JP2011063554A - アディポネクチン分泌調節剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アセト酢酸及び/又は3−ヒドロキシ酪酸、又はそれらの塩を有効成分とするアディポネクチン分泌調節剤からなり、該アディポネクチン分泌調節剤により、アディポネクチンの分泌を抑制し、過剰な血中アディポネクチン濃度の減少を図ることができる。本発明のアディポネクチン分泌調節剤は、冠動脈疾患における高アディポネクチン濃度、及び、過剰な血中アディポネクチンの存在による骨形成の抑制、或いは骨密度の低下のようなアディポネクチンに起因する疾患、症状の予防、緩和、又は改善に用いることができる。また、本発明におけるアディポネクチンの分泌調節剤を、体重調節による抗肥満作用のためのアディポネクチンの分泌調節剤として用いることができる。
【選択図】なし
Description
マウス3T3−L1前駆脂肪細胞懸濁液5×104cells/mlを200μlずつ96ウェルプレートの各ウェルに分注し、脂肪細胞に分化させた。アセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸を25mM HEPESを含む無血清DMEMで適宜希釈し、0.1mMから50mMのアセト酢酸或いは3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地とした。0.1mMから50mMのアセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地をそれぞれ200μlずつ脂肪細胞に加えて培養を行い、24時間後に培地を回収した。回収した培地についてSDS−PAGEを行った後、ウェスタンブロッティングを行い、Odyssey Infrared Imaging Systemsを用いてアディポネクチンを検出した。
得られたデジタル画像をImage Jを用いて解析し、総単量体アディポネクチン値を算出した。図1(アセト酢酸投与によるマウス3T3−L1脂肪細胞のアディポネクチン分泌への影響)に示すように、5mM以上のアセト酢酸を含む無血清培地で培養した結果、脂肪細胞のアディポネクチン分泌は有意に抑制された。また、3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地で培養した結果、10mM以上で有意なアディポネクチン分泌抑制が認められた(図2:3−ヒドロキシ酪酸投与によるマウス3T3−L1脂肪細胞のアディポネクチン分泌への影響)。
以上のように、ケトン体であるアセト酢酸あるいは3−ヒドロキシ酪酸が有意にアディポネクチン分泌の抑制効果が認められた。
マウス3T3−L1前駆脂肪細胞(IFO50416,HSRRB)を購入し、24ウェルプレートを用いて、10%FBS(SIGMA)を含むタルベッコ変法イーグル増殖培地(DMEM)(日水製薬)で培養した。48hごとに培地を交換して細胞を増殖させ、25cm2フラスコ、75cm2フラスコへと細胞を継代した。細胞を回収してBICELL(日本冷凍)にて1分約1℃で−85℃まで冷却し、以下の検討に用いるまで−85℃で保存した。
マウス3T3−L1前駆脂肪細胞を75cm2フラスコからトリプシン−EDTA(免疫生物研究所)を用いて50mlプラスチックチューブに回収した。450×g、5分間遠心し、上清を除いた後、新らたな培地を加えて細胞を懸濁させた。細胞懸濁液を6ウェルプレートへ分注し、コンフルエントに達するまで培養した。細胞がコンフルエントに達した後、10μg/mlインスリン(Wako)、0.5mM/l 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)(SIGMA)及び1M/lデキサメタゾン(Wako)を加えた分化誘導培地に交換した。48時間ごとに新しい分化誘導培地に交換し、7日間培養した。その後、増殖培地に交換し、更に2日間培養した。
Oil red O染色によって分化させた脂肪細胞の脂肪滴を確認した。分化させた脂肪細胞のプレートから培地を除き、PBSで洗浄した後、10%ホルマリン(SIGMA)を加え、1時間静置して細胞を化学固定した。10%ホルマリンを除き、蒸留水で洗浄した後、0.2% Oil red O(SIGMA)染色液(イソプロパノール:蒸留水=6:4)を加え、1時間静置して脂肪滴を染色した(Trouba et al,2000)。染色液を除き、蒸留水で洗浄し、顕微鏡(Olympus IX-70,オリンパス)で確認し、デジタルカメラにて撮像した。
Lithium acetoacetate(SIGMA)或いは(R)−(−)−3−hydroxybutyric acid,sodium saltを微量のフェノールレッドを含むミリQ水に溶解した。HClを用いて中性付近にpHを調整し、1Mの3−ヒドロキシ酪酸及びアセト酢酸溶液を調製した。孔径0.2μmのマイクロフィルターでろ過して下記の実験に使用した。
マウス3T3−L1前駆脂肪細胞懸濁液5×104cells/mlを200μlずつ96ウェルプレートの各ウェルに分注し、脂肪細胞に分化させた。1Mのアセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸溶液を適宜希釈し、それらの溶液を無血清培地で20倍希釈した。これを適宜無血清培地で希釈し、1mMから50mMのアセト酢酸或いは3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地とした。1mMから50mMのアセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地をそれぞれ200μlずつ脂肪細胞に加えて培養を行い、48時間後に培地を回収した。ネガティブコントロールとしてミリQ水を用いた。
結果を図3に示す。
アディポネクチンは単量体、3分子の単量体からなる3量体(Low molecular weight:LMW)、6量体(Middle molecular weight:MMW)及びそれらの複合体である多量体(High molecular weight:HMW)として血中に存在しており、その中でも特に多量体(HMW)がインスリン耐性の改善などに活性を持つと考えられている(J. Biol. Chem. 278, 40352-40363, 2003)。そこで,更に、アセト酢酸のアディポネクチン分泌抑制作用を検討するために,多量体アディポネクチンの分泌を測定した。
マウス3T3−L1前駆脂肪細胞懸濁液5×104cells/mlを200μlずつ96ウェルプレートの各ウェルに分注し、脂肪細胞に分化させた。1mMから50mMのアセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地を調製した。培地を除去後、1mMから50mMのアセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸を含む無血清培地をそれぞれ200μlずつ加えた。ネガティブコントロールとしてミリQ水を用いた。培地を加えて48時間後、各ウェルの培地を回収した。得られた培地を、2−メルカプトエタノールを除いた5×SDS−PAGEsample buffer(0.3125M Tris−HCl (pH6.5)、50%グリセロール、10%SDS、0.004%ブロモフェノールブルー、2−メルカプトエタノール不含)と混合し、1時間室温に静置した。2−15%のグラジェントゲル(マルチゲル(R)IIミニ2/15,コスモ・バイオ株式会社)を用いてSDS−PAGEを行った後、セミドライブロッティング装置を用いてゲル一枚当たり100mAで90分間通電し、PVDF膜にタンパク質を転写した。
結果を図4に示す。得られたデジタル画像をImage Jを用いて解析し、多量体アディポネクチン値を評価した。
図5に示されるように、アセト酢酸を投与した場合、高分子量アディポネクチン多量体の減少に比べて、中分子量および低分子量アディポネクチン多量体の減少が著しかった。このことから、アセト酢酸はインスリン感受性向上など生理活性の高い高分子量アディポネクチン多量体の生成に強い影響を及ぼさずに、中分子量及び低分子量アディポネクチン多量体の生成を抑制することが明らかとなった。
Claims (8)
- アセト酢酸及び/又は3−ヒドロキシ酪酸、又はそれらの塩を有効成分とするアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンの分泌調節が、アディポネクチンの分泌抑制であることを特徴とする請求項1記載のアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンの分泌抑制が、アディポネクチン多量体の分泌抑制であることを特徴とする請求項2記載のアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンの分泌調節が、アディポネクチンの分泌抑制による過剰な血中アディポネクチン濃度の減少であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンの分泌調節が、アディポネクチンに起因する疾患、症状の予防、緩和、又は改善のためのものであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンに起因する疾患、症状の予防、緩和、又は改善が、冠動脈疾患における高アディポネクチン濃度の予防、緩和、又は改善のためのものであることを特徴とする請求項5記載のアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンに起因する疾患、症状の予防、緩和、又は改善が、過剰な血中アディポネクチンの存在による骨形成の抑制、或いは骨密度の低下の予防、緩和、又は改善のためのものであることを特徴とする請求項5記載のアディポネクチン分泌調節剤。
- アディポネクチンの分泌調節が、体重調節による抗肥満作用のためのものであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のアディポネクチン分泌調節剤。
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