JP2011057610A - Method for producing glycosidated polyhydric alcohol - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はα−アミラーゼを活性化し、メイラード反応性が低く、非う蝕性を有するグリコシド化多価アルコールの新規な製造方法に関する。 The present invention relates to a novel method for producing glycosidated polyhydric alcohols that activate α-amylase, have low Maillard reactivity, and have non-cariogenic properties.
本明細書中のグリコシド化多価アルコールとは還元糖と多価アルコールがグリコシド結合した化合物のことを言う。
また、本明細書中で使用するう蝕性とは口腔内の細菌によって糖から酸が産生され、産生された酸が歯質を脱灰することをいう。
The glycosylated polyhydric alcohol in the present specification refers to a compound in which a reducing sugar and a polyhydric alcohol are glycoside-bonded.
Moreover, the caries used in this specification means that an acid is produced from sugar by bacteria in the oral cavity, and the produced acid decalcifies the tooth.
多価アルコールであるグリセロールに還元糖のガラクトースのアノマー炭素がα結合したグリセロールガラクトシドはフロリドシドと呼ばれ、ノリ、ツノマタ、ダルス等の紅藻類に広く分布している。また、本願発明者らはテングサからも抽出されることを見出している。
フロリドシドはα−アミラーゼを活性化するという特徴を有し、消化酵素によって消化されず、腸管からも吸収されないため、腸内細菌の増殖促進能を有し、プレバイオテクスとしての利用が期待されている。また、フロリドシドはメイラード反応性が低いため食品に混合しても食品のアミノ酸と反応し難く、着色し難いという特性も有する。更に、非う蝕性を有するため、歯を溶解する酸を作りにくく、虫歯にもなりにくい。従って食品の甘味料としても期待されている。
加えて、フロリドシドはウイルス感染症や腫瘍性疾患や免疫疾患にも有用であることが報告されている。
Glycerol galactoside, in which the anomeric carbon of galactose, a reducing sugar, is α-bonded to glycerol, which is a polyhydric alcohol, is called fluroidoside, and is widely distributed in red algae such as Nori, Tsunomata, and Darus. In addition, the inventors of the present application have found that it is also extracted from the common plover.
Fluorideside has the feature of activating α-amylase, is not digested by digestive enzymes, and is not absorbed from the intestinal tract, so it has the ability to promote the growth of enteric bacteria and is expected to be used as a prebiotic. Yes. In addition, since fluorideside has low Maillard reactivity, it has a characteristic that even when mixed with food, it hardly reacts with amino acids in food and is difficult to color. Furthermore, since it has non-cariogenic properties, it is difficult to make an acid that dissolves teeth, and it is difficult to become caries. Therefore, it is also expected as a sweetener for foods.
In addition, it has been reported that floridoside is also useful for viral infections, neoplastic diseases and immune diseases.
また、グリセロールにグルコースのアノマー炭素がα結合したα―グルコシルグリセロールは清酒、味噌、味醂といった日本の伝統的な発酵食品に含まれる成分で、フロリシドと同じく小腸で消化されず、プレバイオテクスとしての利用が期待されている。また、保湿性も高いため、化粧品原料としても期待されている。 In addition, α-glucosylglycerol, which is an α-bond of anomeric carbon of glucose to glycerol, is a component contained in traditional Japanese fermented foods such as sake, miso, and miso. Like floriside, it is not digested in the small intestine and is used as a prebiotic. Use is expected. Moreover, since it has high moisture retention, it is also expected as a cosmetic raw material.
これらの多価アルコールに還元糖がグリコシド結合したグリコシド化多価アルコールの有用な特徴を食品、化粧品、医薬品に利用するために、簡便で大量に生産することが求められている。しかしながら、グリコシド化多価アルコールの一種であるフロリドシドは紅藻類に属する海藻類から抽出、生成する方法が報告されており（特許文献１）、α―グルコシルグリセロールはマルトオリゴ糖とグリセリンから酵素合成反応により合成する方法は提案されている（特許文献２）ものの、その量は少なく、簡便で大量に製造できる方法の確立が望まれている。
また、ガラクトースやグルコース以外の還元糖とグリセロール以外の多価アルコールがグリコシド結合したグリコシド化多価アルコールで、メイラード反応性が低く、非う蝕性を示すものの甘味料としての利用も期待されているためその合成方法の確立も望まれている。
In order to utilize the useful characteristics of glycosidated polyhydric alcohols in which reducing sugars are glycoside-bonded to these polyhydric alcohols in foods, cosmetics and pharmaceuticals, it is required to produce them easily and in large quantities. However, a method of extracting and producing fluroside, which is a kind of glycosidated polyhydric alcohol, from seaweeds belonging to red algae has been reported (Patent Document 1), and α-glucosylglycerol is obtained by enzymatic synthesis reaction from maltooligosaccharide and glycerin. Although a synthesis method has been proposed (Patent Document 2), the amount is small, and it is desired to establish a method that can be easily produced in large quantities.
A glycosidated polyhydric alcohol in which a reducing sugar other than galactose or glucose and a polyhydric alcohol other than glycerol is glycoside-bonded, has low Maillard reactivity and is non-cariogenic, but is also expected to be used as a sweetener. Therefore, establishment of the synthesis method is also desired.
本発明は上記問題を解決するためになされたもので、α―アミラーゼを活性化し、メイラード反応性が低く、非う蝕性を有するグリコシド化多価アルコールの新規な製造方法を提供することを課題とする。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a novel method for producing glycosidated polyhydric alcohols that activate α-amylase, have low Maillard reactivity, and have non-cariogenic properties. And
請求項１に係る発明は、還元糖と多価アルコールを触媒下で反応させて製造するグリコシド化多価アルコールの製造方法に関する。
請求項２に係る発明は、前記還元糖がガラクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、キシロースのいずれか一つである請求項１に記載のグリコシド化多価アルコールの製造方法に関する。
請求項３に係る発明は、前記多価アルコールがグリセロールまたはエチレングリコールであることを特徴とする請求項１又は２に記載のグリコシド化多価アルコールの製造方法に関する。
請求項４に係る発明は、前記触媒がリン酸である請求項１乃至３いずれかに記載のグリコシド化多価アルコールの製造方法に関する。
請求項５に係る発明は、ガラクトースとグリセロールをリン酸存在下で反応させて製造するフロリドシドの製造方法に関する。
請求項６に係る発明は、グルコースとグリセロールをリン酸存在下で反応させて製造するグルコシルグリセロールの製造方法に関する。
The invention according to
The invention according to
The invention according to
The invention according to
The invention according to
The invention according to
請求項１に係る発明によれば、還元糖と多価アルコールを触媒下で反応させて製造するため、グリコシド化多価アルコールを簡便にかつ大量に製造することができる。
請求項２に係る発明によれば、前記還元糖がガラクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、キシロースであることにより、これらの糖が多価アルコールに容易に溶けるため、反応性が高く、より収率を上げることができる。
請求項３に係る発明によれば、多価アルコールがグリセロールまたはエチレングリコールであることにより、生体に安全なグリコシド化多価アルコールを製造することができる。
請求項４に係る発明によれば、触媒がリン酸であることにより、高温で反応させたとしても反応液が着色しないようにすることができる。
請求項５係る発明によれば、α―アミラーゼを活性化し、メイラード反応性が低く、う蝕性が低い天然フロリドシドと同じ性質を有する合成フロリドシドを簡便に大量に製造することができる。
請求項６に係る発明によれば、α―アミラーゼを活性化し、う蝕性が低い天然のグルコシルグリセロールと同じ性質を有する合成グルコシルグリセロールを簡便に大量に製造することができる。
According to the first aspect of the present invention, since the reducing sugar and the polyhydric alcohol are reacted in the catalyst, the glycosided polyhydric alcohol can be produced easily and in large quantities.
According to the invention according to
According to the invention of
According to the invention which concerns on
According to the fifth aspect of the present invention, it is possible to easily produce a large amount of synthetic fluroside, which activates α-amylase and has the same properties as natural fluroside, which has low Maillard reactivity and low caries.
According to the sixth aspect of the present invention, synthetic glucosylglycerol having the same properties as natural glucosylglycerol, which activates α-amylase and has low caries, can be easily produced in large quantities.
本発明の方法によれば、α―アミラーゼを活性化し、メイラード反応性が低く、非う蝕性を有するグリコシド化多価アルコールを簡便で大量に製造することができる。
以下本発明の一例を詳述する。
According to the method of the present invention, α-amylase is activated, glycosided polyhydric alcohol having low Maillard reactivity and non-cariogenicity can be produced simply and in large quantities.
Hereinafter, an example of the present invention will be described in detail.
本発明のグリコシド化多価アルコールは、加温した多価アルコールに還元糖を溶解し、触媒を加え、撹拌することによって多価アルコールをグリコシド化することで製造される。 The glycosidated polyhydric alcohol of the present invention is produced by dissolving a reducing sugar in a heated polyhydric alcohol, adding a catalyst and stirring to glycosidate the polyhydric alcohol.
本発明において原料として用いられる糖類は、還元糖であれば特に限定されないが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、キシロースが挙げられ、特にガラクトースはフロリドシドを合成する際に使用し、及びグルコースはグルコシルグリセロールを合成する際に使用するため好適に用いられる。 The saccharide used as a raw material in the present invention is not particularly limited as long as it is a reducing sugar, and examples thereof include galactose, glucose, mannose, rhamnose, and xylose. In particular, galactose is used when synthesizing fluroside, and glucose is glucosylglycerol. Is preferably used because it is used in the synthesis of.
また、グリコシド化するアルコールとしては多価アルコールであれば限定されないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールなどの水酸基を２個有する多価アルコール、グリセリン、トリメチロールプロパン、トリエタノールアミンなどの水酸基を３個有する多価アルコールなどが挙げられ、特にグリセロール、エチレングリコールが好適に用いられる。
尚、高温でも溶けない場合には少量のＤＭＳＯに溶かして用いても良い。
The alcohol to be glycosidated is not limited as long as it is a polyhydric alcohol. However, polyhydric alcohol having two hydroxyl groups such as ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, glycerin, trimethylolpropane, Examples thereof include polyhydric alcohols having three hydroxyl groups such as ethanolamine, and glycerol and ethylene glycol are particularly preferably used.
If it does not melt even at high temperatures, it may be dissolved in a small amount of DMSO.
本発明において還元糖と多価アルコールのモル比は１〜１００倍の範囲であり、好ましくは２５〜５０倍である。多価アルコールの量がモル比で２５倍より少量であると十分にグリコシド化が行えず、５０倍より多く入れた場合生成されるグリコシド化多価アルコールに未反応原料が付加された付加物が生成されるためいずれの場合も好ましくないからである。 In the present invention, the molar ratio of reducing sugar to polyhydric alcohol is in the range of 1 to 100 times, preferably 25 to 50 times. If the amount of the polyhydric alcohol is less than 25 times in terms of molar ratio, the glycosidation cannot be carried out sufficiently, and if it is added more than 50 times, an adduct obtained by adding unreacted raw materials to the glycosidated polyhydric alcohol is produced. This is because it is not preferable in any case.
グリコシド化工程において使用される触媒としては、脱水反応に用いられるものであれば特に限定されず公知のものが用いられる。例えば、リン酸、硫酸、塩酸、硝酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。その中でも、特にリン酸が好ましい。高温の反応溶液中に添加しても反応液が着色しないためである。
使用される触媒の量は、多価アルコール１００mＬ（または100ｇ）に対して１０〜１００μＬ、さらに好ましくは５０〜１００μＬである。１０μＬより少なければ、長時間の反応時間を必要とし、また１００μＬより多くてもそれ以上の反応時間の短縮が望めず、いずれの場合も好ましくないからである。
The catalyst used in the glycosidation step is not particularly limited as long as it is used in a dehydration reaction, and a known catalyst is used. For example, at least one selected from phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, paratoluenesulfonic acid, methanesulfonic acid and the like can be mentioned. Among these, phosphoric acid is particularly preferable. This is because the reaction solution is not colored even if it is added to the high temperature reaction solution.
The amount of the catalyst used is 10 to 100 μL, more preferably 50 to 100 μL with respect to 100 mL (or 100 g) of polyhydric alcohol. If it is less than 10 μL, a long reaction time is required, and if it is more than 100 μL, no further reduction in reaction time can be expected, which is not preferable in any case.
本発明において反応温度は触媒の添加量により調節が可能であるが８０℃〜１６０℃さらに好ましくは１００℃〜１４０℃である。８０℃未満では原料の還元糖が溶解し難く、１６０℃を超えると還元糖が褐変する虞があるため、いずれの場合も好ましくないからである。 In the present invention, the reaction temperature can be adjusted by the amount of the catalyst added, but is 80 ° C to 160 ° C, more preferably 100 ° C to 140 ° C. If the temperature is less than 80 ° C., the reducing sugar of the raw material is difficult to dissolve, and if the temperature exceeds 160 ° C., the reducing sugar may be browned.
反応途中に副生する水は、シリカゲルで取り除くことが好ましい。製造されるグリコシド化多価アルコールの純度を上げるためである。また、シリカゲルで取り除く以外にも窒素等を吹き込んで乾燥させることもできる。 Water produced as a by-product during the reaction is preferably removed with silica gel. This is to increase the purity of the glycosidated polyhydric alcohol produced. In addition to removing with silica gel, nitrogen or the like can be blown and dried.
本発明においては、グリコシド化多価アルコールの原料となる多価アルコールを反応溶媒として用いることができるが、反応系の濃度を調整するために補助溶媒を用いることもできる。但し、補助溶媒はグリコシド化多価アルコールの反応条件下であっても沸騰しない程度の高い沸点を持っており、かつ反応に全く影響を与えないものであることが好ましい。 In the present invention, a polyhydric alcohol that is a raw material for glycosidated polyhydric alcohol can be used as a reaction solvent, but an auxiliary solvent can also be used to adjust the concentration of the reaction system. However, it is preferable that the auxiliary solvent has a boiling point that does not boil even under the reaction conditions of the glycosidated polyhydric alcohol and does not affect the reaction at all.
反応時間は反応温度及び触媒の量によって左右されるため、一概には決定できないが、１０分〜２４０分、さらに好ましくは３０分〜１８０分である。１０分未満であると反応が十分ではなく、未反応の原料が残り、２４０分より長ければ、生成したグリコシド化多価アルコールに未反応物が付着する虞があり、いずれの場合も好ましくないからである。 Since the reaction time depends on the reaction temperature and the amount of the catalyst, it cannot be generally determined, but it is 10 minutes to 240 minutes, more preferably 30 minutes to 180 minutes. If the reaction time is less than 10 minutes, the reaction is not sufficient, and unreacted raw materials remain. If the reaction time is longer than 240 minutes, unreacted substances may adhere to the generated glycosidated polyhydric alcohol, which is not preferable in any case. It is.
反応は、原料や生成物の生成量を追跡し反応終了時を測定して、反応が終了した時点で止めることが好ましい。未反応の還元糖が生成したグリコシド化多価アルコールに付加することを抑制するためである。
反応は、反応溶液に水を大量に入れることによって終了させる。
尚、塩基性物質を添加して触媒を中和することもできる。中和に用いられる塩基性物質としては特に制限はないが、NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3、NH3等を挙げることができる。これらの中では、溶解性、取り扱いの観点からNaOH、KOHが好ましい。
The reaction is preferably stopped at the time when the reaction is completed by measuring the amount of raw materials and products produced and measuring the time when the reaction is completed. This is to suppress the addition of unreacted reducing sugar to the generated glycosidated polyhydric alcohol.
The reaction is terminated by adding a large amount of water to the reaction solution.
A basic substance can be added to neutralize the catalyst. The basic substance used for neutralization is not particularly limited, and examples thereof include NaOH, KOH, Na 2 CO 3 , NaHCO 3 , and NH 3 . Among these, NaOH and KOH are preferable from the viewpoints of solubility and handling.
反応終了後水を添加し、反応生成物を活性炭に吸着させることによって未反応の還元糖や多価アルコール等の不純物を除くことができる。これにより、合成されたグリコシド化多価アルコールのみを分離、精製することができる。 After the reaction is completed, impurities such as unreacted reducing sugar and polyhydric alcohol can be removed by adding water and adsorbing the reaction product on activated carbon. Thereby, only the synthesized glycosidated polyhydric alcohol can be separated and purified.
精製した合成グリコシド化多価アルコールは高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと表記する）分析によって、純度を測定することができる。 The purity of the purified synthetic glycosylated polyhydric alcohol can be measured by high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) analysis.
純度が確認されたグリコシド化多価アルコールを質量分析（以下LC-MSと称する）や、１ＨＮＭＲで分析して分子構造を推定することができる。 The glycosylated polyhydric alcohol whose purity has been confirmed can be analyzed by mass spectrometry (hereinafter referred to as LC-MS) or 1 HNMR to estimate the molecular structure.
以下実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（フロリドシド（ガラクトシルグリセロール）の合成方法）
ホットプレートスターラー上で、グリセロール１００ｍＬを１１６℃に加温し、これにガラクトース５ｇを溶解した。これは、ガラクトース１モルに対して５０倍モルのグリセロールの量に相当する。
ガラクトースがすべて溶解したことを確認した後、触媒としてリン酸１０μＬを添加して、１１６℃で３時間撹拌しながら開放で反応を行った。
(Synthesis method of fluorideside (galactosylglycerol))
On a hot plate stirrer, 100 mL of glycerol was heated to 116 ° C., and 5 g of galactose was dissolved therein. This corresponds to 50 times the amount of glycerol per mole of galactose.
After confirming that all the galactose was dissolved, 10 μL of phosphoric acid was added as a catalyst, and the reaction was carried out with stirring at 116 ° C. for 3 hours.
反応溶液に水を添加した後、活性炭のカラムに１回〜数回かけることによって未反応原料等の不純物を取り除き、反応生成物の分離、精製を行った。 After adding water to the reaction solution, impurities such as unreacted raw materials were removed by applying the activated carbon column once to several times to separate and purify the reaction product.
（反応温度について）
グリセロールとガラクトースの反応温度と反応時間との関係を図１に示した。横軸は時間（ｍｉｎ）、縦軸は反応生成物をＨＰＬＣで測定した際の面積を表わしている。ＨＰＬＣの面積は５０００００で約５ｇ/Ｌであり、グリセロール１００ｍＬ水を加えて１Ｌにした後に、ガラクトースを５ｇ溶解した場合には５０００００の時に略１００％合成されたことを表わしている。これより反応温度は１００℃〜１４０℃のときに反応性が良いことが分かる。
(Reaction temperature)
The relationship between the reaction temperature of glycerol and galactose and the reaction time is shown in FIG. The horizontal axis represents time (min), and the vertical axis represents the area when the reaction product was measured by HPLC. The area of HPLC is about 5 g / L at 500,000, and when 100 g of glycerol is added to make 1 L and then 5 g of galactose is dissolved, it indicates that about 100% was synthesized at 500,000. This shows that the reactivity is good when the reaction temperature is 100 ° C to 140 ° C.
（触媒量について）
グリセロールとガラクトースの反応を触媒するリン酸の量と反応時間との関係を図２に表わした。図１と同じく、横軸は時間（ｍｉｎ）、縦軸は反応生成物をＨＰＬＣで測定した際の面積を表わしており、面積が５０００００の時に略１００％合成されたことが分かる。これによると触媒が１０〜１００μＬ特に５０〜１００μＬの時に反応性が良いことが分かる。
(About catalyst amount)
The relationship between the amount of phosphoric acid catalyzing the reaction between glycerol and galactose and the reaction time is shown in FIG. As in FIG. 1, the horizontal axis represents time (min), and the vertical axis represents the area when the reaction product was measured by HPLC. It can be seen that approximately 100% was synthesized when the area was 500,000. This shows that the reactivity is good when the catalyst is 10 to 100 μL, especially 50 to 100 μL.
（純度の評価）
純度の評価はＨＰＬＣを用いて行った。
ＨＰＬＣの装置はＤ−７０００，Ｈｉｔａｃｈｉを用い、検出にはＬ−７４９０，Ｈｉｔａｃｈｉ（ＲＩ検出器）を用いた。カラムはＳｈｏｄｅｘ社製のカラムＳｕｇａｒ ＫＳ−８０２（ＧＰＣカラム）を用い、カラム温度５０℃、移動相として水を使用し、流速は０．８ｍL/分、注入量５μＬにて分析を行った。 ＨＰＬＣのクロマトグラムを図３に示す。
図３は反応前、反応後３０分、反応後１２０分のそれぞれのＨＰＬＣのクロマトグラムを示したものである。
それぞれ保持時間１２．６分、１３．６分において、ガラクトースおよびグリセロールが検出される。図３より、原料であるガラクトースのピークがなくなり、代わりに新たなピークが１１．５分の位置に表れているため、ガラクトースとグリセロールが反応した反応生成物が合成されていることを示している。
また、精製後、合成された反応生成物の純度は９０％以上であった。
(Evaluation of purity)
The purity was evaluated using HPLC.
The HPLC apparatus used was D-7000, Hitachi, and L-7490, Hitachi (RI detector) was used for detection. The column was a Shodex column KS-802 (GPC column), the column temperature was 50 ° C., water was used as the mobile phase, the flow rate was 0.8 mL / min, and the injection volume was 5 μL. The chromatogram of HPLC is shown in FIG.
FIG. 3 shows HPLC chromatograms before the reaction, 30 minutes after the reaction, and 120 minutes after the reaction.
Galactose and glycerol are detected at retention times of 12.6 minutes and 13.6 minutes, respectively. From FIG. 3, the peak of the galactose as a raw material disappears, and a new peak appears instead at the position of 11.5 minutes, which indicates that a reaction product obtained by reacting galactose and glycerol is synthesized. .
Further, after purification, the purity of the synthesized reaction product was 90% or more.
（分子構造の推定）
合成された反応生成物の分子構造の推定を行うために ＬＣ−ＭＳによる分析を行った。ＬＣ−ＭＳの装置はＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱ Ｄｕｏ ｓｙｓｔｅｍを用いた。移動相は０．０５％ＮＨ４ＯＨ／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（２５％／７５％）、流量は０．２ｍＬ/ｍｉｎで行った。カラムはＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＩｎｅｒｔｓｉｌ ＮＨ２を用いた。
これにより天然のフロリドシドと同じ分子量をもつ物質が確認された（図４）。
(Estimation of molecular structure)
In order to estimate the molecular structure of the synthesized reaction product, analysis by LC-MS was performed. A Finnigan LCQ Duo system was used as the LC-MS apparatus. The mobile phase was 0.05% NH 4 OH / acetontrile (25% / 75%), and the flow rate was 0.2 mL / min. The column used was Inertsil NH2 from GL Science.
As a result, a substance having the same molecular weight as that of natural fluroidoside was confirmed (FIG. 4).
合成された反応生成物とテングサから抽出した天然フロリドシドを１ＨＮＭＲにかけて分析した。装置はＶａｒｉａｎＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ４００を用いた。１ＨＮＭＲは３９９．１ＭＨｚで測定し、内部標準としてはＤ２Ｏを用いた（図５）。
これにより、テングサはガラクトースの２位の位置にグリセロールが結合しているが、合成された反応生成物はガラクトースの１位又は３位の位置にグリセロールが結合していることが分かった。
The synthesized reaction product and the natural fluroidoside extracted from the primrose were analyzed by 1 HNMR. The apparatus used was a Varian UNITY INOVA400. 1 HNMR was measured at 399.1 MHz, and D 2 O was used as an internal standard (FIG. 5).
As a result, it was found that glycerol is bonded to the 2-position of galactose, but glycerol is bonded to the 1-position or 3-position of the galactose in the synthesized reaction product.
そこで、ガラクトースのどの水酸基とグリセロールが反応したかどうかを確かめるために以下の実験を行った。
合成された反応生成物を塩酸により加水分解し、反応生成物、還元糖、ガラクトースの量を測定した。反応生成物はＨＰＬＣ法で測定し、還元糖はフェリシアナイド法で測定し、ガラクトースは酵素法にて測定した。測定した結果を図６に示す。
この結果より、反応生成物は塩酸で加水分解する前は還元性を示さないのに対して、反応生成物の加水分解が進むとともに還元糖及びガラクトースの量が増加していることが分かる。つまり、還元性のあるガラクトースが増加していることになる。
反応生成物自体は還元性を示さないが、塩酸で加水分解すると還元性のあるガラクトースが増加することは、ガラクトースの還元性に関わる位置にグリセロールが結合していることを示しており、ガラクトース還元性に関わる位置即ちガラクトースの１位の位置に結合していることが分かった。
従って反応生成物はガラクトースの１位にグリセロールが結合している合成フロリドシドであることが示された。
以下に本発明の方法で合成したフロリドシド及び合成グルコシルグリセロールの性質について検討した。
Therefore, the following experiment was conducted to confirm which hydroxyl group of galactose and glycerol reacted.
The synthesized reaction product was hydrolyzed with hydrochloric acid, and the amounts of the reaction product, reducing sugar and galactose were measured. The reaction product was measured by the HPLC method, the reducing sugar was measured by the ferricyanide method, and the galactose was measured by the enzyme method. The measurement results are shown in FIG.
From this result, it can be seen that the reaction product does not exhibit reducibility before being hydrolyzed with hydrochloric acid, whereas the amount of reducing sugar and galactose increases as the reaction product proceeds with hydrolysis. That is, reducing galactose is increasing.
Although the reaction product itself does not exhibit reducibility, an increase in reducible galactose when hydrolyzed with hydrochloric acid indicates that glycerol is bound to a position related to the reducibility of galactose, and galactose reduction It was found to be bound to the position related to sex, that is,
Therefore, the reaction product was shown to be a synthetic flurolide side in which glycerol is bonded to the 1-position of galactose.
The properties of fluroidoside and synthetic glucosylglycerol synthesized by the method of the present invention were examined below.
（α―アミラーゼの活性化について）
本発明の方法によって合成したフロリドシド及びグルコシルグリセロールのα―アミラーゼの活性化の測定を行った。
０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した合成フロリドシド又は合成グルコシルグリセロール０．７ｍＬと可溶性デンプン（５ｍｇ/ｍＬ）０．３ｍＬを混合し、３７℃で５分間プレインキュベートを行った。これに緩衝液で希釈したブタ膵臓由来α-アミラーゼ（１ｕｎｉｔ/ｍＬ）２５μＬを添加して１０分間反応後、沸騰水で５分間加熱して反応を停止させた。反応液１２５μＬを採取して０．０１Ｍヨウ素溶液２ｍＬと混合し、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素活性化率は、対照群（試料無添加）との比較で算出した。
合成フロリドシドと合成グルコシルグリセロールのα―アミラーゼの活性化率の結果を図７に示す。
これにより、本発明の方法によって合成されたフロリドシドと合成グルコシルグリセロールは天然のフロリドシドと同様にα―アミラーゼを活性化することが分かる。
また、ヨウ素による比色法のみでなく、還元糖量の増加を経時的にフェリシアナイド法を用いて定量することでα-アミラーゼ活性化を確認した（図８）。この結果からも、合成フロリドシドがα―アミラーゼを活性化することが分かる。
(Activation of α-amylase)
Activation of α-amylase of fluroside and glucosylglycerol synthesized by the method of the present invention was measured.
Synthetic floridoside or 0.7 mL of synthetic glucosylglycerol diluted with 0.25M phosphate buffer (pH 7.0) and 0.3 mL of soluble starch (5 mg / mL) were mixed and preincubated at 37 ° C. for 5 minutes. To this, 25 μL of porcine pancreatic α-amylase (1 unit / mL) diluted with a buffer solution was added and reacted for 10 minutes, followed by heating with boiling water for 5 minutes to stop the reaction. 125 μL of the reaction solution was collected and mixed with 2 mL of 0.01 M iodine solution, and the absorbance at 660 nm was measured. The enzyme activation rate was calculated by comparison with a control group (no sample added).
FIG. 7 shows the result of the activation rate of α-amylase of synthetic fluroside and synthetic glucosylglycerol.
Thus, it can be seen that the fluorideside synthesized by the method of the present invention and the synthetic glucosylglycerol activate α-amylase in the same manner as natural florideside.
In addition, the activation of α-amylase was confirmed not only by the colorimetric method using iodine but also by quantifying the increase in the amount of reducing sugar over time using the ferricyanide method (FIG. 8). This result also shows that synthetic flurolideside activates α-amylase.
（メイラード反応性）
メイラード反応の測定は以下のようにして行った。
０．５％のグリシンと１％糖類（グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、スクロース（Ｓｕｃ）と天然フロリドシド（Ｆｌｏ）又は合成フロリドシド（Ｆｌｏ））を含む２０ｍＭ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液１ｍＬを、容器に入れ、密栓して１００℃で６０分間加熱した。その後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図９に示す。
これによりｐＨ８におけるメイラード反応性はグルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）で高いが、天然フロリドシド（Ｆｌｏ）と同様に合成フロリドシド（Ｆｌｏ）もメイラード反応性が低いことが分かる。
(Maillard reactivity)
The Maillard reaction was measured as follows.
20 mM, pH 8.0 phosphate buffer containing 0.5% glycine and 1% saccharide (glucose (Glu), galactose (Gal), sucrose (Suc) and natural fluroside (Flo) or synthetic fluroside (Flo)) 1 mL was placed in a container, sealed and heated at 100 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured. The results are shown in FIG.
This shows that Maillard reactivity at
（う蝕性について）
う蝕性の測定は以下のようにして行った。
被験者の口腔内を水道水でゆすぎ、蒸留水でうがいした後、唾液を回収した。
１％の合成フロリドシドもしくは合成グルコシルガラクトシド１ｍＬに、採取した唾液３ｍＬとブレインハートインフュージョン培地（Fluka社製）１ｍＬを加えた。反応液は、３７℃で加温し、経時的にｐＨ変化を測定した。反応液のｐＨが下がり酸性となるものをう蝕性があるとした。結果を図１０に示す。これにより、グルコース、ガラクトースはｐＨが下がったが、合成フロリドシド及び合成グルコシルグリセロールのｐＨの変化は少なく、う蝕性が少ないことが分かる。
(About caries)
The caries property was measured as follows.
After rinsing the subject's mouth with tap water and gargle with distilled water, saliva was collected.
3 mL of collected saliva and 1 mL of brain heart infusion medium (Fluka) were added to 1 mL of 1% synthetic fluroside or synthetic glucosyl galactoside. The reaction solution was heated at 37 ° C., and the change in pH was measured over time. Those that become acidic with a lowered pH of the reaction solution were considered carious. The results are shown in FIG. Thereby, although pH of glucose and galactose fell, it turns out that there is little change of pH of synthetic | combination fluroside and synthetic | combination glucosylglycerol, and there is little caries property.
（加熱着色性）
以下の方法で加熱着色性を測定した。
１％糖類（グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、スクロース（Ｓｕｃ）、合成フロリドシド（Ｆｌｏ））を含む、ｐＨ４及びｐＨ７の２０ｍＭクエン酸―リン酸緩衝液（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液を密栓して、１６０℃で６０分間加熱した。その後、蒸留水で希釈し４２０ｎｍの吸光度を測定することによって着色性をみた。その結果合成フロリドシドはほとんど加熱による着色が見られなかった（図１１）。
(Heat colorability)
The heat colorability was measured by the following method.
A 20 mM citrate-phosphate buffer solution (Mclvaine buffer solution) containing 1% saccharides (glucose (Glu), galactose (Gal), sucrose (Suc), synthetic furoside (Flo)),
本発明に係る還元糖と多価アルコールをグリコシド結合した化合物は、消化酵素によって分解されず腸管からも吸収されないので、腸においてα―アミラーゼを活性化し、腸内細菌を増殖させるため、プレバイオテクスにおいて優れた化合物である。また、メイラード反応性が低く、非う蝕性を示すため、食品に用いる甘味料としても適しており、更にウイルス感染症や腫瘍性疾患や免疫疾患にも有用である。 The compound in which the reducing sugar and the polyhydric alcohol according to the present invention are glycosidically bonded is not decomposed by digestive enzymes and is not absorbed from the intestinal tract, so that α-amylase is activated in the intestine and proliferates intestinal bacteria. Is an excellent compound. In addition, since it has low Maillard reactivity and exhibits non-cariogenic properties, it is also suitable as a sweetener used in foods, and is also useful for viral infections, neoplastic diseases and immune diseases.
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