JP2011057574A - アンドロゲン受容体アンタゴニスト及びアンドロゲン受容体結合阻害剤 - Google Patents
アンドロゲン受容体アンタゴニスト及びアンドロゲン受容体結合阻害剤 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】新規で優れたアンドロゲン受容体アンタゴニストと、これを有効成分とするアンドロゲン受容体結合阻害剤を提供する。
【解決手段】フラボン骨格構造の５位と４’位へ特定置換基を導入してなるアンドロゲン受容体アンタゴニスト。その１種又は２種以上を有効成分として含有するアンドロゲン受容体結合阻害剤。
【選択図】なし
【解決手段】フラボン骨格構造の５位と４’位へ特定置換基を導入してなるアンドロゲン受容体アンタゴニスト。その１種又は２種以上を有効成分として含有するアンドロゲン受容体結合阻害剤。
【選択図】なし
Description
本発明は、アンドロゲン受容体アンタゴニスト及びアンドロゲン受容体結合阻害剤に関する。更に詳しくは本発明は、前立腺癌を含む各種の癌、前立腺肥大症その他のアンドロゲン受容体結合阻害が治療・予防上に有効であるような各種アンドロゲン依存性疾患に使用できるアンドロゲン受容体アンタゴニストと、これを有効成分とするアンドロゲン受容体結合阻害剤に関する。
アンドロゲン受容体は雄性決定において役割を果たす点に加えて、その活性化は、良性前立腺肥大症、前立腺癌、脂漏症、座瘡、月経前症候群、肺癌等の発症と進行に重要な役割を果たす。
アンドロゲン受容体アンタゴニストは、アンドロゲン受容体に対するアンドロゲンの結合を阻害することにより、上記の各種疾患の治療や予防に有用であると期待される。
従来、アンドロゲン受容体アンタゴニストとしては、ステロイド剤である「クロルマジノン (Chlormadinone)」、非ステロイド系の「フルタミド (Flutamide)」、フタルイミド系の化合物であるDIMP [N-(3,5-dimethyl-4-isooxazolylmethyl)phthalimide]等が知られている。又、下記特許文献１〜特許文献３に開示された化合物も例示することができる。
本発明は、新規で優れたアンドロゲン受容体アンタゴニストと、これを有効成分とするアンドロゲン受容体結合阻害剤を提供することを、解決すべき技術的課題とする。
本願発明者は、アンドロゲン受容体アンタゴニスト活性を有する化合物の探求を行う過程で、大豆イソフラボン類が性ホルモンと類似の作用を有することが提起されている点に着目し、研究を進めた結果、フラボン骨格構造の５位と４’位への特定置換基の導入が、アンドロゲン受容体アンタゴニスト活性の発現とその向上に大きく影響することを見出した。
そして更に研究を進めた結果、公知の５−ヒドロキシフラボンよりも有意に高活性である一群のアンドロゲン受容体アンタゴニストを得て、本発明を完成した。
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、下記の「化１」式に示す化合物である、アンドロゲン受容体アンタゴニストである。
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、下記の「化１」式に示す化合物である、アンドロゲン受容体アンタゴニストである。
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る「化１」の化合物において、Ｒ２として表記された電子吸引性基が−Ｆ（フルオロ基）、−Ｃｌ（塩素基）、−ＣＮ（シアノ基）及び−ＮＯ２（ニトロ基）から選ばれる基である、アンドロゲン受容体アンタゴニストである。
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、下記の「化２」式に示す化合物である、アンドロゲン受容体アンタゴニストである。
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、下記の「化２」式に示す化合物である、アンドロゲン受容体アンタゴニストである。
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、第１発明〜第３発明のいずれかに記載したアンドロゲン受容体アンタゴニストの１種又は２種以上を有効成分として含有する、アンドロゲン受容体結合阻害剤である。
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係るアンドロゲン受容体結合阻害剤が以下のいずれかの用途に用いられるものである、アンドロゲン受容体結合阻害剤である。
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係るアンドロゲン受容体結合阻害剤が以下のいずれかの用途に用いられるものである、アンドロゲン受容体結合阻害剤である。
（１）アンドロゲン依存性疾患の治療・予防剤。
（２）抗がん剤。
（３）前立腺肥大治療剤。
（４）皮膚外用剤又は頭髪化粧料。
本願発明者は、５−ヒドロキシフラボンの４’位に電子吸引性の置換基を導入した第１発明又は第２発明に係る化合物が、あるいは５−ヒドロキシフラボンの５位の−ＯＨを−Ｆに置換した第３発明に係る化合物が、極めて優れたアンドロゲン受容体アンタゴニスト活性を示し、細胞毒性も極めて低いことを見出した。
それらの点は、レポータージーンアッセイによりin vitroで確認されており、かつ、前立腺癌治療薬として市販されているフルタミドよりも数倍も強いアンタゴニスト活性を示し、更に公知のアンドロゲン受容体作用阻害剤である５−ヒドロキシフラボンよりも活性が有意に強化されている。
従って、本発明のアンドロゲン受容体アンタゴニストは第４発明のアンドロゲン受容体結合阻害剤の有効成分とすることができる。そして、このアンドロゲン受容体結合阻害剤は、例えば第５発明に列挙するような各種用途に用いることができる。
次に、本発明の実施形態を、その最良の形態を含めて説明する。
〔アンドロゲン受容体アンタゴニスト〕
本発明のアンドロゲン受容体アンタゴニストは、それぞれフラボンの骨格構造を持つ、前記「化１」に示す化合物であり、又は前記「化２」に示す化合物（5-fluoroflavone）である。
本発明のアンドロゲン受容体アンタゴニストは、それぞれフラボンの骨格構造を持つ、前記「化１」に示す化合物であり、又は前記「化２」に示す化合物（5-fluoroflavone）である。
これらの内でも、「化１」に示す化合物であってＲ２として表記された電子吸引性基が−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選ばれる基であるものが特に好ましい。とりわけ、電子吸引性基が−Ｆであるもの（5-hydroxy-4’-fluoroflavone）と電子吸引性基が−ＣＮであるもの（5-hydroxy-4’-cyanoflavone）とが、アンドロゲン受容体アンタゴニスト活性が５−ヒドロキシフラボンよりも顕著に高い。これらの化合物は、その製造方法も含めて公知であるか、公知でなくても文献記載の各種合成方法を応用して製造できる。
〔アンドロゲン受容体結合阻害剤〕
本発明のアンドロゲン受容体結合阻害剤は、上記いずれかのアンドロゲン受容体アンタゴニストの１種又は２種以上を有効成分として含有する。
本発明のアンドロゲン受容体結合阻害剤は、上記いずれかのアンドロゲン受容体アンタゴニストの１種又は２種以上を有効成分として含有する。
アンドロゲン受容体結合阻害剤の用途としては、限定はされないが、（１）アンドロゲン依存性疾患の治療・予防剤、（２）抗がん剤、（３）前立腺肥大治療剤、（４）皮膚外用剤又は頭髪化粧料、等を代表的に例示することができる。
言い換えれば、アンドロゲン受容体結合阻害剤の用途は、一般的にアンドロゲン受容体結合阻害剤がその予防及び／又は治療に有効である疾患、又はアンドロゲン受容体結合阻害剤の治療及び／又は予防上の有用性が示唆されている疾患に対して適用可能である。
本発明のアンドロゲン受容体結合阻害剤の投与形態は特に制限されず、経口的・非経口的に投与することができる。アンドロゲン受容体結合阻害剤は、有効成分である前記アンドロゲン受容体アンタゴニストの１種又は２種以上のみからなる製剤として用いることもできる。又、これらの有効成分と、薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物の１種又は２種以上とを含む医薬組成物の形態で投与することも好ましい。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤等を用いることができる。
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、又は貼付剤等を挙げることができる。
また、当業者に利用可能な種々のドラッグ・デリバリ−・システムを応用して、本発明のアンドロゲン受容体結合阻害剤を前立腺等の組織内に選択的に移行させ、あるいは有効成分を持続的に血中に放出させることにより、効果を高めることができる。
アンドロゲン受容体結合阻害剤の投与量は特に限定されず、有効成分である化合物の種類、治療又は予防の目的、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路などの種々の条件に応じて適宜の投与量を選択すれば良い。一日投与量を一日あたり 2〜3 回程度に分割して投与しても良く、2 〜7 日程度に一回の割合で間欠的に単位投与量を投与することもできる。
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。
〔実施例１：供試化合物〕
表１に示すEntry番号１〜１８に係る化合物について試験を行った。なお、表１には示していないが、後述の表２には示すように、コントロールとして、市販のflavone（表２のEntry番号C1）及び5,4’-dihydroxyflavone（表２のEntry番号C２）についても試験を行った。各Entry番号に係る化合物は共通にフラボン骨格を持ち、Ｒ１はその５位の置換基の種類を示し、Ｒ２はその４’位の置換基の種類を示す。置換基の表記に関し、「Ｍｅ」は「メチル」を、「Ｐｈ」は「フェニル」を、「ｔＢＵ」は「tertiaryブチル」を、「Ａｃ」はアセチルを、それぞれ意味する。
表１に示すEntry番号１〜１８に係る化合物について試験を行った。なお、表１には示していないが、後述の表２には示すように、コントロールとして、市販のflavone（表２のEntry番号C1）及び5,4’-dihydroxyflavone（表２のEntry番号C２）についても試験を行った。各Entry番号に係る化合物は共通にフラボン骨格を持ち、Ｒ１はその５位の置換基の種類を示し、Ｒ２はその４’位の置換基の種類を示す。置換基の表記に関し、「Ｍｅ」は「メチル」を、「Ｐｈ」は「フェニル」を、「ｔＢＵ」は「tertiaryブチル」を、「Ａｃ」はアセチルを、それぞれ意味する。
（Entry番号３：5-Hydroxy-4’-cyanoflavoneの合成）
下記の「化５」式に示すように、2,6-Dihydroxyacetophenoneと4-cyanobenzoylchlorideをアセトン中で炭酸カリウム存在下において環流し、Entry番号３に係る化合物を合成した。
下記の「化５」式に示すように、2,6-Dihydroxyacetophenoneと4-cyanobenzoylchlorideをアセトン中で炭酸カリウム存在下において環流し、Entry番号３に係る化合物を合成した。
下記の「化６」式に示すように、2,6-Dihydroxyacetophenoneと4-nitrobenzoylchlorideをアセトン中で炭酸カリウム存在下において環流し、Entry番号４に係る化合物を合成した。
下記の「化7」式に示すように、まず前記した通りにEntry番号４に係る化合物を合成した後、水素置換した系内でパラジウムカーボンを用いて５位のニトロ基をアミノ基に還元することで、Entry番号１１に係る化合物を合成した。
下記の「化８」式に示すように、まず前記した通りにEntry番号１１に係る化合物を合成した後、塩化アセチルとトリエチルアミンを用いてアミノ基をアセチル化することで、Entry番号１２に係る化合物を合成した。
下記の「化9」式に示すように、2,6-Dihydroxyacetophenoneと4-dimethylaminobenzoylchlorideをアセトン中で炭酸カリウム存在下において環流し、Entry番号8に係る化合物を合成した。「化9」式に示すように、この合成反応では、Entry番号8に係る化合物の他にも、4-dimethylaminobenzoylchlorideが２分子導入されたフラボン誘導体も得ることができる。それら収量は、Entry番号8に係る化合物（5-Hydroxy-4’-dimethylaminoflavone）が１０％であり、4-dimethylaminobenzoylchlorideが２分子導入されたフラボン誘導体が２％であった。
下記の「化１０」式に示すように2,6-Dihydroxyacetophenoneと4-phenylbenzoylchlorideをアセトン中で炭酸カリウム存在下において環流し、Entry番号7に係る化合物を合成した。
（実験方法）
供試細胞の培養
供試細胞としてヒトの乳がん細胞を用いた。細胞は、３７℃インキュベーター内で細胞培養フラスコを用いて培養した。フラスコには細胞名、細胞の代数、濃度、最終処理日、処理者の名前を記入した。少なくとも３日に１回は培地交換を行い、コンフルエントになる前（７０％コンフルエントが最適である）に継代し、細胞にかかるダメージができる限り小さくなるように配慮した。
継代
細胞培養フラスコ内の培地を吸引除去後、死細胞を取り除くためにPBS（-）EDTA（+）１０mLを加え洗浄し、それを吸引除去した。この操作を２回行った後、細胞を浮遊させるために０．１２５％
Trypsin ４mL添加後２分間室温で静置した。その後、L-15培地を１０mL加えトリプシンの作用を抑制し、十分にピペッティング後、１２mL容遠心沈殿管２本に７mLずつ分注し、１０００rpmで5分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを吸引除去し、タッピングにより細胞を再懸濁後、遠心沈殿管1本につき１mLのL-15培地を加え細胞懸濁液とした。その細胞懸濁液をパラフィルム上でL-15培地にて１／１０倍希釈後、ヘマトメーターを用いて細胞数を計測し、調製した細胞懸濁液の濃度を求めた。目的の細胞濃度になるように必要な細胞懸濁液量を求め、新しい細胞培養フラスコに移し、L-15培地１０mLを加え３７℃インキュベーター内で静置培養した。
細胞培養フラスコ内の培地を吸引除去後、死細胞を取り除くためにPBS（-）EDTA（+）１０mLを加え洗浄し、それを吸引除去した。この操作を２回行った後、細胞を浮遊させるために０．１２５％
Trypsin ４mL添加後２分間室温で静置した。その後、L-15培地を１０mL加えトリプシンの作用を抑制し、十分にピペッティング後、１２mL容遠心沈殿管２本に７mLずつ分注し、１０００rpmで5分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを吸引除去し、タッピングにより細胞を再懸濁後、遠心沈殿管1本につき１mLのL-15培地を加え細胞懸濁液とした。その細胞懸濁液をパラフィルム上でL-15培地にて１／１０倍希釈後、ヘマトメーターを用いて細胞数を計測し、調製した細胞懸濁液の濃度を求めた。目的の細胞濃度になるように必要な細胞懸濁液量を求め、新しい細胞培養フラスコに移し、L-15培地１０mLを加え３７℃インキュベーター内で静置培養した。
培地交換
培養フラスコ内の培地を吸引除去後、PBS（-）EDTA（+）１０mLで２回洗浄し、L-15培地１０mLを加え、３７℃インキュベーター内で静置培養した。
培養フラスコ内の培地を吸引除去後、PBS（-）EDTA（+）１０mLで２回洗浄し、L-15培地１０mLを加え、３７℃インキュベーター内で静置培養した。
（レポータージーンアッセイ）
９６穴組織培養プレートに、１穴につき約１．０×１０4
cellsの細胞を分注後、３７℃で約４時間静置培養した。静置培養の間、供試化合物の秤量、希釈を行った。細胞の分注から約４時間後、希釈した化合物を添加し、３７℃で約２０時間静置培養した。約２０時間後、ルミノメーターにより測定を行った。実験は4反復を３回以上行い、それを基にデータ処理を行った。
９６穴組織培養プレートに、１穴につき約１．０×１０4
cellsの細胞を分注後、３７℃で約４時間静置培養した。静置培養の間、供試化合物の秤量、希釈を行った。細胞の分注から約４時間後、希釈した化合物を添加し、３７℃で約２０時間静置培養した。約２０時間後、ルミノメーターにより測定を行った。実験は4反復を３回以上行い、それを基にデータ処理を行った。
細胞の分注
細胞数懸濁液の算出までは前記した「継代」と同様の操作を行い、乾熱滅菌したシャーレ中で細胞濃度１．１×１０5
cells/mLとなるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を３００μLの８連ピペットを用いて、１wellにつき９０μLずつ、９６穴組織培養プレートに分注後、３７℃インキュベーター内で約４時間静置培養した。
細胞数懸濁液の算出までは前記した「継代」と同様の操作を行い、乾熱滅菌したシャーレ中で細胞濃度１．１×１０5
cells/mLとなるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を３００μLの８連ピペットを用いて、１wellにつき９０μLずつ、９６穴組織培養プレートに分注後、３７℃インキュベーター内で約４時間静置培養した。
供試化合物の秤量
液体の化合物はパスツールピペットを用いてエッペンドルフチューブに移した。固体の化合物は縦半分に裂き、平たくした竹串を用い、エッペンドルフチューブに入れて電子天秤にて精確に秤量した。
液体の化合物はパスツールピペットを用いてエッペンドルフチューブに移した。固体の化合物は縦半分に裂き、平たくした竹串を用い、エッペンドルフチューブに入れて電子天秤にて精確に秤量した。
供試化合物の希釈
化合物の希釈は、希釈用の溶媒としてジメチルスルフォキシド（DMSO,WAKO;Cat.
No. 043-07216）を用い、クリーンベンチ内で操作を行った。秤量した供試化合物にDMSOを加え２．０×１０-1
Mの濃度に調製後、そこから段階希釈し、目的濃度となるまで希釈した。エッペンドルフチューブ内のＤＭＳＯ濃度を１％に調製後、段階的に希釈した化合物の希釈表を図１に示す。図１において、１は１００％ＤＭＳＯ培地を、２はL-15培地を、３は１％ＤＭＳＯ培地を、それぞれ示す。
化合物の希釈は、希釈用の溶媒としてジメチルスルフォキシド（DMSO,WAKO;Cat.
No. 043-07216）を用い、クリーンベンチ内で操作を行った。秤量した供試化合物にDMSOを加え２．０×１０-1
Mの濃度に調製後、そこから段階希釈し、目的濃度となるまで希釈した。エッペンドルフチューブ内のＤＭＳＯ濃度を１％に調製後、段階的に希釈した化合物の希釈表を図１に示す。図１において、１は１００％ＤＭＳＯ培地を、２はL-15培地を、３は１％ＤＭＳＯ培地を、それぞれ示す。
希釈した化合物の組織培養プレートへの添加量は５μL/wellとし、１well中の最終液量は１００μLとした。よって添加前の化合物の濃度はwell中での最終濃度の２０倍となるようにした。また、添加前のDMSO濃度が１％となるようにした。
供試化合物の添加
前記した継代操作にて調製した細胞懸濁液を１wellにつき９０μL添加後、３７℃インキュベーターで４時間静置培養後、９６穴組織培養プレートに、１wellにつき試験化合物５μLを添加した。アゴニスト処理区には１％
DMSO含有４nM DHT/１４０nM
Dexamethasone ５μL、アゴニスト無処理区には１％
DMSO含有L-15培地５μLを添加した。希釈した化合物のDMSO濃度は全て１％であり、目的濃度の化合物と４nM
DHTあるいは１％ DMSO溶液と合わせて添加量は１０μLであるので、well中のDMSO濃度は０．１％となる。
前記した継代操作にて調製した細胞懸濁液を１wellにつき９０μL添加後、３７℃インキュベーターで４時間静置培養後、９６穴組織培養プレートに、１wellにつき試験化合物５μLを添加した。アゴニスト処理区には１％
DMSO含有４nM DHT/１４０nM
Dexamethasone ５μL、アゴニスト無処理区には１％
DMSO含有L-15培地５μLを添加した。希釈した化合物のDMSO濃度は全て１％であり、目的濃度の化合物と４nM
DHTあるいは１％ DMSO溶液と合わせて添加量は１０μLであるので、well中のDMSO濃度は０．１％となる。
図２（ａ）にＡＲ（アンドロゲン受容体）に対する活性評価における化合物添加位置の区番号を示し、図２（ｂ）にＧＲ（グルココルチコイド受容体）に対する活性評価における化合物の添加位置の区番号を示す。図２（ａ）中の区番号４ａと図２（ｂ）中の区番号４ｂは共に「Cell only」区であって、細胞の異常の有無を確認するため、化合物は添加せずに細胞懸濁液９０μLのみとした区である。又、また、アゴニスト無処理区（DHT/Dexametasone無処理区）へのDHT/Dexの混入を避けるため、化合物やFlutamideは必ずアゴニスト無処理区から処理区にかけて添加した。
更に、図２（ａ）中の区番号５ａは「０．２nM DHT処理」区を、区番号６ａは「０．１％ DMSO処理」区を、区番号７ａは「供試化合物＋０．２nM DHT処理」区を、区番号８ａは「供試化合物＋０．１％ DMSO処理」区を、区番号９ａは「０．２nM DHT＋１μMフルタミド処理」区を、区番号１０ａは「０．１％ DMSO＋１μMフルタミド処理」区を、それぞれ表す。
又、図２（ｂ）中の区番号５ｂは「７nM Dexamethasone処理」区を、区番号６ｂは「０．１％ DMSO処理」区を、区番号７ｂは「供試化合物＋７nM Dexamethasone処理」区を、区番号８ｂは「供試化合物＋ ０．１％ DMSO処理」区を、区番号９ｂは「０．２nM DHT処理」区を、それぞれ表す。
供試化合物の添加後、９６穴組織培養プレートを３７℃インキュベーターで２０時間静置培養した。
細胞の溶解
供試化合物を添加した９６穴組織培養プレートを３７℃、２０時間インキュベートした。細胞を溶解する前に光学顕微鏡を用いて細胞の様子を観察した。化合物の結晶や細胞毒性(剥離、空包化、膜分解など)などの異常が見られた場合には、そのwell番号と異常を記録し、得られた実験結果と関連づけて考察した。クリーンベンチ内でwell中の培地を吸引除去後、あらかじめ調製しておいた１× Lysis Bufferを２５μL/wellずつ添加し、室温で３０分間遮光しながら静置した。
供試化合物を添加した９６穴組織培養プレートを３７℃、２０時間インキュベートした。細胞を溶解する前に光学顕微鏡を用いて細胞の様子を観察した。化合物の結晶や細胞毒性(剥離、空包化、膜分解など)などの異常が見られた場合には、そのwell番号と異常を記録し、得られた実験結果と関連づけて考察した。クリーンベンチ内でwell中の培地を吸引除去後、あらかじめ調製しておいた１× Lysis Bufferを２５μL/wellずつ添加し、室温で３０分間遮光しながら静置した。
ルシフェラーゼ活性の測定
供試化合物のアンドロゲン及びグルココルチコイド活性は、ルミノメーター(Luminoskan
RS, Labsystems)を用いてルシフェラーゼの相対的発光強度(RLU:Relative
Luminescence Unit)を測定することにより評価した。
供試化合物のアンドロゲン及びグルココルチコイド活性は、ルミノメーター(Luminoskan
RS, Labsystems)を用いてルシフェラーゼの相対的発光強度(RLU:Relative
Luminescence Unit)を測定することにより評価した。
ルミノメーターを使用する少なくとも３０分前には、本体、パソコンの順に機械を立ち上げておいた。Lysis
Buffer添加から３０分後、測定するプレートをルミノメーターにセットし、Reaction
Buffer及びLuciferinをそれぞれ２５μL/wellずつルミノメーター内で添加し、RLUを測定した。Reaction
Bufferは使用量を１５mL容コニカルチューブに移し、Luciferinは−２０℃の冷凍庫から取り出し常温の水中で解凍した。なお、ルシフェリンは光や熱に不安定であるので、遮光、氷冷しながら測定を行った。
Buffer添加から３０分後、測定するプレートをルミノメーターにセットし、Reaction
Buffer及びLuciferinをそれぞれ２５μL/wellずつルミノメーター内で添加し、RLUを測定した。Reaction
Bufferは使用量を１５mL容コニカルチューブに移し、Luciferinは−２０℃の冷凍庫から取り出し常温の水中で解凍した。なお、ルシフェリンは光や熱に不安定であるので、遮光、氷冷しながら測定を行った。
パソコンのデスクトップ上にある“Lumcont”アイコンをダブルクリックしルミノメーターを起動後、“Reader”から“Connect
Reader”を選択してルミノメーターとパソコン本体とを接続した。Reaction
BufferはPump
1と、LuciferinはPump
2とそれぞれ接続し、pumpがずれないようにパラフィルムで固定後、それぞれのPumpで“Prime”を３回ずつ行いチューブ内を溶液で満たした。この時のPump
1、2の切り換えは、“Setting”を選択した後、“Pump
Number”に１か２をキー入力することで行った。次に、“Plate
Out”で空のプレートと測定するプレートを交換し、“Plate
In”をクリックしてプレートをルミノメーター内にセット後、“Measure”により測定を開始した。測定は１プレートにつき約１７分を要した。
Reader”を選択してルミノメーターとパソコン本体とを接続した。Reaction
BufferはPump
1と、LuciferinはPump
2とそれぞれ接続し、pumpがずれないようにパラフィルムで固定後、それぞれのPumpで“Prime”を３回ずつ行いチューブ内を溶液で満たした。この時のPump
1、2の切り換えは、“Setting”を選択した後、“Pump
Number”に１か２をキー入力することで行った。次に、“Plate
Out”で空のプレートと測定するプレートを交換し、“Plate
In”をクリックしてプレートをルミノメーター内にセット後、“Measure”により測定を開始した。測定は１プレートにつき約１７分を要した。
測定終了後、“Display”をクリックし測定結果を表示させ、“Date”から“Save
to File”を選択し、データを保存した。測定したプレートを取り出し、空のプレートをルミノメーターにセットした。その後、pump 1、2ともに、“Prime”、“Empty”を３回ずつ、その順に行うことでpump内を洗浄した。“Connect”から“Disconnect
Reader”を選択し、ルミノメーターとパソコンとの接続を遮断後、パソコン、ルミノメーターの順に電源を落とした。
to File”を選択し、データを保存した。測定したプレートを取り出し、空のプレートをルミノメーターにセットした。その後、pump 1、2ともに、“Prime”、“Empty”を３回ずつ、その順に行うことでpump内を洗浄した。“Connect”から“Disconnect
Reader”を選択し、ルミノメーターとパソコンとの接続を遮断後、パソコン、ルミノメーターの順に電源を落とした。
データ解析
１回につき４反復の実験を最低２回行い、その平均値を評価に用いた。各実験区の示すRLU値の平均を０．１％
DMSO処理区の示すRLU値の平均で除した値をFold
inductionとした。このFold
Inductionによるデータ解析は、調製した０．２nM
DHT/７nM
Dexamethasoneの濃度のずれが結果に反映されやすいという欠点を持つ。よって、反復間での誤差をより小さくするために、化合物の評価にはFold
Inductionを基に算出したInduced
Luciferase Activity（％）を用いた。０．２nM
DHT/７nM
Dexamethasone処理区の示すFold
Inductionを１００％、０．１％
DMSO処理区の示すFold
Inductionを０％としたときに、それぞれの試験区の示すFold
Inductionの相対値をInduced
Luciferase Activity（％）とした。
１回につき４反復の実験を最低２回行い、その平均値を評価に用いた。各実験区の示すRLU値の平均を０．１％
DMSO処理区の示すRLU値の平均で除した値をFold
inductionとした。このFold
Inductionによるデータ解析は、調製した０．２nM
DHT/７nM
Dexamethasoneの濃度のずれが結果に反映されやすいという欠点を持つ。よって、反復間での誤差をより小さくするために、化合物の評価にはFold
Inductionを基に算出したInduced
Luciferase Activity（％）を用いた。０．２nM
DHT/７nM
Dexamethasone処理区の示すFold
Inductionを１００％、０．１％
DMSO処理区の示すFold
Inductionを０％としたときに、それぞれの試験区の示すFold
Inductionの相対値をInduced
Luciferase Activity（％）とした。
アゴニスト無処理区においてInduced Luciferase Activityが０％より有意に高く、アゴニスト処理区においてもInduced Luciferase Activityが１００％よりも有意に高い化合物をアゴニストと評価した。アゴニスト活性がＡＲ特異的なものであるかＧＲ特異的なものであるかの区別は、アゴニスト活性を示す供試化合物とＡＲに特異的なアンタゴニストであるFlutamideを同時処理することで行った。アゴニスト無処理区ではInduced Luciferase Activityに有意差が見られないが、アゴニスト処理区ではInduced Luciferase Activity が１００％よりもが有意に低い場合にはアンタゴニストと評価した。ただし、アゴニスト無処理区においてFold Inductionが０．８５よりも小さい場合は細胞毒性と評価した。
データの有意性については、t検定を用いて２．７７６以上であれば有意であるとし、９５％の信頼性で評価した。
データは、y軸にInduced
luciferase activity(％)、x軸に化合物濃度(M)をとった散布図で表した。活性を示した化合物については、有意差が認められた点を３点以上取り対数近似曲線を得た。この近似式にアゴニストの場合は“y=150”を代入しEC150（150％
Effective Concentration）値を、アンタゴニストの場合は“y=50”を代入しIC50（50％
Inhibition Concentration）値を算出した。評価の結果を表２に示す。
luciferase activity(％)、x軸に化合物濃度(M)をとった散布図で表した。活性を示した化合物については、有意差が認められた点を３点以上取り対数近似曲線を得た。この近似式にアゴニストの場合は“y=150”を代入しEC150（150％
Effective Concentration）値を、アンタゴニストの場合は“y=50”を代入しIC50（50％
Inhibition Concentration）値を算出した。評価の結果を表２に示す。
only（化合物無処理区）、０．１％
DMSO処理区、０．２nM
DHT処理区、０．２nM
DHT +１μM
Flutamide処理区、１μM
Flutamide処理区）を選択し、継代数ごとのRLU値を測定した。RLU値と、０．１％
DMSO処理区の示すRLU値を１としたときのそれぞれの処理区が示す相対値（Fold
Induction）を比較することによって、細胞の化合物に対する反応性を評価した。
本発明によって、新規で優れたアンドロゲン受容体アンタゴニストと、これを有効成分とするアンドロゲン受容体結合阻害剤が提供される。
１ １００％ＤＭＳＯ培地
２
L-15培地
３ １％ＤＭＳＯ培地
４ａ，４ｂ 化合物添加位置の区番号
５ａ，５ｂ 化合物添加位置の区番号
６ａ，６ｂ 化合物添加位置の区番号
７ａ，７ｂ 化合物添加位置の区番号
８ａ，８ｂ 化合物添加位置の区番号
９ａ，９ｂ 化合物添加位置の区番号
１０ａ 化合物添加位置の区番号
２
L-15培地
３ １％ＤＭＳＯ培地
４ａ，４ｂ 化合物添加位置の区番号
５ａ，５ｂ 化合物添加位置の区番号
６ａ，６ｂ 化合物添加位置の区番号
７ａ，７ｂ 化合物添加位置の区番号
８ａ，８ｂ 化合物添加位置の区番号
９ａ，９ｂ 化合物添加位置の区番号
１０ａ 化合物添加位置の区番号
Claims (5)
- 下記の「化３」式に示す化合物であるアンドロゲン受容体アンタゴニスト。
- 前記「化３」の化合物においてＲ２として表記された電子吸引性基が−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選ばれる基である請求項１に記載のアンドロゲン受容体アンタゴニスト。
- 下記の「化４」式に示す化合物であるアンドロゲン受容体アンタゴニスト。
- 請求項１〜請求項３のいずれかに記載したアンドロゲン受容体アンタゴニストの１種又は２種以上を有効成分として含有するアンドロゲン受容体結合阻害剤。
- 前記アンドロゲン受容体結合阻害剤が以下のいずれかの用途に用いられるものである請求項４に記載のアンドロゲン受容体結合阻害剤。
（１）アンドロゲン依存性疾患の治療・予防剤。
（２）抗がん剤。
（３）前立腺肥大治療剤。
（４）皮膚外用剤又は頭髪化粧料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009206134A JP5534751B2 (ja) | 2009-09-07 | 2009-09-07 | アンドロゲン受容体アンタゴニスト及びアンドロゲン受容体結合阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009206134A JP5534751B2 (ja) | 2009-09-07 | 2009-09-07 | アンドロゲン受容体アンタゴニスト及びアンドロゲン受容体結合阻害剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011057574A true JP2011057574A (ja) | 2011-03-24 |
| JP5534751B2 JP5534751B2 (ja) | 2014-07-02 |
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ID=43945647
Family Applications (1)
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| JP2009206134A Active JP5534751B2 (ja) | 2009-09-07 | 2009-09-07 | アンドロゲン受容体アンタゴニスト及びアンドロゲン受容体結合阻害剤 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5534751B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015166041A1 (en) * | 2014-05-01 | 2015-11-05 | De Montfort University | Flavones as cyp1a1 inhibitors for the treatment of cancer |
| JP2019507796A (ja) * | 2016-03-11 | 2019-03-22 | エイチ リー モフィット キャンサー センター アンド リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド | イカリイン及びイカリチン誘導体 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5399584A (en) * | 1992-05-05 | 1995-03-21 | The Procter & Gamble Company | Use of flavone derivatives for gastroprotection |
| WO2002060889A1 (de) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur herstellung von flavon derivaten |
-
2009
- 2009-09-07 JP JP2009206134A patent/JP5534751B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5399584A (en) * | 1992-05-05 | 1995-03-21 | The Procter & Gamble Company | Use of flavone derivatives for gastroprotection |
| WO2002060889A1 (de) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur herstellung von flavon derivaten |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6013064525; Ｆ． Ｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．: Ｓｙｎｌｅｔｔ Ｖｏｌ．１９９９， Ｎｏ．９, 1999, ｐ．１４８０-１４８２ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2019507796A (ja) * | 2016-03-11 | 2019-03-22 | エイチ リー モフィット キャンサー センター アンド リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド | イカリイン及びイカリチン誘導体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5534751B2 (ja) | 2014-07-02 |
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