domain-containing proteinのオルソログのアミノ酸配列を示す（AK249855、Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA clone: FLbaf52l18, mRNA）。本タンパク質は、１１１９アミノ酸からなるタンパク質であって、同様にＭＡＴＨドメインを有する。図５のアライメントに示すように、ＭＡＴＨドメイン近辺において、これら３つのタンパク質は非常に相同性が高い。それゆえ、これらオルソログについても赤かび病に対する抵抗性に関与する機能を有する蓋然性が高い。 SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of an ortholog of MATH domain-containing protein in rice (Os12t0489100 (Similar to Ubiquitin-specific protease 12)). This protein is a protein consisting of 551 amino acids and similarly has a MAT domain. SEQ ID NO: 18 shows the amino acid sequence of an ortholog of MATH domain-containing protein in barley (AK249855, Hordeum vulgare subsp. Vulgare cDNA clone: FLbaf52l18, mRNA). This protein is a protein consisting of 1119 amino acids and similarly has a MAT domain. As shown in the alignment of FIG. 5, these three proteins are very homologous near the MATH domain. Therefore, these orthologs also have a high probability of having a function related to resistance to head blight.
上記（ｇ）の遺伝子は、配列番号１３〜１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等を意図しており、赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数等としては、上述の（ｂ）遺伝子に関する記載と同様であるため、省略する。なお、変異を導入したタンパク質が植物に所望の形質を付与するかどうかは、そのタンパク質をコードする遺伝子を植物に導入発現させ、その植物が赤かび病に対する抵抗性を示すかどうか調べることにより判断できる。 The gene (g) is intended to be a functionally equivalent variant, derivative, variant or homolog, ortholog, etc. of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 to 18, and is resistant to head blight. The specific sequence is not limited as long as it encodes a protein involved in. The number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is the same as described above for the gene (b), and is therefore omitted. Whether or not a protein into which a mutation has been introduced imparts a desired trait to a plant is determined by introducing and expressing the gene encoding the protein in the plant and examining whether the plant exhibits resistance to head blight. it can.
上記（ｈ）の遺伝子も、配列番号１３〜１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等を意図しており、赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。ここで、アミノ酸配列の相同性等についての説明は、上述の（ｃ）遺伝子と同じため、省略する。 The gene (h) is also intended to be a functionally equivalent variant, derivative, variant or homolog, ortholog, etc. of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 to 18, and is resistant to head blight. The specific sequence is not limited as long as it encodes a protein involved in. Here, the explanation about the homology of the amino acid sequence and the like is the same as that of the above-mentioned (c) gene, and is omitted.
上記（ｉ）の遺伝子について、配列番号３１は、配列番号１３に示すアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子であり、以下、同様に、配列番号３２〜３６のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１４〜１８に示すアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子である。 Regarding the gene (i) above, SEQ ID NO: 31 is a gene encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and hereinafter, similarly, the polynucleotides of SEQ ID NOs: 32-36 are SEQ ID NOs: 14-18, respectively. A gene encoding a protein having the amino acid sequence shown in FIG.
上記（ｊ）遺伝子は、上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを意図している。ストリンジェントな条件等の説明は、上記＜１−１＞欄の説明と同様であるため、省略する。 The gene (j) is intended to be a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the polynucleotides (f) to (i). The description of the stringent conditions and the like is the same as that described in the section <1-1> above, and is therefore omitted.
本発明の対象となる植物をはじめ、上記＜１−１＞欄の説明を援用できる場合は、ここでの説明は省略する。 In the case where the description of the above <1-1> column can be used, including the plant that is the subject of the present invention, the description here is omitted.
「遺伝子の発現を増大させる」とは、対象とする植物内において、上記遺伝子がコードするタンパク質の産生量が増大すればよく、外部から遺伝子を形質導入する場合以外にも、内因性遺伝子の発現量を増加させる場合を含む。その増大の程度としても、特に制限はなく、結果として、上記遺伝子の発現の増大を受けた植物が、赤かび病に対する抵抗性を示すようになればよい。 “Increasing gene expression” means that the production amount of the protein encoded by the gene in the target plant should be increased. In addition to transducing the gene from the outside, expression of the endogenous gene Including the case of increasing the amount. There is no restriction | limiting in particular also as the grade of the increase, As a result, the plant which received the increase in the expression of the said gene should just show resistance to a head blight.
外部から遺伝子を形質導入する場合であれば、公知の方法を利用でき、具体的な方法は限定されないが、例えば後述する組換えベクターを植物に導入し、本遺伝子を発現させることにより、赤かび病に対する抵抗性植物を作出することができる。また、内因性遺伝子の発現量を増大させる場合は、例えば、公知の変異源を用いて、内因性遺伝子の発現量が増加している変異体を取得することにより、赤かび病に対する抵抗性植物を作出することができる。 In the case of transducing a gene from the outside, a known method can be used, and the specific method is not limited. For example, by introducing a recombinant vector described later into a plant and expressing the gene, Plants resistant to disease can be created. Moreover, when increasing the expression level of an endogenous gene, for example, by using a known mutation source, obtaining a mutant having an increased expression level of the endogenous gene, a plant resistant to head blight Can be created.
なお、外部から遺伝子を形質導入する場合は、宿主植物と同類の植物あるいは近縁種の植物由来の遺伝子を用いることが好ましい。例えば、コムギであればコムギ由来かオオムギ由来の遺伝子を用いることが好ましいといえる。 In the case of transducing a gene from the outside, it is preferable to use a gene derived from a plant similar to the host plant or a plant of a related species. For example, in the case of wheat, it may be preferable to use a gene derived from wheat or barley.
本発明において、赤かび病に対する抵抗性を付与できることが実験的に確認されたのは、シロイヌナズナだけであるが、本発明は、赤かび病に感染する植物一般、特にイネ科植物、さらにはムギ類植物に広く適用できると考えられる。これは以下の理由による。 In the present invention, only Arabidopsis thaliana has been experimentally confirmed to be able to confer resistance to head blight, but the present invention is not limited to plants infecting head blight, particularly grasses, and even wheat. It is thought that it can be widely applied to arboreal plants. This is due to the following reason.
まず、赤かび病菌は、広くイネ科植物、特にムギ類植物に感染するが、シロイヌナズナにも感染する。そして、その感染形態・病徴は、ムギ類植物のコムギとシロイヌナズナとにおいてほぼ共通することが知られている（Urban et al., Plant J., 32: 961, 2002）。特に、赤かび菌が産生するタイプＢのトリコテセン系カビ毒の作用として、タンパク質合成阻害や根の伸長阻害が知られているが、これらカビ毒の作用はシロイヌナズナとコムギにおいて同様に引き起こされる（Masuda et al., J. Exp. Bot. 58:1617, 2007）。また、シロイヌナズナのAtNFXL1遺伝子は、トリコテセンにより顕著な発現誘導を受けるが(Asano et al., Plant J., 53: 450, 2008)、オオムギ及びコムギのオルソログ遺伝子は、赤かび病菌の接種によって発現誘導を受ける(Boddu et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 20:1364, 2007; Jia et al., Mol. Plant-Microbe Interact.,22: 1366, 2009)。さらに、トリコテセンは、シロイヌナズナとコムギにおいて、エリシター活性と細胞死誘導活性を有する(Nishiuchi et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 19: 512, 2006; Desmond et al., Mol Plant Pathol.,9: 435, 2008)。 First, Fusarium head blight fungus widely infects gramineous plants, especially wheat plants, but also in Arabidopsis. It is known that the infection form and disease symptoms are almost common between wheat and Arabidopsis (Urban et al., Plant J., 32: 961, 2002). In particular, type B trichothecene fungal toxins produced by Aspergillus oryzae are known to inhibit protein synthesis and root elongation. These fungal toxins are similarly caused in Arabidopsis and wheat (Masuda). et al., J. Exp. Bot. 58: 1617, 2007). The AtNFXL1 gene of Arabidopsis thaliana is markedly induced by trichothecene (Asano et al., Plant J., 53: 450, 2008), but the ortholog gene of barley and wheat is induced by inoculation with Fusarium head blight fungus. (Boddu et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 20: 1364, 2007; Jia et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 22: 1366, 2009). Furthermore, trichothecene has elicitor activity and cell death-inducing activity in Arabidopsis and wheat (Nishiuchi et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 19: 512, 2006; Desmond et al., Mol Plant Pathol., 9: 435, 2008).
次に、本発明の実施例において機能を確認したシロイヌナズナ由来の遺伝子と類似する遺伝子は、シロイヌナズナ以外にも、イネ科植物において広く存在する。特に着目に値するのが、シロイヌナズナとは分類学的に遠縁の植物であるイネやオオムギにおいても存在することである。それゆえ、上述したシロイヌナズナ由来の遺伝子と類似する遺伝子は、赤かび病に感染する植物一般に広く存在すると考えられる。 Next, genes similar to the genes derived from Arabidopsis thaliana whose functions have been confirmed in the examples of the present invention are widely present in grasses besides Arabidopsis thaliana. Of particular note is that Arabidopsis thaliana also exists in rice and barley, which are taxonomically distantly related plants. Therefore, it is considered that genes similar to the above-mentioned genes derived from Arabidopsis thaliana are widely present in plants infected with head blight.
以上の点を考慮した上で本明細書を読めば、当業者にとっては、シロイヌナズナ以外の植物における類似遺伝子も、シロイヌナズナにおける赤かび病に対する抵抗性／感受性の遺伝子と同様に、赤かび病に対する抵抗性／感受性に関与する機能を有するものと理解できる。それゆえ、上述した各種遺伝子を種々の植物に導入したり、または植物内で発現を抑制したりすることにより、当該植物に赤かび病に対する抵抗性を付与できるといえる。なお、実施例において実証したシロイヌナズナ由来の遺伝子の類似遺伝子は、イネとオオムギにおいてのみ存在が確認されているが、今後、各植物のゲノム解析が進むにつれ、イネやオオムギ以外の植物においても、類似遺伝子が見出される可能性は高い。 After reading this specification in consideration of the above points, those skilled in the art will recognize that similar genes in plants other than Arabidopsis thaliana are resistant to head blight as well as genes for resistance / susceptibility to head blight in Arabidopsis thaliana. It can be understood as having a function related to sex / sensitivity. Therefore, it can be said that by introducing the various genes described above into various plants or suppressing the expression in the plants, the plant can be given resistance to head blight. In addition, similar genes of Arabidopsis derived genes demonstrated in the examples have been confirmed to exist only in rice and barley, but as the genome analysis of each plant progresses in the future, similarities will occur in plants other than rice and barley. The possibility of finding the gene is high.
＜２．赤かび病抵抗性植物＞
本発明にかかる赤かび病抵抗性植物は、上述の方法にて得られた植物であればよく、その他の構成は特に限定されない。換言すれば、上記（ａ）〜（ｅ）の遺伝子の発現が抑制されている植物、または上記（ｆ）〜（ｊ）の遺伝子の発現が増大している植物ともいえる。本発明の赤かび病抵抗性植物は、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、果実等）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、植物細胞、カルス等のいずれをも包含する。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
<2. Red mold resistant plant>
The head blight-resistant plant according to the present invention may be a plant obtained by the above-described method, and other configurations are not particularly limited. In other words, it can be said that the expression of the genes (a) to (e) is suppressed, or the expression of the genes (f) to (j) is increased. The head blight resistant plant of the present invention includes the whole plant body, plant organs (eg, roots, stems, leaves, petals, seeds, fruits, etc.), plant tissues (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundles). Etc.), plant cells, calli and the like. Also included are protoplasts, shoot primordia, multi-buds, and hairy roots.
また、一旦、染色体内の上記（ａ）〜（ｅ）の遺伝子が破壊乃至発現抑制された形質転換植物、あるいは染色体内に上記（ｆ）〜（ｊ）の遺伝子が組み込まれ発現が増大している形質転換植物が得られれば、上記植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。上記植物やその子孫、或いはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に上記植物を量産することもできる。また、本発明の赤かび病抵抗性植物は、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子である「Ｔ１世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。 In addition, once the above-mentioned genes (a) to (e) in the chromosome have been disrupted or expression suppressed, or the genes (f) to (j) have been incorporated into the chromosome and the expression has increased. If a transformed plant is obtained, progeny can be obtained from the plant body by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant, its progeny, or clones, and mass-produce the plant based on them. Further, the head blight-resistant plant of the present invention is a progeny plant such as “T0 generation” which is a regenerated generation that has undergone transformation treatment, or “T1 generation” which is a self-propagating seed of a T0 generation plant, This includes hybrid plants and their progeny plants that have been crossed as a single parent.
また本発明には、後述する組換えベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料も含まれ得る。 The present invention may also include a plant cell into which a recombinant vector described below is introduced, a plant containing the cell, a progeny and clone of the plant, and a propagation material for the plant, its progeny and clone. .
なお、本願出願時点において、既に知られている形質転換植物については、本願の特許請求の範囲から除かれることを念のため付言しておく。 It should be noted that already known transformed plants at the time of filing the present application are excluded from the scope of the claims of the present application.
＜３．赤かび病抵抗性植物の選抜方法＞
本発明にかかる赤かび病抵抗性植物の選抜方法は、植物において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が抑制されているか否かを判定する工程を含むものであればよい。
<3. Selection method for plants resistant to head mold>
The method for selecting a head blight-resistant plant according to the present invention is a step of determining whether or not the gene of any of the above (a) to (e) is present or whether the expression of the gene is suppressed in the plant. As long as it contains.
上記（ａ）〜（ｅ）の遺伝子は赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードしているため、植物においてこれらの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が抑制されているか否かを判定することにより、当該植物が赤かび病に対する抵抗性を有するか否かを簡易に判断できる。 Since the genes (a) to (e) above encode proteins associated with susceptibility to head blight, it is determined whether or not these genes are present in the plant or whether the expression of the genes is suppressed. Thus, it can be easily determined whether or not the plant has resistance to head blight.
具体的な判定方法については従来公知の方法を用いることができるが、例えば、(i)対象となる植物体からＤＮＡ試料を得て、遺伝子の有無または遺伝子に変異が入っており発現が抑制されているか否かを調べる方法、(ii)上記遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの有無または量を調べる方法、(iii) 上記遺伝子の転写産物であるタンパク質の有無または量を調べる方法等を挙げることができる。 As a specific determination method, a conventionally known method can be used. For example, (i) a DNA sample is obtained from a target plant, and the presence or absence of the gene or the gene is mutated to suppress the expression. (Ii) a method for examining the presence or amount of mRNA that is a transcription product of the above gene, (iii) a method for examining the presence or amount of a protein that is a transcription product of the above gene, etc. it can.
上記ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を調べる手法としては、従来公知の方法を利用でき、特に限定されないが、例えば、プローブを用いる手法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、抗体を用いた各種イムノアッセイ法、マイクロアレイを利用する方法等を挙げることができる。 As a method for examining the DNA, RNA, or protein, a conventionally known method can be used and is not particularly limited. For example, a method using a probe, a PCR method, an RT-PCR method, various immunoassay methods using an antibody, a microarray can be used. The method of utilization etc. can be mentioned.
また、本発明にかかる赤かび病抵抗性植物の選抜方法の別の態様としては、植物において、上記（ｆ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が増大しているか否かを判定する工程を含むものであってもよい。 Another aspect of the method for selecting a head blight resistant plant according to the present invention is that the presence or absence of any of the genes (f) to (g) in the plant or the expression of the gene is increased. It may include a step of determining whether or not.
上記（ｆ）〜（ｇ）の遺伝子は赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードしているため、植物においてこれらの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が増大しているか否かを判定することにより、当該植物が赤かび病に対する抵抗性を有するか否かを簡易に判断できる。 Since the genes (f) to (g) above encode proteins associated with resistance to head blight, it is determined whether or not these genes are present in the plant or whether the expression of the genes is increased. By doing, it can be judged easily whether the said plant has resistance to a red mold disease.
＜４．赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法＞
本発明にかかる赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法は、赤かび病に罹病性の植物に対して、赤かび病菌が産生するタイプＢのトリコテセン系カビ毒を作用させ、当該植物における応答遺伝子を同定する第１の工程、第１の工程にて同定した遺伝子の変異体を用いて、上記タイプＢのトリコテセン系カビ毒に対する抵抗性を評価する第２の工程、第２の工程にて同定した遺伝子の変異体（例えば、第２の工程においてタイプＢのトリコテセン系カビ毒に対する抵抗性を示した遺伝子の変異体）を用いて、上記タイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病菌に対する抵抗性を評価する第３の工程、を含むものであればよく、その他の工程、条件、材料等については特に限定されるものではない。
<4. Methods for identifying genes involved in susceptibility to head blight>
According to the method for identifying a gene involved in susceptibility to head blight of the present invention, a type B trichothecene fungal toxin produced by a head blight fungus is caused to act on a plant susceptible to head blight, In the first step for identifying the response gene, the second step for evaluating the resistance to the type B trichothecene fungal toxin using the mutant of the gene identified in the first step, the second step A red mold that produces the type B trichothecene fungus venom using a mutant of the gene identified above (for example, a mutant of a gene that showed resistance to the type B trichothecene fungus toxin in the second step). Any other process, conditions, materials, and the like may be used as long as the process includes a third process for evaluating resistance to pathogens.
後述する実施例に示すように、本発明者らは、赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子について、その欠損株が、赤かび病に対する抵抗性のみならず、赤かび病菌が産生するトリコテセン系カビ毒に対しても耐性を示すことを見出した。また、トリコテセン系カビ毒を作用させると、赤かび病に対する感受性または抵抗性に関与する遺伝子が応答することも確認した。これらの新規知見に基づけば、赤かび病に罹病性の植物に対して、トリコテセン系カビ毒を作用させ、その際に応答する遺伝子を解析・同定し、当該遺伝子の変異体についてトリコテセン系カビ毒に対する抵抗性を評価することで、トリコテセン系カビ毒に対する感受性に関与する遺伝子を同定し、その後、当該遺伝子の変異体に対して赤かび病菌を接種して、赤かび病に対する抵抗性を評価することにより、効率的に赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子を見出すことができる。 As shown in the examples described later, the present inventors have found that a deficient strain of a gene involved in susceptibility to head blight is not only resistant to head blight but also a trichothecene fungus produced by a head blight fungus. It was found to be resistant to poisons. It was also confirmed that when a trichothecene fungal venom was acted on, a gene involved in susceptibility or resistance to head blight was responded. Based on these new findings, trichothecene fungal toxin is applied to plants susceptible to head blight, and the genes that respond are analyzed and identified. The genes involved in susceptibility to trichothecene fungal venoms are identified by evaluating resistance to the fungus, and then the mutants of the gene are inoculated with Fusarium head blight and evaluated for resistance to Fusarium head blight Thus, a gene involved in susceptibility to head blight can be found efficiently.
本方法において、使用するトリコテセン系カビ毒は、主要作物に対する汚染例が数多く報告されているタイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病を対象とすることが好ましい。タイプＢのトリコテセン系カビ毒としては、例えば、ＤＯＮ，ＮＩＶを挙げることができる。 In this method, it is preferable that the trichothecene fungus venom to be used is for red mold disease producing type B trichothecene fungus venom for which many cases of contamination of main crops have been reported. Examples of the type B trichothecene mold poison include DON and NIV.
また、使用する植物としては、赤かび病に罹病性の植物であれば何でもよく特に限定されるものではないが、全ゲノム解析が完了しており、かつ各種変異体が豊富に存在するモデル植物のシロイヌナズナが好ましい。 In addition, the plant to be used is not particularly limited as long as it is susceptible to head blight, but the whole genome analysis has been completed and a variety of mutant plants are present. The Arabidopsis thaliana is preferred.
応答遺伝子を同定する手法については、従来公知に手法を利用でき特に制限されるものではないが、ＤＮＡマイクロアレイを用いると応答遺伝子を網羅的に解析できる点で好ましい。特に、シロイヌナズナの遺伝子を固定化したＤＮＡマイクロアレイは既に市販されており、容易に取得できる点でも優れる。 A method for identifying a response gene is not particularly limited because a conventionally known method can be used, but a DNA microarray is preferable in that a response gene can be comprehensively analyzed. In particular, a DNA microarray having an Arabidopsis gene immobilized thereon is already on the market and is excellent in that it can be easily obtained.
遺伝子の変異体を用いてトリコテセン系カビ毒に対する抵抗性を評価する手法についても、当業者にとって公知の手法を利用できる。例えば、後述する実施例に示すように、トリコテセン系カビ毒を含む培地にて同定した遺伝子の変異植物体（例えば、欠損株）を生育させ、生重量や根の伸長状態を調べることで容易にカビ毒に対する抵抗性を評価できる。カビ毒に対して感受性のものは、生重量の低下および／または根の伸長の阻害が認められる。 A technique known to those skilled in the art can also be used for a technique for evaluating resistance to trichothecene fungal toxin using a gene mutant. For example, as shown in the examples described later, it is easy to grow a mutant plant body (for example, a defective strain) of a gene identified in a medium containing trichothecene fungal toxin and examine the raw weight and the state of root elongation. Resistance to mold poison can be evaluated. Those susceptible to mold toxins are found to have reduced fresh weight and / or inhibited root elongation.
遺伝子の変異体を用いて赤かび病菌に対する抵抗性を評価する手法についても、当業者にとって公知の手法を利用でき、特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例に示すように、同定した遺伝子の変異植物体（例えば、欠損株）の葉に対して赤かび病菌を接種して重症度を判定する方法を挙げることができる。 A technique known to those skilled in the art can also be used as a technique for evaluating resistance to Fusarium head blight using a gene mutant, and is not particularly limited. For example, as shown in the Example mentioned later, the method of inoculating a Fusarium head blight fungus | curd with respect to the leaf of the mutant plant body (for example, defect | deletion strain) of the identified gene can be mentioned.
＜５．組換えベクター＞
本発明にかかる組換えベクターは、上記（ｆ）〜（ｊ）および上記（ｋ）〜（ｏ）のいずれかの遺伝子を含むものであればよいが、適当なプロモーター等も含み、植物内で本遺伝子を発現できるものであることが好ましい。この際、使用するプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを例示できるが、それ以外にもノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のＰＲタンパク質プロモーターなども使用できる。
<5. Recombinant vector>
The recombinant vector according to the present invention only needs to contain any of the genes (f) to (j) and (k) to (o) above, but also contains an appropriate promoter and the like. It is preferable that the gene can be expressed. In this case, the cauliflower mosaic virus 35S promoter can be exemplified as the promoter to be used, but in addition to that, the promoter of nopaline synthase gene (Pnos), the ubiquitin promoter derived from corn, the actin promoter derived from rice, the tobacco-derived PR Protein promoters can also be used.
本発明にかかる組換えベクターを植物に導入し、上記遺伝子を発現させることにより、赤かび病に対する抵抗性植物を作出することができる。本発明のベクターを植物に導入する方法としては、従来公知の方法を利用でき、例えば、アグロバクテリウムを用いた手法を例示できるが、それ以外にも、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティカルガン法、マイクロインジェクション法などによっても、導入することができる。 By introducing the recombinant vector according to the present invention into a plant and expressing the gene, a plant resistant to head blight can be produced. As a method for introducing the vector of the present invention into a plant, a conventionally known method can be used. For example, a method using Agrobacterium can be exemplified, but besides this, a PEG-calcium phosphate method, an electroporation method, It can also be introduced by the liposome method, the partical cancer method, the microinjection method, or the like.
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、明細書に記載した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。 The present invention is not limited to the configurations described above, and various modifications can be made within the scope described in the specification, and implementations obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. The form is also included in the technical scope of the present invention. Moreover, all the literatures described in this specification are used as reference. EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited only to this Example.
〔実施例１．ＲＰＳ２７a／ＵＢＱ１５遺伝子について〕
ＲＰＳ２７a／ＵＢＱ１５遺伝子について、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）エコタイプコロンビア（Columbia-0）の２つのホモ接合性単一変異体；ｒｐｓ２７ａ−１、ｒｐｓ２７ａ−２をＡＢＲＣ（The Arabidopsis Biological Research Center）から入手した。これらの変異体はいずれもＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 1. About RPS27a / UBQ15 gene]
For the RPS27a / UBQ15 gene, two homozygous single mutants of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0; rps27a-1 and rps27a-2 were obtained from ABCR (The Arabidopsis Biological Research Center) did. These mutants are all T-DNA insertion mutants.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＤＯＮを産生する赤かび病菌（Fusarium graminearum）を、１×１０６／ｍｌにて、変異体ｒｐｓ２７ａ−１およびコントロールとして野生型ＷＴの葉に接種し、８日後の赤かび病の重症度を評価した。重症度は、接種痕のみ（１段階目）、５０％未満の侵食（２段階目）、５０％以上の侵食（３段階目）、完全な萎枯（４段階目）の４段階で評価した。 Fusarium graminearum, which produces DON, a type B trichothecene fungus poison, was inoculated at 1 × 10 6 / ml into mutant rps27a-1 and wild-type WT leaves as a control, 8 days later The severity of head blight was evaluated. Severity was assessed in 4 stages: inoculation mark only (1st stage), less than 50% erosion (2nd stage), more than 50% erosion (3rd stage), complete wilt (4th stage) .
結果を図６に示す。図６（ａ）は、赤かび病菌の接種後４日目における葉の様子を示した図である。図６（ｂ）は、赤かび病菌の接種後８日目における葉の重症度を数値化したグラフである。同図に示すように、変異体ｒｐｓ２７ａ−１は、野生型ＷＴに比べて有意に重症度が低かった。特に、抵抗性の違いは、図６（ａ）に示すように、目視にても差異が明確にわかるレベルであった。 The results are shown in FIG. FIG. 6A is a view showing the state of leaves on the fourth day after inoculation with Fusarium head blight. FIG. 6 (b) is a graph showing the severity of leaves on the eighth day after inoculation with Fusarium head blight. As shown in the figure, mutant rps27a-1 was significantly less severe than wild type WT. In particular, as shown in FIG. 6A, the difference in resistance was at a level where the difference could be clearly seen even visually.
次に、タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＤＯＮに対する耐性を検討すべく、１０μＭの濃度にてＤＯＮを含むＭＳ培地に、変異体ｒｐｓ２７ａ−１およびｒｐｓ２７ａ−２、コントロールとして野生型ＷＴについて、１０粒ずつ播種し、播種後２０日の生重量と根長を測定した。結果を図７に示す。同図に示すように、変異体ｒｐｓ２７ａ−１およびｒｐｓ２７ａ−２ともに、野生型ＷＴに比べて、生重量は顕著に増加し、根長は有意に伸長した。 Next, in order to examine the resistance to DON, which is a type B trichothecene fungal toxin, an MS medium containing DON at a concentration of 10 μM was added to mutant rps27a-1 and rps27a-2, and wild type WT as a control. Each seed was sown and the fresh weight and root length on the 20th day after sowing were measured. The results are shown in FIG. As shown in the figure, in both mutants rps27a-1 and rps27a-2, the fresh weight was remarkably increased and the root length was significantly increased as compared to wild-type WT.
〔実施例２．ＡＮＡＣ０７４遺伝子〕
ＡＮＡＣ０７４遺伝子について、アラビドプシス・サリアナ エコタイプコロンビアのホモ接合性単一変異体；ａｎａｃ０７４をＡＢＲＣから入手した。この変異体はＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 2. ANAC074 gene]
For the ANAC074 gene, a homozygous single mutant of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia; anac074 was obtained from ABRC. This mutant is a T-DNA insertion mutant.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＤＯＮに対する耐性を検討すべく、１０μＭの濃度にてＤＯＮを含むＭＳ培地に、変異体ａｎａｃ０７４、コントロールとして野生型ＷＴについて、１０粒ずつ播種し、播種後２０日の生重量を測定した。結果を図８に示す。同図に示すように、変異体ａｎａｃ０７４は野生型ＷＴに比べて生重量が顕著に増加した。 To examine the resistance to DON, a type B trichothecene fungus poison, 10 seeds of mutant anac074 and wild-type WT as a control were seeded on MS medium containing DON at a concentration of 10 μM, and 20 days after sowing. The raw weight of was measured. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the mutant anac074 showed a marked increase in raw weight compared to the wild type WT.
〔実施例３．ＰＲＥ１遺伝子〕
ＰＲＥ１遺伝子について、アラビドプシス・サリアナ エコタイプコロンビアのホモ接合性単一変異体；ｐｒｅ１をＡＢＲＣから入手した。この変異体はＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 3. PRE1 gene]
For the PRE1 gene, a homozygous single mutant of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia; pre1 was obtained from ABRC. This mutant is a T-DNA insertion mutant.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＤＯＮに対する耐性を検討すべく、１０μＭの濃度にてＤＯＮを含むＭＳ培地に、変異体ｐｒｅ１、コントロールとして野生型ＷＴについて、１０粒ずつ播種し、播種後２０日の生重量を測定した。結果を図９に示す。同図に示すように、変異体ｐｒｅ１は野生型ＷＴに比べて生重量が顕著に増加した。 To examine the resistance to DON, which is a type B trichothecene fungus poison, 10 seeds of mutant pre1 and wild type WT as a control were seeded in MS medium containing DON at a concentration of 10 μM, and 20 days after sowing. The raw weight of was measured. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the mutant pre1 had a marked increase in fresh weight compared to the wild type WT.
〔実施例４．ＤＵＦ２９５−１，ＤＵＦ２９５−２，ＤＵＦ２９５−３遺伝子〕
ＤＵＦ２９５−１，ＤＵＦ２９５−２，ＤＵＦ２９５−３遺伝子について、アラビドプシス・サリアナ エコタイプコロンビアのホモ接合性単一変異体；ｄｕｆ２９５−１ａ，ｄｕｆ２９５−１ｂ，ｄｕｆ２９５−２，ｄｕｆ２９５−３をＡＢＲＣから入手した。これらの変異体はいずれもＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 4. DUF295-1, DUF295-2, DUF295-3 gene]
For the DUF295-1, DUF295-2 and DUF295-3 genes, homozygous single mutants of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia; duf295-1a, duf295-1b, duf2955-2, and duf295-3 were obtained from ABRC. These mutants are all T-DNA insertion mutants.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＤＯＮに対する耐性を検討すべく、１０μＭの濃度にてＤＯＮを含むＭＳ培地に、変異体ｄｕｆ２９５−１ａ，ｄｕｆ２９５−１ｂ，ｄｕｆ２９５−２およびｄｕｆ２９５−３、コントロールとして野生型ＷＴについて、１０粒ずつ播種し、播種後２０日の生重量を測定した。結果を図１０に示す。同図に示すように、変異体ｄｕｆ２９５−１ａ，ｄｕｆ２９５−１ｂ，ｄｕｆ２９５−２，ｄｕｆ２９５−３はいずれも野生型ＷＴに比べて生重量が顕著に増加した。 In order to examine the resistance to DON, a type B trichothecene fungus toxin, in a MS medium containing DON at a concentration of 10 μM, mutants duf295-1a, duf295-1b, duf295-2 and duf295-3, wild as a control About type WT, 10 seeds were sown and the fresh weight was measured 20 days after sowing. The results are shown in FIG. As shown in the figure, all of the mutants duf295-1a, duf295-1b, duf2955-2, and duf295-3 had a significantly increased raw weight compared to wild-type WT.
〔実施例５．Caleosin-related protein遺伝子〕
Caleosin-related protein遺伝子について、アラビドプシス・サリアナ エコタイプコロンビアのホモ接合性単一変異体；ｃａｌｅｏｓｉｎをＡＢＲＣから入手した。この変異体はＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 5. Caleosin-related protein gene)
For the Caleosin-related protein gene, a single homozygous mutant of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia; caleosin was obtained from ABRC. This mutant is a T-DNA insertion mutant.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＮＩＶに対する耐性を検討すべく、１０μＭの濃度にてＮＩＶを含むＡＢＲＣ培地に、変異体ｐｒｅ１、コントロールとして野生型ＷＴについて、１０粒ずつ播種し、播種後２０日の生重量を測定した。結果を図１１に示す。同図に示すように、変異体ｃａｌｅｏｓｉｎは野生型ＷＴに比べて生重量が顕著に減少した。 In order to examine the resistance to NIV, which is a type B trichothecene fungal toxin, 10 seeds of mutant pre1 and wild type WT as a control were seeded in an ABCR medium containing NIV at a concentration of 10 μM, and 20 days after sowing. The raw weight of was measured. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the mutant caleosin was significantly reduced in raw weight compared to the wild type WT.
〔実施例６．MATH domain-containing protein遺伝子〕
MATH domain-containing protein遺伝子について、アラビドプシス・サリアナ エコタイプコロンビアのホモ接合性単一変異体；ｍａｔｈをＡＢＲＣから入手した。この変異体はＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 6. MATH domain-containing protein gene)
The MATH domain-containing protein gene was obtained from ABRC as a homozygous single mutant of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia; This mutant is a T-DNA insertion mutant.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＮＩＶに対する耐性を検討すべく、１０μＭの濃度にてＮＩＶを含むＭＳ培地に、変異体ｍａｔｈ、コントロールとして野生型ＷＴについて、１０粒ずつ播種し、播種後２０日の生重量を測定した。結果を図１２に示す。同図に示すように、変異体ｍａｔｈは野生型ＷＴに比べて生重量が顕著に減少した。 To examine the resistance to NIV, which is a type B trichothecene fungus poison, 10 seeds of mutant math and wild-type WT as a control were seeded in an MS medium containing NIV at a concentration of 10 μM, and 20 days after sowing. The raw weight of was measured. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the mutant math showed a marked decrease in the raw weight compared to the wild type WT.
〔実施例７．ＥＲＦ０７１遺伝子およびＡＮＡＮＣ０７９遺伝子〕
ＥＲＦ０７１遺伝子およびＡＮＡＮＣ０７９遺伝子のそれぞれについて、アラビドプシス・サリアナ エコタイプコロンビアのホモ接合性単一変異体；ｅｒｆ０７１、およびａｎａｃ０７９をＡＢＲＣから入手した。これらの変異体はＴ−ＤＮＡ挿入変異体である。
[Example 7. ERF071 gene and ANANC079 gene]
For each of the ERF071 and ANANC079 genes, homozygous single mutants of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia; erf071, and anac079 were obtained from ABRC. These mutants are T-DNA insertion mutants.
タイプＢのトリコテセン系カビ毒であるＤＯＮを産生する赤かび病菌（Fusarium graminearum）を、１×１０4／ｍｌにて、変異体ｅｒｆ０７１あるいはａｎａｃ０７９、およびコントロールとして野生型ＷＴの花に接種した。 Fusarium graminearum, which produces DON, a type B trichothecene mold venom, was inoculated at 1 × 10 4 / ml into mutant erf071 or anac079 and wild type WT flowers as controls.
接種後５日後の赤かび病の病徴を図１３（ａ）に示す。同図に示すように、変異体ｅｒｆ０７１は、野生型ＷＴに比べて有意に重症度が低かった。抵抗性の違いは、目視にても差異が明確にわかるレベルであった。 The symptom of red mold disease 5 days after the inoculation is shown in FIG. As shown in the figure, mutant erf071 was significantly less severe than wild type WT. The difference in resistance was such that the difference could be clearly seen even visually.
また、赤かび病菌を接種した組織から抽出したゲノムＤＮＡにおいて、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡ量を、ＡＣＴ２遺伝子を用いたリアルタイムＰＣＲ法により算出し、赤かび病菌のゲノムＤＮＡ量を、ＥＦ１α遺伝子を用いたリアルタイムＰＣＲ法により算出した。全ゲノム中（シロイヌナズナゲノムＤＮＡ量＋赤かび病菌ゲノムＤＮＡ量）に対する赤かび病菌のゲノムＤＮＡ量をパーセントにより算出した。ゲノムＤＮＡ量比は接種組織における菌体量を反映しており、抵抗性を示す一般的な指標の一つである。このゲノムＤＮＡ量比を図１３（ｂ）に示した。同図に示すように、ｅｒｆ０７１及びａｎａｃ０７９は、野生型ＷＴに比べて赤かび病菌の菌体量が少なかった。 In addition, in the genomic DNA extracted from the tissue inoculated with Fusarium head blight, the amount of Arabidopsis genomic DNA was calculated by the real-time PCR method using ACT2 gene, and the amount of genomic DNA of Fusarium head blight fungus was calculated in real time using EF1α gene. Calculated by PCR method. The amount of genomic DNA of Fusarium head blight fungus relative to the whole genome (Arabidopsis thaliana genomic DNA amount + Fusarium head blight fungus genome DNA amount) was calculated as a percentage. The genomic DNA amount ratio reflects the amount of bacterial cells in the inoculated tissue and is one of the general indicators of resistance. This genomic DNA amount ratio is shown in FIG. As shown in the figure, erf071 and anac079 had a smaller amount of Fusarium head blight fungus than wild type WT.
本発明によれば、赤かび病菌に抵抗性を示す植物を提供できるため、農業、食品産業等に利用可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a plant exhibiting resistance to Fusarium head blight fungus, so that it can be used in agriculture, food industry and the like.
Claims (9)
（ａ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１９〜３０，４３〜４８に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 A method for producing a head blight-resistant plant comprising a step of suppressing the expression of any of the following genes (a) to (e) in a plant:
(A) A gene encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42.
(B) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 12, 37 to 42, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and A gene encoding a protein involved in susceptibility to.
(C) A gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42 and involved in susceptibility to head blight.
(D) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 19-30 and 43-48.
(E) a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (a) to (d) above and encodes a protein involved in susceptibility to head blight .
該植物細胞から植物体を再生させる工程を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の赤かび病抵抗性植物の作製方法。 A step of producing a plant cell in which the expression of any of the genes (a) to (e) is suppressed,
The method for producing a head blight-resistant plant according to claim 1 or 2, further comprising a step of regenerating a plant from the plant cell.
（ｆ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｈ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号３１〜３６に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｊ）上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 A method for producing a head blight-resistant plant comprising the step of increasing the expression of any of the following genes (f) to (j) in a plant:
(F) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13-18.
(G) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 13 to 18, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and is resistant to head blight. A gene that codes for the protein involved.
(H) a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 13 to 18 and involved in resistance to head blight.
(I) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 31 to 36.
(J) It hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (f) to (i) above under stringent conditions and encodes a protein involved in resistance to head blight gene.
（ａ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１〜１２，３７〜４２に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１９〜３０，４３〜４８に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 In a plant for resistance to head blight, characterized by comprising the step of determining the presence or absence of any of the following genes (a) to (e) in the plant or whether the expression of the gene is suppressed: Selection method.
(A) A gene encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42.
(B) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 12, 37 to 42, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and A gene encoding a protein involved in susceptibility to.
(C) A gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-12 and 37-42 and involved in susceptibility to head blight.
(D) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 19-30 and 43-48.
(E) a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (a) to (d) above and encodes a protein involved in susceptibility to head blight .
（ｆ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｈ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号３１〜３６に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｊ）上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 A plant having resistance to head blight disease comprising the step of determining whether or not the gene of any of the following (f) to (j) is present in the plant or whether the expression of the gene is increased: Selection method.
(F) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13-18.
(G) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 13 to 18, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and is resistant to head blight. A gene that codes for the protein involved.
(H) a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 13 to 18 and involved in resistance to head blight.
(I) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 31 to 36.
(J) It hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (f) to (i) above under stringent conditions and encodes a protein involved in resistance to head blight gene.
第１の工程にて同定した遺伝子の変異体を用いて、上記タイプＢのトリコテセン系カビ毒に対する抵抗性を評価する第２の工程、
第２の工程にて同定した遺伝子の変異体を用いて、上記タイプＢのトリコテセン系カビ毒を産生する赤かび病菌に対する抵抗性を評価する第３の工程、
を含むことを特徴とする赤かび病に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法。 A first step of acting a type B trichothecene fungal venom produced by Fusarium head blight on a plant susceptible to Fusarium head blight and identifying a response gene in the plant;
A second step of evaluating resistance to the type B trichothecene fungal toxin using the mutant of the gene identified in the first step;
A third step of evaluating resistance against the mold of molds that produce the type B trichothecene fungal toxin using the mutant of the gene identified in the second step;
And a method for identifying a gene involved in susceptibility to head blight.
（ｆ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｈ）配列番号１３〜１８に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号３１〜３６に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｊ）上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する抵抗性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｋ）配列番号３７〜４２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｌ）配列番号３７〜４２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｍ）配列番号３７〜４２に記載されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｎ）配列番号４３〜４８に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｏ）上記（ｋ）〜（ｎ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ赤かび病に対する感受性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。 A recombinant vector comprising any of the following genes (f) to (o):
(F) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 13-18.
(G) In the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 13 to 18, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added, and is resistant to head blight. A gene that codes for the protein involved.
(H) a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 13 to 18 and involved in resistance to head blight.
(I) A gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 31 to 36.
(J) It hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes (f) to (i) above under stringent conditions and encodes a protein involved in resistance to head blight gene.
(K) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 37 to 42.
(L) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 37 to 42, one or several amino acid residues are composed of amino acid sequences substituted, deleted, inserted and / or added, and are involved in susceptibility to head blight A gene that encodes a protein
(M) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 37 to 42 and involved in susceptibility to head blight.
(N) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 43 to 48.
(O) a gene that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any of the genes of (k) to (n) and encodes a protein involved in susceptibility to head blight .
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