JP2011105602A - 腹足類に属する軟体動物の忌避剤及びその製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】天然物由来で安全性が高く、強力且つ安定した効果を有する、腹足類に属する軟体動物に対する忌避剤を提供する。
【解決手段】天然物である椿科植物種子の油粕から、ナメクジ類、カタツムリ類に対して強力な忌避効果を有する成分を抽出し、２段階精製を行うことにより粉末として得る方法。本有効成分の粉末を用い、腹足類に属する軟体動物に対して強力且つ安定した効果を発揮する忌避剤。
【選択図】図１

Description

本発明は、植物の新芽、花、葉、果実などを食し、農園芸分野において多大な被害を与えるナメクジ類やカタツムリ類など腹足類に属する軟体動物を忌避することのできる忌避剤に関するものである。

農園芸分野においては植物を栽培する為散水頻度が高く、湿気を好むナメクジ類やカタツムリ類が発生し易い。さらに新芽、花、葉、果実等をナメクジ類、カタツムリ類が好んで食するため、被害が著しいという問題がある。従来、それらの食害を防ぐ方策として、メタアルデヒドを有効成分とする合成薬剤が開発されている。

この薬剤は、害虫駆除乃至殺を目的としており、強い薬効を持つ反面、付着した場合は植物そのものを損傷することもある。また、散布等の取扱時には人体との接触を避ける必要があり、特に家畜やペットに対しても配慮する必要がある。さらに環境保全や健康、安心安全への社会的志向が高まり、天然物由来資材や生物を殺す駆除剤ではなく寄せ付けない忌避剤が求められている。

本発明者らは以前、上記の要請に応えるため研究を重ね、椿科植物種子の搾油残渣（油粕）がナメクジ類やカタツムリ類に対する忌避効果を有することを見出し、椿科植物種子の油粕を原料に用いた忌避剤を発明した経緯がある。椿油粕は古くから肥料として使用されており、安全面で非常に実績がある。さらに天然有機物であるため微生物等の働きにより最終的に土に返るため環境にも配慮されている。

特開平８−１７５９２５

しかし、上記忌避剤は天然物をそのまま使用するため、化学物質を用いた忌避材と比較して効果が弱く、さらに原料となる油粕の品質によって効果が大きく左右される。このため、農業や園芸業界などからは、より強い忌避効果を安定して発揮する忌避剤が要求されている。

本発明者らは以上のような要求に応えるべく研究開発を重ね、椿科植物種子の油粕に含まれる腹足類に対して忌避効果を有する物質（以下有効成分）を抽出し、精製を行うことによって粉末として取り出し、効果を高める方法を開発した。即ち本発明は、椿科植物種子の油粕に含まれる有効成分を抽出して精製を行い、純度を高めることによって、より強く安定した忌避効果を発揮する忌避剤を提供することにある。

上記目的を達成する為、椿科植物種子の油粕より有効成分の抽出及び精製を行う。特許文献１において発明した忌避剤の効果持続時間から考察するに、有効成分の揮発性は低い。また、使用方法及び状況から考察するに、有機溶剤等の溶剤にのみ溶け出す物質が忌避効果を発揮している可能性も低い。特許文献１における研究で、浸漬液に忌避効果が確認されていることから、有効成分は水溶性であると考えられるため、抽出は水抽出で行う。さらに、抽出液から有効成分を分離・精製する方法としてクロマトグラフィーを用いる。

有効成分の抽出に用いる椿科植物種子の油粕は、特許文献１において既に忌避効果が確認されている茶、椿、山茶花が好ましい。なお、搾油方法や油の抽出条件については特に制限はなく、物理的圧力で油を搾る圧搾法や、ヘキサン等有機溶剤を用いた抽出法が一般的である。搾油された油分はそれ自体製品として用いることができる。

有効成分の純度を高め、より強い忌避効果を発揮させるためには、油粕の水抽出液中に含まれる多種多様な水溶性物質から、有効成分のみを分離して精製を行う必要がある。分離、精製には『オクタデシル基結合シリカゲル（以下ＯＤＳ）カラムクロマトグラフィー』及び『シリカゲルカラムクロマトグラフィー』を用いる。

得られた精製物質の忌避効果を確認する方法として、試料をナメクジの傍に近づけて反応を見る方法や、試料を水に溶かして水溶液を作り、直接ナメクジの体に滴下して反応を見る方法を実施する。特に水溶液を滴下する方法においては、希釈倍率を変更することで効果の強さも測ることが可能であり、効果確認方法として優れているため、本方法を主として用いる。

『ＯＤＳカラムクロマトグラフィー』と『シリカゲルカラムクロマトグラフィー』を用い、椿科植物種子の油粕水抽出成分に対し２段階の分離と精製を行うことにより、有効成分の純度をより高める。精製された有効成分は粉末の形で得られ、１，０００倍重量の水に溶かした水溶液であっても非常に強い忌避効果を有する。分離、精製された有効成分の粉末が本発明の忌避剤である。
忌避剤の製造工程は図１に示す通りである。

本発明は、腹足類に属する軟体動物に対する忌避効果が確認されている椿科植物種子の油粕から、有効成分を抽出及び精製によって高純度で取り出し、強く安定した効果を有する忌避剤を開発し、農園芸業界に提供するものである。また、本研究により開発された忌避剤は微量でも効果を発揮することに加え、粉末（固体）の状態で保管が可能であり、高い水溶性を示すことからも汎用性が高い。本発明は農園芸分野で多大な食害を起こすナメクジ、カタツムリ等の防除及び、新たな忌避剤開発に広く応用が可能である。

本発明に当たり開発した忌避剤の製造工程図である。椿科植物種子の油粕に水を加えて有効成分を抽出し、固液分離を行った後、『ＯＤＳカラムクロマトグラフィー』と『シリカゲルクロマトグラフィー』を用いて２段階精製を行い、得られた純度の高い有効成分の結晶が本発明の忌避剤である。 本発明に当たり実施した成分の抽出、分離、精製方法及び、忌避効果確認試験を示した工程図であり、詳細な説明は文中に記述されている。なお、図中の分離・精製した物質を示す符号は、表１、表２、表３、表４の試料名とそれぞれ対応している。 茶種子油粕（以下茶粕）水抽出物及び椿種子油粕（以下椿粕）水抽出物の、『高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）』を用いた成分分析結果を示したクロマトグラムであり、図の上側が椿粕抽出物、下側が茶粕抽出物である。クロマトグラムの横軸は時間軸であり、縦軸は物資に対する検出器の応答（濃度）を示すため、各成分ピークとベースラインの間の面積が成分量に比例している。『ＨＰＬＣ』を用いた分析は、検出される物質の分子量と検出にかかる時間に相関があることを利用しており、特定の物質（分子量の同じ物質）は特定の時間帯に検出される。従って、構成成分及び成分量が類似した物質のクロマトグラムは類似する。茶粕と椿粕が非常に類似した成分を有していることが本図より明らかとなった。

以下、本発明の腹足類に属する軟体動物忌避剤を、作業工程及び実験の具体的な実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施した成分の抽出、分離、精製方法及び忌避効果確認試験の具体的な工程は図２に示す通りである。なお、図２内の分離、精製した物質を示す符号と、後述の文中及び表１〜表４内の試料名を示す符号はそれぞれ対応している。

本発明において使用する椿科植物種子の油粕は、大量入手が容易であることから茶粕（中国産：株式会社カーギルジャパンより購入品およびそれに準じるもの）を選定した。有効成分の抽出は、特許文献１において茶粕の浸漬液に忌避効果が確認されていることから水抽出で実施する。
細かく粉砕した茶粕に対し、１０倍（重量）の水を加え１０分間撹拌した。遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分）により抽出液と沈殿に分け、この沈殿を抽出残渣「Ｄ」とした。抽出液を『ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ナカライテスク株式会社製）（充填剤：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８ＯＰＮ）』により分離した。ＭｅＯＨで溶出され『薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣ）（ＯＤＳ，６０％ＭｅＯＨ）』でＲｆ（スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割ったものをＲｆ値と呼ぶ）＝０．２〜０を示す画分（この範囲のＲｆ値を示す成分を含むカラム溶出液を合わせ、減圧濃縮し、真空乾燥して粉末もしくはペースト状に得られたもの）を「Ａ」とし、４０％ＭｅＯＨおよび６０％ＭｅＯＨで溶出され『ＴＬＣ（同）』でＲｆ＝０．２〜０．８を示す画分を「Ｂ」、溶出液に水及び２０％ＭｅＯＨを用いて溶出され『ＴＬＣ（同）』でＲｆ＝０．８〜１を示す画分を「Ｃ」とした。

供試動物：ナメクジ
評価方法：忌避効果の評価は、ナメクジに各画分の水溶液をナメクジに直接滴下し、その際のナメクジの反応及び行動を確認して判断する方法で行った。忌避効果を有する画分の水溶液がナメクジに触れると、身悶えや身を縮込ませるなど顕著な拒否反応を示す。その反応の強弱によって４段階で評価し、また反応の有無が判断できないものは「判断できず」とした。
試料：茶粕水抽出物より前述の方法で分離、精製された３画分「Ａ」「Ｂ」「Ｃ」および抽出残渣「Ｄ」の水溶液を用いる。水溶液の濃度は抽出に用いた茶粕の重量と得られた画分の重量から計算し、０．１％（１０００倍希釈）とした。また、抽出残渣「Ｄ」に関しては１０倍重量の水を加えて撹拌した上澄み液（「Ｄ」の水抽出液）を用いて評価した。
１段階目の忌避効果確認試験評価結果は表１に示す通りである。

この表から明らかなように、ナメクジに対し画分「Ａ」の水溶液が極めて強い忌避効果を示した。画分「Ｂ」の水溶液は効果が確認されるものの「Ａ」と比較すると弱く、画分「Ｃ」の水溶液と抽出残渣「Ｄ」の上澄み液には効果がほとんど無いという結果となった。有効成分をより純度を高めて取り出すため、画分「Ａ」に対しさらに分離、精製を行う。

画分「Ａ」を『シリカゲルカラムクロマトグラフィー（和光純薬工業株式会社製）（充填剤：ＷａｋｏｇｅｌＣ−３００）』により分離した。ＣＨＣｌ３−９０％ＭｅＯＨ（７：３〜３：７）を用いて溶出され『ＴＬＣ（シリカゲル，ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ＝６：４：１）』でＲｆ＝０．５〜０．３を示す画分を「Ａ−１−ａ」、溶出液にＣＨＣｌ３−９０％ＭｅＯＨ（８：２〜７：３）を用いて溶出され『ＴＬＣ（同）』でＲｆ＝１〜０．５を示す画分を「Ａ−１−ｂ」とした。

供試動物及び評価方法は、実施例１と同様にして行った。
試料：１段階目の忌避効果確認試験において強い忌避効果を示した画分「Ａ」を前述の方法を用いて２つに分離、精製し、得られた画分「Ａ−１−ａ」「Ａ−１−ｂ」の水溶液を用いる。水溶液の濃度は実施例と同じ理由から０．１％（１０００倍希釈）とし、また、ナメクジが示す反応の比較を行うため、水を対照区として用いた。
２段階目の忌避効果確認試験評価結果は表２に示す通りである。

この表から明らかなように、画分「Ａ」を分離した２つの画分の内「Ａ−１−ａ」にのみ忌避効果が確認されたことから、有効成分は「Ａ−１−ａ」にのみ含まれていることが判明した。さらに純度を高めるため、分離、精製を行う。

活性の見られた画分「Ａ−１−ａ」に対し、『ＨＰＬＣ（日本分光株式会社製、ポンプ機種ＰＵ−１５８６、検出器機種ＵＶ−１５７０』を用いて分離、精製を行った。カラム（野村化学株式会社製）にＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ−ＵＧ−５（内径２８ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を用い、３０−５０％ＭｅＣＮ−２０ｍＭＮＨ４ＯＡｃ（８０ｍｉｎのグラジエント溶出）で溶出し、流速１８ｍｌ／分、検出器波長２２５ｎｍで７回に分けて分取を行った。
保持時間３１分のピークを集め「Ａ−２−ａ」、同３７分のピークを集め「Ａ−２−ｂ」、同４３分のピークを集め「Ａ−２−ｃ」、５７分のピークを集め「Ａ−２−ｄ」の各画分を得た。

供試動物及び評価方法は、実施例１と同様にして行った。
試料：２段階目の忌避効果確認試験において強い忌避効果を示した画分「Ａ−１−ａ」を、さらに『ＨＰＬＣ』を用いて分離、精製し、得られた画分を「Ａ−２−ａ」「Ａ−２−ｂ」「Ａ−２−ｃ」「Ａ−２−ｄ」の水溶液を用いる。なお、実施例２で行った忌避効果確認試験においてなめくじが非常に激しく反応したため、水溶液の濃度を０．１％（１０００倍希釈）、０．０１％（１万倍希釈）、０．００１％（１０万倍希釈）の３パターン用意し、忌避効果の強さの確認も行った。
３段階目の忌避効果確認試験評価結果は表３に示す通りである。

この表から明らかなように、４つの画分全てに強い忌避効果が確認され、その効果は１０万倍希釈でもナメクジが反応するくらい強力である。複数の画分に忌避効果が確認されたことから、茶粕の有効成分は単一の物質ではなく、類縁化合物の混合物であることが判明した。次に、有効成分をより高純度に分離した場合、忌避効果がより強化されるのかを確認する為に、それぞれの画分に対しさらに精製を行った。

「Ａ−２−ａ」〜「Ａ−２−ｄ」に対しさらに『ＨＰＬＣ』を用いて精製を行った。「Ａ−２−ａ」を『ＨＰＬＣ（６０％ＭｅＯＨ−２０ｍＭＮＨ４ＯＡｃ、カラムなど他の条件は先の精製に用いたものと同じである）』で精製し、保持時間＝４０−４６分のピークを集め「Ａ−３−ａ」を得た。「Ａ−２−ｂ」を『リサイクルＨＰＬＣ（３３％ＭｅＣＮ−２０ｍＭＮＨ４ＯＡｃ、他の条件は同じ）』に供し、保持時間＝５０−７０分の範囲を２回リサイクルした後、主なピークを集め「Ａ−３−ｂ」を得た。「Ａ−２−ｃ」を『リサイクルＨＰＬＣ（３５％ＭｅＣＮ−２０ｍＭＮＨ４ＯＡｃ、他の条件は同じ）』に供し、保持時間＝４８−６１分の範囲を５回リサイクルした後、主なピークを集め「Ａ−３−ｃ」を得た。「Ａ−２−ｄ」を『ＨＰＬＣ（３５％ＭｅＣＮ−２０ｍＭＮＨ４ＯＡｃ、他の条件は同じ）』で精製し、保持時間７３−８５分のピークを集め「Ａ−３−ｄ」を得た。

供試動物及び評価方法は、実施例１と同様にして行った。ただし、効果の強さをより細かく評価する為に、評価を４段階から５段階に増やして実施した。
試料：３段階目の忌避効果確認試験に用いた４画分に対し、さらに『ＨＰＬＣ』を用いて精製を行った画分を「Ａ−３−ａ」「Ａ−３−ｂ」「Ａ−３−ｃ」「Ａ−３−ｄ」とし、各画分の水溶液を用いる。なお、忌避効果の強さを確認する為、水溶液の濃度を０．０１％（１万倍希釈）、０．００１％（１０万倍希釈）、０．０００１％（１００万倍希釈）、０．００００３３％（３００万倍希釈）の４パターンで実施した。
４段階目の忌避効果確認試験評価結果は第４表に示す通りである。

本表から明らかなように、「Ａ−３−ａ」〜「Ａ−３−ｄ」全てに効果が確認された。また、画分を１０万倍以上に希釈すると、その効果が弱まることも確認された。１０万倍希釈は実施例３で確認した濃度である。つまり、３段階の精製を行った得られた画分「Ａ−２−ａ」〜「Ａ−２−ｄ」と、それらをさらに精製した画分「Ａ−３−ａ」〜「Ａ−３−ｄ」では、忌避効果の強さは同等であることを示しており、４段階目以降の精製を行っても忌避効果が強まるわけではないことも判明した。

以上の試験結果より、茶粕のナメクジ類に対する有効成分は、３段階目の精製時でその効果の強さはほぼ最高となり、以降の精製は強度の面からみると無駄であることが判明した。また、２段階の精製行うことよって得られる「Ａ−１−ａ」から分離された画分全てに強い忌避効果が確認されたことから、有効成分である近似した構造を持つ類縁化合物群は全て「Ａ−１−ａ」内に含まれていることも明らかとなっている。
忌避効果の強度からみた場合、３段階の精製を行うことが好ましいが、非常にコストが高い。一方、２段階目の精製までは比較的容易で安価である。２段階目の精製で得られる画分の効果は特許文献１における先に発明した忌避剤よりもはるかに強力であり、１０００倍希釈で強い忌避効果を発揮する。強い忌避効果を安定して発揮する忌避剤の開発し提供するという課題は充分に満たしていると考えられ、コスト、効果の両面から判断し、有効成分の精製は２段階が好ましい。

茶粕の有効成分を解明するため、「Ａ−３−ａ」〜「Ａ−３−ｄ」の内、比較的純度が高いと考えられた「Ａ−３−ｃ」に対し、さらに『リサイクルＨＰＬＣ（３５％ＭｅＣＮ−２０ｍＭＮＨ４ＯＡｃ、他の条件は同じ）』に供し、保持時間＝５３−６７分の範囲を８回リサイクルした後、主なピークを集め「Ａ−４」を得た。この物質はほぼ純粋と思われたため、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）をはじめとする機器分析に供した。結果、糖を数個含む分子量８００〜１６００のサポニン（ステロイド、ステロイドアルカロイド、トリテルペンの配糖体で、水に溶けて石鹸様の発泡作用を示す物質の総称）であると判明したが、構造決定には至っていない。

茶と同じく椿科に属する椿の種子もサポニンを含んでおり、特許文献１にあるようにその油粕はナメクジ類、カタツムリ類に対し忌避効果を有する。互いに近縁種であるため含まれる成分も類似していると推測され、茶粕と椿粕の水抽出物を成分分析にかけ、比較を行った。
図３は成分分析の結果を示したものであり、図の上側が椿粕水抽出物、下側が茶粕水抽出物を示している。

図３より、茶粕と椿粕の水抽出物において、含まれる物質及び割合が非常に類似していることが認められた。本結果より、近縁種である茶と椿において、その種子に腹足類に属する軟体動物に対し忌避効果を有する、特徴的なサポニンを共通して含有するものと判明した。また、特許文献１によると、同じく椿科植物である山茶花の種子の油粕にも同様の忌避効果が認められており、椿科植物の種子の油粕にはナメクジ等に対する忌避効果物質が共通して含まれているものと推測される。

本発明は、椿科植物の種子の油粕より抽出、分離、精製した有効成分を用いる忌避剤の開発であり、植物の新芽や花、葉、果実等を食害するナメクジ類やカタツムリ類などの腹足類に属する軟体動物を有効に忌避することができる。精製で得られた有効成分は常温で粉末であるため、保存、取扱いが容易である。
忌避効果の強さは条件によって異なるが、概ね１０００倍希釈水溶液において優位に効果を発揮する。また、精製回数をもう１回増やすことで有効成分の純度を高め、１０万倍希釈の水溶液においても効果を発揮するほど強化することも可能である。また、本有効成分は化学農薬とは異なり、椿科植物の種子に含まれる天然有機物質であり、あらゆる植物に対して安心して使用することができ、人体、ペット、家畜等に対しても安全性が高い。
本忌避剤は水溶性も高く、水溶液をナメクジ等に直接散布して利用する方法や、他の物質と混合、吸着させて徐放性をもたせ、長期間効果を持続させる方法など、様々な利用方法が考えられ、汎用性も高い。それ故、本発明及び研究によって得られた忌避剤及び有効成分の精製方法は、園芸、農業の各分野において有効に利用することができる。

Claims (4)

1. 椿科植物種子の油粕の水抽出物を、オクタデシル基結合シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分離を行い、さらにシリカゲルクロマトグラフィーによる分離を行うことにより精製されることを特徴とする、腹足類に属する軟体動物の忌避剤の製造方法。
2. 椿科植物が椿、茶、山茶花であることを特徴とする請求項１記載の忌避剤の製造方法。
3. 上記腹足類に属する軟体動物が、ナメクジ類、カタツムリ類である請求項１または請求項２記載の腹足類に属する軟体動物の忌避剤の製造方法。
4. 有効成分が糖を数個含む分子量８００〜１６００のサポニンであり、請求項１または請求項２に記載された製造方法で粉末として取り出され、水溶性であることを特徴とする腹足類に属する軟体動物忌避剤。

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