JP2011097898A - RECOMBINANT Fc RECEPTOR AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト抗体に対して高い親和性を有し、抗体の免疫活性測定用試薬として有用なＦｃレセプター、および遺伝子工学的手法を用いたＦｃレセプターの製造方法に関する。 The present invention relates to an Fc receptor that has high affinity for human antibodies and is useful as a reagent for measuring the immunological activity of antibodies, and a method for producing Fc receptors using genetic engineering techniques.
Ｆｃレセプター（Ｆｃ受容体）とは免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子である。個々の分子種は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＦｃ認識ドメインを有し、単一種の、または同じサブタイプに属する免疫グロブリンを認識する。これによって個々の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動員されるかが決定される（非特許文献１）。 Fc receptors (Fc receptors) are a group of protein molecules that bind to the Fc region of immunoglobulin molecules. Each molecular species has an Fc recognition domain belonging to the immunoglobulin superfamily and recognizes immunoglobulins belonging to a single species or the same subtype. This determines which accessory cells are mobilized in individual immune responses (Non-Patent Document 1).
Ｆｃレセプターは、さらにサブタイプに分類することができ、免疫グロブリンＧ（以下ＩｇＧという）に対するレセプターとしてはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。中でも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧに対するレセプターであり、単球とマクロファージ上に構成的に発現し、好中球および好酸球上においては誘導的に発現する。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へと結合のシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜貫通領域と細胞外領域の境界にあるシステインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。 Fc receptors can be further classified into subtypes, and FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, and FcγRIII have been reported as receptors for immunoglobulin G (hereinafter referred to as IgG) (Non-patent Document 1). Among them, the binding affinity between FcγRI and IgG is high, and the equilibrium dissociation constant (KD) is 10 −8 M or less (Non-patent Document 2). FcγRI is a receptor for IgG and is constitutively expressed on monocytes and macrophages and inducibly expressed on neutrophils and eosinophils. FcγRI is divided into an extracellular region, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region, and binding to IgG occurs in the extracellular region of the IgG molecule Fc region and FcγRI, and then a binding signal is transmitted to the cytoplasm. FcγRI is composed of two types of subunits, α chain and γ chain, which are directly involved in binding to IgG. The γ chain forms homodimer by covalent bond via cysteine at the boundary between transmembrane region and extracellular region. (Non-patent document 1).
Ｆｃレセプターには免疫抑制的な生物学的特性があることから、近年では、自己免疫疾患、移植物の拒絶、悪性リンパ増殖などの領域において有効な医薬となる可能性が期待されている。また、Ｆｃレセプターはヒトが持っている免疫機能の一つであることから、抗体のＡＤＣＣ（Ａｎｉｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性（抗体依存性細胞障害活性）を測定するためのタンパク質としても注目を浴びている（特許文献１）。さらに、Ｆｃレセプターの一つであるＦｃγＲＩが有する抗体への結合能は抗体の免疫活性測定用試薬や各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルに用いる捕捉タンパク質として利用することができる（特許文献２）。 Since the Fc receptor has immunosuppressive biological properties, in recent years, it is expected to be an effective drug in the fields of autoimmune diseases, transplant rejection, malignant lymphoproliferation and the like. In addition, since the Fc receptor is one of the immune functions possessed by humans, it has also attracted attention as a protein for measuring the ADCC (Antibibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) activity (antibody-dependent cytotoxic activity) of an antibody. (Patent Document 1). Furthermore, the ability of FcγRI, which is one of the Fc receptors, to bind to an antibody can be used as a capture protein for use in a reagent for measuring antibody immunoactivity or a chromatography gel for purifying various antibodies (Patent Document 2).
このようにＦｃγＲＩの有する機能、およびさらなる生物学的機能を追求するために、ＦｃγＲＩ、その中でも特に抗体への結合能を有する細胞外領域を、遺伝子工学的手法を用いて効率よく発現させる試みがなされている。ＦｃγＲＩ細胞外領域を発現させる方法としては、哺乳動物細胞や昆虫細胞等を利用したものがある（非特許文献３）が、煩雑な作業と手間を要する。また、ＦｃγＲＩ細胞外領域を取扱いの容易な大腸菌で発現させた例もあるが、ＦｃγＲＩ細胞外領域は不活性型である封入体として発現するため、必ずしも効率的で有用な方法ではない（特許文献２および３）。さらに、従来、ＦｃγＲＩ細胞外領域を発現させる際は、ＦｃγＲＩ細胞外領域の一部分を欠いたポリペプチドで発現させたり、融合タンパク質の形態で発現させたり、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼやＦＬＡＧ−ｔａｇ等をＮ末端に付加して発現させていた。 Thus, in order to pursue the functions of FcγRI and further biological functions, there has been an attempt to efficiently express FcγRI, in particular, an extracellular region particularly capable of binding to an antibody, using genetic engineering techniques. Has been made. As a method for expressing the FcγRI extracellular region, there are methods using mammalian cells, insect cells, and the like (Non-patent Document 3), which requires complicated work and labor. In addition, there is an example in which the FcγRI extracellular region is expressed in E. coli which is easy to handle. However, since the FcγRI extracellular region is expressed as an inactive inclusion body, it is not always an efficient and useful method (Patent Literature). 2 and 3). Furthermore, conventionally, when expressing the FcγRI extracellular region, it is expressed with a polypeptide lacking a part of the FcγRI extracellular region, expressed in the form of a fusion protein, glutathione-S-transferase, FLAG-tag, etc. It was added to the N-terminal and expressed.
本発明は、抗体の免疫活性測定用試薬として有用なＦｃγＲＩ細胞外領域を、活性型として発現させるためのポリヌクレオチド、およびそれを用いたＦｃγＲＩを簡便に製造する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a polynucleotide for expressing an FcγRI extracellular region useful as a reagent for measuring an immunological activity of an antibody as an active form, and a method for easily producing FcγRI using the same.
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。 The present invention made in view of the above problems includes the following inventions.
第一の発明は、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加した、ポリヌクレオチドである。 The first invention is a polynucleotide in which a polynucleotide encoding a signal peptide that causes the periplasm to secrete a protein is added to the 5 'end of a polynucleotide encoding a human Fc receptor FcγRI extracellular region.
第二の発明は、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドが配列番号１３から１６に示すいずれかのポリペプチドである、第一の発明に記載のポリヌクレオチドである。 A second invention is the polynucleotide according to the first invention, wherein the signal peptide that causes the periplasm to secrete the protein is any one of the polypeptides shown in SEQ ID NOs: 13 to 16.
第三の発明は、配列番号３から１２に示すいずれかのポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドである。 A third invention is a polynucleotide encoding any of the polypeptides shown in SEQ ID NOs: 3 to 12.
第四の発明は、第一から第三のいずれかの発明に記載のポリヌクレオチドを含む、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミドである。 The fourth invention is a plasmid for expressing the human Fc receptor FcγRI, comprising the polynucleotide according to any one of the first to third inventions.
第五の発明は、第四の発明に記載のプラスミドで宿主を形質転換して得られる、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な形質転換体である。 A fifth invention is a transformant capable of expressing a human Fc receptor FcγRI, obtained by transforming a host with the plasmid described in the fourth invention.
第六の発明は、第五の発明に記載の形質転換体を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法である。 A sixth invention is a method for producing a human type Fc receptor FcγRI using the transformant according to the fifth invention.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明においてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域とは、ヒト型ＦｃγＲＩのうち細胞外領域の全領域または概ね全領域のアミノ酸を含むポリペプチドのことをいう。 In the present invention, the human Fc receptor FcγRI extracellular region refers to a polypeptide comprising all or almost all amino acids in the extracellular region of human FcγRI.
ヒト型ＦｃγＲＩは図１に示すように、Ｎ末端側から１５残基のシグナルペプチド領域（図１のＳＳ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち−１５番目から−１番目までの領域）、２７７残基からなる細胞外領域（図１のＥＣ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７７番目までの領域）、２１残基の細胞膜貫通領域（図１のＴＭ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２７８番目から２９８番目までの領域）、６１残基の細胞内領域（図１のＣ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２９９番目から３５９番目までの領域）からなる。このうちＩｇＧ分子のＦｃ領域と結合親和性を有するのは細胞外領域であり、前記領域でＩｇＧを直接捕捉している。なお、本発明のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（具体的には配列番号２の−１５番目から−１番目までの領域）の一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（具体的には配列番号２の２７８番目から２９８番目までの領域）の一部を含んでもよい。
As shown in FIG. 1, human-type FcγRI has a 15-residue signal peptide region from the N-terminal side (SS in FIG. 1, region from −15 to −1 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2), Extracellular region consisting of 277 residues (EC from FIG. 1,
本発明において、ヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域のアミノ酸とは、具体的には、配列番号２で開示のヒト型ＦｃγＲＩアミノ酸配列のうち１番目から２７７番目までの領域、すなわち２７７残基からなるヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域の全アミノ酸のことをいう。また、ヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全領域のアミノ酸とは、具体的には、配列番号２の１番目から２７７番目までの領域（ヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域）のうち、抗体（ＩｇＧ）結合親和性を失わない範囲で、Ｎ末端側および／またはＣ末端側の１から１５アミノ酸を削除したものをいう。 In the present invention, the amino acids in the entire region of the human FcγRI extracellular region specifically include the first to 277th regions of the human FcγRI amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 2, ie, from 277 residues. All amino acids in the extracellular region of human type FcγRI. In addition, the amino acids in almost the entire region of the human FcγRI extracellular region are specifically the antibodies (of the region from the first to 277th of SEQ ID NO: 2 (the entire region of the human FcγRI extracellular region) ( IgG) An amino acid having 1 to 15 amino acids deleted from the N-terminal side and / or the C-terminal side within a range not losing the binding affinity.
なお、本発明において、ヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域または概ね全領域のアミノ酸配列には、ＩｇＧへの捕捉機能を妨げない範囲でアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入があってもよい。 In the present invention, amino acid substitution and / or deletion and / or insertion in the amino acid sequence of the entire human FcγRI extracellular region or almost the entire region is within the range that does not interfere with the capture function to IgG. Also good.
本発明のポリヌクレオチドは、前述したヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加していることを特徴としている。ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドは、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させる宿主により適宜選択すればよく、宿主が大腸菌の場合は大腸菌発現において汎用されているｐｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域、配列番号１３）、ＤｓｂＡシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＧ４の１から１９番目までの領域、配列番号１４）、ＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までの領域、配列番号１５）、ＴｏｒＴシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ３８６８３の１番目から１８番目の領域、配列番号１６）が例示できる。
The polynucleotide of the present invention is characterized in that a polynucleotide encoding a signal peptide that causes the periplasm to secrete a protein is added to the 5 ′ end side of the polynucleotide encoding the extracellular region of the human Fc receptor FcγRI described above. It is said. The signal peptide that secretes the protein into the periplasm may be appropriately selected depending on the host that expresses human FcγRI. When the host is Escherichia coli, the pelB signal peptide (UniProt No. P0C1C1 from the first to the 22nd) widely used in E. coli expression is used. Region, SEQ ID NO: 13), DsbA signal peptide (UniProt No.
なお、本発明のポリヌクレオチドにおいて、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に直接付加してもよいし、前記二つのポリヌクレオチドの間に、任意のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、発現するヒト型ＦｃγＲＩのＩｇＧへの捕捉機能を妨げない範囲で挿入してもよい。さらに、本発明のポリヌクレオチドには、５’末端側および／または３’末端側に、発現したヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製や定量を可能にするためのポリヒスチジンタグやｃ−ｍｙｃタグといったタグペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに付加してもよい。 In the polynucleotide of the present invention, the polynucleotide encoding the signal peptide that secretes the protein into the periplasm may be added directly to the 5 ′ end side of the polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region. A polynucleotide sequence encoding any linker peptide may be inserted between the two polynucleotides as long as it does not interfere with the capture function of the expressed human FcγRI to IgG. Furthermore, the polynucleotide of the present invention includes tags such as a polyhistidine tag and a c-myc tag on the 5 ′ end side and / or 3 ′ end side to enable easy purification and quantification of the expressed human FcγRI. A polynucleotide encoding a peptide may be further added.
本発明のポリヌクレオチドの一態様として、大腸菌発現において汎用されているｐｅｌＢシグナルペプチド（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号１３）、およびヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７４番目までの領域、または５番目から２７４番目までの領域）を含む、配列番号３から５に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがあげられる。 As one embodiment of the polynucleotide of the present invention, the pelB signal peptide (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA, SEQ ID NO: 13), which is widely used in E. coli expression, and the human Fc receptor FcγRI extracellular region (the first of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2) To the 274th region, or the 5th to 274th region), and a polynucleotide encoding the polypeptide shown in SEQ ID NOs: 3 to 5.
本発明のポリヌクレオチドの別の態様として、ＤｓｂＡ（ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ、配列番号１４）、ＭａｌＥ（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ、配列番号１５）、ＴｏｒＴ（ＭＲＶＬＬＦＬＬＬＳＬＦＭＬＰＡＦＳ、配列番号１６）のいずれかより選択されるシグナルペプチド、およびヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７４番目までの領域）を含む、配列番号６から１２に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをあげることができる。
As another embodiment of the polynucleotide of the present invention, a signal peptide selected from any of DsbA (MKKIWLALAGGLVLAFSASA, SEQ ID NO: 14), MalE (MKIKTGARILALALTALTMMFSASALA, SEQ ID NO: 15), TorT (MRVLLFLLLLSLFMLPFAS, SEQ ID NO: 16), and human type Examples include polynucleotides encoding the polypeptides shown in SEQ ID NOs: 6 to 12, including the Fc receptor FcγRI extracellular region (
なお、本発明におけるヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域、およびペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを含むポリペプチドから、本発明のポリヌクレオチドに変換する際、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮のうえ変換するのが好ましい。一例として宿主が大腸菌の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡ、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡ、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣを例示することができる。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２００９年９月２５日）を利用することによっても可能である。 Use of codons in a host that expresses human FcγRI when converting from a polypeptide containing a human Fc receptor FcγRI extracellular region and a signal peptide that secretes a protein to the periplasm into the polynucleotide of the present invention It is preferable to convert in consideration of the frequency. For example, when the host is E. coli, AGA, AGG, CGG, CGA for arginine (Arg), ATA for isoleucine (Ile), CTA for leucine (Leu), GGA for glycine (Gly), CCC for proline (Pro) It can be illustrated. Codon usage frequency can also be analyzed by using a public database (URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/, access date: September 25, 2009).
本発明のポリヌクレオチドの具体的態様として、配列番号３から１２に示すアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換した配列番号１７から２６に示すポリヌクレオチドがあげられる。 Specific embodiments of the polynucleotide of the present invention include the polynucleotides shown in SEQ ID NOs: 17 to 26 converted from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 12 into nucleotide sequences.
本発明のポリヌクレオチドを用いてヒト型ＦｃγＲＩを製造するには、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させる宿主に適したプラスミドに本発明のポリヌクレオチドを挿入後、宿主を形質転換することで組換え体を作製し、前記組換え体を培養して製造すればよい。以下、製造方法について詳細に説明する。 To produce human FcγRI using the polynucleotide of the present invention, a recombinant is produced by inserting the polynucleotide of the present invention into a plasmid suitable for a host expressing human FcγRI and then transforming the host. Then, the recombinant may be produced by culturing. Hereinafter, the manufacturing method will be described in detail.
本発明のポリヌクレオチドの取得方法としては、
（１）目的とするタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド全体を人工的に合成して取得する方法、
（２）ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドの領域（一例として、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のうち５８番目から８８８番目までの配列を含む領域）を、ヒト型ＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、その増幅産物を利用して目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを人工的に合成して取得する方法、
が例示できる。
As a method for obtaining the polynucleotide of the present invention,
(1) A method for converting an amino acid sequence of a target protein into a nucleotide sequence and artificially synthesizing and obtaining the entire polynucleotide containing the nucleotide sequence,
(2) A region of a polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region (for example, a region comprising the 58th to 888th sequences among the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1) A method of preparing a polynucleotide encoding a target protein by using a DNA amplification method such as a PCR method from cDNA or the like and using the amplified product,
Can be illustrated.
（１）の方法で取得する場合において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、前述したように、組換え対象宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。 In the case of obtaining by the method of (1), when converting from an amino acid sequence to a nucleotide sequence, it is preferable to convert in consideration of the codon usage frequency in the recombination target host as described above.
また、（１）、（２）いずれの方法で本発明のポリヌクレオチドを取得する場合においても、前記ポリヌクレオチドと発現プラスミドとを連結させるための制限酵素認識配列、および／または発現したヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製・定量を可能にするためのタグ配列を付加してもよい。付加する制限酵素認識配列は、前記ポリヌクレオチド配列を考慮のうえ適切な配列を選択すればよい。また付加するタグ配列は、ポリヒスチジンタグやｃ−ｍｙｃタグといった遺伝子工学で多用されるオリゴアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が使用できる。なお前記タグ配列は、前記ポリヌクレオチドの５’末端側に付加してもよいし、３’末端側に付加してもよい。 Moreover, in the case of obtaining the polynucleotide of the present invention by any of the methods (1) and (2), a restriction enzyme recognition sequence for ligating the polynucleotide and the expression plasmid, and / or an expressed human FcγRI A tag sequence may be added to enable simple purification and quantification. As a restriction enzyme recognition sequence to be added, an appropriate sequence may be selected in consideration of the polynucleotide sequence. As the tag sequence to be added, a nucleotide sequence encoding an oligoamino acid frequently used in genetic engineering such as a polyhistidine tag or a c-myc tag can be used. The tag sequence may be added to the 5 'end side of the polynucleotide or may be added to the 3' end side.
本発明のヒト型ＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミドは、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチド、および宿主中で本発明のプラスミドを複製するための複製起点を有し、かつ、対象宿主を形質転換できるものであればよく、適宜選択し使用することができるが、通常は取扱いの容易な発現プラスミドを用いる。大腸菌を宿主として用いる場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドとしては、ｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、Ｔ７プロモータ等が例示でき、中でも、転写活性の強いＴ７プロモータが好ましい。また、本発明のプラスミドにアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのポリヌクレオチド（薬剤耐性遺伝子）をさらに含んでいると、本発明のプラスミドで宿主を形質転換する操作にあたり、本発明のプラスミドが導入された宿主と導入されなかった宿主との選別が容易に行なえるため好ましい。 The plasmid for expressing the human FcγRI of the present invention has a polynucleotide of the present invention, a polynucleotide for expressing the polynucleotide of the present invention, and an origin of replication for replicating the plasmid of the present invention in a host. In addition, any plasmid can be used as long as it can transform the target host, and an expression plasmid that is easy to handle is usually used. When Escherichia coli is used as a host, examples of the polynucleotide for expressing the polynucleotide of the present invention include lac promoter, trc promoter, T7 promoter, etc. Among them, T7 promoter having strong transcription activity is preferable. In addition, when the plasmid of the present invention further contains a polynucleotide (drug resistance gene) for imparting resistance to a drug such as ampicillin to the host, the plasmid of the present invention is used for the operation of transforming the host with the plasmid of the present invention. It is preferable because selection can be easily made between a host into which is introduced and a host into which is not introduced.
ヒト型ＦｃγＲＩを、遺伝子工学的手法を用いて製造するために使用する宿主としては、大腸菌の場合、ＪＭ１０９株等Ｋ１２系の株を用いるのが好ましく、ＢＬ２１（ＤＥ３）株等Ｔ７プロモータが利用できる株がさらに好ましい。なお、前記宿主を変異処理することにより得られる変異株も、本発明の製造方法で用いる宿主として利用することもできる。変異処理は、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチルといった変異処理剤、紫外線、放射線等の当業者にとって周知の方法を用いて行なえばよい。 As a host used for producing human FcγRI using genetic engineering techniques, in the case of E. coli, it is preferable to use a K12 strain such as JM109 strain, and a T7 promoter such as BL21 (DE3) strain can be used. More preferred are strains. In addition, the mutant obtained by carrying out the mutation process of the said host can also be utilized as a host used with the manufacturing method of this invention. Mutation treatment may be performed using methods well known to those skilled in the art, such as mutation treatment agents such as nitrosoguanidine and ethyl methanesulfonate, ultraviolet light, and radiation.
宿主への本発明のプラスミドの導入および発現のための手順または方法は、下記に示す方法以外であってもよく、例えば非特許文献４に記載されている遺伝子工学の分野により慣用されている手法または方法に準じて実施してもよい。具体的にはヒートショック法、エレクトロポレーション法等をあげることができる。 The procedure or method for introducing and expressing the plasmid of the present invention into the host may be other than the method shown below, for example, a method commonly used in the field of genetic engineering described in Non-Patent Document 4. Or you may implement according to a method. Specifically, a heat shock method, an electroporation method, etc. can be mentioned.
本発明のヒト型ＦｃγＲＩの製造方法は、本発明のプラスミドで形質転換した宿主（形質転換体）を培養する工程を含む。上記方法は、具体的には、前記形質転換体を培養し、その培養物から、ヒト型ＦｃγＲＩを回収することを含む。本発明のヒト型ＦｃγＲＩの製造方法で用いる本発明の形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。好ましい実施態様においては、形質転換体の増殖を本発明のプラスミドの導入の有無により選択的に可能にするために、培地に本発明のプラスミドに挿入した薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を含んでいるのが好ましい。例えば、カナマイシン耐性遺伝子を発現可能な本発明のプラスミドが導入された宿主の増殖のために、培地にカナマイシンが添加される。なお、培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。さらに、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。また、培地にはグリシン等の細胞から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を加えてもよい。具体的添加例として、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で加えるのが好ましい。 The method for producing human FcγRI of the present invention includes a step of culturing a host (transformant) transformed with the plasmid of the present invention. Specifically, the method includes culturing the transformant and recovering human FcγRI from the culture. The transformant of the present invention used in the method for producing human FcγRI of the present invention may be cultured in a medium suitable for culturing the target host. When the host is Escherichia coli, LB (Luria supplemented with necessary nutrients) is used. -Bertani) medium is an example of a preferable medium. In a preferred embodiment, the medium contains a drug corresponding to the drug resistance gene inserted into the plasmid of the present invention in order to selectively allow the transformant to grow depending on the presence or absence of introduction of the plasmid of the present invention. Is preferred. For example, kanamycin is added to the medium for growth of a host introduced with the plasmid of the present invention capable of expressing a kanamycin resistance gene. In addition to carbon, nitrogen and inorganic salt sources, an appropriate nutrient source may be added to the medium. Furthermore, if desired, one or more reducing agents selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycolate, and dithiothreitol may be included. Moreover, you may add the reagent which accelerates | stimulates protein secretion from cells, such as glycine, to a culture solution. As a specific addition example, when the host is Escherichia coli, glycine is preferably added to the medium at 2% (w / v) or less.
培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるヒト型ＦｃγＲＩの特性により選択すればよい。培養培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。 When the host is Escherichia coli, the culture temperature is generally 10 ° C. to 40 ° C., preferably 25 ° C. to 35 ° C., more preferably around 30 ° C., but may be selected depending on the characteristics of the human FcγRI to be expressed. When the host is Escherichia coli, the pH of the culture medium is pH 6.8 to pH 7.4, preferably around pH 7.0.
本発明のプラスミドに誘導性のプロモータが含まれる場合は、ヒト型ＦｃγＲＩが良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）が例示できる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ヒト型ＦｃγＲＩの発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭ程度が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。 When the plasmid of the present invention contains an inducible promoter, it may be induced under conditions that allow human FcγRI to be expressed well. Examples of the inducer include IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). When the host is Escherichia coli, the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution is measured, and when it reaches about 0.5 to 1.0, an appropriate amount of IPTG is added, followed by culturing, whereby human-type FcγRI Expression can be induced. The addition concentration of IPTG may be appropriately selected from the range of 0.005 to 1.0 mM, but is preferably about 0.01 to 0.5 mM. Various conditions relating to the IPTG induction may be performed under conditions well known in the art.
本発明の形質転換体培養液からヒト型ＦｃγＲＩを回収するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物のペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、可溶性かつ抗体結合活性を有したヒト型ＦｃγＲＩを高純度に調製することができる。 In order to recover human-type FcγRI from the transformant culture medium of the present invention, an extraction method may be appropriately selected depending on the form of expression. When expressed in the culture supernatant, the cells are separated by centrifugation, and human-type FcγRI may be extracted from the resulting culture supernatant. On the other hand, when expressed in cells (including prokaryotic periplasm), after collecting the cells by centrifugation, the cells are disrupted by adding an enzyme treatment agent or a surfactant, Human type FcγRI may be extracted. In order to separate and purify human FcγRI from the extracted protein, a method known in the art may be used. An example is separation / purification using liquid chromatography. Examples of liquid chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like. By performing a purification operation by combining these chromatographies, a human-type FcγRI having solubility and antibody binding activity can be prepared with high purity.
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加していることを特徴としている。本発明のポリヌクレオチドを対象宿主に適切なプラスミドに挿入し、本発明のポリヌクレオチドを挿入したプラスミドで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、ヒト型ＦｃγＲＩを可溶性かつ抗体結合活性を有した状態で発現させることができる。特に宿主が大腸菌の場合、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号１３から１６に示すいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いると、大腸菌でヒト型ＦｃγＲＩを可溶性かつ抗体結合活性を有した状態で発現させることができるため、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便かつ大量に製造することができる。 The polynucleotide of the present invention is characterized in that a polynucleotide encoding a signal peptide that causes the periplasm to secrete a protein is added to the 5′-terminal side of the polynucleotide encoding the extracellular region of the human Fc receptor FcγRI. . By inserting the polynucleotide of the present invention into a plasmid suitable for the target host and culturing a transformant obtained by transforming the host with the plasmid into which the polynucleotide of the present invention has been inserted, human FcγRI is soluble and antibody It can be expressed in a state having binding activity. In particular, when the host is Escherichia coli, if a polynucleotide encoding any of the polypeptides shown in SEQ ID NOs: 13 to 16 is used as a polynucleotide encoding a signal peptide that causes the periplasm to secrete the protein, human FcγRI is soluble in Escherichia coli. In addition, since it can be expressed in a state having antibody binding activity, human FcγRI can be produced easily and in large quantities.
本発明の製造方法で得られたヒト型ＦｃγＲＩはその細胞外領域を含んでいるため、ヒト型ＦｃγＲＩが有する抗体（ＩｇＧ）との結合活性は保持されている。したがって、本発明の製造方法で得られたヒト型ＦｃγＲＩは、抗体の免疫活性測定用試薬、抗体精製用クロマトグラフィーゲルに用いる捕捉タンパク質、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源等に用いることができる。 Since the human type FcγRI obtained by the production method of the present invention contains the extracellular region, the binding activity with the antibody (IgG) possessed by the human type FcγRI is retained. Therefore, the human type FcγRI obtained by the production method of the present invention can be used as a reagent for measuring antibody immunoactivity, a capture protein used for antibody purification chromatography gel, an immunogen for producing anti-FcγRI antibody, and the like. it can.
以下に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１ 発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲを調製した。
（１）特許文献２に記載の、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチド（コドンはヒト型から大腸菌型に変換している）を含むプラスミドｐＥＣＦｃＲを鋳型として、配列番号２７のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴ［ＧＧＡＴＣＣ］ＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＴ−３’；角かっこ内は制限酵素ＢａｍＨＩサイト）と、配列番号２８のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）をＰＣＲプライマーとして下記のＰＣＲ条件１でＰＣＲを行ない、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。なお、前記ポリヌクレオチドの３’末端には、配列番号２８を用いてポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドを付加した。
Example 1 Preparation of Expression Plasmid ppelBL1FcR A human FcγRI expression plasmid ppelBL1FcR was prepared by the method shown below.
(1) The oligo of SEQ ID NO: 27 using, as a template, the plasmid pECFcR containing a polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region described in Patent Document 2 (codon is converted from human type to E. coli type) Nucleotides (5′-AGT [GGATCC] CACCCAAGGCTGTGATTACGCTGCAACCACCGT-3 ′; restriction enzyme BamHI site in square brackets) and oligonucleotide of SEQ ID NO: 28 (5′-CC [AAGCTT] AATGATGATGATGATGGATGCGCCGGGTTCGGGCGG PCR is performed under the following
ＰＣＲ条件１：
（試薬組成）
鋳型ＤＮＡ
各０．４μＭ ＰＣＲプライマー
０．０２５Ｕ／μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ（タカラバイオ社）
１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー（Ｍｇ２＋Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社）
各２００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社）
（反応条件）
９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分を１サイクルとするＰＣＲ反応を
３０サイクル行なった。
（２）反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動により、増幅産物のバンドが設計通りのサイズの位置にあることを確認後、前記増幅産物を抽出し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
（３）ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ）（タカラバイオ社）を用いてライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で培養した。培養菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ：キアゲン社）することで、発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲを得た。
PCR condition 1:
(Reagent composition)
Template DNA
Each 0.4 μM PCR primer 0.025 U / μL PrimeSTAR HS DNA Polymeras
e (Takara Bio Inc.)
1 x PrimeSTAR buffer (Mg 2+ Plus) (Takara Bio Inc.)
Each 200μM dNTP Mixture (Takara Bio Inc.)
(Reaction conditions)
A PCR reaction was performed 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 1 minute.
(2) After completion of the reaction, the amplified product is extracted by confirming that the amplified product band is in the position of the designed size by 0.9% agarose electrophoresis (QIAquick Gel extraction kit: Qiagen) Then, restriction enzymes were digested with BamHI and HindIII.
(3) Ligation was performed on pET26b (+) plasmid (Novagen) digested with BamHI and HindIII using DNA Ligation Kit (Mighty Mix) (Takara Bio), and E. coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method. .
(4) The obtained transformant was cultured in LB medium (10 g / L tryptone, 5 g / L Yeast extract, 5 g / L NaCl) supplemented with 50 μg / mL kanamycin. By extracting plasmid DNA from the cultured cells (QIAprep Spin Miniprep kit: Qiagen), an expression plasmid ppelBL1FcR was obtained.
実施例２ 発現プラスミドｐｐｅｌＢＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐｐｅｌＢＦｃＲを調製した。
（１）配列番号２９のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、配列番号３０のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＣ−３’）、配列番号３１のオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＡ−３’）、および配列番号３２のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＧＴ−３’）を下記のＰＣＲ条件２でＰＣＲを行ない、各オリゴヌクレオチドを連結した。
Example 2 Preparation of Expression Plasmid ppelBFcR A human FcγRI expression plasmid ppelBFcR was prepared by the method shown below.
(1) Oligonucleotide of SEQ ID NO: 29 (5′-TATA [CATATG] AAATACCTATTGCCCTACGGCAGCCGCT-3 ′; the base in square brackets is the restriction enzyme NdeI site), the oligonucleotide of SEQ ID NO: 30 (5′-ATTGTTTACTCGCTGCCCCAACCAGCGGATGGCCC-3 ′) PCR was performed on the oligonucleotide of SEQ ID NO: 31 (5′-GCAGCGAGTAATACACAATCCAGCGGCTGCCCGTAGGGCA-3 ′) and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 32 (5′-TTTGGTGGTATCACTTGGGCCCATCGCTGGGT-3 ′), and each oligonucleotide was linked.
ＰＣＲ条件２：
（試薬組成）
各２．５μＭのオリゴヌクレオチド、または各等モルのポリヌクレオチド
０．０２５Ｕ／μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ（タカラバイオ社）
１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー（Ｍｇ２＋Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社）
各２００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社）
（反応条件）
９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分を１サイクルとするＰＣＲ反応を
５サイクル行なった。
（２）鋳型として（１）の増幅産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号２９および３２のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ｐｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３）（２）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（４）鋳型として実施例１で調製したｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ、ＰＣＲプライマーとして配列番号３３のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＴ−３’）および配列番号３４のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）を用いた他は、前記ＰＣＲ条件１でＰＣＲを行ない、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（５）（４）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（６）（３）で得られたｐｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（５）で得られたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを用い、前記ＰＣＲ条件２でＰＣＲを行ない、前記二つのポリヌクレオチドを連結した。
（７）鋳型として（６）のＰＣＲ産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号２９および３４のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ｐｅｌＢシグナルペプチドおよびヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（８）（７）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（９）（８）で精製した増幅産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
（１０）ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（１１）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐｐｅｌＢＦｃＲを得た。
PCR condition 2:
(Reagent composition)
2.5 μM each oligonucleotide, or each equimolar polynucleotide 0.025 U / μL PrimeSTAR HS DNA Polymeras
e (Takara Bio Inc.)
1 x PrimeSTAR buffer (Mg 2+ Plus) (Takara Bio Inc.)
Each 200μM dNTP Mixture (Takara Bio Inc.)
(Reaction conditions)
Five cycles of the PCR reaction were performed with 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 1 minute.
(2) PCR was performed under the same conditions as
(3) The amplification product of (2) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(4) The ppelBL1FcR prepared in Example 1 was used as a template, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 33 (5′-CAAGTAGATACCACCCAAAGCTGTGATACCGCTGCACACCACCGT-3 ′) and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 34 (5′-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 ′) were used as PCR primers. Others were subjected to PCR under the
(5) The amplification product of (4) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(6) Using the polynucleotide encoding the pelB signal peptide obtained in (3) and the polynucleotide encoding the human type Fc receptor FcγRI extracellular region obtained in (5), PCR was performed under the
(7) PCR was carried out under the same conditions as
(8) The amplification product of (7) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(9) The amplification product purified in (8) was digested with restriction enzymes with NdeI and HindIII.
(10) Ligation was performed with pET26b (+) plasmid (Novagen) digested with NdeI and HindIII, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(11) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and plasmid DNA was extracted from the cells to obtain an expression plasmid ppelBFcR.
実施例３ 発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲの調製
実施例２の（１）における各オリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号２９のオリゴヌクレオチド、配列番号３０のオリゴヌクレオチド、配列番号３１のオリゴヌクレオチド、および配列番号３５のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＧＣＣＡＣＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＧ−３’）を用いた他は、実施例２と同様な方法で調製することで、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲを得た。
Example 3 Preparation of Expression Plasmid ppelBL2FcR Instead of each oligonucleotide in (2) of Example 2, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 29, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 30, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 31 and an oligo of SEQ ID NO: 35 A human-type FcγRI expression plasmid ppelBL2FcR was obtained by preparing in the same manner as in Example 2 except that the nucleotide (5′-TTGGTGGTATTCTACTTGGCCCACCCGTATTTGCGGCCATCGCTGG-3 ′) was used.
実施例４ 発現プラスミドｐＤｓｂＡ１ＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＤｓｂＡ１ＦｃＲを調製した。
（１）配列番号３６のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＧＣ［ＴＣＴＡＧＡ］ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＸｂａＩサイト）、配列番号３７のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧ−３’）、配列番号３８のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣ−３’）、配列番号３９のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＧＧＴＧ［ＧＧＡＴＣＣ］ＡＣＴＴＧＣＧＣＣＧＡＴ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＢａｍＨＩサイト）、配列番号４０のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＡＡＣＧＣＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡ−３’）、および配列番号４１のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡ−３’）を前記ＰＣＲ条件２でＰＣＲを行ない、各オリゴヌクレオチドを連結した。
（２）鋳型として（１）の増幅産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号３６のオリゴヌクレオチドおよび３９のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＤｓｂＡシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３）（２）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（４）（３）で精製した増幅産物を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで制限酵素消化した。
（５）ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐＤｓｂＡを調製した。
（７）実施例１で作製したヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化後、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現プラスミドｐＤｓｂＡ（（６）で調製）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（８）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐＤｓｂＡ１ＦｃＲを得た。
Example 4 Preparation of Expression Plasmid pDsbA1FcR A human type FcγRI expression plasmid pDsbA1FcR was prepared by the method shown below.
(1) Oligonucleotide of SEQ ID NO: 36 (5′-CGC [TCTAGA] AATAATTTTGTTTACTACTTAAGAGG-3 ′; the base in square brackets is the restriction enzyme XbaI site), oligonucleotide of SEQ ID NO: 37 (5′-TATACCATGAAAAAGTTGCTCGGCGCTGGCTGGG-3) The oligonucleotide of SEQ ID NO: 38 (5′-TAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGGCGCAAGTGGATC-3 ′), the oligonucleotide of SEQ ID NO: 39 (5′-CTTGGTG [GGATCC] ACTTGCGCCGAT-3 ′; the base in brackets is the restriction enzyme BamHI site) Oligonucleotide (5'-CTAAACGCTAAAATACAAACCAGCCAGCGCCAGCCA-3 ') , And the oligonucleotide of SEQ ID NO: 41 (5′-CTTTTCATCATGTATATCTCCTTTTATAAGTTAAAACAA-3 ′) was subjected to PCR under the
(2) PCR is performed under the same conditions as
(3) The amplification product of (2) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(4) The amplification product purified in (3) was digested with restriction enzymes with XbaI and BamHI.
(5) Ligation was performed on pET28a (+) plasmid (Novagen) digested with XbaI and BamHI, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(6) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and plasmid DNA was extracted from the cells to prepare an expression plasmid pDsbA.
(7) Ligation to the expression plasmid pDsbA (prepared with (6)) digested with BamHI and HindIII after digesting the polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region prepared in Example 1 with BamHI and HindIII E. coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(8) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and plasmid DNA was extracted from the cells to obtain an expression plasmid pDsbA1FcR.
実施例５ 発現プラスミドｐＤｓｂＡ２ＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＤｓｂＡ２ＦｃＲを調製した。
（１）鋳型として実施例４で調製したｐＤｓｂＡ１ＦｃＲを、ＰＣＲプライマーとして配列番号３６のオリゴヌクレオチドと配列番号４２のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＣＧＣＴＡＡＡＣＧＣＴＡ−３’）を用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＤｓｂＡシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（２）（１）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（３）（２）で得られたＤｓｂＡシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと、実施例２で作製したヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドとを、前記ＰＣＲ条件２にてＰＣＲを行なうことで連結した。
（４）鋳型として（３）の増幅産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号３６のオリゴヌクレオチドおよび配列番号３４のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＤｓｂＡシグナルペプチドとヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（５）（４）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（６）（５）で精製した増幅産物を、ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
（７）ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（８）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐＤｓｂＡ２ＦｃＲを得た。
Example 5 Preparation of Expression Plasmid pDsbA2FcR A human type FcγRI expression plasmid pDsbA2FcR was prepared by the method shown below.
(1)
(2) The amplification product of (1) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, a band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(3) The polynucleotide encoding the DsbA signal peptide obtained in (2) and the polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region prepared in Example 2 were subjected to PCR under the
(4) PCR was carried out under the same conditions as
(5) The amplification product of (4) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(6) The amplification product purified in (5) was digested with restriction enzymes with XbaI and HindIII.
(7) Ligation was performed on pET28a (+) plasmid (Novagen) digested with XbaI and HindIII, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(8) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and plasmid DNA was extracted from the cells to obtain an expression plasmid pDsbA2FcR.
実施例６ 発現プラスミドｐＤｓｂＡＬＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＤｓｂＡＬＦｃＲを調製した。
（１）鋳型として実施例４で調製したｐＤｓｂＡ１ＦｃＲを、ＰＣＲプライマーとして配列番号３６のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４０のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＤｓｂＡシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（２）（１）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（３）配列番号４３のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡ−３’）と配列番号４４のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＣ−３’）とを、前記ＰＣＲ条件２と同じ条件でＰＣＲを行なうことで連結した。
（４）鋳型として（２）および（３）の増幅産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号３６のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４４のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＤｓｂＡシグナルペプチドおよびリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（５）（４）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（６）（５）の増幅産物および実施例２で作製したヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドから、実施例５の（３）から（８）と同じ方法により、発現プラスミドｐＤｓｂＡＬＦｃＲを得た。
Example 6 Preparation of Expression Plasmid pDsbALFcR A human FcγRI expression plasmid pDsbALFcR was prepared by the method shown below.
(1) PCR was performed under the same conditions as in
(2) The amplification product of (1) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, a band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(3) Perform PCR under the same conditions as in the above PCR under the
(4) PCR was carried out under the same conditions as
(5) The amplification product of (4) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(6) The expression plasmid pDsbALFcR is obtained from the amplification product of (5) and the polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region prepared in Example 2 by the same method as in (3) to (8) of Example 5. Got.
実施例７ 発現プラスミドｐＭａｌＥＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＭａｌＥＦｃＲを調製した。
（１）配列番号４５のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、配列番号４６のオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、配列番号４７のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、および配列番号４８のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡ−３’）を前記ＰＣＲ条件２でＰＣＲを行ない、各オリゴヌクレオチドを連結した。
（２）鋳型として（１）の増幅産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号４５のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４８のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３）（２）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（４）（３）で精製した増幅産物と、実施例２に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドとを、上記ＰＣＲ条件２でＰＣＲを行なうことで連結した。
（５）鋳型として（４）の増幅産物を、ＰＣＲプライマーとして配列番号４５のオリゴヌクレオチドおよび配列番号３４のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ方法でＰＣＲを行ない、ＭａｌＥシグナルペプチドとヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（６）（５）の増幅産物０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（７）（６）で精製した増幅産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
（８）ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（９）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐＭａｌＥＦｃＲを得た。
Example 7 Preparation of Expression Plasmid pMalEFcR A human FcγRI expression plasmid pMalEFcR was prepared by the method shown below.
(1) Oligonucleotide of SEQ ID NO: 45 (5′-TATA [CATATG] AAAATAAAAACAGGTGCACGCATCC-3 ′; the base in square brackets is the restriction enzyme NdeI site), oligonucleotide of SEQ ID NO: 46 (5′-GCATTAACGACGATGAGTTTTCGCCCCTCGGCTCTCCGCC The oligonucleotide of SEQ ID NO: 47 (5′-ATCGTCGTTAATGCGGATATATGCGAGGATGCGGTGCACCTG-3 ′) and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 48 (5′-TTTGGTGGTATCACTACTTGGGCGGAGGCCGAGGCGGAAA-3 ′) were ligated with the
(2) PCR was carried out under the same conditions as
(3) The amplification product of (2) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(4) The amplification product purified in (3) and the polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region described in Example 2 were linked by performing PCR under the
(5) PCR was performed in the same manner as in
(6) The amplified product was purified by subjecting it to 0.9% agarose electrophoresis of the amplified product of (5), cutting out the band corresponding to the target amplified product and then extracting it from the gel.
(7) The amplification product purified in (6) was digested with restriction enzymes with NdeI and HindIII.
(8) Ligation was performed with pET26b (+) plasmid (Novagen) digested with NdeI and HindIII, and E. coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(9) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and plasmid DNA was extracted from the cells to obtain an expression plasmid pMalEFcR.
実施例８ 発現プラスミドｐＭａｌＥＬＦｃＲの作製
実施例７の（１）における各オリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号４５のオリゴヌクレオチド、配列番号４６のオリゴヌクレオチド、配列番号４７のオリゴヌクレオチド、および配列番号４９のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＧ−３’）を用いた他は、実施例７と同様な方法で調製することで、発現プラスミドｐＭａｌＥＬＦｃＲを得た。
Example 8 Construction of Expression Plasmid pMalELFcR Instead of each oligonucleotide in Example 7 (1), an oligonucleotide of SEQ ID NO: 45, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 46, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 47, and an oligonucleotide of SEQ ID NO: 49 An expression plasmid pMalELFcR was obtained by preparing in the same manner as in Example 7 except that the nucleotide (5′-TGGTATCTACTTGACCCTTCTCGATTTTGGCGGAGAGCGAGGCG-3 ′) was used.
実施例９ 発現プラスミドｐＴｏｒＴＦｃＲの調製
以下に示す方法により、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＴｏｒＴＦｃＲを調製した。
（１）配列番号５０のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＣＧＣＧＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、配列番号５１のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’）、配列番号５２のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣＧ−３’）、および配列番号５３のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＣＡＡＣＡ−３’）を前記ＰＣＲ条件２でＰＣＲを行ない、各オリゴヌクレオチドを連結した。
（２）鋳型として（１）の増幅産物、ＰＣＲプライマーとして配列番号５０のオリゴヌクレオチドおよび配列番号５３のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ条件でＰＣＲを行ない、ＴｏｒＴシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３）（２）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（４）（３）で精製した増幅産物と、実施例２に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドとを、上記ＰＣＲ条件２でＰＣＲを行なうことで連結した。
（５）鋳型として（４）の増幅産物を、ＰＣＲプライマーとして配列番号５０のオリゴヌクレオチドおよび配列番号３４のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１と同じ方法でＰＣＲを行ない、ＴｏｒＴシグナルペプチドとヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（６）（５）の増幅産物０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（７）（６）で精製した増幅産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
（８）ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（９）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐＴｏｒＴＦｃＲを得た。
Example 9 Preparation of Expression Plasmid pTorTFcR A human FcγRI expression plasmid pTorTFcR was prepared by the method shown below.
(1) Oligonucleotide of SEQ ID NO: 50 (5′-TATA [CATATG] CGCGTACTGCTATTTTTAC-3 ′; the base in square brackets is the restriction enzyme NdeI site), oligonucleotide of SEQ ID NO: 51 (5′-TTCTTCTCTTTTCATGTTGCCGGCATTTTCG-3 ′) PCR was performed on the oligonucleotide of SEQ ID NO: 52 (5′-TGAAAAGGGAAAGAAGTAAAAAATAGCAGTACG-3 ′) and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 53 (5′-TTTGGGGTATCTACTTGGCGAAAATGCCGGCAACA-3 ′), and each oligonucleotide was ligated.
(2) PCR was performed under the same conditions as the
(3) The amplification product of (2) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, the band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(4) The amplification product purified in (3) and the polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region described in Example 2 were linked by performing PCR under the
(5) PCR was performed in the same manner as in
(6) The amplified product was purified by subjecting it to 0.9% agarose electrophoresis of the amplified product of (5), cutting out the band corresponding to the target amplified product and then extracting it from the gel.
(7) The amplification product purified in (6) was digested with restriction enzymes with NdeI and HindIII.
(8) Ligation was performed with pET26b (+) plasmid (Novagen) digested with NdeI and HindIII, and E. coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(9) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and the plasmid DNA was extracted from the cells to obtain an expression plasmid pTorTFcR.
実施例１０ 発現プラスミドｐＴｏｒＴＬＦｃＲの調製
実施例９（１）における各オリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号５０のオリゴヌクレオチド、配列番号５１のオリゴヌクレオチド、配列番号５２のオリゴヌクレオチド、および配列番号５４のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＣＡ−３’）を用いた他は、実施例９と同様な方法で調製することで、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＴｏｒＴＬＦｃＲを得た。
Example 10 Preparation of Expression Plasmid pToTLLFcR Instead of each oligonucleotide in Example 9 (1), an oligonucleotide of SEQ ID NO: 50, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 51, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 52, and an oligonucleotide of SEQ ID NO: 54 A human-type FcγRI expression plasmid pTorTLFcR was obtained by preparing in the same manner as in Example 9, except that (5′-TGGTGGTATCTCTGTCAACAGGTTATCAGCCCGAAAATGCCGCA-3 ′) was used.
実施例１１ 各発現プラスミドのポリヌクレオチド配列確認
実施例１から１０で調製した発現プラスミドのポリヌクレオチド配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社）にて解析した。なお、配列番号５５（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）と配列番号３４に示すオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。解析の結果、ヌクレオチド配列はそれぞれのプラスミドで設計通りであることが確認された。
Example 11 Confirmation of Polynucleotide Sequence of Each Expression Plasmid Using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit (PE Applied Biosystems) based on the chain terminator method, the polynucleotide sequence of the expression plasmid prepared in Examples 1 to 10 was used. The sample was subjected to a cycle sequence reaction and analyzed with a fully automatic DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer (PE Applied Biosystems). The oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 55 (5′-TAATACGACTCACTATAGG-3 ′) and SEQ ID NO: 34 was used as a sequencing primer. As a result of analysis, it was confirmed that the nucleotide sequence was as designed for each plasmid.
以下にそれぞれの発現プラスミドの概要を記す。 The outline of each expression plasmid is described below.
発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（実施例１）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号３に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号１７に示す。また、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲの構造を図２に示す。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid ppelBL1FcR (Example 1) is shown in SEQ ID NO: 3, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 17. The structure of ppelBL1FcR is shown in FIG.
発現プラスミドｐｐｅｌＢＦｃＲ（実施例２）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号４に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。なお、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＮｄｅＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号１８の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid ppelBFcR (Example 2) is shown in SEQ ID NO: 4, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 18. The structure of ppelBL1FcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 18 is replaced between the restriction enzyme NdeI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ（実施例３）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号５に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号１９に示す。なお、ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＮｄｅＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号１９の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid ppelBL2FcR (Example 3) is shown in SEQ ID NO: 5, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 19. The structure of ppelBL2FcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 19 is replaced between the restriction enzyme NdeI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ（実施例４）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号６に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２０に示す。なお、ｐＤｓｂＡ１ＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＸｂａＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２０の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid pDsbA1FcR (Example 4) is shown in SEQ ID NO: 6, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 20. The structure of pDsbA1FcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 20 is replaced between the restriction enzyme XbaI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＤｓｂＡ２ＦｃＲ（実施例５）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号７に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２１に示す。なお、ｐＤｓｂＡ２ＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＸｂａＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２１の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid pDsbA2FcR (Example 5) is shown in SEQ ID NO: 7, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 21. The structure of pDsbA2FcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 21 is replaced between the restriction enzyme XbaI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＤｓｂＡＬＦｃＲ（実施例６）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号８に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２２に示す。なお、ｐＤｓｂＡＬＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＸｂａＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２２の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid pDsbALFcR (Example 6) is shown in SEQ ID NO: 8, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 22. The structure of pDsbALFcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 22 is replaced between the restriction enzyme XbaI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＭａｌＥＦｃＲ（実施例７）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号９に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２３に示す。なお、ｐＭａｌＥＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＮｄｅＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２３の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human type FcγRI expressed by the expression plasmid pMalEFcR (Example 7) is shown in SEQ ID NO: 9, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 23. The structure of pMalEFcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 23 is replaced between the restriction enzyme NdeI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＭａｌＥＬＦｃＲ（実施例８）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号１０に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２４に示す。なお、ｐＭａｌＥＬＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＮｄｅＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２４の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid pMalELFcR (Example 8) is shown in SEQ ID NO: 10, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 24. The structure of pMalELFcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 24 is replaced between the restriction enzyme NdeI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＴｏｒＴＦｃＲ（実施例９）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号１１に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２５に示す。なお、ｐＴｏｒＴＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＮｄｅＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２５の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human-type FcγRI expressed by the expression plasmid pTorTFcR (Example 9) is shown in SEQ ID NO: 11, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 25. The structure of pTorTFcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 25 is replaced between the restriction enzyme NdeI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
発現プラスミドｐＴｏｒＴＬＦｃＲ（実施例１０）によって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号１２に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２６に示す。なお、ｐＴｏｒＴＬＦｃＲの構造は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ（図２）のうち制限酵素ＮｄｅＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号２６の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid pTorTLFcR (Example 10) is shown in SEQ ID NO: 12, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 26. The structure of pTorTLFcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 26 is replaced between the restriction enzyme NdeI site and the restriction enzyme HindIII site in ppelBL1FcR (FIG. 2).
実施例１から１０で調製した発現プラスミドによって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのうち、Ｎ末端側アミノ酸配列の概要を表１および配列番号５９から６８に示す。なお、表１の「発現されるヒト型ＦｃγＲＩのＮ末端アミノ酸配列」欄にある「−」は各領域の境界を示す。 Among the human-type FcγRI expressed by the expression plasmids prepared in Examples 1 to 10, a summary of the N-terminal amino acid sequence is shown in Table 1 and SEQ ID NOs: 59 to 68. In Table 1, “-” in the column “N-terminal amino acid sequence of human FcγRI to be expressed” indicates the boundary of each region.
（１）ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体、実施例１）、およびｐＤｓｂＡ１ＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体、実施例４）を、それぞれ５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。
（２）それぞれの培養液を、新たに５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加した２×ＹＴ液体培地（１６ｇ／Ｌ Ｔｒｉｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し３７℃で振盪培養した。
（３）培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）の値が約０．５になったところで培養温度を２０℃にして３０分培養後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように培養液に添加し、２０℃で２２時間振盪培養した。培養後の培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）の値は、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体が４．７６、ｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体が６．５４であった。
（４）それぞれの形質転換体からＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。
（５）可溶性タンパク質抽出液中の可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性を下記に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法により評価した。
（５−１）抗体であるガンマグロブリン（化学及血清療法研究所）を、９６穴マイクロプレートのウェルに濃度１μｇ／ｗｅｌｌで固定し（４℃、１８時間）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）によりブロッキングした。
（５−２）調製した可溶性タンパク質抽出液を段階希釈し、ＥＬＩＳＡ反応に供した（３０℃、２時間）。
（５−３）０．２％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社）を添加し、３０℃で２時間反応した。
（５−４）（５−３）の緩衝液で洗浄後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社）を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
(1) Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with ppelBL1FcR (ppelBL1FcR transformant, Example 1), and recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pDsbA1FcR (pDsbA1FcR transformant, implementation) Example 4) was inoculated into LB liquid medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, respectively, and cultured overnight at 37 ° C. with shaking.
(2) Each culture solution was inoculated into 2 × YT liquid medium (16 g / L Triptone, 10 g / L Yeast extract, 5 g / L NaCl) newly added with 50 μg / mL kanamycin, and cultured at 37 ° C. with shaking.
(3) When the value of the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution is about 0.5, after culturing at a culture temperature of 20 ° C. for 30 minutes, IPTG is added to the culture solution to 0.1 mM. The culture was shaken at 20 ° C. for 22 hours. The values of the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution after the culture were 4.76 for the ppelBL1FcR transformant and 6.54 for the pDsbA1FcR transformant.
(4) A soluble protein extract was prepared from each transformant using BugBuster protein extraction Kit (Novagen).
(5) Antibody binding activity of soluble human FcγRI in the soluble protein extract was evaluated by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method shown below.
(5-1) Gamma globulin (Laboratory for Chemotherapy and Serum Therapy) as an antibody was fixed to a well of a 96-well microplate at a concentration of 1 μg / well (4 ° C., 18 hours) and started by Starting Block Blocking Buffers (PIERCE) Blocked.
(5-2) The prepared soluble protein extract was serially diluted and subjected to an ELISA reaction (30 ° C., 2 hours).
(5-3) Washed with Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.2% (w / v)
(5-4) After washing with the buffer solution of (5-3), TMB Peroxidase Substrate (KPL) was added, and the absorbance at 450 nm was measured.
結果を図３に示す。図中、Ｘ軸（横軸）はサンプルの希釈倍率を示し、Ｙ軸（縦軸）は、４５０ｎｍの吸光度（単位は任意）となり抗体結合活性を示す。図３に示す通り、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体およびｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体から得られた可溶性タンパク質抽出液は、その濃度が高くなるほど（希釈倍率が小さいほど）吸光度の値が高くなった。すなわち、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体およびｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体により発現したヒト型ＦｃγＲＩが、可溶性かつ抗体結合活性を有していることがわかる。 The results are shown in FIG. In the figure, the X-axis (horizontal axis) indicates the dilution factor of the sample, and the Y-axis (vertical axis) indicates the absorbance at 450 nm (unit is arbitrary) and indicates antibody binding activity. As shown in FIG. 3, the soluble protein extracts obtained from the ppelBL1FcR transformant and the pDsbA1FcR transformant had higher absorbance values as the concentration increased (lower dilution factor). That is, it can be seen that the human FcγRI expressed by the ppelBL1FcR transformant and the pDsbA1FcR transformant is soluble and has antibody binding activity.
実施例１３ 発現されたヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性確認（その２）
（１）ｐｐｅｌＢＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐｐｅｌＢＦｃＲ形質転換体、実施例２）、ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ形質転換体、実施例３）、ｐＭａｌＥＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＭａｌＥＦｃＲ形質転換体、実施例７）、およびｐＭａｌＥＬＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＭａｌＥＬＦｃＲ形質転換体、実施例８）を、それぞれ５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。
（２）それぞれの培養液を、新たに５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し３７℃で振盪培養した。
（３）培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５になったところで培養温度を２０℃にして３０分培養後、ＩＰＴＧを０．０１ｍＭとなるように培養液に添加し、２０℃で２２時間振盪培養した。培養後の培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）は、ｐｐｅｌＢＦｃＲ形質転換体が５．２１、ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ形質転換体が５．２４、ｐＭａｌＥＦｃＲ形質転換体が４．８２、ｐＭａｌＥＬＦｃＲ形質転換体が５．３６であった。
（４）実施例１２の（４）から（５）と同様な方法で、それぞれの形質転換体から可溶性タンパク質抽出液を調製し、可溶性タンパク質抽出液中の可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性をＥＬＩＳＡ法により評価した。
Example 13 Confirmation of Antibody Binding Activity of Expressed Human FcγRI (Part 2)
(1) Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with ppelBFcR (ppelBFcR transformant, Example 2), recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with ppelBL2FcR (ppelBL2FcR transformant, Example) 3), recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pMalEFcR (pMalEFcR transformant, Example 7), and recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pMalELFcR (pMalELFcR transformant, implementation) Example 8) was inoculated into LB liquid medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, respectively, and cultured overnight at 37 ° C. with shaking.
(2) Each culture solution was inoculated into an LB liquid medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin and cultured at 37 ° C. with shaking.
(3) When the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution is about 0.5, the culture temperature is set to 20 ° C. for 30 minutes, and then IPTG is added to the culture solution to 0.01 mM. Cultured with shaking at 22 ° C. for 22 hours. The turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution after culture was 5.21 for the ppelBFcR transformant, 5.24 for the ppelBL2FcR transformant, 4.82 for the pMalEFcR transformant, and 5.36 for the pMalELFcR transformant. Met.
(4) A soluble protein extract is prepared from each transformant in the same manner as in Example 12 (4) to (5), and the antibody binding activity of soluble human FcγRI in the soluble protein extract is determined by ELISA. It was evaluated by the law.
結果を図４に示す。図中、Ｘ軸（横軸）およびＹ軸（縦軸）は図３と同じである。図４に示した通り、いずれの形質転換体から得られた可溶性タンパク質抽出液であっても、その濃度が高くなるほど（希釈倍率が小さいほど）吸光度の値が高くなった。すなわち、ｐｐｅｌＢＦｃＲ形質転換体、ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ形質転換体、ｐＭａｌＥＦｃＲ形質転換体およびｐＭａｌＥＬＦｃＲ形質転換体でそれぞれ発現したヒト型ＦｃγＲＩが、可溶性かつ抗体結合活性を有していることがわかる。 The results are shown in FIG. In the figure, the X axis (horizontal axis) and the Y axis (vertical axis) are the same as those in FIG. As shown in FIG. 4, in any soluble protein extract obtained from any transformant, the higher the concentration (the smaller the dilution factor), the higher the absorbance value. That is, it can be seen that the human FcγRI expressed in the ppelBFcR transformant, ppelBL2FcR transformant, pMalEFcR transformant and pMalELFcR transformant is soluble and has antibody-binding activity.
実施例１４ 発現されたヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性確認（その３）
（１）ｐＤｓｂＡ２ＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＤｓｂＡ２ＦｃＲ形質転換体、実施例５）、ｐＤｓｂＡＬＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＤｓｂＡＬＦｃＲ形質転換体、実施例６）、ｐＴｏｒＴＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＴｏｒＴＦｃＲ形質転換体、実施例９）、およびｐＴｏｒＴＬＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＴｏｒＴＬＦｃＲ形質転換体、実施例１０）を、実施例１３の（１）から（３）と同様な方法で発現誘導した。培養後の培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）は、ｐＤｓｂＡ２ＦｃＲ形質転換体が２．８１、ｐＤｓｂＡＬＦｃＲ形質転換体が３．２７、ｐＴｏｒＴＦｃＲ形質転換体が３．３５、ｐＴｏｒＴＬＦｃＲ形質転換体が３．５７であった。
（２）実施例１３の（４）から（５）と同様の方法で、それぞれの形質転換体から可溶性タンパク質抽出液を調製し、可溶性タンパク質抽出液中の可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性をＥＬＩＳＡ法により評価した。
Example 14 Confirmation of Antibody Binding Activity of Expressed Human FcγRI (Part 3)
(1) Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pDsbA2FcR (pDsbA2FcR transformant, Example 5), Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pDsbALFcR (pDsbALFcR transformant, Example) 6) Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pTorTFcR (pTorTFcR transformant, Example 9), and recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pTorTLFcR (pTorTLFcR transformant, implementation) Expression of Example 10) was induced in the same manner as in Example 13 (1) to (3). The turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution after culture was 2.81 for the pDsbA2FcR transformant, 3.27 for the pDsbALFcR transformant, 3.35 for the pTorTFcR transformant, and 3.57 for the pTorTLFcR transformant. Met.
(2) A soluble protein extract is prepared from each transformant in the same manner as in (4) to (5) of Example 13, and the antibody binding activity of soluble human FcγRI in the soluble protein extract is determined by ELISA. It was evaluated by the law.
結果を図５に示す。図中、Ｘ軸（横軸）およびＹ軸（縦軸）は図３と同じである。図５に示した通り、いずれの形質転換体から得られた可溶性タンパク質抽出液であっても、その濃度が高くなるほど（希釈倍率が小さいほど）吸光度の値が高くなった。すなわち、ｐＤｓｂＡ２ＦｃＲ形質転換体と、ｐＤｓｂＡＬＦｃＲ形質転換体、ｐＴｏｒＴＦｃＲ形質転換体、ｐＴｏｒＴＬＦｃＲ形質転換体でそれぞれ発現したＦｃγＲＩが、可溶性かつ抗体結合活性を有していることがわかる。 The results are shown in FIG. In the figure, the X axis (horizontal axis) and the Y axis (vertical axis) are the same as those in FIG. As shown in FIG. 5, in any soluble protein extract obtained from any transformant, the higher the concentration (the smaller the dilution factor), the higher the absorbance value. That is, it can be seen that the FDγb expressed by the pDsbA2FcR transformant, the pDsbALFcR transformant, the pTorTFcR transformant, and the pTorTLFcR transformant are soluble and have antibody binding activity.
比較例１ 発現プラスミドｐＦｃＲの調製
比較対象プラスミドとして、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドのみを挿入した、ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドｐＦｃＲを調製した。
（１）鋳型として実施例２に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５６のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）および配列番号３４のオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記ＰＣＲ条件１でＰＣＲを行ない、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチド（５’末端側にＮｃｏＩサイトが存在）を作製した。
（２）（１）の増幅産物を０．９％のアガロース電気泳動にかけ、目的の増幅産物に相当するバンドを切り出し後、ゲルから抽出することで増幅産物を精製した。
（３）（２）で精製した増幅産物を、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化した。
（４）ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、発現プラスミドｐＦｃＲを得た。
（６）（５）で得られたｐＦｃＲを、実施例１１と同様の方法でヌクレオチド配列の確認を行なった。
Comparative Example 1 Preparation of Expression Plasmid pFcR As a comparative plasmid, a human FcγRI expression plasmid pFcR into which only a polynucleotide encoding the extracellular region of the human Fc receptor FcγRI was inserted was prepared.
(1) The polynucleotide encoding the human Fc receptor FcγRI extracellular region described in Example 2 as a template and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 56 as a PCR primer (5′-TCAG [CCATGG] GACAAGTAGATACACCACAAGCTGTGATTA-3 ′; square brackets PCR was carried out under the
(2) The amplification product of (1) was subjected to 0.9% agarose electrophoresis, a band corresponding to the target amplification product was cut out, and then extracted from the gel to purify the amplification product.
(3) The amplification product purified in (2) was digested with restriction enzymes with NcoI and HindIII.
(4) Ligation was performed with pET28a (+) plasmid (Novagen) digested with NcoI and HindIII, and E. coli BL21 (DE3) was transformed by the heat shock method.
(5) The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and plasmid DNA was extracted from the cells to obtain an expression plasmid pFcR.
(6) The nucleotide sequence of pFcR obtained in (5) was confirmed in the same manner as in Example 11.
発現プラスミドｐＦｃＲによって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号５７に、それをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号５８に示す。なお、ｐＦｃＲの構造は、ｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドの制限酵素ＮｃｏＩサイトと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトの間が、配列番号５８の同制限酵素サイト間のポリヌクレオチド配列と置き換わったものである。ｐＦｃＲによって発現されるヒト型ＦｃγＲＩのうち、Ｎ末端側アミノ酸配列の概要を表１および配列番号６９に示す。 The amino acid sequence of human FcγRI expressed by the expression plasmid pFcR is shown in SEQ ID NO: 57, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 58. The structure of pFcR is such that the polynucleotide sequence between the restriction enzyme sites of SEQ ID NO: 58 is replaced between the restriction enzyme NcoI site and the restriction enzyme HindIII site of the pET28a (+) plasmid. Among human FcγRI expressed by pFcR, an outline of the N-terminal amino acid sequence is shown in Table 1 and SEQ ID NO: 69.
比較例２ ｐＦｃＲ形質転換体で発現したヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性確認
（１）ｐＦｃＲで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌（ｐＦｃＲ形質転換体、比較例１）、およびｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ形質転換体（実施例３）を、それぞれ５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。
（２）それぞれの培養液を、新たに５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し３７℃で振盪培養した。
（３）培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５になったところで培養温度を２０℃にして３０分培養後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように培養液に添加し、２０℃で２２時間振盪培養した。培養後の培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）は、ｐＦｃＲ形質転換体が６．９１、ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ形質転換体が２．８７であった。
（４）実施例１２の（４）から（５）と同様の方法で、それぞれの形質転換体から可溶性タンパク質抽出液を調製し、可溶性タンパク質抽出液中の可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性をＥＬＩＳＡ法により評価した。
Comparative Example 2 Confirmation of antibody binding activity of human FcγRI expressed in pFcR transformant (1) Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with pFcR (pFcR transformant, Comparative Example 1), and ppelBL2FcR transformation Each body (Example 3) was inoculated into LB liquid medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and cultured overnight at 37 ° C. with shaking.
(2) Each culture solution was inoculated into an LB liquid medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin and cultured at 37 ° C. with shaking.
(3) When the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution becomes about 0.5, the culture temperature is set at 20 ° C. for 30 minutes, and then IPTG is added to the culture solution so that the concentration becomes 0.1 mM. Cultured with shaking at 22 ° C. for 22 hours. The turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution after the culture was 6.91 for the pFcR transformant and 2.87 for the ppelBL2FcR transformant.
(4) A soluble protein extract is prepared from each transformant in the same manner as in Example 12 (4) to (5), and the antibody binding activity of soluble human FcγRI in the soluble protein extract is determined by ELISA. It was evaluated by the law.
結果を図６に示す。図中、Ｘ軸（横軸）およびＹ軸（縦軸）は図３と同じである。ｐｐｅｌＢＬ２ＦｃＲ形質転換体から得られた可溶性タンパク質抽出液は、図６および図４（実施例１３）に示すように、その濃度が高くなるほど（希釈倍率が小さいほど）吸光度の値が高くなった。一方、ｐＦｃＲ形質転換体から得られた可溶性タンパク質抽出液は、その濃度を高くしても（希釈倍率が小さくしても）吸光度の値は高くならず、抗体結合活性は認められなかった。ｐＦｃＲで発現するＦｃγＲＩの細胞外領域を含むポリペプチド（配列番号５７）のＮ末端側には、従来技術（特許文献２および３）のようにシグナルペプチドが付加されていないため、大腸菌内で発現したヒト型ＦｃγＲＩは不溶性の封入体となり、可溶性タンパク質として発現しなかった。よって、組換え大腸菌を用いて、可溶性かつ抗体結合活性を有するヒト型ＦｃγＲＩを発現させるには、発現させるヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域のＮ末端側に大腸菌ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを付加することが必要であることがわかる。
The results are shown in FIG. In the figure, the X axis (horizontal axis) and the Y axis (vertical axis) are the same as those in FIG. As shown in FIG. 6 and FIG. 4 (Example 13), the soluble protein extract obtained from the ppelBL2FcR transformant had a higher absorbance value as the concentration increased (lower dilution factor). On the other hand, the soluble protein extract obtained from the pFcR transformant did not have a high absorbance value even when its concentration was increased (even if the dilution factor was decreased), and no antibody binding activity was observed. Since the signal peptide is not added to the N-terminal side of the polypeptide containing the extracellular region of FcγRI expressed by pFcR (SEQ ID NO: 57) as in the prior art (
以上より、本発明のヒト型ＦｃγＲＩの製造方法は、従来の大腸菌発現系（特許文献２および３）と比較し、ヒト型ＦｃγＲＩを可溶性かつ抗体結合活性を有した状態で発現可能な方法であり、当該タンパク質の生産に有用な方法といえる。
From the above, the method for producing human FcγRI of the present invention is a method capable of expressing human FcγRI in a state that is soluble and has antibody-binding activity, as compared with conventional E. coli expression systems (
実施例１５ 発現したタンパク質の抗体結合活性の確認（抗体スペクトラム）
ヒト型ＦｃγＲＩでは抗体（ＩｇＧ）のサブクラスＩｇＧ１からＩｇＧ４に対して結合活性が異なることが知られ、ＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順で結合活性を示すことが知られている（非特許文献３）。そこで、ＥＬＩＳＡ法を用いてｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体（実施例１）で発現したヒト型ＦｃγＲＩの抗体サブクラスへの結合活性を評価した。ＥＬＩＳＡ法は、実施例１２の（５−１）において９６穴マイクロプレートのウェルにガンマグロブリンを添加する代わりに濃度０．１μｇ／ｗｅｌｌのＩｇＧ１κ、ＩｇＧ２κ、ＩｇＧ３κまたはＩｇＧ４κを固定化した他は、実施例１２の（５）と同様な方法で行なった。また、ＥＬＩＳＡには調製した可溶性タンパク質抽出液を２０倍希釈したものを供した。
Example 15 Confirmation of antibody binding activity of expressed protein (antibody spectrum)
In human type FcγRI, it is known that the binding activity differs from subclass IgG1 to IgG4 of antibody (IgG), and it is known that the binding activity is shown in the order of IgG1 ≧ IgG3>IgG4> IgG2 (Non-patent Document 3). ). Thus, the binding activity of the human FcγRI expressed in the ppelBL1FcR transformant (Example 1) to the antibody subclass was evaluated using an ELISA method. The ELISA method was performed in the same manner as in Example 12 (5-1) except that IgG1κ, IgG2κ, IgG3κ or IgG4κ was immobilized at a concentration of 0.1 μg / well instead of adding gamma globulin to the wells of a 96-well microplate. In the same manner as in Example 12, (5). Moreover, what diluted the prepared
ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体（実施例１）で発現したヒト型ＦｃγＲＩについて、抗体サブクラスへの結合活性を評価した結果を図７に示した。図７に示すように、抗体サブクラスに対しＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２の順で結合活性を示した。このことから、ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体で発現したヒト型ＦｃγＲＩは、天然のヒト型ＦｃγＲＩとほぼ同等のサブクラス選択性を有していることがわかる。 FIG. 7 shows the results of evaluating the binding activity to the antibody subclass of the human FcγRI expressed in the ppelBL1FcR transformant (Example 1). As shown in FIG. 7, the binding activity was shown in the order of IgG3 ≧ IgG1> IgG4 ≧ IgG2 with respect to the antibody subclass. From this, it can be seen that the human FcγRI expressed in the ppelBL1FcR transformant has almost the same subclass selectivity as the natural human FcγRI.
実施例１６ 発現したヒト型ＦｃγＲＩのウエスタンブロッティング検出
（１）ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体（実施例１）およびｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体（実施例４）を、それぞれ実施例１２と同様な方法で誘導発現培養を行なった。
（２）それぞれの菌体から、実施例１２と同様の方法で可溶性タンパク質抽出液を調製し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いたクロマトグラフィーにより粗精製し、粗精製タンパク質溶液を得た。
（３）それぞれの粗精製タンパク質溶液中のＨｉｓタグが付いたヒト型ＦｃγＲＩを特異的に検出するため下記に示すウエスタンブロッティングを行なった。
（３−１）それぞれの粗精製タンパク質溶液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写・固定化した。
（３−２）ＰＶＤＦ膜を０．２％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）からなる緩衝液で洗浄後、３％スキムミルクを含む同緩衝液でブロッキングを行ない、スキムミルクなしの同緩衝液で再度洗浄した。
（３−３）ＰＶＤＦ膜に対しＨＲＰ抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社）で抗原抗体反応を行ない、これを（３−２）の緩衝液（スキムミルクなし）で洗浄後、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用い化学発光検出した。
Example 16 Western blotting detection of expressed human FcγRI (1) Inducible expression culture of ppelBL1FcR transformant (Example 1) and pDsbA1FcR transformant (Example 4) was performed in the same manner as in Example 12, respectively. It was.
(2) A soluble protein extract was prepared from each cell in the same manner as in Example 12, and was roughly purified by chromatography using His · Bind Resin (Novagen) to obtain a crudely purified protein solution. .
(3) Western blotting shown below was performed in order to specifically detect the human-type FcγRI with a His tag in each crude protein solution.
(3-1) Each crude protein solution was subjected to SDS-PAGE, and transferred and immobilized on a PVDF (Polyvinylidene difluoride) membrane.
(3-2) After washing the PVDF membrane with a buffer solution comprising Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.2% (w / v)
(3-3) An antigen-antibody reaction was performed on the PVDF membrane with an HRP anti-His-Tag antibody reagent (BETHYL), and this was washed with the buffer solution (without skim milk) of (3-2), and then ECL plus (GE Health) Chemiluminescence detection was performed using Care Bioscience.
ｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体とｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体、それぞれで発現するヒト型ＦｃγＲＩは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．０、ゼネティックス社）を使用して計算した結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうと両方とも３０ｋＤａ付近にバンドが位置すると推測されたが、ウエスタンブロティングの結果、図８に示すように３０ｋＤａ付近にｐｐｅｌＢＬ１ＦｃＲ形質転換体とｐＤｓｂＡ１ＦｃＲ形質転換体、それぞれで発現したヒト型ＦｃγＲＩが検出された。このことから、それぞれの形質転換体より得られた粗精製タンパク質溶液中に、ヒト型ＦｃγＲＩが含まれていることが明らかとなった。 The human FcγRI expressed in each of the ppelBL1FcR transformant and the pDsbA1FcR transformant was calculated using GENETYX-WIN (version 3.1.0, Genetics). As a result, when SDS-PAGE was performed, both were 30 kDa. Although it was assumed that a band was located in the vicinity, as a result of Western blotting, human-type FcγRI expressed in the ppelBL1FcR transformant and the pDsbA1FcR transformant was detected in the vicinity of 30 kDa as shown in FIG. From this, it was revealed that the human protein FcγRI was contained in the crude protein solution obtained from each transformant.
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