JP2011111406A - Vitrified liquid for cryopreservation of animal cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血清を含まない新規な生体細胞のガラス化凍結保存液に関する。 The present invention relates to a novel vitrified cryopreservation solution of living cells that does not contain serum.
従来より、動物細胞を凍結保存する場合、その凍結培地中に血清の添加を必要とする。また、血清の替りとしてメチルセルロースを添加した凍結保存用培地を用いて凍結する方法も確立されている。
血清の構成成分は、未だ完全に解明されておらず、その上、凍結保存中に動物細胞に何らかの変異を促す因子が存在する可能性もある。また血清やメチルセルロースを細胞凍結時の保護剤として添加した、凍結保存用培地を用いても、それらによって十分に凍結保存ができない動物細胞があることも知られている。
近年、生殖医療の分野では、卵子および胚の凍結保存がＩＶＦ治療の基幹技術として重要な役割を果たしている。我が国だけでも年間２０万件を超える。ＩＶＦ治療において近年、開発、実用化されたガラス化保存法がその標準法として普及定着している。一方、生殖医療に用いられる様々な培地、凍結液の安全性についても、そのニーズに基づいた規制が進み始めており、血清など、従来の培養、凍結保存液に不可欠である生体由来物質に対し、組成が明らかで安全な代替物質への移行が望まれている。
Conventionally, when animal cells are cryopreserved, it is necessary to add serum to the freezing medium. In addition, a method of freezing using a cryopreservation medium added with methylcellulose instead of serum has been established.
Serum components have not yet been fully elucidated, and there may be factors that induce some mutation in animal cells during cryopreservation. It is also known that there are animal cells that cannot be sufficiently cryopreserved by using a cryopreservation medium to which serum or methylcellulose is added as a protective agent during cell freezing.
In recent years, in the field of reproductive medicine, the cryopreservation of eggs and embryos has played an important role as a basic technique for IVF treatment. Japan alone exceeds 200,000 cases per year. In recent years, the vitrification preservation method developed and put into practical use in IVF treatment has become widespread as the standard method. On the other hand, as for the safety of various culture media and frozen solutions used in reproductive medicine, regulations based on their needs have begun to progress. For biological substances that are indispensable for conventional culture and cryopreservation solutions such as serum, There is a desire to move to a safe alternative with a clear composition.
特開平５−７４８９（特許文献１）には、血清を含まず、凍結保護剤として２糖類であるトレハロースを含有することを特徴とする動物細胞の凍結保存用血清不含培地を開示しており、また、血清の替りとしてメチルセルロースを添加した凍結保存用培地を用いて凍結する方法が確立されていることも開示している。
また、特表２０００−５００３２７（特許文献２）は、ガラス化液にカルボキシメチルセルロースを添加することを開示している。
Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-7489 (Patent Document 1) discloses a serum-free medium for cryopreservation of animal cells, which does not contain serum and contains trehalose, a disaccharide, as a cryoprotectant. It also discloses that a method of freezing using a cryopreservation medium to which methylcellulose is added instead of serum has been established.
JP 2000-500327 (Patent Document 2) discloses adding carboxymethyl cellulose to a vitrification solution.
特に、本願発明者が鋭意研究したところ、ガラス化凍結保存液に添加する保存細胞膜非透過性凍結保護物質として、ヒドロキシプロピルセルロースが有効かつ添加の容易性が高いことを知見した。
本発明の目的は、血清を用いない既知の成分からなる凍結保護物質を含有し、かつ良好にガラス化凍結が可能なガラス化凍結保存液を提供するものである。
In particular, as a result of intensive studies by the present inventors, it has been found that hydroxypropylcellulose is effective and easy to add as a preserved cell membrane impermeable cryoprotectant to be added to a vitrified cryopreservation solution.
An object of the present invention is to provide a vitrified cryopreservation solution that contains a cryoprotectant composed of known components that do not use serum and that can be vitrified and frozen well.
上記目的を達成するものは、以下のものである。
（１） 血清を含まず、凍結保護物質としてヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群より選択された少なくとも一種の水溶性セルロース系凍結保護物質を含有する動物細胞のガラス化凍結保存液。
（２） 前記ガラス化凍結保存液は、グリセロール、プロピレングリコール、ジメチルスルホサイド、エチレングリコール、ブタンジオールから選択される１種または２種以上の細胞膜透過性凍結保護物質を含有するものである上記（１）に記載の動物細胞のガラス化凍結保存液。
（３） 前記ガラス化凍結保存液は、前記セルロース系凍結保護物質に加えて、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンから選択される１種または２種以上の細胞膜非透過性凍結保護物質を含有するものである上記（１）または（２）に記載の動物細胞のガラス化凍結保存液。
（４） 前記ガラス化凍結保存液は、前記セルロース系凍結保護物質に加えて、スクロースを含有するものである上記（１）または（２）に記載の動物細胞のガラス化凍結保存液。
（５） 前記ガラス化凍結保存液は、前記セルロース系凍結保護物質に加えて、スクロース、ジメチルスルホサイドおよびエチレングリコールを含有するものである上記（１）または（２）に記載の動物細胞のガラス化凍結保存液。
What achieves the above object is as follows.
(1) Vitrified cryopreservation of animal cells containing no serum and containing at least one water-soluble cellulose cryoprotectant selected from the group consisting of hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and hydroxyethylmethylcellulose as a cryoprotectant liquid.
(2) The above vitrified cryopreservation solution contains one or more cell membrane-permeable cryoprotectants selected from glycerol, propylene glycol, dimethylsulfoside, ethylene glycol, and butanediol. The vitrified cryopreservation solution for animal cells according to 1).
(3) The vitrified cryopreservation solution contains one or more cell membrane impermeable cryoprotectants selected from sucrose, trehalose, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone in addition to the cellulose cryoprotectant. The vitrified cryopreservation solution for animal cells according to (1) or (2) above.
(4) The vitrification cryopreservation solution for animal cells according to (1) or (2) above, wherein the vitrification cryopreservation solution contains sucrose in addition to the cellulose cryoprotectant.
(5) The glass for animal cells according to (1) or (2) above, wherein the vitrified cryopreservation solution contains sucrose, dimethylsulfoside and ethylene glycol in addition to the cellulose cryoprotectant. Frozen storage solution.
本発明のガラス化凍結保存液は、血清を含まず、凍結保護物質としてヒドロキシプロピルセルロースを含有するものであるので、血清を含有しないにもかかわらず血清を含有するガラス化凍結保存液と同等の細胞生存率を持ち、かつヒドロキシプロピルセルロースは、非イオン性の水溶性セルロースエーテルであるため、ガラス化凍結保存液に添加したときの溶解性が極めて良好である。 Since the vitrified cryopreservation solution of the present invention does not contain serum and contains hydroxypropylcellulose as a cryoprotectant, it is equivalent to a vitrified cryopreservation solution containing serum despite not containing serum. Since it has cell viability and hydroxypropylcellulose is a nonionic water-soluble cellulose ether, its solubility when added to a vitrified cryopreservation solution is extremely good.
本発明のガラス化凍結保存液について、実施例を用いて説明する。
本発明の動物細胞のガラス化凍結保存液は、血清を含まず、凍結保護物質としてヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群より選択された少なくとも一種の水溶性セルロース系凍結保護物質を含有するものである。
本発明のガラス化凍結保存液を用いてガラス化凍結する動物細胞としては、家畜（ウシ、ブタなど）、愛玩動物（ネコ、イヌなど）などのほ乳類の精子、卵子、胚、また、人間の精子、卵子、胚などがあげられる。
本発明で用いる水溶性セルロース系凍結保護物質は、天然物であるセルロースを原料とし、これを苛性ソーダで処理した後、エーテル化剤と反応させることにより得られる非イオン性の水溶性セルロースである。
ヒドロキシプロピルセルロースは、セルロースの水酸基の水素原子の一部をヒドロキシプロピル（ヒドロキシプロポキシ基）で置換したものである。そして、ヒドロキシプロピルセルロースとしては、ヒドロキシプロポキシ基による置換率は、１０〜８０％であることが好ましく、特に、３０〜６０％であることが好ましい。
ヒドロキシプロピルメチルセルロースは、セルロースの水酸基の水素原子の一部をメチル（メトキシ基）およびヒドロキシプロピル（ヒドロキシプロポキシ基）で置換したものである。そして、ヒドロキシプロピルメチルセルロースとしては、ヒドロキシプロポキシ基置換率は、７〜１２％であり、メトキシ基置換率は、１７〜３０％であることが好ましい。
ヒドロキシエチルメチルセルロースは、セルロースの水酸基の水素原子の一部をメチル（メトキシ基）およびヒドロキシエチル（ヒドロキシエトキシ基）で置換したものである。また、ヒドロキシエチルメチルセルロースとしては、ヒドロキシエトキシ基置換率は、７〜１２％であり、メトキシ基置換率は、１７〜３０％であることが好ましい。
そして、上述したセルロース系凍結保護物質の分子量は、３００００〜２０００００程度のものが好適であり、特に、８００００〜１８００００が好ましい。また、ヒドロキシプロピルセルロースとしては、特に、３００００〜１７００００が好ましい。
また、ガラス化凍結保存液におけるセルロース系凍結保護物質の添加量は、０．６ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌであることが好ましい。また、本発明のガラス化凍結保存液は、セルロース系凍結保護物質としては、上述した３種のものより一つのみを選択して添加するもの、任意の２つを選択して添加するもの、さらには、３種すべてを選択して添加するもののいずれかであってもよい。
The vitrification cryopreservation solution of the present invention will be described using examples.
The vitrified cryopreservation solution for animal cells of the present invention does not contain serum, and at least one water-soluble cellulose cryoprotectant selected from the group consisting of hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and hydroxyethylmethylcellulose as a cryoprotectant It contains.
Examples of animal cells that are vitrified and frozen using the vitrification cryopreservation solution of the present invention include sperm, eggs, embryos of mammals such as domestic animals (cow, pigs, etc.), pets (cats, dogs, etc.) Examples include sperm, eggs, and embryos.
The water-soluble cellulose cryoprotectant used in the present invention is nonionic water-soluble cellulose obtained by reacting a natural product cellulose with a caustic soda and then reacting with an etherifying agent.
Hydroxypropyl cellulose is obtained by substituting part of the hydrogen atoms of the hydroxyl group of cellulose with hydroxypropyl (hydroxypropoxy group). And as hydroxypropylcellulose, it is preferable that the substitution rate by a hydroxypropoxy group is 10 to 80%, and it is especially preferable that it is 30 to 60%.
Hydroxypropyl methylcellulose is obtained by substituting a part of hydrogen atoms of hydroxyl group of cellulose with methyl (methoxy group) and hydroxypropyl (hydroxypropoxy group). As hydroxypropylmethylcellulose, the hydroxypropoxy group substitution rate is preferably 7 to 12%, and the methoxy group substitution rate is preferably 17 to 30%.
Hydroxyethyl methylcellulose is obtained by substituting part of the hydrogen atoms of the hydroxyl group of cellulose with methyl (methoxy group) and hydroxyethyl (hydroxyethoxy group). Moreover, as hydroxyethyl methylcellulose, it is preferable that a hydroxyethoxy group substitution rate is 7 to 12%, and a methoxy group substitution rate is 17 to 30%.
And as for the molecular weight of the cellulose cryoprotectant mentioned above, the thing of about 30000-200000 is suitable, and 80000-18000 are especially preferable. Moreover, as hydroxypropylcellulose, 30000-170000 are especially preferable.
Moreover, it is preferable that the addition amount of the cellulosic cryoprotectant in the vitrification cryopreservation solution is 0.6 g / L to 6 g / L. Moreover, the vitrification cryopreservation liquid of the present invention is a cellulosic cryoprotectant that is added by selecting only one from the above-mentioned three types, and by adding any two selected, Furthermore, it may be any one selected by adding all three types.
ガラス化凍結保存液は、細胞膜透過性凍結保護物質と細胞膜非透過性凍結保護物質を含有するものであることが好ましい。
そして、本発明のガラス化凍結保存液は、細胞膜非透過性凍結保護物質として、ヒドロキシプロピルセルロースを含有するものである。さらに、本発明のガラス化凍結保存液は、ヒドロキシプロピルセルロースに加えて、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンから選択される１種または２種以上の細胞膜非透過性凍結保護物質を含有するものであることが好ましい。
特に、細胞膜非透過性凍結保護物質として、ヒドロキシプロピルセルロースに加えて、スクロースを含有するものであることが好ましい。
また、本発明のガラス化凍結保存液に用いる細胞膜透過性凍結保護物質としては、グリセロール、プロピレングリコール、ジメチルスルホサイド、エチレングリコール、ブタンジオールから選択される１種または２種以上のものを用いることが好ましい。
The vitrified cryopreservation solution preferably contains a cell membrane permeable cryoprotectant and a cell membrane impermeable cryoprotectant.
The vitrification cryopreservation solution of the present invention contains hydroxypropylcellulose as a cell membrane impermeable cryoprotectant. Furthermore, the vitrified cryopreservation solution of the present invention contains one or more cell membrane impermeable cryoprotectants selected from sucrose, trehalose, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone in addition to hydroxypropylcellulose. It is preferable that
In particular, the cell membrane impermeable cryoprotectant preferably contains sucrose in addition to hydroxypropylcellulose.
The cell membrane-permeable cryoprotectant used in the vitrification cryopreservation solution of the present invention should be one or more selected from glycerol, propylene glycol, dimethylsulfoside, ethylene glycol, and butanediol. Is preferred.
特に、本発明のガラス化凍結保存液は、ヒドロキシプロピルセルロースに加えて、スクロース、ジメチルスルホサイドおよびエチレングリコールを含有するものであることが好ましい。
ガラス化凍結保存液におけるスクロースの添加量は、１２０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。ガラス化凍結保存液におけるジメチルスルホキシド（濃度９９．５％以上）の添加量は、１００ｍｌ／Ｌ〜２００ｍｌ／Ｌであることが好ましい。ガラス化凍結保存液におけるエチレングリコールの添加量は、１００ｍｌ／Ｌ〜２００ｍｌ／Ｌであることが好ましい。
そして、本発明のガラス化凍結保存液は、ゲンタマイシンのような抗生物質を含有することが好ましい。ガラス化凍結保存液における抗生物質の添加量は、２５ｍｇ／Ｌ〜７５ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
In particular, the vitrified cryopreservation solution of the present invention preferably contains sucrose, dimethylsulfoside and ethylene glycol in addition to hydroxypropylcellulose.
The amount of sucrose added in the vitrified cryopreservation solution is preferably 120 g / L to 200 g / L. The addition amount of dimethyl sulfoxide (concentration of 99.5% or more) in the vitrified cryopreservation solution is preferably 100 ml / L to 200 ml / L. The amount of ethylene glycol added in the vitrified cryopreservation solution is preferably 100 ml / L to 200 ml / L.
The vitrified cryopreservation solution of the present invention preferably contains an antibiotic such as gentamicin. The amount of antibiotic added in the vitrified cryopreservation solution is preferably 25 mg / L to 75 mg / L.
（実施例１）
以下の組成にて、基礎液に各添加物を添加させることにより本発明のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
ヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達製 製品名HPC-SSL 分子量３万〜５万） ０．６ｇ／Ｌ
スクロース（シグマ社） １７１．１５ｇ／Ｌ
ジメチルスルホキシド(99.5：シグマ社) １５０ｍｌ／Ｌ
エチレングリコール（シグマ社） １５０ｍｌ／Ｌ
ゲンタマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
（実施例２）
以下の組成にて、基礎液に各添加物を添加させることにより本発明のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
ヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達製 製品名HPC-SL 分子量８万〜１２万） ０．６ｇ／Ｌ
スクロース（シグマ社） １７１．１５ｇ／Ｌ
ジメチルスルホキシド(99.5：シグマ社) １５０ｍｌ／Ｌ
エチレングリコール（シグマ社） １５０ｍｌ／Ｌ
ゲンタマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
（実施例３）
以下の組成にて、基礎液に各添加物を添加させることにより本発明のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
ヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達製 製品名HPC-L 分子量１０万〜１７万） ０．６ｇ／Ｌ
スクロース（シグマ社） １７１．１５ｇ／Ｌ
ジメチルスルホキシド(99.5：シグマ社) １５０ｍｌ／Ｌ
エチレングリコール（シグマ社） １５０ｍｌ／Ｌ
ゲンタマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
（実施例４）
以下の組成にて、基礎液に各添加物を添加させることにより本発明のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（信越化学社製）０．６ｇ／Ｌ
スクロース（シグマ社） １７１．１５ｇ／Ｌ
ジメチルスルホキシド(99.5：シグマ社) １５０ｍｌ／Ｌ
エチレングリコール（シグマ社） １５０ｍｌ／Ｌ
ゲンタマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
（実施例５）
以下の組成にて、基礎液に各添加物を添加させることにより本発明のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
ヒドロキシエチルメチルセルロース（信越化学社製）０．６ｇ／Ｌ
スクロース（シグマ社） １７１．１５ｇ／Ｌ
ジメチルスルホキシド(99.5：シグマ社) １５０ｍｌ／Ｌ
エチレングリコール（シグマ社） １５０ｍｌ／Ｌ
ゲンタマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
Example 1
1 L of vitrification cryopreservation liquid of this invention was produced by making each additive add to a base solution with the following compositions.
Hydroxypropyl cellulose (Nippon Soda product name HPC-SSL Molecular weight 30,000 to 50,000) 0.6g / L
Sucrose (Sigma) 171.15 g / L
Dimethyl sulfoxide (99.5: Sigma) 150ml / L
Ethylene glycol (Sigma) 150ml / L
Gentamicin 50mg / L
(Example 2)
1 L of vitrification cryopreservation liquid of this invention was produced by making each additive add to a base solution with the following compositions.
Hydroxypropylcellulose (Nippon Soda product name HPC-SL molecular weight 80,000-120,000) 0.6g / L
Sucrose (Sigma) 171.15 g / L
Dimethyl sulfoxide (99.5: Sigma) 150ml / L
Ethylene glycol (Sigma) 150ml / L
Gentamicin 50mg / L
(Example 3)
1 L of vitrification cryopreservation liquid of this invention was produced by making each additive add to a base solution with the following compositions.
Hydroxypropyl cellulose (Nippon Soda product name HPC-L molecular weight 100,000 ~ 170,000) 0.6g / L
Sucrose (Sigma) 171.15 g / L
Dimethyl sulfoxide (99.5: Sigma) 150ml / L
Ethylene glycol (Sigma) 150ml / L
Gentamicin 50mg / L
Example 4
1 L of vitrification cryopreservation liquid of this invention was produced by making each additive add to a base solution with the following compositions.
Hydroxypropyl methylcellulose (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 0.6g / L
Sucrose (Sigma) 171.15 g / L
Dimethyl sulfoxide (99.5: Sigma) 150ml / L
Ethylene glycol (Sigma) 150ml / L
Gentamicin 50mg / L
(Example 5)
1 L of vitrification cryopreservation liquid of this invention was produced by making each additive add to a base solution with the following compositions.
Hydroxyethyl methylcellulose (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 0.6 g / L
Sucrose (Sigma) 171.15 g / L
Dimethyl sulfoxide (99.5: Sigma) 150ml / L
Ethylene glycol (Sigma) 150ml / L
Gentamicin 50mg / L
（比較例１）
ヒドロキシプロピルセルロースを添加しない以外、実施例１と同様に行い比較例１のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
（比較例２）
ヒドロキシプロピルセルロースの代わりに、血清成分（SSS； serum substitute supplement, Irvine scientific社）をほぼ同量添加した以外、実施例１と同様に行い比較例２のガラス化凍結保存液１Ｌを作製した。
(Comparative Example 1)
A vitrified cryopreservation solution 1L of Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1 except that hydroxypropylcellulose was not added.
(Comparative Example 2)
A vitrified cryopreservation solution 1L of Comparative Example 2 was prepared in the same manner as in Example 1, except that almost the same amount of serum component (SSS; serum substitute supplement, Irvine scientific) was added instead of hydroxypropylcellulose.
（実験）
ウシ卵子を体外成熟培養後、実施例１ないし５，比較例１および２のガラス化凍結保存液を用いて、卵子をガラス化保存し、それぞれ、解凍後、形態的判定により生存性を評価、比較した。
比較例１の無添加ガラス化保存液での生存率は８７％であったが、実施例１ないし５および比較例２のガラス化保存液では、１００％生存率が得られた。
以上の結果から、食品、医療分野で安全な添加物として使用されているヒドロキシプロピルセルロースが、卵子ガラス化保存におけるガラス化液の血清由来成分の代替物質として利用できることがわかった。
(Experiment)
After in vitro maturation culture of bovine eggs, the vitrified cryopreservation solutions of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 and 2 were used to preserve vitrified eggs, and after thawing, respectively, the viability was evaluated by morphological determination. Compared.
The survival rate in the additive-free vitrification storage solution of Comparative Example 1 was 87%, but in the vitrification storage solutions of Examples 1 to 5 and Comparative Example 2, 100% survival rate was obtained.
From the above results, it was found that hydroxypropylcellulose, which is used as a safe additive in the food and medical fields, can be used as a substitute for the serum-derived component of the vitrification solution in egg vitrification preservation.
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