JP2011010651A - 芳香族化合物分解能を有する光合成生物および芳香族化合物の分解方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】貧栄養環境下においても芳香族化合物を分解することができる生物を提供すること。
【解決手段】光合成を行い、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを生成することができる光合成生物に、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する。本発明の光合成生物では、芳香族化合物変換酵素群は、光合成を行って精製されたＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用して芳香族化合物を分解することができる。したがって、本発明の光合成生物は、貧栄養環境下においても芳香族化合物を分解することができる。
【選択図】図２
【解決手段】光合成を行い、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを生成することができる光合成生物に、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する。本発明の光合成生物では、芳香族化合物変換酵素群は、光合成を行って精製されたＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用して芳香族化合物を分解することができる。したがって、本発明の光合成生物は、貧栄養環境下においても芳香族化合物を分解することができる。
【選択図】図２
Description
本発明は、芳香族化合物分解能を有する光合成生物、および前記光合成生物を用いた芳香族化合物の分解方法に関する。
ポリ塩化ビフェニル（以下「ＰＣＢ」と略記する）は、ビフェニルの水素原子が塩素原子で置換された化合物である。ＰＣＢは、熱安定性、耐薬品性および絶縁性に優れていることから、１９７０年代まで熱媒体や絶縁油などの様々な用途に使用されてきた。ところが、ＰＣＢには生体毒性および生物濃縮の問題があることが判明したため、現在はＰＣＢの製造および使用は禁止されている。特に、分子の平面性が高いコプラナーＰＣＢは、その他のＰＣＢよりも毒性が高いことが知られており、ダイオキシン類に分類されている。
ＰＣＢは安定性が極めて高いため、製造および使用が禁止された現在においてもＰＣＢを分解する処理方法の開発が求められている。現在までに、保管されているＰＣＢについては、熱分解をはじめとする様々な物理的または化学的な処理方法が開発されている。一方、環境中（例えば、土壌中）に低濃度で広く残留しているＰＣＢについては、これらの物理的または化学的な処理方法よりも、微生物を用いたバイオレメディエーション（生物的環境浄化）が有効であると考えられている。
アシドボラクス（シュードモナス） ｓｐ．（Acidovorax (Pseudomonas) sp.）ＫＫＳ１０２株は、ＰＣＢのバイオレメディエーションへの応用が期待されているビフェニル化合物分解細菌である。このＫＫＳ１０２株は、ビフェニル化合物の分解酵素群を有する（例えば、非特許文献１〜４参照）。図１は、ＫＫＳ１０２株が有するビフェニル化合物の分解酵素群を示す模式図である。図１Ａに示されるように、ジオキシゲナーゼ複合体ＢｐｈＡ１／Ａ２によるビフェニル骨格への酸素添加反応（水酸化）をきっかけとして、ＰＣＢ（ビフェニル化合物）は酸化的に分解される。図１Ｂに示されるように、ＢｐｈＡ１／Ａ２による酸素添加反応にはＮＡＤＨからの電子の供給が不可欠であり、ＮＡＤＨの電子は、ＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）およびＢｐｈＡ３（フェレドキシン）を経由してＢｐｈＡ１／Ａ２（ジオキシゲナーゼ複合体）に供給される。
Kimbara, K., Hashimoto, T., Fukuda, M., Koana, T., Takagi, M., Oishi, M. and Yano K., "Cloning and sequencing of two tandem genes involved in degradation of 2,3-dihydroxybiphenyl to benzoic acid in the polychlorinated biphenyl-degrading soil bacterium Pseudomonas sp. Strain KKS102", J. Bacteriol., Vol.171, p.2740-2747.
Kikuchi, Y., Nagata Y., Hinata, M., Kimbara, K., Fukuda, M., Yano, K. and Takagi, M., "Identification of the bphA4 gene encoding ferredoxin reductase involved in biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation in Pseudomonas sp. strain KKS102", J. Bacteriol., Vol.176, p.1689-1694.
Kikuchi, Y., Yasukochi, Y., Nagata Y., Fukuda, M. and Takagi, M., "Nucleotide sequence and functional analysis of the meta-cleavage pathway involved in biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation in Pseudomonas sp. Strain KKS102", J. Bacteriol., Vol.176, p.4269-4276.
Fukuda, M., Yasukochi, Y., Kikuchi, Y., Nagata Y., Kimbara, K., Horiuchi, H., Takagi, M. and Yano, K., "Identification of the bphA and bphB genes of Pseudomonas sp. strains KKS102 involved in degradation of biphenyl and polychlorinated biphenyls", Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.202, p.850-856.
しかしながら、上記従来のビフェニル化合物分解細菌には、貧栄養環境下におけるＰＣＢ分解能が低いという問題がある。
ＮＡＤＨは、主に解糖系やＴＣＡサイクルなどにより生成されるため、従来のビフェニル化合物分解細菌は、貧栄養環境下ではＮＡＤＨの産生量が少なく、ＮＡＤＨからの電子の供給が不可欠なＢｐｈＡ１／Ａ２による酸素添加反応を十分に行うことができない。したがって、貧栄養環境下において、従来のビフェニル化合物分解細菌を用いてＰＣＢを分解するためには、外部から糖などの有機化合物を供給しなければならなかった。このように、低濃度のＰＣＢを分解するために有機化合物を供給しなければならないことは、コストなどの観点からバイオレメディエーションの実用化に向けて大きな問題である。
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、貧栄養環境下においてもＰＣＢなどの芳香族化合物を分解することができる生物、およびその生物を用いた芳香族化合物の分解方法を提供することを目的とする。
本発明者は、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用しうる芳香族化合物変換酵素群の遺伝子をシアノバクテリアなどの光合成生物で発現させることで上記課題を解決しうることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第一は、以下の光合成生物に関する。
［１］ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用して芳香族化合物を他の化合物に変換する芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されている光合成生物。
［２］前記ポリヌクレオチドは、前記芳香族化合物を基質とするオキシゲナーゼをコードする、［１］に記載の光合成生物。
［３］前記芳香族化合物は、ビフェニル化合物であり、前記芳香族化合物変換酵素群は、ビフェニル化合物変換酵素群である、［１］または［２］に記載の光合成生物。
［４］前記ポリヌクレオチドは、ｂｐｈ遺伝子群に含まれる１または２以上の遺伝子を有する、［３］に記載の光合成生物。
［５］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれる１または２以上の遺伝子を有する、［４］に記載の光合成生物。
［６］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を有する、［５］に記載の光合成生物。
［７］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２およびｂｐｈＡ３遺伝子を有する、［６］に記載の光合成生物。
［８］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４遺伝子を有する、［６］に記載の光合成生物。
［９］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤからなる群から選択される１または２以上の遺伝子をさらに有する、［５］〜［８］のいずれかに記載の光合成生物。
［１０］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子をさらに有する、［５］〜［８］のいずれかに記載の光合成生物。
［１１］前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＢｐｈＡ４変異体をコードする、［３］に記載の光合成生物。
［１２］前記ポリヌクレオチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＢｐｈＡ４変異体をコードする、［３］に記載の光合成生物。
［１３］微生物である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の光合成生物。
［１４］シアノバクテリアである、［１］〜［１２］のいずれかに記載の光合成生物。
［１５］前記シアノバクテリアは、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株である、［１４］に記載の光合成生物。
［１６］配列番号１４のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１７］配列番号１５のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１８］配列番号１６のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１９］配列番号１７のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［２０］配列番号３２のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１］ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用して芳香族化合物を他の化合物に変換する芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されている光合成生物。
［２］前記ポリヌクレオチドは、前記芳香族化合物を基質とするオキシゲナーゼをコードする、［１］に記載の光合成生物。
［３］前記芳香族化合物は、ビフェニル化合物であり、前記芳香族化合物変換酵素群は、ビフェニル化合物変換酵素群である、［１］または［２］に記載の光合成生物。
［４］前記ポリヌクレオチドは、ｂｐｈ遺伝子群に含まれる１または２以上の遺伝子を有する、［３］に記載の光合成生物。
［５］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれる１または２以上の遺伝子を有する、［４］に記載の光合成生物。
［６］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を有する、［５］に記載の光合成生物。
［７］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２およびｂｐｈＡ３遺伝子を有する、［６］に記載の光合成生物。
［８］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４遺伝子を有する、［６］に記載の光合成生物。
［９］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤからなる群から選択される１または２以上の遺伝子をさらに有する、［５］〜［８］のいずれかに記載の光合成生物。
［１０］前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子をさらに有する、［５］〜［８］のいずれかに記載の光合成生物。
［１１］前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＢｐｈＡ４変異体をコードする、［３］に記載の光合成生物。
［１２］前記ポリヌクレオチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＢｐｈＡ４変異体をコードする、［３］に記載の光合成生物。
［１３］微生物である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の光合成生物。
［１４］シアノバクテリアである、［１］〜［１２］のいずれかに記載の光合成生物。
［１５］前記シアノバクテリアは、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株である、［１４］に記載の光合成生物。
［１６］配列番号１４のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１７］配列番号１５のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１８］配列番号１６のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［１９］配列番号１７のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
［２０］配列番号３２のプラスミドを有する、［１５］に記載の光合成生物。
また、本発明の第二は、以下の芳香族化合物の分解方法に関する。
［２１］［１］〜［２０］のいずれかに記載の光合成生物を芳香族化合物に接触させて、前記芳香族化合物を他の化合物に変換させるステップを含む、芳香族化合物の分解方法。
［２１］［１］〜［２０］のいずれかに記載の光合成生物を芳香族化合物に接触させて、前記芳香族化合物を他の化合物に変換させるステップを含む、芳香族化合物の分解方法。
本発明によれば、貧栄養環境下においてもＰＣＢなどの芳香族化合物を分解することができる光合成生物を提供することができる。したがって、本発明によれば、貧栄養環境下におけるバイオレメディエーションを実現することができる。
１．本発明の光合成生物
本発明の光合成生物は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有することを特徴とする。ここで「ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群」とは、由来生物においてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用することが知られている芳香族化合物変換酵素群をいう。したがって、当該芳香族化合物変換酵素群には、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子だけでなく、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを経由せずに受け取った電子も利用できる酵素群も含まれる。
本発明の光合成生物は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有することを特徴とする。ここで「ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群」とは、由来生物においてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用することが知られている芳香族化合物変換酵素群をいう。したがって、当該芳香族化合物変換酵素群には、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子だけでなく、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを経由せずに受け取った電子も利用できる酵素群も含まれる。
本発明の光合成生物は、光合成系由来の電子を利用して特定の芳香族化合物を他の化合物に変換することができる。ここで「光合成系由来の電子を利用」には、光合成を行って生成されたＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用すること、および光合成により合成された糖の代謝により生成されたＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用することだけでなく、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを経由せずに光合成系由来の電子を利用すること（例えば、光合成系で還元されたフェレドキシンなどから電子を受け取ること）も含まれる。
また、本明細書において「ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを利用」には、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの一方のみを利用することだけでなく、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方を利用することも含まれる。同様に、「ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用」には、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの一方に由来する電子を利用することだけでなく、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方に由来する電子を利用することも含まれる。
本発明の光合成生物は、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主の光合成生物に導入することで作製されうる。
宿主となる光合成生物は、光合成を行って芳香族化合物変換酵素群が利用可能な電子を生成しうる生物であれば特に限定されない。ここで「光合成を行って芳香族化合物変換酵素群が利用可能な電子を生成すること」には、光合成を行ってＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを生成することが含まれる。また、「光合成を行ってＮＡＤＨを生成すること」には、光合成により糖を合成し、得られた糖を呼吸基質としてＮＡＤＨを生成することが含まれる。宿主となりうる光合成生物の例には、シアノバクテリア、光合成細菌、藻類、植物が含まれる。宿主となる光合成生物は、取り扱いの容易さなどを考慮すると微生物が好ましく、シアノバクテリアが特に好ましい。シアノバクテリアの例には、シネコシスチス ｓｐ．（Synechocystis sp.）ＰＣＣ６８０３株が含まれる。
芳香族化合物変換酵素群とは、光合成系由来の電子を利用して特定の芳香族化合物を他の化合物に変換する芳香族化合物変換系を構成する酵素群を意味する。芳香族化合物変換酵素群は、光合成により直接生成されたＮＡＤＰＨ由来の電子を利用できるものであってもよいし、光合成により間接的に生成されたＮＡＤＨ由来の電子も利用できるものであってもよい。
芳香族化合物変換酵素群の種類は、光合成系由来の電子を利用でき、かつ宿主内で機能しうるものであれば特に限定されず、変換対象の芳香族化合物の種類や宿主の種類などに応じて適宜選択すればよい。
たとえば、ＰＣＢなどのビフェニル化合物を変換する場合は、アシドボラクス（シュードモナス） ｓｐ．（Acidovorax (Pseudomonas) sp.）ＫＫＳ１０２株またはロドコッカス ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＲＨＡ１株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）、ＢｐｈＡ３（フェレドキシン）、ＢｐｈＡ１およびＢｐｈＡ２（ジオキシゲナーゼ）、ＢｐｈＢ（ジヒドロゲナーゼ）、ＢｐｈＣ（環開裂ジオキシゲナーゼ）ならびにＢｐｈＤ（加水分解酵素）を含むビフェニル化合物変換酵素群を選択してもよい。後述するように、ＢｐｈＡ４は、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨから電子を受け取り、他のタンパク質（ＢｐｈＡ３などのフェレドキシン）に電子を供与することができる（実施の形態１，３参照）。一方、ＢｐｈＡ３は、ＢｐｈＡ４とは異なるルートでも電子を供給されうる。したがって、ＫＫＳ１０２株またはＲＨＡ１株由来のビフェニル化合物変換酵素群を利用する場合であっても、ＢｐｈＡ４は必須ではない（実施の形態２，４参照）。また、ＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ１およびＢｐｈＡ２のみでもビフェニル化合物を変換することは可能であるが、さらにＢｐｈＢ、ＢｐｈＣおよびＢｐｈＤも導入することでビフェニル化合物をより害の少ない安息香酸と脂肪酸の中間体にまで変換（分解）することができる（実施の形態３，４参照）。
また、ベンゼンを変換する場合は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＭＬ２株（ＮＣＩＢ １２１９０株）由来のＢｅｄＣ１（フェレドキシン還元酵素）、ＢｅｄＣ２（フェレドキシン）ならびにＢｅｄＢおよびＢｅｄＡ（ジオキシゲナーゼ）を含むベンゼン変換酵素群を選択してもよい。トルエンを変換する場合は、シュードモナス・プチダＦ１株由来のＴｏｄＣ１（フェレドキシン還元酵素）、ＴｏｄＣ２（フェレドキシン）およびＴｏｄＢおよびＴｏｄＡ（ジオキシゲナーゼ）を含むトルエン変換酵素群を選択してもよい。なお、本発明者らの実験によれば、前述のビフェニル化合物変換酵素群（ＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ１およびＢｐｈＡ２）を選択しても、ベンゼンおよびトルエンを変換することができる。ダイオキシンを変換する場合は、ヒトまたはラット由来のｈＣＲＰ（Ｐ４５０還元酵素）およびＰ４５０ １Ａ１（薬物代謝酵素）を含むダイオキシン変換酵素群などを選択してもよい。
芳香族化合物変換酵素群に含まれるタンパク質（酵素）は、野生型のものであってもよいし、変異体であってもよい。後述するように、ＮＡＤＨ依存性の芳香族化合物変換酵素群を光合成生物に導入する場合は、ＮＡＤＨから電子を受け取る酵素の代わりに、ＮＡＤＰＨから電子を受け取れるように改変された変異体を導入することが好ましい。
宿主に複数の遺伝子を導入する場合、各遺伝子は同一の酵素群に属していてもよいが、一つの電子伝達系を構成できるのであれば異なる酵素群に属していてもよい。たとえば、ベンゼン分解能を有する光合成生物を作製する場合、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ４遺伝子と、シュードモナス・プチダＭＬ２株由来のｂｅｄＣ２遺伝子、ｂｅｄＢ遺伝子およびｂｅｄＡ遺伝子とを導入してもよい（後述）。
これらの遺伝子を宿主に導入する方法（形質転換方法）は、特に限定されず、公知の方法から宿主の種類に応じて適宜選択すればよい。たとえば、所望の遺伝子（例えば、ｂｐｈＡ４）の上流に高発現型のプロモーターを配置したＤＮＡ断片を、宿主内で複製可能なベクターに組み込み、このベクターを用いて宿主を形質転換すればよい。また、相同組み換えにより遺伝子を導入してもよい。
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
図２は、本発明の実施の形態１に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）、ｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）およびｂｐｈＡ４遺伝子（配列番号７）が導入されている。
図２は、本発明の実施の形態１に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）、ｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）およびｂｐｈＡ４遺伝子（配列番号７）が導入されている。
実施の形態１のシアノバクテリアは、ビフェニル化合物変換酵素群に含まれる４種類の酵素、すなわちＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ；配列番号２）、ＢｐｈＡ２（ジオキシゲナーゼ；配列番号４）、ＢｐｈＡ３（フェレドキシン；配列番号６）およびＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素；配列番号８）を発現しており、ＢｐｈＡ１／Ａ２によるビフェニル骨格への酸素添加反応（水酸化）によりＰＣＢ（ビフェニル化合物）をジヒドロジオールに変換する。前述の通り、ＢｐｈＡ１／Ａ２による酸素添加反応には、電子の供給が不可欠であるが、実施の形態１のシアノバクテリアでは、ＮＡＤＨ由来の電子ではなく、ＮＡＤＰＨ由来の電子が供給される。すなわち、光合成により得られたＮＡＤＰＨ由来の電子は、ＢｐｈＡ４およびＢｐｈＡ３を経由してＢｐｈＡ１／Ａ２に供給される。
ＢｐｈＡ４は、通常はＮＡＤＨから電子を受け取るが（図１参照）、ＮＡＤＰＨからも電子を受け取ることができる（実施例参照）。したがって、野生型ＢｐｈＡ４（配列番号８）を発現させても、図２に示すビフェニル化合物変換系は機能するが、より効率的にビフェニル化合物を変換するためには、野生型ＢｐｈＡ４の代わりにＢｐｈＡ４変異体を発現させることが好ましい。ＮＡＤＰＨへの特異性が高いＢｐｈＡ４変異体の例には、配列番号１０または配列番号１２のアミノ酸配列を有するものが含まれる。
ＢｐｈＡ１（配列番号２）、ＢｐｈＡ２（配列番号４）、ＢｐｈＡ３（配列番号６）および野生型ＢｐｈＡ４（配列番号８）を発現するシアノバクテリアは、例えば配列番号１４の塩基配列を有するプラスミドを導入することで作製されうる。ＢｐｈＡ１（配列番号２）、ＢｐｈＡ２（配列番号４）、ＢｐｈＡ３（配列番号６）およびＢｐｈＡ４変異体（配列番号１０）を発現するシアノバクテリアは、例えば配列番号１５の塩基配列を有するプラスミドを導入することで作製されうる。ＢｐｈＡ１（配列番号２）、ＢｐｈＡ２（配列番号４）、ＢｐｈＡ３（配列番号６）およびＢｐｈＡ４変異体（配列番号１２）を発現するシアノバクテリアは、例えば配列番号１６の塩基配列を有するプラスミドを導入することで作製されうる。
後述する実施例に示されるように、配列番号１４のプラスミドを有するシアノバクテリアの例には、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株が含まれる。同様に、配列番号１５のプラスミドを有するシアノバクテリアの例には、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株が含まれる。配列番号１６のプラスミドを有するシアノバクテリアの例には、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株が含まれる。ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株は、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７４５、ＮＩＴＥ Ｐ−７４６、ＮＩＴＥ Ｐ−７４７として、２００９年６月１７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
図２に示されるように、実施の形態１のシアノバクテリアは、光合成を行って生成されたＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを電子の供給源として利用して、ＰＣＢなどのビフェニル化合物をジヒドロジオールに変換することができる。したがって、実施の形態１のシアノバクテリアは、従来のビフェニル化合物分解細菌がＮＡＤＨを生成できない貧栄養環境下でもビフェニル化合物を変換することができる。
なお、実施の形態１では、配列番号１、３、５および７の塩基配列からなる遺伝子を導入したが、ｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子およびｂｐｈＡ４遺伝子として、配列番号２、４、６および８のアミノ酸配列に対して高い相同性（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子を導入してもよい。すなわち、ｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子およびｂｐｈＡ４遺伝子は、配列番号１、３、５および７の塩基配列のものに限定されない。この場合、配列番号２のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のＢｐｈＡ１と同様に、ジオキシゲナーゼ活性を有していなければならない。同様に、配列番号４のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号４のＢｐｈＡ２と同様に、ジオキシゲナーゼ活性を有していなければならない。また、配列番号６のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号６のＢｐｈＡ３と同様に、フェレドキシン活性を有していなければならない。また、配列番号８のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号８のＢｐｈＡ４と同様に、フェレドキシン還元活性を有していなければならない。
実施の形態１では、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）、ＢｐｈＡ３（フェレドキシン）、ＢｐｈＡ２およびＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ）を発現させたが、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ２およびＢｐｈＡ１の代わりに他のフェレドキシンおよびジオキシゲナーゼを発現させて、キメラ電子伝達系を構築することで、他の芳香族化合物を変換できるシアノバクテリアを作製することができる。
たとえば、図３において実線で示すように、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）と、ロドコッカス ｓｐ．ＲＨＡ１株由来のＢｐｈＡ３（フェレドキシン）、ＢｐｈＡ２およびＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ）とを発現させるか、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）およびＢｐｈＡ３（フェレドキシン）と、ＲＨＡ１株由来のＢｐｈＡ２およびＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ）とを発現させることで、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用してビフェニル化合物を変換することができるシアノバクテリアを作製することができる。
また、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）と、シュードモナス・プチダＭＬ２株由来のＢｅｄＣ２（フェレドキシン）、ＢｅｄＢおよびＢｅｄＡ（ジオキシゲナーゼ）とを発現させるか、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）およびＢｐｈＡ３（フェレドキシン）と、ＲＨＡ１株由来のＢｅｄＢおよびＢｅｄＡ（ジオキシゲナーゼ）とを発現させることで、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用してベンゼンを変換することができるシアノバクテリアを作製することができる。
また、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）と、シュードモナス・プチダＦ１株由来のＴｏｄＣ２（フェレドキシン）、ＴｏｄＢおよびＴｏｄＡ（ジオキシゲナーゼ）とを発現させるか、ＫＫＳ１０２株由来のＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素）およびＢｐｈＡ３（フェレドキシン）と、Ｆ１株由来のＴｏｄＢおよびＴｏｄＡ（ジオキシゲナーゼ）とを発現させることで、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用してトルエンを変換することができるシアノバクテリアを作製することができる。
（実施の形態２）
図４は、本発明の実施の形態２に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）およびｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）が導入されている。実施の形態２の光合成生物は、ｂｐｈＡ４遺伝子が導入されていない点で実施の形態１の光合成生物と異なる。
図４は、本発明の実施の形態２に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）およびｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）が導入されている。実施の形態２の光合成生物は、ｂｐｈＡ４遺伝子が導入されていない点で実施の形態１の光合成生物と異なる。
実施の形態２のシアノバクテリアは、ビフェニル化合物変換酵素群に含まれる３種類の酵素、すなわちＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ；配列番号２）、ＢｐｈＡ２（ジオキシゲナーゼ；配列番号４）およびＢｐｈＡ３（フェレドキシン；配列番号６）を発現しており、ＢｐｈＡ１／Ａ２によるビフェニル骨格への酸素添加反応（水酸化）によりＰＣＢ（ビフェニル化合物）をジヒドロジオールに変換する。実施の形態２のシアノバクテリアでは、光合成系に由来する電子がＢｐｈＡ４を介さずに供給される。すなわち、光合成系に由来する電子は、ＢｐｈＡ３を経由してＢｐｈＡ１／Ａ２に供給される。
後述する実施例に示されるように、本発明者らの実験によれば、ｂｐｈＡ４遺伝子を導入せずに、ｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子およびｂｐｈＡ３遺伝子のみを導入しても、光合成系に由来する電子を電子の供給源として利用して、ビフェニル化合物を分解しうるシアノバクテリアを作製できることが判明している。これは、ＢｐｈＡ４とは異なるルートでもＢｐｈＡ３およびＢｐｈＡ１／Ａ２に電子が供給されうるためと考えられる。ＢｐｈＡ１（配列番号２）、ＢｐｈＡ２（配列番号４）およびＢｐｈＡ３（配列番号６）を発現するシアノバクテリアは、例えば配列番号１７の塩基配列を有するプラスミドを導入することで作製されうる。
後述する実施例に示されるように、配列番号１７のプラスミドを有するシアノバクテリアの例には、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株が含まれる。ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７４８として、２００９年６月１７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
実施の形態２のシアノバクテリアは、実施の形態１のシアノバクテリアと同様に、貧栄養環境下でもビフェニル化合物を変換することができる。
なお、実施の形態２では、配列番号１、３および５の塩基配列からなる遺伝子を導入したが、ｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子およびｂｐｈＡ３遺伝子として、配列番号２、４および６のアミノ酸配列に対して高い相同性（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子を導入してもよい。
（実施の形態３）
図５は、本発明の実施の形態３に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）、ｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）、ｂｐｈＡ４遺伝子（配列番号７）、ｂｐｈＢ遺伝子（配列番号２６）、ｂｐｈＣ遺伝子（配列番号２８）、ｂｐｈＤ遺伝子（配列番号３０）が導入されている。実施の形態３の光合成生物は、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４遺伝子に加えて、さらにｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子が導入されている点で実施の形態１の光合成生物と異なる。
図５は、本発明の実施の形態３に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）、ｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）、ｂｐｈＡ４遺伝子（配列番号７）、ｂｐｈＢ遺伝子（配列番号２６）、ｂｐｈＣ遺伝子（配列番号２８）、ｂｐｈＤ遺伝子（配列番号３０）が導入されている。実施の形態３の光合成生物は、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４遺伝子に加えて、さらにｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子が導入されている点で実施の形態１の光合成生物と異なる。
実施の形態３のシアノバクテリアは、ビフェニル化合物変換酵素群に含まれる７種類の酵素、すなわちＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ；配列番号２）、ＢｐｈＡ２（ジオキシゲナーゼ；配列番号４）、ＢｐｈＡ３（フェレドキシン；配列番号６）、ＢｐｈＡ４（フェレドキシン還元酵素；配列番号８）、ＢｐｈＢ（ジヒドロゲナーゼ；配列番号２７）、ＢｐｈＣ（環開裂ジオキシゲナーゼ；配列番号２９）およびＢｐｈＤ（加水分解酵素；配列番号３１）を発現している。実施の形態３のシアノバクテリアは、ＢｐｈＡ１／Ａ２によりＰＣＢ（ビフェニル化合物）をジヒドロジオールに変換し、さらにＢｐｈＢ、ＢｐｈＣおよびＢｐｈＤによりジヒドロジオールを安息香酸および２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートにまで変換する（図１参照）。実施の形態３のシアノバクテリアでは、ＮＡＤＨ由来の電子ではなく、ＮＡＤＰＨ由来の電子が供給される。すなわち、光合成により得られたＮＡＤＰＨ由来の電子は、ＢｐｈＡ４およびＢｐｈＡ３を経由してＢｐｈＡ１／Ａ２に供給される。
実施の形態３のシアノバクテリアは、光合成を行って生成された電子を利用して、ＰＣＢなどのビフェニル化合物を安息香酸および２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートにまで変換することができる。これらの分解産物は、毒性が低く、かつ再生可能なエネルギー源として利用可能である。このように、実施の形態３のシアノバクテリアは、貧栄養環境下でもビフェニル化合物を毒性の低い化合物に分解することができる。
なお、実施の形態３では、配列番号１、３、５、７、２６、２８および３０の塩基配列からなる遺伝子を導入したが、ｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＡ４遺伝子、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子およびｂｐｈＤ遺伝子として、配列番号２、４、６、８、２７、２９および３１のアミノ酸配列に対して高い相同性（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子を導入してもよい。
（実施の形態４）
図６は、本発明の実施の形態４に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）、ｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）、ｂｐｈＢ遺伝子（配列番号２６）、ｂｐｈＣ遺伝子（配列番号２８）およびｂｐｈＤ遺伝子（配列番号３０）が導入されている。実施の形態４の光合成生物は、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２およびｂｐｈＡ３遺伝子に加えて、さらにｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子が導入されている点で実施の形態２の光合成生物と異なる。
図６は、本発明の実施の形態４に係る光合成生物（ビフェニル化合物分解シアノバクテリア）を説明するための模式図である。この例では、宿主はシアノバクテリア（例えば、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）であり、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれるｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）、ｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）、ｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）、ｂｐｈＢ遺伝子（配列番号２６）、ｂｐｈＣ遺伝子（配列番号２８）およびｂｐｈＤ遺伝子（配列番号３０）が導入されている。実施の形態４の光合成生物は、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２およびｂｐｈＡ３遺伝子に加えて、さらにｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子が導入されている点で実施の形態２の光合成生物と異なる。
実施の形態４のシアノバクテリアは、ビフェニル化合物変換酵素群に含まれる６種類の酵素、すなわちＢｐｈＡ１（ジオキシゲナーゼ；配列番号２）、ＢｐｈＡ２（ジオキシゲナーゼ；配列番号４）、ＢｐｈＡ３（フェレドキシン；配列番号６）、ＢｐｈＢ（ジヒドロゲナーゼ；配列番号２７）、ＢｐｈＣ（環開裂ジオキシゲナーゼ；配列番号２９）およびＢｐｈＤ（加水分解酵素；配列番号３１）を発現している。実施の形態４のシアノバクテリアは、ＢｐｈＡ１／Ａ２によりＰＣＢ（ビフェニル化合物）をジヒドロジオールに変換し、さらにＢｐｈＢ、ＢｐｈＣおよびＢｐｈＤによりジヒドロジオールを安息香酸および２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートにまで変換する（図１参照）。実施の形態４のシアノバクテリアでは、光合成系に由来する電子がＢｐｈＡ４を介さずに供給される。すなわち、光合成系に由来する電子は、ＢｐｈＡ３を経由してＢｐｈＡ１／Ａ２に供給される。
ＢｐｈＡ１（配列番号２）、ＢｐｈＡ２（配列番号４）、ＢｐｈＡ３（配列番号６）、ＢｐｈＢ（配列番号２７）、ＢｐｈＣ（配列番号２９）およびＢｐｈＤ（配列番号３１）を発現するシアノバクテリアは、例えば配列番号３２の塩基配列を有するプラスミドを導入することで作製されうる。
後述する実施例に示されるように、配列番号３２のプラスミドを有するシアノバクテリアの例には、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株が含まれる。ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４８として、２０１０年１月１５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
実施の形態４のシアノバクテリアは、実施の形態３のシアノバクテリアと同様に、貧栄養環境下でもビフェニル化合物を毒性の低い化合物に分解することができる。
なお、実施の形態４では、配列番号１、３、５、２６、２８および３０の塩基配列からなる遺伝子を導入したが、ｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子およびｂｐｈＤ遺伝子として、配列番号２、４、６、２７、２９および３１のアミノ酸配列に対して高い相同性（８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子を導入してもよい。
以上のように、本発明の光合成生物は、光合成を行って生成されたＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを利用して芳香族化合物を分解することができるため、貧栄養環境下でも芳香族化合物を分解することができる。本発明の光合成生物は、貧栄養環境下における芳香族化合物汚染のバイオレメディエーションに適用可能である。
２．本発明の分解方法
本発明の光合成生物を芳香族化合物に接触させることで、その芳香族化合物を分解することができる。したがって、本発明の光合成生物を利用することによって、環境中に含まれるＰＣＢなどの芳香族化合物を分解して、環境浄化処理（バイオレメディエーション）を行うことができる。
本発明の光合成生物を芳香族化合物に接触させることで、その芳香族化合物を分解することができる。したがって、本発明の光合成生物を利用することによって、環境中に含まれるＰＣＢなどの芳香族化合物を分解して、環境浄化処理（バイオレメディエーション）を行うことができる。
本発明の光合成生物は、様々なバイオレメディエーション技術に適用されうる。浄化処理対象の環境の例には、水域、土壌、汚泥、空気が含まれる。本発明の分解方法（環境浄化方法）は、閉鎖系で行われてもよいし、開放系で行われてもよい。
たとえば、汚染水に含まれる汚染物質を本発明の光合成生物により分解する場合は、本発明の光合成生物（例えば、シアノバクテリア）を処理対象の水域に直接導入してもよいし、本発明の光合成生物を入れた培養槽に汚染水を導入してもよい。このとき、汚染水のｐＨや塩濃度、温度、汚染物質の濃度などを予め調整しておくことが好ましい。培養槽に汚染水を導入する場合は、汚染水を連続して培養槽に導入してもよいし、バッチ式で導入してもよい。
また、汚染土壌または汚泥に含まれる汚染物質を本発明の光合成生物により分解する場合は、本発明の光合成生物（例えば、シアノバクテリア）を処理対象の土壌または汚泥に直接導入してもよいし、本発明の光合成生物を担持させた担体を充填した反応槽に汚染土壌または汚泥を導入してもよい。
また、汚染空気に含まれる汚染物質を本発明の光合成生物により分解する場合は、本発明の光合成生物（例えば、シアノバクテリア）を入れた培養槽に汚染空気を導入すればよい。このとき、汚染空気を連続して培養槽に導入してもよいし、バッチ式で導入してもよい。
以上のように、本発明の光合成生物を芳香族化合物に接触させることで、その芳香族化合物を分解することができる。前述の通り、本発明の光合成生物は、独立栄養生物であり、貧栄養環境下でも芳香族化合物を分解することができる。したがって、本発明の分解方法（環境浄化方法）は、芳香族化合物を低コストで効率的に分解することができる。
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
［実施例１］
本実施例では、シアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）に、アシドボラクス（シュードモナス） ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子およびｂｐｈＡ４遺伝子（野生型または変異型）を導入した例を示す。
本実施例では、シアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）に、アシドボラクス（シュードモナス） ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子およびｂｐｈＡ４遺伝子（野生型または変異型）を導入した例を示す。
１．プラスミドの構築
ＰＣＲは、東洋紡績株式会社のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）および株式会社アステックのサーマルサイクラー（ＰＣ−３２０）を用いて行った。ＤＮＡ断片の連結には、タカラバイオ株式会社のＤＮＡライゲーションキット（DNA Ligation Kit <Mighty Mix>）を用いた。
ＰＣＲは、東洋紡績株式会社のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）および株式会社アステックのサーマルサイクラー（ＰＣ−３２０）を用いて行った。ＤＮＡ断片の連結には、タカラバイオ株式会社のＤＮＡライゲーションキット（DNA Ligation Kit <Mighty Mix>）を用いた。
（１）ｐＣＡ１２
プラスミドｐＫＨ２０（非特許文献２参照）からｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＳａｌＩ部位間に挿入してプラスミドｐＣＡ１を構築した。同様に、プラスミドｐＫＨ２０からｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＳａｌＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＣＡ２を構築した。プラスミドｐＣＡ１を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＡ１遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＡ２のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＣＡ１２を構築した（図７参照）。
プラスミドｐＫＨ２０（非特許文献２参照）からｂｐｈＡ１遺伝子（配列番号１）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＳａｌＩ部位間に挿入してプラスミドｐＣＡ１を構築した。同様に、プラスミドｐＫＨ２０からｂｐｈＡ２遺伝子（配列番号３）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＳａｌＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＣＡ２を構築した。プラスミドｐＣＡ１を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＡ１遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＡ２のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＣＡ１２を構築した（図７参照）。
（２）ｐＵＪＫ６８−Ａ１２３
シネコシスチス ｓｐ．（Synechocystis sp.）ＰＣＣ６８０３株の染色体ＤＮＡから、ｐｓｂＥ、ｐｓｂＦ、ｐｓｂＬおよびｐｓｂＪ遺伝子を含む１０３３ｂｐの領域およびその下流１０５３ｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。得られたＤＮＡ断片をカナマイシン耐性遺伝子カセットを含むＤＮＡ断片と共に、プラスミドｐＵＣ１１８のＨｉｎｄIII部位−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＪＫ６８を構築した。プラスミドｐＣＡ３（Kimura, S., Kikuchi, A. Senda, T., Shiro, Y. and Fukuda, M., "Tolerance of the rieske-type [2Fe-2S] cluster in recombinant ferredoxin BphA3 from Pseudomonas sp. KKS102 to histidine ligand mutations", Biochem. J., Vol.388, p.869-878.参照）からｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＪＫ６８のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ３を構築した。前述のプラスミドｐＣＡ１２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ３のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３を構築した（図８参照）。
シネコシスチス ｓｐ．（Synechocystis sp.）ＰＣＣ６８０３株の染色体ＤＮＡから、ｐｓｂＥ、ｐｓｂＦ、ｐｓｂＬおよびｐｓｂＪ遺伝子を含む１０３３ｂｐの領域およびその下流１０５３ｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。得られたＤＮＡ断片をカナマイシン耐性遺伝子カセットを含むＤＮＡ断片と共に、プラスミドｐＵＣ１１８のＨｉｎｄIII部位−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＪＫ６８を構築した。プラスミドｐＣＡ３（Kimura, S., Kikuchi, A. Senda, T., Shiro, Y. and Fukuda, M., "Tolerance of the rieske-type [2Fe-2S] cluster in recombinant ferredoxin BphA3 from Pseudomonas sp. KKS102 to histidine ligand mutations", Biochem. J., Vol.388, p.869-878.参照）からｂｐｈＡ３遺伝子（配列番号５）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＪＫ６８のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ３を構築した。前述のプラスミドｐＣＡ１２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ３のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３を構築した（図８参照）。
（３）ｐＶＥＡ１２３４
前述のＰＣＣ６８０３株の染色体ＤＮＡから、ｐｓｂＥ遺伝子のプロモーター領域（３３５ｂｐ）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＺ３２１のＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＰ３２１（配列番号１３）を構築した。このとき、ＨｉｎｄIII部位−ＳｍａＩ部位間にＢａｍＨＩ部位を設けたＤＮＡ断片を挿入した。プラスミドｐＫＨ２０４（非特許文献２参照）からｂｐｈＡ４遺伝子（配列番号７）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＡ４を構築した。前述のプラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３からｂｐｈＡ１遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ）およびｂｐｈＡ３遺伝子の下流のターミネータ領域を含む領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＡ４のＢａｍＨＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＡ１２３４（配列番号１４）を構築した（図９参照）。
前述のＰＣＣ６８０３株の染色体ＤＮＡから、ｐｓｂＥ遺伝子のプロモーター領域（３３５ｂｐ）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＺ３２１のＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＰ３２１（配列番号１３）を構築した。このとき、ＨｉｎｄIII部位−ＳｍａＩ部位間にＢａｍＨＩ部位を設けたＤＮＡ断片を挿入した。プラスミドｐＫＨ２０４（非特許文献２参照）からｂｐｈＡ４遺伝子（配列番号７）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＡ４を構築した。前述のプラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３からｂｐｈＡ１遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ）およびｂｐｈＡ３遺伝子の下流のターミネータ領域を含む領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＡ４のＢａｍＨＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＡ１２３４（配列番号１４）を構築した（図９参照）。
（４）ｐＫＱ１７５Ｋ１７７
プラスミドｐＫＨ２０４からプライマー１（配列番号１８）とプライマー２（配列番号１９）のセット、およびプライマー３（配列番号２０）とプライマー４（配列番号２１）のセットを用いて２種類の遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。プライマー２は、ＢｐｈＡ４タンパク質の１７５位のグルタミン酸をグルタミンに変換し、１７７位のグルタミンをリシンに変換する変異を含むプライマーである。次いで、得られた２種類のＤＮＡ断片の混合物を鋳型ＤＮＡとして、プライマー１とプライマー４のセットを用いてＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７Ｋ；配列番号９）を含むプラスミドｐＫＱ１７５Ｋ１７７を構築した（図１０参照）。
プラスミドｐＫＨ２０４からプライマー１（配列番号１８）とプライマー２（配列番号１９）のセット、およびプライマー３（配列番号２０）とプライマー４（配列番号２１）のセットを用いて２種類の遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。プライマー２は、ＢｐｈＡ４タンパク質の１７５位のグルタミン酸をグルタミンに変換し、１７７位のグルタミンをリシンに変換する変異を含むプライマーである。次いで、得られた２種類のＤＮＡ断片の混合物を鋳型ＤＮＡとして、プライマー１とプライマー４のセットを用いてＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７Ｋ；配列番号９）を含むプラスミドｐＫＱ１７５Ｋ１７７を構築した（図１０参照）。
（５）ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ
プラスミドｐＫＱ１７５Ｋ１７７からｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７Ｋ）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子を含むプラスミドｐＶＥＡ４ＱＫを構築した。プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３からｂｐｈＡ１遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ）およびｂｐｈＡ３遺伝子の下流のターミネータ領域を含む領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。この断片をプラスミドｐＶＥＡ４ＱＫのＢａｍＨＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７Ｋ）を含むプラスミドｐＶＥＡ１２３４ＱＫ（配列番号１５）を構築した（図１１参照）。
プラスミドｐＫＱ１７５Ｋ１７７からｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７Ｋ）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子を含むプラスミドｐＶＥＡ４ＱＫを構築した。プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３からｂｐｈＡ１遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ）およびｂｐｈＡ３遺伝子の下流のターミネータ領域を含む領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。この断片をプラスミドｐＶＥＡ４ＱＫのＢａｍＨＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７Ｋ）を含むプラスミドｐＶＥＡ１２３４ＱＫ（配列番号１５）を構築した（図１１参照）。
（６）ｐＫＣ１７５Ｇ１７７
プラスミドｐＫＨ２０４からプライマー１（配列番号１８）とプライマー５（配列番号２２）のセット、およびプライマー６（配列番号２３）とプライマー４（配列番号２１）のセットを用いて２種類の遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。プライマー５は、ＢｐｈＡ４タンパク質の１７５位および１７７位のアミノ酸をランダムに変換する変異を含むプライマーである。配列番号２２の塩基配列中のＮは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの混合塩基を意味する。次いで、得られた２種類のＤＮＡ断片の混合物を鋳型ＤＮＡとして、プライマー１とプライマー４のセットを用いてＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することにより、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｘ／Ｑ１７７Ｘ）を含むプラスミドｐＫＸ１７５Ｘ１７７を有する大腸菌ライブラリーＪＭ１０９／ｐＫＸ１７５Ｘ１７７ライブラリーを作製した。
プラスミドｐＫＨ２０４からプライマー１（配列番号１８）とプライマー５（配列番号２２）のセット、およびプライマー６（配列番号２３）とプライマー４（配列番号２１）のセットを用いて２種類の遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。プライマー５は、ＢｐｈＡ４タンパク質の１７５位および１７７位のアミノ酸をランダムに変換する変異を含むプライマーである。配列番号２２の塩基配列中のＮは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの混合塩基を意味する。次いで、得られた２種類のＤＮＡ断片の混合物を鋳型ＤＮＡとして、プライマー１とプライマー４のセットを用いてＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することにより、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｘ／Ｑ１７７Ｘ）を含むプラスミドｐＫＸ１７５Ｘ１７７を有する大腸菌ライブラリーＪＭ１０９／ｐＫＸ１７５Ｘ１７７ライブラリーを作製した。
ＪＭ１０９／ｐＫＸ１７５Ｘ１７７ライブラリー２００μＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、３７℃で一晩培養した。形成されたコロニーを２×ＹＴ−アンピシリン培地１ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養した。菌体を含む培地５μＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植え継ぎ、１.５時間培養した。次いで、ＩＰＴＧを終濃度が０.２ｍＭになるように添加し、さらに１６時間振とう培養した。遠心分離して集菌し、上清を取り除いた。大腸菌細胞溶解試薬（CelLytic B；シグマアルドリッチ社）１００μＬを加え、３７℃で１５分間静置した。遠心分離し、上清を回収して、粗抽出画分を得た。
得られた粗抽出画分を用いてフェリシアン化カリウム（Ｋ３[Ｆｅ(ＣＮ)６]）の還元に伴う４２０ｎｍの吸光度の減少をマイクロプレートリーダー（Model 680；Bio-Rad Laboratories社）で測定することにより、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからの電子の受け渡しを測定した。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する速度は、フェリシアン化カリウムの濃度を十分な濃度である１.５ｍＭに固定し、１ｍＭのＥＤＴＡおよび２％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）中で測定した。フェリシアン酸イオン（Ｆｅ(ＣＮ)６ ３−）は酵素非存在下でもピリジンヌクレオチドがあるとわずかに還元されるため、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨによるフェリシアン酸イオンの還元速度を測定し、酵素反応の定常状態速度から差し引くことで真の酵素活性速度を算出した。ＮＡＤＰＨに対する速度をＮＡＤＨに対する速度で割った比を特異性の値とした。この解析で最もＮＡＤＰＨ特異性が高い値を示した大腸菌株よりプラスミドを抽出し、１７５位および１７７位のアミノ酸をコードする塩基配列を決定し、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｃ／Ｑ１７７Ｇ；配列番号１１）を含むプラスミド、ｐＫＣ１７５Ｇ１７７を得た。
（７）ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ
プラスミドｐＫＣ１７５Ｇ１７７からｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｃ／Ｑ１７７Ｇ）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子を含むプラスミドｐＶＥＡ４ＣＧを構築した。プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３からｂｐｈＡ１遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ）およびｂｐｈＡ３遺伝子の下流のターミネータ領域を含む領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。この断片をプラスミドｐＶＥＡ４ＣＧのＢａｍＨＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｃ／Ｑ１７７Ｇ）を含むプラスミドｐＶＥＡ１２３４ＣＧ（配列番号１６）を構築した。
プラスミドｐＫＣ１７５Ｇ１７７からｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｃ／Ｑ１７７Ｇ）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子を含むプラスミドｐＶＥＡ４ＣＧを構築した。プラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３からｂｐｈＡ１遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ）およびｂｐｈＡ３遺伝子の下流のターミネータ領域を含む領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。この断片をプラスミドｐＶＥＡ４ＣＧのＢａｍＨＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入して、ｂｐｈＡ４変異体遺伝子（Ｅ１７５Ｃ／Ｑ１７７Ｇ）を含むプラスミドｐＶＥＡ１２３４ＣＧ（配列番号１６）を構築した。
（８）ｐＶＥＡ１２３
前述のプラスミドｐＣＡ１２のＮｄｅＩ部位−ＰｖｕII部位間のＤＮＡ断片と、前述のプラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３のＰｖｕII部位−ＳｐｈＩ部位間のＤＮＡ断片を、前述のプラスミドｐＶＥＡ１２３４のＮｄｅＩ部位−ＳｐｈＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＡ１２３（配列番号１７）を構築した（図１２参照）。
前述のプラスミドｐＣＡ１２のＮｄｅＩ部位−ＰｖｕII部位間のＤＮＡ断片と、前述のプラスミドｐＵＪＫ６８−Ａ１２３のＰｖｕII部位−ＳｐｈＩ部位間のＤＮＡ断片を、前述のプラスミドｐＶＥＡ１２３４のＮｄｅＩ部位−ＳｐｈＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＶＥＡ１２３（配列番号１７）を構築した（図１２参照）。
２．シアノバクテリアの形質転換
（１）形質転換
Zinchenkoらの方法（Zinchenko, V.V., Piven, I.V., Melnik, V.A. and Shestakov, S.V., "Vectors for the complementation analysis of cyanobacterial mutants", Russian Journal of Genetics, Vol.35, p.291-296.）を参考にして、接合伝達を利用してシアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）の形質転換を行った。
（１）形質転換
Zinchenkoらの方法（Zinchenko, V.V., Piven, I.V., Melnik, V.A. and Shestakov, S.V., "Vectors for the complementation analysis of cyanobacterial mutants", Russian Journal of Genetics, Vol.35, p.291-296.）を参考にして、接合伝達を利用してシアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）の形質転換を行った。
まず、一晩振とう培養したレシピエント大腸菌（プラスミドｐＶＥＰ、ｐＶＥＡ１２３４、ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ、ｐＶＥＡ１２３４ＣＧまたはｐＶＥＡ１２３のいずれかを保有）およびドナー大腸菌（プラスミドＲ７５１を保有）０.１ｍＬを滅菌水で３回洗浄した。また、７〜８日間培養したＰＣＣ６８０３株をＢＧ１１培地で３回洗浄した。洗浄は、菌体を５０μＬの洗浄液（滅菌水またはＢＧ１１培地）に懸濁した後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、室温、５分間）を行い、抗生物質を完全に洗い流すことで行った。
洗浄後、各菌体を５０μＬの滅菌水に懸濁し、混合した。ＢＧ１１寒天培地（５％のＬＢ培地含有）上に置いたニトロセルロースメンブレン（Millipore社）の上に混合した菌体を乗せ、３０℃、弱光条件下（〜１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）で一晩培養した。ニトロセルロースメンブレンをマイクロチューブ（容量１.５ｍＬ）内に移し、１００μＬのＢＧ１１培地を加え、撹拌した後、チューブ内のＢＧ１１培地をＢＧ１１寒天培地（２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有）に塗布した。３０℃、弱光条件下（〜１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）で培養し、形質転換体を選抜した。
以下、上記の手順により、プラスミドｐＶＥＰ３２１を導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株」と称し、プラスミドｐＶＥＡ１２３４を導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株」と称し、プラスミドｐＶＥＡ１２３４ＱＫを導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株」と称し、プラスミドｐＶＥＡ１２３４ＣＧを導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株」と称し、プラスミドｐＶＥＡ１２３を導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株」と称する。なお、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株は、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７４４、ＮＩＴＥ Ｐ−７４５、ＮＩＴＥ Ｐ−７４６、ＮＩＴＥ Ｐ−７４７、ＮＩＴＥ Ｐ−７４８として、２００９年６月１７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
（２）タンパク質の抽出
以下の手順により、各形質転換体（ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４４）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６））からタンパク質を抽出した。
以下の手順により、各形質転換体（ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４４）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６））からタンパク質を抽出した。
まず、培養液５０ｍＬを遠心分離（６０００ｒｐｍ、室温、８分間）して菌体を回収した。得られた菌体を１ｍＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＮ３）に素早く懸濁した。懸濁液を再度同じ条件で遠心分離し、上清を取り除いて得た菌体を−８０℃で保存した。
氷上でゆっくりと溶かした菌体を２５０μＬのＴＧＥバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブ（容量１.５ｍＬ）内に移した。マイクロチューブ内に０.２ｇのガラスビーズ（直径０.１ｍｍ；BioSpec Products社）を加え、アタッチメント（TurboMix）を装着したボルテックス・ミキサー（Vortex-Genie 2；Scientific Industries社）にマイクロチューブをセットした。スケール８で２分間破壊した後、２分間静置という操作を５回繰り返し、細胞を破壊した。この作業は４℃の冷蔵庫内で行った。細胞を破壊した後、懸濁液を遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、上清を回収した。回収した上清をさらに同じ条件で遠心分離して上清を回収し、−３０℃で保存した。上清（シアノバクテリアの全タンパク質を含有）は、使用時に氷上で緩やかに溶解した。
（３）ウェスタンブロット
ウェスタンブロット法で、各形質転換体から抽出したタンパク質に目的のタンパク質（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ４）が含まれているか否かを確認した。
ウェスタンブロット法で、各形質転換体から抽出したタンパク質に目的のタンパク質（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ４）が含まれているか否かを確認した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを終了した後、濃縮ゲルを取り除き、分離ゲルをカソードバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０.４）、２０％メタノール、２０ｍＭ ６−アミノ−ｎ−カプロン酸、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１０.０に調整）に３０分間浸漬した。このとき、分離ゲル、分離ゲルよりも数ミリ大きいメンブレン（Hybond ECL nitrocellulose membrane；Amersham Bioscience社）１枚、および濾紙（３ＭＭ Ｃｈｒ；Whatman社）２枚を同時にカソードバッファーに浸漬した。また、分離ゲルよりも数ミリ大きい濾紙４枚を別個に用意し、そのうちの２枚をアノードバッファーＮｏ.１（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０.４）、２０％メタノール）に、別の２枚をアノードバッファーＮｏ.２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０.４）、２０％メタノール）に浸漬した。ゲルの平衡化を終えた後、ブロッティング装置に濾紙およびメンブレンを空気が入らないように積み重ね、メンブレンの面積（ｃｍ３）×３ｍＡ（最高電圧６０Ｖ）で６０分間ブロッティングした。
ブロッティングを終了した後、タンパク質転写面を上にしてメンブレンをブロッキングバッファー（５％スキムミルク（雪印乳業株式会社）を含むＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、塩酸でｐＨ８.０に調整））に浸漬し、卓上小型振とう機（ＰＲ−２４；タイテック株式会社）を用いてゆっくりと振とうさせながら１時間以上ブロッキングした。
以下の操作は、すべてメンブレンのタンパク質転写面を上にし、室温で行った。メンブレンの大きさに合うようにパラフィルムで船型の容器を作製し、そこにブロッキングバッファー（５〜１０ｍＬ）を加えた。そこに、１次抗体（抗ＢｐｈＡ１抗体、抗ＢｐｈＡ２抗体、抗ＢｐｈＡ３抗体または抗ＢｐｈＡ４抗体；いずれもウサギＩｇＧ）を添加して軽く攪拌した後、ブロッキングを終えたメンブレンを浸漬し、卓上小型振とう機で１時間以上振とうさせながら反応させた。メンブレンを適当な大きさのタッパに移し、約８０ｍＬのＴＢＳ−Ｔでメンブレンを３回軽く洗浄した後、同量のＴＢＳ−Ｔで１５分間卓上小型振とう機でゆっくりと振とうさせながら洗浄した。この操作を３回繰り返した。その後、１次抗体を反応させた手順と同様に、ブロッキングバッファーに希釈した２次抗体（ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体；ＮＡ９３４Ｖ；Amersham Bioscience社）にメンブレンを３０分以上浸漬して反応させた。反応後、１次抗体の反応後と同様に洗浄した。シグナルの検出は、「ECL Western blotting detection reagents and analysis system」のプロトコール（Amersham Bioscience社）に従って行った。
図１３は、ウェスタンブロットの結果を示す写真である。レーン１は、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４４）の結果を示し、レーン２は、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）の結果を示し、レーン３は、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６）の結果を示す。この結果から、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（レーン２）およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（レーン３）から抽出したタンパク質にＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３およびＢｐｈＡ４が含まれていることがわかる。したがって、これらの株に各遺伝子が正常に導入され、発現していることがわかる。
３．光依存的発現量の解析
（１）菌体の回収
ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）をＢＧ１１培地に植菌し、３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の連続光を照射して７日間培養した後、暗条件で１２時間培養し、再び３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の連続光を照射して培養した。図１４Ａに示すように、暗条件にする３時間前（Ｌ１）、暗条件開始時（Ｌ２）、暗条件にしてから６時間後（Ｄ３）、暗条件にしてから１２時間後（Ｄ４）、照射を再開してから１時間後（Ｌ５）、照射を再開してから３時間後（Ｌ６）の各ポイントで菌体を回収した。回収した各菌体を１ｍＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＮ３）に素早く懸濁した。懸濁液を再度同じ条件で遠心分離し、上清を取り除いて得た菌体を−８０℃で保存した。
（１）菌体の回収
ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）をＢＧ１１培地に植菌し、３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の連続光を照射して７日間培養した後、暗条件で１２時間培養し、再び３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の連続光を照射して培養した。図１４Ａに示すように、暗条件にする３時間前（Ｌ１）、暗条件開始時（Ｌ２）、暗条件にしてから６時間後（Ｄ３）、暗条件にしてから１２時間後（Ｄ４）、照射を再開してから１時間後（Ｌ５）、照射を再開してから３時間後（Ｌ６）の各ポイントで菌体を回収した。回収した各菌体を１ｍＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＮ３）に素早く懸濁した。懸濁液を再度同じ条件で遠心分離し、上清を取り除いて得た菌体を−８０℃で保存した。
（２）ｂｐｈＡ４遺伝子の転写量の測定
（ＲＮＡの抽出）
氷上でゆっくりと溶かした菌体を５００μＬのＬＥＴバッファー（１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５））に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブ（容量１.５ｍＬ）内に移した。懸濁液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、菌体を回収した。回収した菌体を１３０μＬのＬＥＴバッファーに菌体の固まりが無くなるまで注意深く懸濁した。
（ＲＮＡの抽出）
氷上でゆっくりと溶かした菌体を５００μＬのＬＥＴバッファー（１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５））に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブ（容量１.５ｍＬ）内に移した。懸濁液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、菌体を回収した。回収した菌体を１３０μＬのＬＥＴバッファーに菌体の固まりが無くなるまで注意深く懸濁した。
得られた懸濁液に、ＴＥ１０−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）に溶解させたリゾチーム溶液（８０ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ加えた。ボルテックス・ミキサーで１秒間攪拌した後（スケール４）、氷上に１時間静置した。１時間後、ボルテックス・ミキサーで１秒間攪拌した後（スケール４）、ＬＥＴバッファー（１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１％ ＳＤＳ）を加え、チューブを８回上下逆さまにして緩やかに混ぜた。その後、予め６５℃に保温しておいた６５０μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノールを加え、６５℃で１分間保温した後、３０秒間に８回のペースで転倒混和した。これを８回繰り返した。得られた混合液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、上層を新しいチューブに移した。上層を移した新しいチューブに５００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノールを加え、よく撹拌した後、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した。再び上層を新しいチューブに移し、さらに同条件で遠心分離してフェノールを完全に除去した上清を得た。
得られた溶液に１／１０容量の２Ｍ ＬｉＣｌ溶液と等量の２−プロパノールを加え、−３０℃で３０分間以上静置した後、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。沈殿物を８０％エタノールで洗浄した後、再び遠心した。沈殿物を軽く乾燥させた後、４０μＬのＲＮａｓｅフリーの超純水に溶解させた。完全に溶解させるために、６０℃で３分間保温した後、ボルテックス・ミキサーで５秒間攪拌（スケール８）する操作を２回繰り返した。得られたＲＮＡ溶液１００μｇにＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ Ｉ（１５ユニット；タカラバイオ株式会社）を加え、３７℃で３０分間処理して混入しているゲノムＤＮＡを完全に分解した。その後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）処理、およびクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）処理を行った。回収した上清に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液および２倍容量のエタノールを添加してエタノール沈殿処理を行い、ＲＮＡを回収した。
（逆転写反応）
回収したＲＮＡ１μｇに、５×First-Strand Buffer（PowerScript Reverse Transcriptase（Clontech）に付属）を４μＬ、リバースプライマー（１ｐｍｏｌ／μＬ；配列番号２４）を２μＬ加え、さらに全液量が１６μＬとなるようにＲＮａｓｅフリーの超純水を加えた。７０℃で１０分間保温した後、４２℃の恒温槽の中で１０分間保温して、プライマーをＲＮＡにアニーリングさせた。次に、０.１Ｍ ＤＴＴ（PowerScript Reverse Transcriptase に付属）を２μＬ、２０ｍＭ ｄＮＴＰｓを１μＬ, PowerScript Reverse Transcriptaseを１μＬ加え、４２℃で６０分間反応（逆転写反応）させた。６０分後、７０℃で１５分間保温して逆転写酵素を失活させた後、氷中で２分間以上静置して溶液を冷却した。その後、ＲＮａｓｅ Ｈ（２ユニット；タカラバイオ株式会社）を加え、３７℃で２０分間反応させて、定量ＲＴ−ＰＣＲ反応用のｃＤＮＡ溶液１μＬを得た。
回収したＲＮＡ１μｇに、５×First-Strand Buffer（PowerScript Reverse Transcriptase（Clontech）に付属）を４μＬ、リバースプライマー（１ｐｍｏｌ／μＬ；配列番号２４）を２μＬ加え、さらに全液量が１６μＬとなるようにＲＮａｓｅフリーの超純水を加えた。７０℃で１０分間保温した後、４２℃の恒温槽の中で１０分間保温して、プライマーをＲＮＡにアニーリングさせた。次に、０.１Ｍ ＤＴＴ（PowerScript Reverse Transcriptase に付属）を２μＬ、２０ｍＭ ｄＮＴＰｓを１μＬ, PowerScript Reverse Transcriptaseを１μＬ加え、４２℃で６０分間反応（逆転写反応）させた。６０分後、７０℃で１５分間保温して逆転写酵素を失活させた後、氷中で２分間以上静置して溶液を冷却した。その後、ＲＮａｓｅ Ｈ（２ユニット；タカラバイオ株式会社）を加え、３７℃で２０分間反応させて、定量ＲＴ−ＰＣＲ反応用のｃＤＮＡ溶液１μＬを得た。
（定量ＲＴ−ＰＣＲ）
定量ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Bio-Rad Laboratories社のサーマルサイクラー（iCycler）を用いて行った。１μＬのｃＤＮＡ溶液、１μＬの２０ｐＭフォワードプライマー（配列番号２５）、１μＬの２０ｐＭリバースプライマー（配列番号２４）、１５μＬのiQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratories社）および１２μＬの滅菌済み超純水を、互いに混ざらないようにマイクロチューブ（容量０.６ｍＬ）内に入れた。反応直前に各溶液を混合し、サーマルサイクラーにセットするまでは氷上に置いて反応を停止させた。
定量ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Bio-Rad Laboratories社のサーマルサイクラー（iCycler）を用いて行った。１μＬのｃＤＮＡ溶液、１μＬの２０ｐＭフォワードプライマー（配列番号２５）、１μＬの２０ｐＭリバースプライマー（配列番号２４）、１５μＬのiQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratories社）および１２μＬの滅菌済み超純水を、互いに混ざらないようにマイクロチューブ（容量０.６ｍＬ）内に入れた。反応直前に各溶液を混合し、サーマルサイクラーにセットするまでは氷上に置いて反応を停止させた。
ＰＣＲ反応は以下のプログラムで行った。なお、今回使用したSYBR Greenは、ＤＮＡの２本鎖中で蛍光を発することから、７２℃の伸長ステップ（サイクル２のステップ３）の時にシグナルを検出した。
サイクル１（１回）
・ステップ１：９５℃、３０秒間
サイクル２（４０回）
・ステップ１：９５℃、３０秒間
・ステップ２：６１℃、３０秒間
・ステップ３：７２℃、３０秒間
サイクル１（１回）
・ステップ１：９５℃、３０秒間
サイクル２（４０回）
・ステップ１：９５℃、３０秒間
・ステップ２：６１℃、３０秒間
・ステップ３：７２℃、３０秒間
反応後、増幅の特異性を調べるため、５５℃で１０秒間保温した後、１０秒ごとに０.５℃間隔で９４℃まで上昇させ、各温度で１０秒間保温する際のシグナル強度を測定して解離曲線を作成した。また、転写量を相対的に比較するため、暗条件にする３時間前（Ｌ１）のサンプルのｃＤＮＡを希釈（１〜１×１０−４または１×５−４）し、同じ手順でＰＣＲ反応を行って検量線を作成した。得られた検量線より、各サンプルの相対転写量を求めた。なお、それぞれの実験では、１つのサンプルにつき３つの反応液を調製し、それらから得られた測定値の平均値を計算に用いた。また、逆転写反応をしていないＲＮＡについても同じ手順でＰＣＲ反応を行い、シグナルが検出されないこと（ゲノムＤＮＡが混入していないこと）を毎回確認した。
図１４Ｂは、各ポイント（Ｌ１〜Ｌ６）におけるｂｐｈＡ４遺伝子の転写量を示すグラフである。それぞれの値は、Ｌ１の転写量を１００としたときの相対値である。このグラフからわかるように、ｐｓｂＥ遺伝子のプロモーター領域の下流にｂｐｈＡ４遺伝子を繋げているため、ｂｐｈＡ４遺伝子の転写は明条件のときに活発に行われていることがわかる。
（３）ＢｐｈＡ３タンパク質およびＢｐｈＡ４タンパク質の量の測定
（タンパク質の抽出）
前述の「２．シアノバクテリアの形質転換」の「（２）タンパク質の抽出」および「（３）ウェスタンブロット」と同様の手順で、各ポイント（Ｌ１〜Ｌ６）におけるＢｐｈＡ３タンパク質およびＢｐｈＡ４タンパク質の量を測定した。
（タンパク質の抽出）
前述の「２．シアノバクテリアの形質転換」の「（２）タンパク質の抽出」および「（３）ウェスタンブロット」と同様の手順で、各ポイント（Ｌ１〜Ｌ６）におけるＢｐｈＡ３タンパク質およびＢｐｈＡ４タンパク質の量を測定した。
図１５は、各ポイント（Ｌ１〜Ｌ６）におけるウェスタンブロットの結果を示す写真である。「Ｍ」は分子量マーカー（２０.１ｋＤａ、２９.０ｋＤａ、４５.０ｋＤａ、６６.４ｋＤａおよび９７.２ｋＤａ）を示す。この写真からわかるように、明条件および暗条件に関係なくＢｐｈＡ３タンパク質およびＢｐｈＡ４タンパク質が存在することがわかる。また、図１４Ｂおよび図１５のグラフから、ｐｓｂＥ遺伝子のプロモーター領域の下流に導入した各遺伝子は明条件下で転写および翻訳されるが、生成したタンパク質は暗条件下でも分解されずに残っていることがわかる。
４．ビフェニル分解能の測定
（１）ビフェニル減少量の測定
各形質転換体（ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４４）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４７）およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４８））をビフェニル存在下で培養し、ビフェニルの減少量を測定した。
（１）ビフェニル減少量の測定
各形質転換体（ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４４）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４７）およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４８））をビフェニル存在下で培養し、ビフェニルの減少量を測定した。
遠心して集めた菌体（ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株またはＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株）を、ＯＤ６６０が４になるようにＢＧ１１培地に懸濁した。懸濁液をガラス瓶中に５００μＬ入れ、３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の光を照射して３０℃で１５分間前培養を行った。５０ｎｍｏｌのビフェニルを加えた後、さらに任意の時間培養し、３Ｎ ＨＣｌを３.５μＬ加えて反応を停止させた。内部標準として５０ｎｍｏｌのフェナントレンを加えた。飽和量の塩化ナトリウムおよび１.２ｍＬの酢酸エチルを加えた後、１分間激しく混合した。酢酸エチル層を１ｍＬ回収し、硫酸ナトリウムで脱水処理した。遠心分離後の上清８００μＬを回収し、エバポレーターにより乾固させた。得られた固形物を１００μＬの酢酸エチルに懸濁し、１μＬをガスクロマトグラフィーに供し、ビフェニルの残存量を求めた。
図１６は、各形質転換体の培養時間とビフェニルの残存量との関係を示すグラフである。このグラフから、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４を有していないＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＰ３２１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４４）は、ビフェニルをほとんど分解できないことがわかる。一方、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４５）、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６）およびＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＣＧ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４７）は、ビフェニルを分解していることがわかる。特に、変異型のｂｐｈＡ４遺伝子を有するＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株は、野生型のｂｐｈＡ４遺伝子を有するＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４株よりもよりビフェニル分解能が高いことがわかる。また、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４８）もビフェニルを分解していることがわかる。このことから、ＢｐｈＡ３およびＢｐｈＡ１／Ａ２のみでも（ＢｐｈＡ４が無くても）ビフェニルを分解することが可能であり、ＢｐｈＡ４とは異なるルートでも電子が供給されうることがわかる。
（２）水酸化ビフェニルの検出
ビフェニルの減少が各形質転換体によるビフェニルの分解によるものであるか否かを調べるために、ＢｐｈＡ１／Ａ２（ジオキシゲナーゼ複合体）の作用により水酸化ビフェニルが生成されているか否かを調べた。
ビフェニルの減少が各形質転換体によるビフェニルの分解によるものであるか否かを調べるために、ＢｐｈＡ１／Ａ２（ジオキシゲナーゼ複合体）の作用により水酸化ビフェニルが生成されているか否かを調べた。
遠心して集めた菌体（ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３４ＱＫ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４６））を、ＯＤ６６０が４になるようにＢＧ１１培地に懸濁した。懸濁液をガラス瓶中に５００μＬ入れ、３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の光を照射して３０℃で１５分間前培養を行った。５０ｎｍｏｌのビフェニルを加えた後、さらに任意の時間培養し、３Ｎ ＨＣｌを３.５μＬ加えて反応を停止させた。内部標準として５０ｎｍｏｌのフェナントレンを加えた。飽和量の塩化ナトリウムおよび１.２ｍＬの酢酸エチルを加えた後、１分間激しく混合した。酢酸エチル層を１ｍＬ回収し、硫酸ナトリウムで脱水処理した。遠心分離後の上清８００μＬを回収し、エバポレーターにより乾固させた。得られた固形物を１００μＬのシリル化剤（ＴＭＳＩ−Ｈ；ジーエルサイエンス株式会社）に懸濁し、５０℃で３０分間反応させた。反応物１μＬをガスクロマトグラフィーに供し、トリメチルシリル化されたビフェニルを検出した。
図１７は、水酸化ビフェニルの検出結果を示すグラフである。図１７ＡはＧＣスペクトルを示し、図１７Ｂ〜図１７Ｅは図１７ＡのＢ〜Ｅの各ピークのマススペクトルを示す。これらのグラフから、トリメチルシリル化されたビフェニルが存在すること、すなわち水酸化ビフェニルが生成されていることがわかる。
５．変異体の酵素活性の測定
以下の手順で、野生型ＢｐｈＡ４および変異型ＢｐｈＡ４（いずれも大腸菌（Escherichia coli）で発現させ、精製したもの）について、フェリシアン化カリウム（Ｋ３[Ｆｅ(ＣＮ)６]）の還元反応におけるピリジンヌクレオチドに対するみかけの酵素動力学的パラメーターを測定した。野生型ＢｐｈＡ４および変異型ＢｐｈＡ４の大腸菌菌体からの精製は、文献（Yamada, T., Sakurai, N., Nishizaki, T., Senda, T., Masai, E., Fukuda, M. and Mitsui, Y., "Purification and crystallization of a ferredoxin reductase component of a biphenyl dioxigenase derived from Pseudomonas sp. strain KKS102", Protein Pept. Letters, Vol.7, p.277-280.）に記載の方法と同様の手順で行った。
以下の手順で、野生型ＢｐｈＡ４および変異型ＢｐｈＡ４（いずれも大腸菌（Escherichia coli）で発現させ、精製したもの）について、フェリシアン化カリウム（Ｋ３[Ｆｅ(ＣＮ)６]）の還元反応におけるピリジンヌクレオチドに対するみかけの酵素動力学的パラメーターを測定した。野生型ＢｐｈＡ４および変異型ＢｐｈＡ４の大腸菌菌体からの精製は、文献（Yamada, T., Sakurai, N., Nishizaki, T., Senda, T., Masai, E., Fukuda, M. and Mitsui, Y., "Purification and crystallization of a ferredoxin reductase component of a biphenyl dioxigenase derived from Pseudomonas sp. strain KKS102", Protein Pept. Letters, Vol.7, p.277-280.）に記載の方法と同様の手順で行った。
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対するみかけの酵素動力学的パラメーター(Ｋｍ ＮＡＤＨおよびｋｃａｔ ＮＡＤＨ、Ｋｍ ＮＡＤＰＨおよびｋｃａｔ ＮＡＤＰＨ）は、フェリシアン化カリウムの濃度を十分な濃度である１.５ｍＭに固定し、ＮＡＤＨ濃度またはＮＡＤＰＨ濃度に対する定常状態速度をプロットして算出した。定常状態速度は、１ｍＭのＥＤＴＡおよび２％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）中、２５℃で測定した。吸光度変化の測定は、株式会社日立製作所の分光光度計（Ｕ−２０１０）を使用した。２５℃で５分間プレインキュベートした酵素（ＢｐｈＡ４）およびフェリシアン化カリウムを含む反応溶液に、ＮＡＤＨ溶液またはＮＡＤＰＨ溶液を加えて酵素反応を開始し、フェリシアン酸イオン（Ｆｅ(ＣＮ)６ ３−）の還元に伴う４２０ｎｍにおける吸光度の減少を測定して酵素反応の定常状態速度を算出した。フェリシアン酸イオンは酵素非存在下でもピリジンヌクレオチドによって還元するため、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨによるフェリシアン酸イオンの還元速度を測定し、酵素反応の定常状態速度から差し引くことで真の酵素活性を算出した。
フェリシアン酸イオンの還元速度は、フェリシアン酸イオンの還元に伴う分子吸光係数の差ε４２０＝１.０２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１用いて算出した。ＮＡＤＨ溶液およびＮＡＤＰＨ溶液の濃度は、それぞれ分子吸光係数ε３４０ ＮＡＤＨ＝６.３×１０３Ｍ−１ｃｍ−１、ε３４０ ＮＡＤＰＨ＝６.２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１を用いて決定した。以下、これらの値を用いてＮＡＤＨ濃度およびＮＡＤＰＨ濃度を決定した。
測定したフェリシアン化カリウムの還元反応における定常状態速度をＮＡＤＨ濃度またはＮＡＤＰＨ濃度に対してプロットした。プロットした測定値を統計ソフト（ＰＲＩＺＭ４；GraphPad社）を用いてミカエリス・メンテンの式（１）にフィッティングして、みかけのミカエリス定数（Ｋｍ）と最大速度（Ｖｍａｘ）を求めた。ＶｍａｘをＢｐｈＡ４の濃度で割って触媒定数（ｋｃａｔ）を算出した。
Ｖは初速度、［Ｓ］は反応溶液中のＮＡＤＨ濃度またはＮＡＤＰＨ濃度である。
求めた酵素動力学的パラメーターから、ＮＡＤＨに対する触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＰＨを算出し、両者の比をピリジンヌクレオチドに対する特異性を示すパラメーター（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨとした。なお、「（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＨ／（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＰＨ」と「（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ」との間には、以下の式（２）が成り立つ。
表１〜３に、酵素動力学的パラメーターおよびピリジンヌクレオチドに対する特異性を示すパラメーターを示す。
表３から、野生型のＢｐｈＡ４は、（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの値が大きく、ＮＡＤＨに対する依存性（特異性）が高いことがわかる。一方、変異型のＢｐｈＡ４（Ｅ１７５Ｑ／Ｑ１７７ＫおよびＥ１７５Ｃ／Ｑ１７７Ｇ）は、（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの値が小さく、ＮＡＤＰＨに対する依存性（特異性）が高いことがわかる。
６．トルエン分解能およびベンゼン分解能の測定
ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４８））をトルエンまたはベンゼン存在下で培養し、トルエンまたはベンゼンの減少量を測定した。
ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡ１２３株（ＮＩＴＥ Ｐ−７４８））をトルエンまたはベンゼン存在下で培養し、トルエンまたはベンゼンの減少量を測定した。
遠心して集めた菌体を、ＯＤ６６０が４になるようにＢＧ１１培地に懸濁した。懸濁液をガラス瓶中に５００μＬ入れ、３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の光を照射して３０℃で１５分間前培養を行った。トルエンまたはベンゼンを小試験管に１００μＬ入れ、菌体懸濁液と混ざらないようにガラス瓶中に挿入した後、さらに６時間培養した。このとき、小試験管内のトルエンまたはベンゼンは揮発して菌体懸濁液に徐々に溶解する。３Ｎ ＨＣｌを３.５μＬ加えて反応を停止させた後、内部標準として５０ｎｍｏｌのフェナントレンを加えた。飽和量の塩化ナトリウムおよび１.２ｍＬの酢酸エチルを加えた後、１分間激しく混合した。酢酸エチル層を１ｍＬ回収し、硫酸ナトリウムで脱水処理した。遠心分離後の上清８００μＬを回収し、エバポレーターにより乾固させた。得られた固形物を１００μＬのシリル化剤に懸濁し、５０℃で３０分間反応させた。反応物１μＬをガスクロマトグラフィーに供し、トリメチルシリル化されたトルエンまたはベンゼンを検出した。
図１８は、水酸化トルエンの検出結果を示すグラフである。図１８ＡはＧＣスペクトルを示し、図１８Ｂは図１８ＡのピークＢのマススペクトルを示す。これらのグラフから、トリメチルシリル化されたトルエンが存在すること、すなわち水酸化トルエンが生成されていることがわかる。
図１９は、水酸化ベンゼンの検出結果を示すグラフである。図１９ＡはＧＣスペクトルを示し、図１９Ｂは図１９ＡのピークＢのマススペクトルを示す。これらのグラフから、トリメチルシリル化されたベンゼンが存在すること、すなわち水酸化ベンゼンが生成されていることがわかる。
［実施例２］
本実施例では、シアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）に、アシドボラクス（シュードモナス） ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子およびｂｐｈＤ遺伝子を導入した例を示す。
本実施例では、シアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）に、アシドボラクス（シュードモナス） ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１遺伝子、ｂｐｈＡ２遺伝子、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子およびｂｐｈＤ遺伝子を導入した例を示す。
１．プラスミドの構築
ＰＣＲは、東洋紡績株式会社のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）および株式会社アステックのサーマルサイクラー（ＰＣ−３２０）を用いて行った。ＤＮＡ断片の連結には、タカラバイオ株式会社のＤＮＡライゲーションキット（DNA Ligation Kit <Mighty Mix>）を用いた。
ＰＣＲは、東洋紡績株式会社のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）および株式会社アステックのサーマルサイクラー（ＰＣ−３２０）を用いて行った。ＤＮＡ断片の連結には、タカラバイオ株式会社のＤＮＡライゲーションキット（DNA Ligation Kit <Mighty Mix>）を用いた。
（１）ｐＣＡ１２
プラスミドｐＫＨ２０（非特許文献２参照）からｂｐｈＢ遺伝子（配列番号２６）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＨｉｎｄIII部位間に挿入してプラスミドｐＣＢＢを構築した。同様に、プラスミドｐＫＨ２０からｂｐｈＣ遺伝子（配列番号２８）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＨｉｎｄIII部位間に挿入して、プラスミドｐＣＢＣを構築した。同様に、プラスミドｐＫＨ２０からｂｐｈＤ遺伝子（配列番号３０）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＸｂａＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＣＢＤを構築した。
プラスミドｐＫＨ２０（非特許文献２参照）からｂｐｈＢ遺伝子（配列番号２６）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＨｉｎｄIII部位間に挿入してプラスミドｐＣＢＢを構築した。同様に、プラスミドｐＫＨ２０からｂｐｈＣ遺伝子（配列番号２８）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＨｉｎｄIII部位間に挿入して、プラスミドｐＣＢＣを構築した。同様に、プラスミドｐＫＨ２０からｂｐｈＤ遺伝子（配列番号３０）をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＷｏｒｉ＋のＮｄｅＩ部位−ＸｂａＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＣＢＤを構築した。
プラスミドｐＣＢＢを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＢＣのＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＣＢＢＣを構築した。プラスミドｐＣＢＢＣを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＢ遺伝子およびｂｐｈＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＢＤのＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＣＢＢＣＤを構築した（図２０参照）。
（２）ｐＣＡ３ＢＣＤ
プラスミドｐＣＢＢＣＤを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子、ｂｐｈＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＡ３のＢｇｌII部位に挿入して、プラスミドｐＣＡ３ＢＣＤを構築した（図２１参照）。
プラスミドｐＣＢＢＣＤを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子、ｂｐｈＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＡ３のＢｇｌII部位に挿入して、プラスミドｐＣＡ３ＢＣＤを構築した（図２１参照）。
（３）ｐＶＥＡＢＣＤ６
プラスミドｐＣＡ１２からｂｐｈＡ１遺伝子およびｂｐｈＡ２遺伝子をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入してプラスミドｐＶＥＡ１２を構築した。プラスミドｐＣＡ３ＢＣＤを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子およびｂｐｈＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＡ１２のＢｇｌII部位に挿入して、プラスミドｐＶＥＡＢＣＤ６を構築した（図２２参照）。
プラスミドｐＣＡ１２からｂｐｈＡ１遺伝子およびｂｐｈＡ２遺伝子をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩで切断した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＰ３２１のＮｄｅＩ部位−ＳｍａＩ部位間に挿入してプラスミドｐＶＥＡ１２を構築した。プラスミドｐＣＡ３ＢＣＤを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｂｐｈＡ３遺伝子、ｂｐｈＢ遺伝子、ｂｐｈＣ遺伝子およびｂｐｈＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をプラスミドｐＶＥＡ１２のＢｇｌII部位に挿入して、プラスミドｐＶＥＡＢＣＤ６を構築した（図２２参照）。
２．シアノバクテリアの形質転換
実施例１と同様の手順により、プラスミドｐＶＥＡＢＣＤ６をシアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）に導入した。プラスミドｐＶＥＡＢＣＤ６を導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株」と称する。ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４８として、２０１０年１月１５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
実施例１と同様の手順により、プラスミドｐＶＥＡＢＣＤ６をシアノバクテリア（シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株）に導入した。プラスミドｐＶＥＡＢＣＤ６を導入した菌体を「ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株」と称する。ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４８として、２０１０年１月１５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。
３．ビフェニル分解能の測定
（１）ビフェニル減少量および安息香酸の増加量の測定
ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−８４８）をビフェニル存在下で培養し、ビフェニルの減少量および安息香酸の増加量を測定した。
（１）ビフェニル減少量および安息香酸の増加量の測定
ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−８４８）をビフェニル存在下で培養し、ビフェニルの減少量および安息香酸の増加量を測定した。
遠心して集めた菌体を、ＯＤ６６０が４になるようにＢＧ１１培地に懸濁した。懸濁液をガラス瓶中に１ｍＬ入れ、３５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の光を照射して３０℃で１５分間前培養を行った。１００ｎｍｏｌのビフェニルを加えた後、さらに任意の時間培養し、３Ｎ ＨＣｌを３.５μＬ加えて反応を停止させた。遠心分離後の上清８００μＬを回収し、そのうちの５０μＬを液体クロマトグラフィーに供し、安息香酸を検出した。
図２３は、ＰＣＣ６８０３／ｐＶＥＡＢＣＤ６株の培養時間とビフェニルの残存量および安息香酸の蓄積量との関係を示すグラフである。このグラフから、ビフェニルが減少するに従い、安息香酸が蓄積していくのがわかる。
本発明の光合成生物は、例えば貧栄養環境下における芳香族化合物汚染のバイオレメディエーションに適用可能な生物として有用である。また、本発明の光合成生物は、精密化学合成やin vitroにおける薬物代謝研究などの様々な分野に適用可能である。
Claims (21)
- ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来の電子を利用して芳香族化合物を他の化合物に変換する芳香族化合物変換酵素群に含まれる１または２以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されている光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、前記芳香族化合物を基質とするオキシゲナーゼをコードする、請求項１に記載の光合成生物。
- 前記芳香族化合物は、ビフェニル化合物であり、
前記芳香族化合物変換酵素群は、ビフェニル化合物変換酵素群である、
請求項１に記載の光合成生物。 - 前記ポリヌクレオチドは、ｂｐｈ遺伝子群に含まれる１または２以上の遺伝子を有する、請求項３に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈ遺伝子群に含まれる１または２以上の遺伝子を有する、請求項４に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４からなる群から選択される１または２以上の遺伝子を有する、請求項５に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２およびｂｐｈＡ３遺伝子を有する、請求項６に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３およびｂｐｈＡ４遺伝子を有する、請求項６に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤからなる群から選択される１または２以上の遺伝子をさらに有する、請求項７に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、アシドボラクス ｓｐ．ＫＫＳ１０２株由来のｂｐｈＢ、ｂｐｈＣおよびｂｐｈＤ遺伝子をさらに有する、請求項７に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＢｐｈＡ４変異体をコードする、請求項３に記載の光合成生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＢｐｈＡ４変異体をコードする、請求項３に記載の光合成生物。
- 微生物である、請求項１に記載の光合成生物。
- シアノバクテリアである、請求項１に記載の光合成生物。
- 前記シアノバクテリアは、シネコシスチス ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株である、請求項１４に記載の光合成生物。
- 配列番号１４のプラスミドを有する、請求項１５に記載の光合成生物。
- 配列番号１５のプラスミドを有する、請求項１５に記載の光合成生物。
- 配列番号１６のプラスミドを有する、請求項１５に記載の光合成生物。
- 配列番号１７のプラスミドを有する、請求項１５に記載の光合成生物。
- 配列番号３２のプラスミドを有する、請求項１５に記載の光合成生物。
- 請求項１に記載の光合成生物を芳香族化合物に接触させて、前記芳香族化合物を他の化合物に変換させるステップを含む、芳香族化合物の分解方法。
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