JP2011122912A - 試料に含まれる被測定物質を定量する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】固定化抗体と試料液に含まれる浮遊抗体との間で生じる競合によって生じる測定誤差を抑制する方法を提供すること。
【解決手段】センサにより試料液に含まれる被測定物質２４を定量する。試料液は浮遊抗体２２を含有し、センサはプロテインＡまたはプロテインＧを構成する１以上かつ４以下のドメインからなるペプチド、標識化抗原１９、および固定化抗体１２を具備する。被測定物質２４は固定化抗体１２に特異的に結合する。試料液をセンサに供給してペプチドおよび標識化抗原１９を試料液に溶解してペプチドを浮遊抗体２２に結合させ、次に試料液を固定化抗体１２に到達させて標識化抗原１９および被測定物質２４を固定化抗体１２に結合させ、最後に固定化抗体１２に結合された被測定物質２４の量に基づいて被測定物質２４の濃度を求める。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料に含まれる被測定物質を定量する方法に関する。

生体試料液に含まれる抗原のような被測定物質に対して特異的に結合する抗体を用いて、当該被測定物質を検出または定量するために、基体にプロテインＡまたはプロテインＧを介して当該抗体を固定する方法が知られている。例えば、非特許文献１を参照。

非特許文献１の他、特許文献１〜４および非特許文献２は本開示に関連し得る。

特開平０５−０１８９７０号公報 特開２００３−２６２６０１号公報 特開２００２−１７４６１２号公報 米国特許第６０１３７６３号明細書（特にアブストラクト）

インターネット<URL:http://www.biacore.com/jp/> インターネット<URL:http://www.aist.go.jp/aist#j/press#release/pr2007/pr20070910/pr20070910.html>（特にプロテインＡに関する記述）

図５は、基体９にプロテインＡまたはプロテインＧ１１を介して固定された複数の固定化抗体１２を反応部１３に具備しているセンサを例示している。

図５のセンサは、複数の標識化抗原１９を標識化抗原保持部１７に具備している。標識化抗原１９は、固定化抗体１２に特異的に結合する抗原１９ａおよび蛍光物質のような標識１９ｂを具備している。

図６は、図５に示されるセンサを用いて被測定物質を検出または定量する方法を示す。以下の説明では、被測定物質は固定化抗体１２と特異的に結合する抗原２４であること、および抗原２４は抗原１９ａと実質的に同一であることが仮定される。

図６の左側から右側に向けて、抗原２４を含む生体試料液が供給される。標識化抗原保持部１７に到達した生体試料液は、標識化抗原１９を溶解する。

生体試料は図６の右側に向けてさらに進行し、固定化抗体１２に到達する。すると、抗原２４および標識化抗原１９は、固定化抗体１２に特異的に結合する。

固定化抗体１２に特異的に結合する抗原２４の量が増加すると、固定化抗体１２に特異的に結合する標識化抗原１９の量が減少する。標識化抗原１９の量と抗原２４の量との間のこの関係を予め検量線として求めておく。固定化抗体１２に特異的に結合した標識化抗原１９の量から、生体試料液に含まれる抗原２４の濃度を求め得る。

しかし、生体試料液には、抗原２４だけでなく、ＩｇＧ、ＩｇＭのような浮遊抗体２２も含まれている。

反応部１３に到達した浮遊抗体２２は固定化抗体１２と置換し得る。すなわち、当該固定化抗体１２が生体試料に溶解し、当該浮遊抗体２２がプロテインＡまたはプロテインＧ１１を介して基体９に固定され得る。本明細書において用いられる用語「競合」は、当該置換を意味する。

当該浮遊抗体２２は、抗原２４および標識化抗原１９のいずれとも特異的に結合しない。従って、当該浮遊抗体２２の量が増加すると、固定化抗体１２に特異的に結合する抗原２４および標識化抗原１９のいずれの量も減少する。このことは、生体試料液に含まれる抗原２４の濃度が本来の正確な濃度よりも大きく求められるという誤差を引き起こす。

より具体的な当該誤差を以下に示す。ここでは、以下の（ａ）〜（ｅ）を仮定する。（ａ）生体試料液は１０分子の抗原２４および１分子の浮遊抗体２２を含有する。（ｂ）標識化抗原保持部１７は１０分子の標識化抗原１９を保持する。（ｃ）反応部１３は５分子の固定化抗体１２を具備する。（ｄ）１分子の固定化抗体１２は２分子の抗原と特異的に結合し得る。（ｅ）生体試料液は抗原および抗体を均一に含有する。

標識化抗原１９を溶解した生体試料液は、反応部１３に到達する。

競合が生じないと仮定すると、５分子の固定化抗体１２は、５分子の抗原２４および５分子の標識化抗原１９と特異的に結合する。残余の５分子の抗原２４および５分子の標識化抗原１９は除去される。

５分子の標識化抗原１９から得られる蛍光強度に基づいて、生体試料液が含有する抗原２４の濃度を求める。すなわち、５分子の標識化抗原１９から得られる蛍光強度は、５分子の抗原２４が固定化抗体１２と結合していることを意味する。

しかし、実際には競合が生じる。具体的には、１分子の浮遊抗体２２が１分子の固定化抗体１２と置換し、１分子の浮遊抗体２２および４分子の固定化抗体１２が反応部１３に固定される。

１分子の浮遊抗体２２は、抗原２４および標識化抗原１９のいずれとも特異的に結合しない。４分子の浮遊抗体２２が、４分子の抗原２４および４分子の標識化抗原１９と特異的に結合する。４分子の標識化抗原１９から得られる蛍光強度は、６分子の抗原２４が固定化抗体１２と結合していることを意味する。従って、競合により、求められる抗原２４の濃度は大きくなる。

本発明の目的は、試料に含まれる被測定物質を定量する方法であって、競合によって生じる測定誤差を抑制する方法を提供することである。

本発明の方法は、センサを用いて試料液に含まれる被測定物質（２４）を定量する方法であって、
ここで
当該試料液は浮遊抗体（２２）を含有し、
当該センサは、プロテインＡまたはプロテインＧを構成する１以上かつ４以下のドメインからなるペプチド、標識化抗原（１９）、および固定化抗体（１２）を具備しており、
当該標識化抗原（１９）は、当該固定化抗体（１２）に特異的に結合する抗原（１９ａ）および標識（１９ｂ）を具備しており、
当該被測定物質（２４）は当該固定化抗体（１２）に特異的に結合し、
当該方法は、
当該試料液を当該センサに供給し、当該ペプチドおよび当該標識化抗原（１９）を当該試料液に溶解して当該ペプチドを当該浮遊抗体（２２）に結合させる工程、
当該試料液を前記固定化抗体（１２）に到達させ、当該標識化抗原（１９）および当該被測定物質（２４）を当該固定化抗体（１２）に結合させる工程、および
当該固定化抗体（１２）に結合された被測定物質（２４）の量に基づいて、被測定物質（２４）の濃度を求める工程、
を順に有する。

本発明によれば、競合による測定時の誤差が抑制される。

本発明のセンサを示す図 本発明のセンサの使用態様を示す図 本発明のセンサの使用態様を示す図 本発明のセンサの使用態様を示す図 センサを示す図 図５のセンサの使用態様を示す図

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の方法に用いられるセンサを示す。

当該センサは、プロテインＡまたはプロテインＧの１以上のドメインからなるペプチド１５、標識化抗原１９、および固定化抗体１２を具備している。ペプチド１５および標識化抗原１９は基体９上に保持されている。固体化抗体１２は、基体９上に固定されている。

プロテインＡまたはプロテインＧはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの５つのドメインから構成されていることが知られている。センサは、いずれか１つのドメインからなるペプチド１５を具備する。２以上のドメインからなるペプチド１５が基体９上に保持されていてもよい。ドメインＢおよびドメインＤの複合体からなるペプチド１５が基体９上に保持されることが好ましい。２以上のドメインの複合体からなる２種類以上のペプチド１５が基体９上に保持されていてもよい。

ただし、本発明においては、ペプチド１５として全ドメインＡ〜Ｅからなるペプチドを用いてはならない。全ドメインＡ〜Ｅからなるペプチドは、プロテインＡまたはプロテインＧである。すなわち、ペプチド１５としてプロテインＡまたはプロテインＧを用いてはならない。

基体９の形状は限定されない。板状の基体９、すなわち基板が用いられることが好ましい。

本明細書において用いられる用語「保持」は、液体により容易に溶解するように基体９上に具備されていることを意味する。具体的には、試薬を風による乾燥または凍結乾燥によって基体９に配置させることである。本明細書において用いられる用語「固定」は、液体により溶解することが困難であるように基体９上に具備されていることを意味する。具体的には、化学結合または抗原抗体反応によって試薬を基体９に配置させることである。

標識化抗原１９および固定化抗体１２は、図５に示されるそれらと同一である。

ペプチド１５は、標識化抗原保持部１７の近くのペプチド保持部１８に保持されることが好ましい。なぜなら、試料液が供給された時に、標識化抗原１９と共にペプチド１５が試料液に溶解されることが好ましいからである。

次に、上記のセンサを用いて試料液に含まれる被測定物質２４を定量する方法を説明する。

被測定物質２４は固定化抗体１２に特異的に結合する。試料液は生体成分由来であることが好ましい。従って、被測定物質２４は抗原であることが好ましい。標識化抗原１９の抗原１９ａと区別するために、本明細書では、試料液に含まれる抗原２４を浮遊抗原と述べることがある。具体的な試料液としては血漿を挙げることができる。ヒト血漿が好ましい。

まず、図２の左側から右側に向けて、浮遊抗体２２を含有する試料液をセンサの流路１４に供給する。

試料液は標識化抗原１９およびペプチド１５を溶解する。

プロテインＡまたはプロテインＧの各ドメインＡ〜Ｅは、いずれも抗体のＦｃ領域に結合することが知られている。

そのため、浮遊抗体２２を含有する試料液がプロテインＡまたはプロテインＧの１以上のドメインからなるペプチド１５を溶解したときに、図３に示すように、ペプチド１５が浮遊抗体２２に結合する。より詳細には、浮遊抗体２２のＦｃ領域にペプチド１５が結合する。いずれのドメインＡ〜Ｅも、浮遊抗体２２のＦｃ領域に結合する能力を有する。

次に、試料液はさらに図２の矢印１６に示すように左側から右側に向けて進行し、反応部１３に到達する。

図４に示すように、反応部１３では、被測定物質２４および標識化抗原１９が固定化抗体１２と結合する。このとき、浮遊抗体２２はペプチド１５に結合しているので、浮遊抗体２２は固定化抗体１２と置換されない。従って、競合は発生しない。これにより、本発明は競合による測定時の誤差を抑制する。

固定化抗体１２の量は、想定される抗原２４および標識化抗体１９の合計量より小さい。当該合計量よりも固定化抗体１２の量が大きいと、想定される抗原２４の量に拘わらず、全ての量の抗原２４および標識化抗体１９が固定化抗体１２に結合する。これは、常に一定量の標識化抗体１９が固定化抗体１２に結合することを意味する。これでは、抗原２４の量に応じて標識化抗体１９の量が変化しない。従って、被測定物質である抗原２４を定量することはできない。

より具体的には以下の通りである。段落番号００１３と同様に、以下のような場合を仮定する。

標識化抗原保持部１７は１０分子の標識化抗原１９を保持する。反応部１３は１００分子の固定化抗体１２を具備する。生体試料液は１０分子の抗原２４を有すると想定されたと仮定する。

１００分子の固定化抗体１２は、合計２００個の抗原と結合し得る。よって、１０分子の標識化抗原１９および１０分子の抗原２４は、全て固定化抗体１２に結合する。

試料液が５０分子の抗原２４を含有していても、合計６０分子の抗原は全て固定化抗体１２に結合する。

以上の通り、抗原の合計量よりも固定化抗体１２の量が大きいと、被測定物質である抗原２４を定量することはできない。

試料液に含有されている抗原２４の量は未知であるので、標識化抗原１９の量を固定化抗体１２の量よりも多くすることが望ましい。固定化抗体１２に２分子の標識化抗原１９が結合する場合、固定化抗体１２の量よりも２倍以上の量の標識化抗原１９が標識化抗原保持部１７に保持されることが好ましい。

標識１９ｂとしてはフェロセンを挙げることができる。標識１９ｂを測定する方法は特に限定されず、電極を用いた電気化学的な公知の測定方法を挙げることができる。

本発明は、生体由来の試料液に含まれる抗原を定量するために好適である。

上記の開示内容から導出される本発明は以下の通りである：
１． センサを用いて試料液に含まれる被測定物質（２４）を定量する方法であって、
ここで
前記試料液は浮遊抗体（２２）を含有し、
前記センサは、プロテインＡまたはプロテインＧを構成する１以上かつ４以下のドメインからなるペプチド、標識化抗原（１９）、および固定化抗体（１２）を具備しており、
前記標識化抗原（１９）は、前記固定化抗体（１２）に特異的に結合する抗原（１９ａ）および標識（１９ｂ）を具備しており、
前記被測定物質（２４）は前記固定化抗体（１２）に特異的に結合し、
前記方法は、
前記試料液を前記センサに供給し、前記ペプチドおよび前記標識化抗原（１９）を前記試料液に溶解して前記ペプチドを前記浮遊抗体（２２）に結合させる工程、
前記試料液を前記固定化抗体（１２）に到達させ、前記標識化抗原（１９）および前記被測定物質（２４）を前記固定化抗体（１２）に結合させる工程、および
前記固定化抗体（１２）に結合された被測定物質（２４）の量に基づいて、被測定物質（２４）の濃度を求める工程、
を順に有する。
２． 前記ペプチドがプロテインＡまたはＧのＢドメインおよびＤドメインの複合体から構成される、前記項目１の方法。
３． 前記被測定物質が前記試料液に含まれる浮遊抗原である、前記項目１の方法。

１１ プロテインＡまたはプロテインＧ
１２ 固定化抗体
１３ 反応部
１４ 流路
１５ ペプチド
１７ 標識化抗原保持部
１８ ペプチド保持部
１９ 標識化抗原
１９ａ 抗原
１９ｂ 標識
９ 基体
２２ 浮遊抗体
２４ 被測定物質（浮遊抗原）

Claims (3)

1. センサを用いて試料液に含まれる被測定物質（２４）を定量する方法であって、
   ここで
   前記試料液は浮遊抗体（２２）を含有し、
   前記センサは、プロテインＡまたはプロテインＧを構成する１以上かつ４以下のドメインからなるペプチド、標識化抗原（１９）、および固定化抗体（１２）を具備しており、
   前記標識化抗原（１９）は、前記固定化抗体（１２）に特異的に結合する抗原（１９ａ）および標識（１９ｂ）を具備しており、
   前記被測定物質（２４）は前記固定化抗体（１２）に特異的に結合し、
   前記方法は、
   前記試料液を前記センサに供給し、前記ペプチドおよび前記標識化抗原（１９）を前記試料液に溶解して前記ペプチドを前記浮遊抗体（２２）に結合させる工程、
   前記試料液を前記固定化抗体（１２）に到達させ、前記標識化抗原（１９）および前記被測定物質（２４）を前記固定化抗体（１２）に結合させる工程、および
   前記固定化抗体（１２）に結合された被測定物質（２４）の量に基づいて、被測定物質（２４）の濃度を求める工程、
   を順に有する。
2. 前記ペプチドがプロテインＡまたはＧのＢドメインおよびＤドメインの複合体から構成される、請求項１の方法。
3. 前記被測定物質が前記試料液に含まれる浮遊抗原である、請求項１の方法。

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