JP2011130747A - 住環境真菌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域についてPCR(Polymerase Chain Reaction)法により増幅し、得られたPCR産物を制限酵素で切断し、得られた制限酵素断片長の多型を解析するT−RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)法により解析し、住環境真菌の検出を行う、住環境真菌の検出方法。
【選択図】なし
Description
住環境真菌の前記DNA領域を増幅するために、下記(c)及び(b)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることが好ましい。
(c)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して80%以上の相同性を有しかつ前記DNA領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して80%以上の相同性を有しかつ前記DNA領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
前記(c)及び(b)のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号3及び2に記載の塩基配列に対する相同性は、85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、95%以上がさらに好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドには、配列番号3若しくは2に記載の塩基配列において1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1〜2個、特に好ましくは1個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号3又は2に記載の塩基配列に適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を蛍光色素によりラベル化する場合、蛍光色が互いに異なる蛍光色素で前記2種のプライマーをそれぞれ標識するのが好ましい。
本発明におけるPCR条件は、目的のDNA断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、PCR反応に用いる鋳型としての2本鎖DNA量は0.1ng以上が好ましく、1〜50ngがより好ましい。また、2本鎖DNAを1本鎖にする熱変性反応を92〜98℃で10〜60秒間行い、プライマー対を1本鎖DNAにハイブリダイズさせるアニーリング反応を50〜60℃で10〜60秒間行い、DNAポリメラーゼを作用させる伸長反応を60〜72℃で5〜120秒間行い、これらを1サイクルとしたものを20〜40サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行い、サイクル反応後に追加の伸長反応をおこなうことが好ましい。
PCRにおける初期変性反応条件について、変性温度は92〜98℃が好ましく、92〜96℃がより好ましく、約94℃がさらに好ましい。変性時間は30秒〜10分が好ましく、1〜5分がより好ましく、約2分がさらに好ましい。
PCRにおけるサイクル反応時の変性条件について、変性温度は92〜96℃が好ましく、約94℃がより好ましい。変性時間は20〜40秒が好ましく、約30秒がより好ましい。
PCRにおけるアニーリング条件について、アニーリング温度は52〜58℃が好ましく、約55℃がより好ましい。アニーリング時間は20〜40秒が好ましく、約30秒がより好ましい。
PCRにおける伸長反応条件について、伸長反応温度は68〜72℃が好ましく、約72℃がより好ましい。伸長反応時間は20〜60秒が好ましく、約30秒がより好ましい。
PCRにおけるサイクル数は、25〜35サイクルが好ましく、約30サイクルがより好ましい。
PCRにおけるサイクル反応後の追加の伸長反応条件について、温度は約72℃が好ましい。時間は30秒〜10分が好ましく、1〜10分がより好ましく、約5分がさらに好ましい。
住環境真菌の前記DNA領域を増幅するために、下記(a)及び前記(b)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることが好ましい。
(a)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して80%以上の相同性を有しかつ前記DNA領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号1及び2に記載の塩基配列に対する相同性は、85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、95%以上がさらに好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドには、配列番号1若しくは2に記載の塩基配列において1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1〜2個、特に好ましくは1個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号1又は2に記載の塩基配列に適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
本発明におけるPCR条件は、目的のDNA断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、PCR反応に用いる鋳型としての2本鎖DNA量は0.1ng以上が好ましく、1〜50ngがより好ましい。また、2本鎖DNAを1本鎖にする熱変性反応を92〜98℃で10〜60秒間行い、プライマー対を1本鎖DNAにハイブリダイズさせるアニーリング反応を50〜60℃で10〜60秒間行い、DNAポリメラーゼを作用させる伸長反応を60〜72℃で5〜120秒間行い、これらを1サイクルとしたものを20〜40サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行い、サイクル反応後に追加の伸長反応をおこなうことが好ましい。
PCRにおける初期変性反応条件について、変性温度は92〜98℃が好ましく、92〜96℃がより好ましく、約94℃がさらに好ましい。変性時間は30秒〜10分が好ましく、1〜5分がより好ましく、約2分がさらに好ましい。
PCRにおけるサイクル反応時の変性条件について、変性温度は92〜96℃が好ましく、約94℃がより好ましい。変性時間は20〜40秒が好ましく、約30秒がより好ましい。
PCRにおけるアニーリング条件について、アニーリング温度は52〜58℃が好ましく、約55℃がより好ましい。アニーリング時間は20〜40秒が好ましく、約30秒がより好ましい。
PCRにおける伸長反応条件について、伸長反応温度は68〜72℃が好ましく、約72℃がより好ましい。伸長反応時間は20〜60秒が好ましく、約30秒がより好ましい。
PCRにおけるサイクル数は、25〜35サイクルが好ましく、約30サイクルがより好ましい。
PCRにおけるサイクル反応後の追加の伸長反応条件について、温度は約72℃が好ましい。時間は30秒〜10分が好ましく、1〜10分がより好ましく、約5分がさらに好ましい。
例えば、本発明の住環境真菌検出用キットは、(i)住環境真菌の5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域を増幅することができる2種類のプライマー(例えば、前記(c)及び(b)のオリゴヌクレオチド、好ましくは真菌検出用として汎用されているユニバーサルプライマーITS3(配列番号3)及びNL4(配列番号2))であって当該プライマーの両方又は一方が蛍光色素により標識されたもの、及び(ii)制限酵素(例えば、EcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIから選ばれる少なくとも1種の制限酵素)を含有する。好ましくは、本発明の住環境真菌検出用キットはさらに、(iii)前記DNA領域を増幅する際に鋳型として用いるDNAを増幅するためのプライマー対(例えば、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド、好ましくは真菌検出用として汎用されているユニバーサルプライマーITS5(配列番号1)及びNL4(配列番号2))を含有する。本発明の住環境真菌検出用キットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、緩衝液、核酸合成酵素(DNAポリメラーゼ、逆転写酵素等)、酵素基質(dNTP,rNTP等)等、住環境真菌の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってPCR反応が正常に進行することを確認するための陽性対照(ポジティブコントロール)を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の検出方法により増幅される領域を含んだDNAが挙げられる。
なお、前記DNA領域を対象とすることで、T−RFLP法だけではなく、単鎖DNA高次構造多型解析(Single strand conformation polymorphism)法(例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(Denaturing Gradient Gel Electorophoresis)、温度勾配ゲル電気泳動(Temperature Gradient Gel Electorophoresis))などによっても、住環境真菌の検出が可能となる。
表1に示す住環境からの分離菌1〜17について、MicroSeqD2Kit(商品名アプライドバイオシステムズ社)を用い、rDNAのD2領域約500bpの塩基配列解析を行い、環境分離菌の属又は種の特定を行った。また、環境分離菌1(Exophaiala sp.type A)、環境分離菌7(Phoma sp.)及び環境分離菌8(Phialophora sp.)については、前記遺伝子解析の他に形態観察(コロニー形態と光学顕微鏡による分生子の観察)を併用して、属の特定を行った。
前記第1次PCR産物を滅菌イオン交換水又はトリスEDTA緩衝液を用いて1/100倍又は1/1000倍濃度に希釈した溶液1μLを鋳型とし、表3に示したITS3及び5'末端側をカルボキシフルオレセイン(FAM)でラベルした5’FAM−NL4のプライマーセット(ニッポンイージーティーに合成委託)を用いて、住環境真菌のrRNA遺伝子の部分領域B(5.8S rRNAの一部分、ITS−2及び28S rRNAの一部分)をコードするrDNA遺伝子の部分配列をPCR法により増幅した。PCR反応は25μLの容量で行い、第2次PCR産物を得た。PCR法による増幅は、変性温度を94℃として2分間維持し、その後、94℃30秒→55℃30秒→72℃30秒というサイクルを単位として30サイクル行い、その後72℃を5分間維持することで実施した。
前記第1次PCR産物を滅菌イオン交換水又はトリスEDTA緩衝液を用いて1/100倍又は1/1000倍濃度に希釈した溶液1μLを鋳型とし、表4に示したITS3及びNL4のプライマーセット(ニッポンイージーティー社に合成委託)を用いて、住環境真菌のrRNA遺伝子の部分配列B(5.8S rRNAの一部分、ITS−2及び28S rRNAの一部分)をコードするrDNA遺伝子の部分配列をPCR法により増幅した。PCR反応は25μLの容量で行い、第2次PCR産物を得た。PCR法による増幅は、変性温度を94℃として2分間維持し、その後、94℃30秒→55℃30秒→72℃30秒というサイクルを単位として30サイクル行い、その後72℃を5分間維持することで実施した。
種名未知の住環境真菌株として、住環境(浴室、洗濯槽、衣類など)から分離した黒カビA〜Sをそれぞれポテトデキストロース寒天培地にて25℃で7〜14日間培養し、各菌体からDNA抽出キット(商品名:Genとるくん(酵母用)、タカラバイオ社製)を用いてDNAを抽出し、精製した。
さらに、上記のようにして決定したフラグメントサイズと、試験例1で構築した表5に示すデータベースを基に、住環境から分離した黒カビA〜Sの同定を行った。その結果も表6に示す。
浴室のパッキンに形成されたカビ汚れ、洗濯機の脱水槽に形成された汚れ、衣料上に形成された汚れに存在する住環境真菌の検出を下記の通り行なった。
さらに、洗濯機の脱水槽に形成された暗色汚れ部分約2平方センチメートルを滅菌したピンセットで剥がし取り、それぞれ異なる箇所から洗濯機の脱水槽に形成された汚れを回収し、サンプルNo.21〜27を調製した。
さらに、衣料上に形成された着色汚れ部分を滅菌したハサミで切り取ったのち、滅菌したピンセットで単繊維までほぐし、それぞれ異なる箇所から汚れ部分のみを回収し、サンプルNo.31〜44を調製した。
住環境真菌として、試験例1で属の特定を行ったExophaiala sp.type A(環境分離株)、Exophaiala sp.type B(環境分離株)、Exophaiala sp.type C(環境分離株)、Exophaiala sp.type D(環境分離株)、Exophaiala sp.type E(環境分離株)、Exophaiala sp.type F(環境分離株)、Phoma sp.(環境分離株)、Phialophora sp.(環境分離株)、Ochroconis又はScolecobasidium sp.(環境分離株)、Cladosporium sp.(環境分離株)、Alternaria sp.(環境分離株)、Candida sp.(環境分離株)、Pichia sp.(環境分離株)、Aureobasidium sp.(環境分離株)、Capronia sp.(環境分離株)、Ramichloridium sp.(環境分離株)及びFusarium sp.(環境分離株)、Saccharomyces cerevisiae IFO1661(購入株)並びにRhodotorula mucilaginosa NBRC0909(購入株)をそれぞれポテトデキストロース寒天培地にて25℃で7〜14日間培養し、各菌体からDNA抽出キット(商品名:Genとるくん(酵母用)、タカラバイオ社製)を用いてDNAを抽出し、精製した。
前記第1次PCR産物を滅菌イオン交換水又はトリスEDTA緩衝液を用いて1/100倍又は1/1000倍濃度に希釈した溶液1μLを鋳型とし、前記表13に示した5'末端側をPETでラベルした5’PET−ITS3及び5'末端側をカルボキシフルオレセイン(FAM)でラベルした5’FAM−NL4のプライマーセット(ニッポンイージーティー社に合成委託)を用いて、住環境真菌のrRNA遺伝子の部分領域B(5.8S rRNAの一部分、ITS−2及び28S rRNAの一部分)をコードするrDNA遺伝子の部分配列をPCR法により増幅した。PCR反応は25μLの容量で行い、第2次PCR産物を得た。PCR法による増幅は、変性温度を94℃として2分間維持し、その後、94℃30秒→55℃30秒→72℃30秒というサイクルを単位として30サイクル行い、その後72℃を5分間維持することで実施した。
前記第1次PCR産物を滅菌イオン交換水又はトリスEDTA緩衝液を用いて1/100倍又は1/1000倍濃度に希釈した溶液1μLを鋳型とし、前記表4に示したITS3及びNL4のプライマーセットを用いて、住環境真菌のrRNA遺伝子の部分配列B(5.8S rRNAの一部分、ITS−2及び28S rRNAの一部分)をコードするrDNA遺伝子の部分配列をPCR法により増幅した。PCR反応は25μLの容量で行い、第2次PCR産物を得た。PCR法による増幅は、変性温度を94℃として2分間維持し、その後、94℃30秒→55℃30秒→72℃30秒というサイクルを単位として30サイクル行い、その後72℃を5分間維持することで実施した。
実施例1で用いた黒カビB、黒カビC、黒カビD、黒カビE、黒カビF、黒カビH、黒カビJ、黒カビK、黒カビM、黒カビN、黒カビP及び黒カビSから実施例1と同様にDNAを抽出し、精製した。
さらに、上記のようにして決定したフラグメントサイズと、試験例2で構築した表14に示すデータベースを基に、住環境から分離した黒カビB、黒カビC、黒カビD、黒カビE、黒カビF、黒カビH、黒カビJ、黒カビK、黒カビM、黒カビN、黒カビP及び黒カビSの同定を行った。その結果も表15に示す。
浴室のパッキンに形成されたカビ汚れに存在する住環境真菌の検出を下記の通り行なった。
Claims (10)
- 5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域についてPCR(Polymerase Chain Reaction)法により増幅し、得られたPCR産物を制限酵素で切断し、得られた制限酵素断片長の多型を解析するT−RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)法により解析し、住環境真菌の検出を行うことを特徴とする住環境真菌の検出方法。
- 前記制限酵素がEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれることを特徴とする請求項1記載の住環境真菌の検出方法。
- 前記PCR産物をEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも2種の制限酵素で切断することを特徴とする請求項1又は2記載の住環境真菌の検出方法。
- 前記PCR産物をEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも1種の制限酵素で切断することを特徴とする請求項1又は2記載の住環境真菌の検出方法。
- 下記(c)及び(b)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域を増幅することを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の住環境真菌の検出方法。
(c)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して80%以上の相同性を有しかつ前記DNA領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して80%以上の相同性を有しかつ前記DNA領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド - 両方又は一方が蛍光色素で標識された前記(c)及び(b)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域をPCR法により増幅することを特徴とする請求項5記載の住環境真菌の検出方法。
- 18S rRNAの一部、ITS−1、5.8S rRNA、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域をPCR法により増幅して、得られたPCR産物を鋳型として、前記5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域を増幅することを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載の住環境真菌の検出方法。
- 下記(a)及び前記(b)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記18S rRNAの一部、ITS−1、5.8S rRNA、ITS−2及び28S rRNAの一部をコードするDNA領域をPCR法により増幅することを特徴とする請求項7記載の住環境真菌の検出方法。
(a)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して80%以上の相同性を有しかつ前記DNA領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド - 住環境真菌が環境Exophiala属真菌、Acremonium属真菌、Fusarium属真菌、Scolecobasidium属真菌、Phoma属真菌、Phialophora属真菌、Cladosporium属真菌、Ochroconis属真菌、Alternaria属真菌、Saccharomyces属真菌、Rhodotorula属真菌、Aspergillus属真菌、Penicillium属真菌、Aureobasidium属真菌、Candida属真菌、Pichia属真菌、Capronia属真菌及びRamichloridium属真菌からなる群より選ばれることを特徴とする請求項1〜8のいずれか記載の住環境真菌の検出方法。
- 請求項1〜8のいずれか記載の住環境真菌の検出方法に用いる住環境真菌検出用キットであって、前記5.8S rRNAの一部、ITS−2及び28S rRNAをコードするDNA領域をPCR法により増幅するためのプライマーセット、及びEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも1種の制限酵素を含む住環境真菌検出用キット。
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