JP2011007664A - Method for screening antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原に対する高い親和性を有する特異抗体のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening a specific antibody having high affinity for an antigen.
モノクローナル抗体作製における細胞融合後の特異抗体のスクリーニング方法としては、従来は、ELISA法を用いてスクリーニングを行っている。しかし、モノクローナル抗体産生細胞の培養上清中における特異抗体の濃度は、細胞によって異なるため、特異抗体を効率よくスクリーニングすることは困難である。モノクローナル抗体の作製においては、抗体産生細胞である脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを作成するが、作成したハイブリドーマの中から、抗原に対して特異性及び親和性の高い抗体を産生するハイブリドーマをいかにして選択するかが重要である。しかし、ハイブリドーマの培養上清中における抗体産生量はハイブリドーマ毎に異なるため、培養上清中の抗体濃度はハイブリドーマ毎に異なり、ばらついている。そのため、従来のELISA評価では、多数の偽陽性サンプルを選択してしまう可能性が高かった。また、細胞が産生する抗体の抗原に対する親和性も分からないため、抗原に対して特異性及び親和性が高い抗体を合理的にスクリーングすることは困難であった。 As a screening method for specific antibodies after cell fusion in the production of monoclonal antibodies, conventionally, screening is performed using the ELISA method. However, since the concentration of the specific antibody in the culture supernatant of the monoclonal antibody-producing cell varies depending on the cell, it is difficult to efficiently screen the specific antibody. In the production of monoclonal antibodies, spleen cells, which are antibody-producing cells, and myeloma cells are fused to create a hybridoma. From the hybridomas produced, antibodies with high specificity and affinity for antigen are produced. How to select a hybridoma is important. However, since the amount of antibody production in the culture supernatant of the hybridoma varies from one hybridoma to another, the antibody concentration in the culture supernatant varies from one hybridoma to another and varies. Therefore, in the conventional ELISA evaluation, there was a high possibility that a large number of false positive samples were selected. In addition, since the affinity of the antibody produced by the cells for the antigen is unknown, it has been difficult to rationally screen for antibodies having high specificity and affinity for the antigen.
一方、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできる技術の一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析が知られている、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析においては、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析することができる。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、例えば、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。 On the other hand, surface plasmon resonance (SPR) analysis, which is known as one of the techniques that can detect a change in the binding amount of a measurement substance with high sensitivity without requiring a labeling substance, is known. ) In analysis, a transparent substrate (for example, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance thereon, the physiologically active substance on the metal surface via the functional group. To fix. By measuring the specific binding reaction between the physiologically active substance and the analyte substance, the interaction between biomolecules can be analyzed. As a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance, for example, a functional group capable of binding to a metal, a linker having a chain length of 10 or more, and a compound having a functional group capable of binding to a physiologically active substance are used. A measurement chip in which a physiologically active substance is immobilized has been reported (see Patent Document 1).
即ち、本発明は、抗原に対する高い親和性を有するモノクローナル抗体を高い精度でスクリーニングできる方法を提供することを解決すべき課題とした。 That is, an object of the present invention is to provide a method capable of screening a monoclonal antibody having high affinity for an antigen with high accuracy.
本発明者らは、任意のサブクラスの抗体（IgG、IgM、IgEなど）と結合することができる捕捉抗体を、表面プラズモン共鳴分析用のセンサーチップ上に固定化し、ハイブリドーマ培養上清中の全イムノグロブリン量を定量し、また、別のセンサーチップに特異抗原を固定化し、ハイブリドーマ培養上清中の特異抗体量を定量し、それぞれのシグナル値（ΔRU）の比率を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を産生するハイブリドーマを選択することに成功し、本発明を完成した。 The present inventors immobilized a capture antibody capable of binding to an antibody of any subclass (IgG, IgM, IgE, etc.) on a sensor chip for surface plasmon resonance analysis, so that all immunoassays in the hybridoma culture supernatant could be obtained. Affinity to antigen is determined by quantifying the amount of globulin, immobilizing a specific antigen on another sensor chip, quantifying the amount of specific antibody in the hybridoma culture supernatant, and comparing the ratio of each signal value (ΔRU). The present invention was completed by successfully selecting hybridomas that produce highly specific antibodies.
即ち、本発明によれば、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法が提供される。 That is, according to the present invention, a first surface plasmon resonance analysis sensor chip on which a capture antibody capable of binding to an antibody of an arbitrary subclass is immobilized and a second surface plasmon resonance analysis sensor chip on which an antigen is immobilized. Contact each with an antibody-containing sample, and measure the change in surface plasmon resonance in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip to obtain the respective signal values. By comparing the signal value ratio (signal value in the second surface plasmon resonance sensor chip / signal value in the first surface plasmon resonance sensor chip), it contains a specific antibody with high affinity for the antigen A method for screening an antibody comprising selecting a sample to be provided is provided That.
好ましくは、抗体含有試料は、モノクローナル抗体含有試料である。
好ましくは、抗体含有試料は、抗体産生細胞の培養上清である。
好ましくは、抗体含有試料は、抗体産生ハイブリドーマの培養上清である。
好ましくは、抗体含有試料は、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマの培養上清である。
Preferably, the antibody-containing sample is a monoclonal antibody-containing sample.
Preferably, the antibody-containing sample is a culture supernatant of antibody-producing cells.
Preferably, the antibody-containing sample is a culture supernatant of an antibody-producing hybridoma.
Preferably, the antibody-containing sample is a culture supernatant of an antibody-producing hybridoma derived from a single clone after limiting dilution.
好ましくは、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択する。 Preferably, a sample having a signal value ratio (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / signal value in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip) equal to or higher than a predetermined reference value is used as an affinity for the antigen. Select as a sample containing highly specific antibody.
本発明によれば、捕捉抗体のイムノグロブリン結合能とSPRセンシングを用いて、ハイブリドーマなどの抗体産生細胞の全抗体産生量と特異抗体産生量を定量することにより、抗原に対する親和性が高い特異抗体を高い精度でスクリーニングすることが可能である。本発明によれば、ELISAによるスクリーニング法で偽陽性と判断したサンプルを見分けることができる。また、本発明によれば、培養上清中の抗体濃度が分からない場合であっても、抗原に対する親和性が高い特異抗体を効率よくスクリーニングすることが可能である。 According to the present invention, a specific antibody having a high affinity for an antigen is quantified by quantifying the total antibody production amount and the specific antibody production amount of antibody-producing cells such as hybridomas using the immunoglobulin binding ability of the capture antibody and SPR sensing. Can be screened with high accuracy. According to the present invention, it is possible to distinguish a sample determined to be false positive by an ELISA screening method. Moreover, according to the present invention, even when the antibody concentration in the culture supernatant is unknown, it is possible to efficiently screen for a specific antibody having a high affinity for an antigen.
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得する。次いで、上記で取得したそれぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することによって、抗体のスクリーニングを行う。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
In the present invention, each of the first surface plasmon resonance analysis sensor chip on which a capture antibody capable of binding to an antibody of any subclass is immobilized and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip on which an antigen is immobilized, The antibody-containing sample is brought into contact, and changes in surface plasmon resonance in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip are measured to obtain respective signal values. Next, by comparing the ratio of the respective signal values obtained above (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / signal value in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip), affinity for the antigen is obtained. Antibody screening is performed by selecting a sample containing a highly specific antibody.
シグナル値の比率の比較においては、例えば、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができる。上記した「所定の基準値」は、測定条件（例えば、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した捕捉抗体の量、第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した抗原の量）、並びに取得を意図する抗体の抗原に対する親和性の程度に応じて、所望の値に設定することができる。上記した「所定の基準値」は、例えば、本発明で用いる「任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ」のそれぞれに、当該抗原に対する既存の抗体（以下、基準抗体とも称する）を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得することによって得られるそれぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）と同じ値に設定してもよい。あるいは、「所定の基準値」は、上記した基準抗体を用いて測定した場合のシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）に所定の比率（例えば、０．１から１．０の間の任意の比率、例えば、０．４又は０．８など）を掛けた値に設定してもよい。なお、上記した基準抗体としては、当該抗原に対する抗体であれば任意の抗体を用いることができるが、抗原に対して所望の親和性を有する抗体を用いることが特に好ましい。 In the comparison of the signal value ratio, for example, the signal value ratio (the signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / the signal value in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip) is equal to or greater than a predetermined reference value. Can be selected as a sample containing a specific antibody with high affinity for an antigen. The above-mentioned “predetermined reference value” is the measurement condition (for example, the amount of the capture antibody immobilized on the first surface plasmon resonance analysis sensor chip, the amount of the antigen immobilized on the second surface plasmon resonance analysis sensor chip). Amount), as well as the degree of affinity of the antibody intended to be obtained for the antigen, can be set to a desired value. The above-mentioned “predetermined reference value” includes, for example, “a first surface plasmon resonance analysis sensor chip on which a capture antibody capable of binding to an antibody of an arbitrary subclass is immobilized, and a second on which an antigen is immobilized. The surface plasmon resonance analysis sensor chip ”is brought into contact with an existing antibody against the antigen (hereinafter also referred to as a reference antibody), and the first surface plasmon resonance analysis sensor chip and second surface plasmon resonance analysis chip are used. Ratio of each signal value obtained by measuring change of surface plasmon resonance in sensor chip and acquiring each signal value (signal value in sensor chip for second surface plasmon resonance analysis / first surface plasmon resonance You may set to the same value as the signal value in the sensor chip for analysis. Alternatively, the “predetermined reference value” is a ratio of signal values when measured using the above-described reference antibody (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / first surface plasmon resonance analysis sensor chip May be set to a value obtained by multiplying a predetermined ratio (for example, an arbitrary ratio between 0.1 and 1.0, for example, 0.4 or 0.8). As the reference antibody, any antibody can be used as long as it is an antibody against the antigen, but it is particularly preferable to use an antibody having a desired affinity for the antigen.
本発明の一例としては、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、基準抗体におけるシグナル値の比率の４０％以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよいし、あるいはシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、基準抗体におけるシグナル値の比率の８０％以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。 As an example of the present invention, the ratio of signal values (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / signal value in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip) is the ratio of the signal value ratio in the reference antibody. An antibody-containing sample that is 40% or more may be selected as a sample containing a specific antibody having a high affinity for an antigen, or the ratio of signal values (signal value / second in the second surface plasmon resonance sensor chip) The antibody-containing sample whose signal value in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip) is 80% or more of the ratio of the signal value in the reference antibody is selected as a sample containing a specific antibody having a high affinity for the antigen. Also good.
なお、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）は、測定条件（例えば、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した捕捉抗体の量、第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した抗原の量など）により変動するため、一般的には、シグナル値の比率の絶対値を、試料の選別の指標とすることは適切ではないと考えられる。しかし、本発明の一例として本明細書の実施例に記載するような条件下又はそれに準ずる条件下においては、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、例えば０．２以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができ、あるいは上記のシグナル値の比率が、例えば０．４以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができる。 The ratio of signal values (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / signal value in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip) is a measurement condition (for example, for the first surface plasmon resonance analysis) In general, the absolute value of the ratio of the signal value is determined by the amount of the capture antibody immobilized on the sensor chip and the amount of the antigen immobilized on the second surface plasmon resonance analysis sensor chip. It is considered that it is not appropriate to use it as an index for selection. However, under the conditions described in the examples of the present specification as an example of the present invention or under conditions equivalent thereto, the ratio of signal values (the signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / the first value) An antibody-containing sample having a signal value in the surface plasmon resonance analysis sensor chip) of, for example, 0.2 or more can be selected as a sample containing a specific antibody having a high affinity for an antigen, or the above signal value For example, an antibody-containing sample having a ratio of 0.4 or more can be selected as a sample containing a specific antibody having a high affinity for an antigen.
更に別の観点によれば、複数の抗体含有試料を、本発明の方法により同一条件下においてスクニーニングし、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、例えば、上位５０％以内のもの、好ましくは上位４０％以内のもの、より好ましくは上位３０％以内のもの、より好ましくは上位２０％以内のもの、より好ましくは上位１０％以内のもの、より好ましくは上位５％以内のものを、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。更に別の観点によれば、複数の抗体含有試料を、本発明の方法により同一条件下においてスクニーニングし、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）の偏差値が、例えば５０以上、好ましくは５５以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは６５以上、より好ましくは７０以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。 According to still another aspect, a plurality of antibody-containing samples are screened under the same conditions by the method of the present invention, and the ratio of signal values (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / first surface) Signal value in the sensor chip for plasmon resonance analysis) is, for example, within the top 50%, preferably within the top 40%, more preferably within the top 30%, more preferably within the top 20%, More preferably, those within the top 10%, more preferably those within the top 5%, may be selected as a sample containing a specific antibody having a high affinity for the antigen. According to still another aspect, a plurality of antibody-containing samples are screened under the same conditions by the method of the present invention, and the ratio of signal values (signal value in the second surface plasmon resonance analysis sensor chip / first surface) An antibody-containing sample having a deviation value of the signal value in the sensor chip for plasmon resonance analysis is, for example, 50 or more, preferably 55 or more, more preferably 60 or more, more preferably 65 or more, more preferably 70 or more. You may select as a sample containing the specific antibody with high affinity.
本発明のスクリーニングの対象となる抗体含有試料における抗体の種類は特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体含有試料としては、抗体産生細胞の培養上清を使用することができ、さらに好ましくは抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いることができる。また、ハイブリドーマとしては、複数のクローンに由来するハイブリドーマでもよいし、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマを用いてもよい。 The type of antibody in the antibody-containing sample to be screened according to the present invention is not particularly limited, and may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody. As the antibody-containing sample, a culture supernatant of antibody-producing cells can be used, and a culture supernatant of an antibody-producing hybridoma can be used more preferably. The hybridoma may be a hybridoma derived from a plurality of clones, or an antibody-producing hybridoma derived from a single clone after limiting dilution.
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得は、通常の方法で行うことができる。すなわち、抗原をアジュバンドとともに数回腹腔等に注射して、脾臓細胞を取り出しポリエチレングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させればよい。例えば、以下の通り行うことができる。 Acquisition of a hybridoma producing a monoclonal antibody can be performed by a usual method. That is, the antigen may be injected into the abdominal cavity several times with adjuvant, and the spleen cells may be taken out and fused with mouse myeloma cells using polyethylene glycol or the like. For example, it can be performed as follows.
先ず、所望の抗原を、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は特に限定されないが、例えば、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜2000μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、１〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜60日後、好ましくは１〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。 First, a desired antigen is administered to mammals such as rats, mice, rabbits and the like. The dose of the antigen per animal is not particularly limited, and is, for example, 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 2000 μg when an adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
ハイブリドーマを得るため、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。 In order to obtain a hybridoma, cell fusion between the antibody-producing cells and myeloma cells is performed. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred. Examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) and NS-I.
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、１×106〜１×107個/mlの抗体産生細胞と２×105〜２×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。 Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion is performed in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 media, and 1 × 10 6 to 1 × 10 7 antibody-producing cells and 2 × 10 5 to 2 × 10 6. Per ml of myeloma cells (cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 5: 1), and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used. Alternatively, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
上記の細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×105個/well程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。 After appropriately diluting the above cell suspension with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, sprinkle about 3 × 10 5 cells / well on a microtiter plate, add selective medium to each well, and then select appropriately. Cultivate by changing the medium. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、上記のハイブリドーマの培養上清を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得することができる。 Next, it is screened whether the target antibody exists in the culture supernatant of the hybridoma which has proliferated. In the present invention, each of the first surface plasmon resonance analysis sensor chip on which a capture antibody capable of binding to an antibody of any subclass is immobilized and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip on which an antigen is immobilized, Contacting the culture supernatant of the hybridoma described above, measuring changes in surface plasmon resonance in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip, and acquiring respective signal values Can do.
ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。 Hybridoma cloning can be performed by a limiting dilution method or the like, and finally a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell can be established.
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、５％ CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。 As a method for collecting the monoclonal antibody from the established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Cultivate for 7 to 14 days and obtain antibody from the culture supernatant.
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ−アガロース等）などの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。 In the case of the ascites formation method, about 1 × 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a mammal derived from a myeloma cell and the same strain, and the hybridomas are proliferated in large quantities. And ascitic fluid is collected after 1-2 weeks. When antibody purification is required in the antibody collection method, a known method such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography (protein A-agarose, etc.) is appropriately selected. Or by combining them.
本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、上記のハイブリドーマの培養上清を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得する。 In the present invention, each of the first surface plasmon resonance analysis sensor chip on which a capture antibody capable of binding to an antibody of any subclass is immobilized and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip on which an antigen is immobilized, The culture supernatant of the hybridoma is brought into contact with each other, and changes in surface plasmon resonance in the first surface plasmon resonance analysis sensor chip and the second surface plasmon resonance analysis sensor chip are measured to obtain respective signal values.
任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体としては、例えば、スクリーニング対象の抗体が、マウス抗体である場合には、任意のサブクラスのマウス抗体に結合できるα-マウスイムノグロブリンなどを用いることができる。 As a capture antibody that can bind to an antibody of any subclass, for example, when the antibody to be screened is a mouse antibody, α-mouse immunoglobulin that can bind to a mouse antibody of any subclass can be used.
次に、本発明で用いる表面プラズモン共鳴分析について説明する。表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。 Next, surface plasmon resonance analysis used in the present invention will be described. The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, there is an apparatus using a system called Kretschmann arrangement (for example, JP-A-6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。 In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。 In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon, so that the entire energy is transferred to the interface between the dielectric block and the metal film. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。 If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。 In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.
上述した表面プラズモン測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には、金属膜の上に被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定することができる。 The surface plasmon measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research, etc. In this case, as a substance to be measured on a metal film, A sensing substance is fixed, a sample solution in which various analytes are dissolved in a solvent is added onto the sensing substance, and the angle of total reflection attenuation (θSP) is measured every time a predetermined time elapses. it can.
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。 If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, by measuring the total reflection attenuation angle (θSP) every predetermined time and measuring whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed, the binding state of the analyte and the sensing substance is determined. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody.
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。 Note that in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of total reflection attenuation (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the angle change. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring device using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value. In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not particularly limited by the following examples.
（参考例）
細胞融合後の作業スキームを図１に示す。細胞融合後に、抗体産生細胞のスクリーニングを行い、更にその後の限界希釈後にハイブリドーマ樹立細胞を選択する必要がある。
(Reference example)
The work scheme after cell fusion is shown in FIG. After cell fusion, it is necessary to screen antibody-producing cells and select hybridoma-established cells after further limiting dilution.
（抗体産生細胞（脾臓細胞）の取得、細胞融合）
免疫マウスより摘出した脾臓細胞をミエローマと混合して細胞融合を実施した。融合方法は、PEG法を採用した。使用細胞は、最終免疫3日後の脾臓細胞。ミエローマは、P3-X63-Ag8-U1。細胞比は、脾臓細胞 ： ミエローマ = 5-10 ： 1とした。脾臓細胞として0.5〜1.0 × 105 cells/wellで96-well plateに播種。培地は、RPMI-1640 + 10 % FBS + HAT（場合によっては更にHCF or IL-6を添加）を使用した。
(Acquisition of antibody-producing cells (spleen cells), cell fusion)
Spleen cells extracted from the immunized mice were mixed with myeloma to perform cell fusion. The PEG method was adopted as the fusion method. The cells used are spleen cells 3 days after the final immunization. Myeloma is P3-X63-Ag8-U1. The cell ratio was spleen cells: myeloma = 5-10: 1. Spleen cells were seeded on a 96-well plate at 0.5-1.0 x 10 5 cells / well. As the medium, RPMI-1640 + 10% FBS + HAT (added with HCF or IL-6 in some cases) was used.
（ＥＬＩＳＡ）
マウスに抗原（ポリハプテン）を免疫感作した後に、抗体産生を確認するために、マウス抗血清サンプル(約1mL)を採取しELISAで評価を行った。
ELISA条件は、以下のような操作を行った。
１）固相化：T4-BSAを1 μg/mL濃度で50 μL/wellで分注する（4℃，over night）
２）ブロッキング：1 % BSA/PBSを、200 μL/wellで分注する（4℃，over nightまたは室温1〜2時間）
３）1次抗体：各マウス抗血清を段階希釈にて希釈（×100，×1000，×3000，×10000）し、50 μL/wellで分注する（室温，1時間）
４）洗浄：0.05 % Tween-PBSにて3回洗浄
５）2次抗体：抗マウスIgG POD標識抗体を0.1 % BSA/PBSで希釈し、50 μL/wellで分注する（室温，1時間）
６）洗浄：0.05 % Tween-PBSにて5回洗浄
７）発色：発色基質（OPD）を100 μL/wellで分注する（室温，5〜15分）
８）反応停止：2N H2SO4を100 μL/wellで分注する
(ELISA)
After immunizing mice with an antigen (polyhapten), mouse antiserum samples (about 1 mL) were collected and evaluated by ELISA to confirm antibody production.
ELISA conditions were as follows.
1) Immobilization: Dispense T4-BSA at a concentration of 1 μg / mL at 50 μL / well (4 ° C, over night).
2) Blocking: Dispense 1% BSA / PBS at 200 μL / well (4 ° C, overnight or room temperature for 1-2 hours)
3) Primary antibody: Each mouse antiserum is diluted by serial dilution (x100, x1000, x3000, x10000) and dispensed at 50 μL / well (room temperature, 1 hour)
4) Washing: Washing 3 times with 0.05% Tween-PBS 5) Secondary antibody: Anti-mouse IgG POD-labeled antibody is diluted with 0.1% BSA / PBS and dispensed at 50 μL / well (room temperature, 1 hour)
6) Washing: Washing 5 times with 0.05% Tween-PBS 7) Color development: Dispense chromogenic substrate (OPD) at 100 μL / well (room temperature, 5-15 minutes)
8) Stop reaction: Dispense 2N H 2 SO 4 at 100 μL / well.
細胞融合後のELISAスクリーニング結果を図２に示す。38サンプルの陽性サンプルが確認された。この中からクローニングする細胞を選択する必要があるが、どれを選択するかの決定は困難である。 The result of ELISA screening after cell fusion is shown in FIG. 38 positive samples were confirmed. It is necessary to select cells to be cloned from these, but it is difficult to determine which one to select.
実施例１
（ＳＰＲ装置、センサーチップ、フローセルの説明）
SPRはBiacore社のBiacore3000を使用し、センサーチップは、CM5を使用した。SPR センサーは抗原・抗体複合物等の結合物質を迅速に検出する装置である。 抗原あるいは抗体を金属薄膜に蒸着したセンサーチップ表面に固定化し、このセンサーチップ上に固定化された抗原あるいは抗体に作用する物質を含む試料を一定量流し、抗原抗体反応を起こさせ、この時生じる微妙な金属表面の変化を表面プラズモン共鳴という光学現象を用いて検出し， センサグラムと呼ぶグラフにより表示する。光学的な変化を直接検出する手法であるため標識を行う必要が無く， 短時間で測定できるとともに少量の試料で検出することが可能という特徴を有している。表面プラズモン共鳴とは， ある特定の角度から入射した光は金属表面プラズモンと共鳴し吸収されるが、このとき金属膜の表面で抗原抗体反応等が発生すると， 反射光が高感度に変化するという原理を利用している。
Example 1
(Description of SPR device, sensor chip, flow cell)
SPR used Biacore 3000 from Biacore and CM5 sensor chip. The SPR sensor is a device that rapidly detects a binding substance such as an antigen / antibody complex. An antigen or antibody is immobilized on the surface of a sensor chip deposited on a metal thin film, and a sample containing a substance that acts on the antigen or antibody immobilized on the sensor chip is flowed to cause an antigen-antibody reaction. Subtle changes in the metal surface are detected using an optical phenomenon called surface plasmon resonance, and displayed on a graph called a sensorgram. Since it is a technique that directly detects optical changes, it does not need to be labeled, and it can be measured in a short time and can be detected with a small amount of sample. With surface plasmon resonance, light incident from a specific angle resonates with and is absorbed by metal surface plasmons. When an antigen-antibody reaction occurs on the surface of the metal film, the reflected light changes with high sensitivity. The principle is used.
（ＳＰＲ測定条件の説明）
測定装置は Biacore 3000（ビアコア社製） を使用し， センサーチップとして CM5チップ （カルボキシルメチル基を導入） を用いた。抗体は， 抗 サイロキシン（以下 T4） モノクローナル抗体マウス（以下 MAb）IgG1（Medix社製）を使用した。測定試料 （抗原） はT4-BSA（Fitzgerald社製または、別途自社合成品） を使用した。 測定時にこれらの抗体液を移動相 HBS-P（10ｍM HEPES pH7.4， 0.15M NaCl 0.005％ Surfactant P20） で希釈して使用した。
(Explanation of SPR measurement conditions)
Biacore 3000 (Biacore) was used as the measuring device, and a CM5 chip (carboxylmethyl group introduced) was used as the sensor chip. Anti-thyroxine (hereinafter T4) monoclonal antibody mouse (hereinafter MAb) IgG1 (manufactured by Medix) was used as the antibody. As a measurement sample (antigen), T4-BSA (manufactured by Fitzgerald or separately synthesized in-house) was used. At the time of measurement, these antibody solutions were diluted with mobile phase HBS-P (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl 0.005% Surfactant P20).
まず， Medix社製抗体の T4-BSAに対する反応性を確認した。Biacore 3000の操作手順としては， まず， センサーチップ （CM5チップ） を装置にセットし， 移動相を用いて装置の安定化を行った．抗体、抗原の固定化溶液 （10mM 酢酸ナトリウム pH5.5） でタンパク質量50μｇ/ml になるように希釈した後，アミノカップリング薬 （200 mM M-Ethyl-3-carbodiimide hydrochloride, 50 mM N-hydroxysuccinimide） でチップの活性化， 抗体、抗原の固定及び１M ethanolamine-HCｌによるブロッキングを行い， 固定化をした。 チップ接触時間は、 活性化， 固定化の順に各７分ずつ行った。 First, the reactivity of Medix antibody against T4-BSA was confirmed. The operation procedure of the Biacore 3000 was as follows. First, a sensor chip (CM5 chip) was set in the device, and the device was stabilized using the mobile phase. After diluting with an antibody / antigen immobilization solution (10 mM sodium acetate pH 5.5) to a protein content of 50 μg / ml, an amino coupling agent (200 mM M-Ethyl-3-carbodiimide hydrochloride, 50 mM N-hydroxysuccinimide ), The chip was activated, the antibody and the antigen were immobilized, and blocking with 1M ethanolamine-HCl was carried out. The chip contact time was 7 minutes each in the order of activation and immobilization.
測定条件は Biacore3000の既定条件に従った。 同一抗体による繰り返し測定を行うため， センサーチップ上で結合した抗原を解離溶液 （10mM グリシン-塩酸緩衝液） で解離した。流速は、10μl/min で行った。SPR センサーによる測定結果を図３、４のセンサグラムに示した。測定結果は， センサーチップ上の質量変化をビアコア独自の単位であるリゾナンスユニット （RU） で表した。（1000RU＝1mm2当たり１ng の変化） The measurement conditions followed the default conditions of Biacore3000. In order to perform repeated measurements with the same antibody, the antigen bound on the sensor chip was dissociated with a dissociation solution (10 mM glycine-hydrochloric acid buffer). The flow rate was 10 μl / min. The measurement results with the SPR sensor are shown in the sensorgrams of FIGS. In the measurement results, the mass change on the sensor chip was expressed in the resonance unit (RU), a unit unique to Biacore. (1000 RU = 1 ng change per 1 mm 2 )
（速度論解析の説明）
抗原（T4-BSA）固定化
抗原の固定化は、上記で記載した通りの手法で、固定化量（RU）が、1500を使用した。
抗体液の調製
抗体として、Medix社製の抗体１、及び本実施例で作成した抗体２種（ＦＦ１及び２）を用いた。それぞれ、0.2, 0.4, 1, 2, 5 nMの溶液を作成し、測定に用いた。
(Explanation of kinetic analysis)
Antigen (T4-BSA) Immobilization Antigen immobilization was carried out as described above, and the immobilization amount (RU) was 1500.
Preparation of antibody solution As an antibody, antibody 1 manufactured by Medix and two types of antibodies (FF1 and 2) prepared in this example were used. Solutions of 0.2, 0.4, 1, 2, 5 nM were prepared and used for measurement.
（４）ＳＰＲでの評価
上記のFc1及びFc3を用い、以下の条件で抗体溶液を添加して評価を行った。測定結果を図３に、及びBivalent（２価結合の相互作用）での速度論解析結果を表２に示す。
流速、結合、解離、洗浄条件
Flow: 10μL / mL
結合：10 min
解離：20 min
洗浄1 Gly pH1.5：3 min
洗浄2 Gly 10 mM NaOH：3 min
洗浄3 Gly pH1.5：3 min
洗浄4 Gly 10 mM NaOH：3 min
再生：HBSP buffer 8 min
(4) Evaluation by SPR Using the above Fc1 and Fc3, an antibody solution was added under the following conditions for evaluation. The measurement results are shown in FIG. 3, and the kinetic analysis results in Bivalent (divalent bond interaction) are shown in Table 2.
Flow rate, binding, dissociation, washing conditions
Flow: 10μL / mL
Bonding: 10 min
Dissociation: 20 min
Wash 1 Gly pH1.5: 3 min
Wash 2 Gly 10 mM NaOH: 3 min
Wash 3 Gly pH1.5: 3 min
Wash 4 Gly 10 mM NaOH: 3 min
Playback: HBSP buffer 8 min
一例として、ELISAで強陽性である1F2ウエルのSPR測定を行った結果を図３に示す。
キャプチャー抗体は、α-Mouse Immunoglobulins（Biacore社製）を使用し、フローセル4に固定化した。抗原としては、T4-BSAを使用し、フローセル3（Fc3）に固定化した。フローセル4（Fc4）において、抗体産生量（ΔRU=388）は確認されたが、Fc3においては、特異抗体産生量は確認されなかった（ΔRU=0）。この細胞ウエルでは、イムノグロブリンは産生されているが、親和性の高い特異抗体は産生されてないことが示唆された。
As an example, FIG. 3 shows the results of SPR measurement of 1F2 wells that are strongly positive by ELISA.
The capture antibody was immobilized on the flow cell 4 using α-Mouse Immunoglobulins (Biacore). As an antigen, T4-BSA was used and immobilized on flow cell 3 (Fc3). In flow cell 4 (Fc4), the antibody production amount (ΔRU = 388) was confirmed, but in Fc3, the specific antibody production amount was not confirmed (ΔRU = 0). It was suggested that immunoglobulins were produced in this cell well, but specific antibodies with high affinity were not produced.
一方、ELISAで強陽性である9F1ウエルのSPR測定を行った結果を図４に示す。フローセル4（Fc4）において、抗体産生量（ΔRU=402）が確認され、Fc3においても特異抗体の産生量も確認された（ΔRU=104）。この細胞ウエルでは、イムノグロブリンが産生され、親和性の高い特異抗体も産生されていることが示唆された。 On the other hand, FIG. 4 shows the result of SPR measurement of 9F1 well which is strongly positive by ELISA. The amount of antibody production (ΔRU = 402) was confirmed in flow cell 4 (Fc4), and the amount of specific antibody produced was also confirmed in Fc3 (ΔRU = 104). It was suggested that immunoglobulin was produced in this cell well, and a specific antibody with high affinity was also produced.
この時の２つのフローセルの値の比（ΔRU at Fc3/ ΔRU at Fc4 ×100）を特異抗体結合能の指標として用い、ELISA評価を行った３８ウエルを評価した結果を図５に示す。
参照値：Medix社製市販抗体：5μg/mL（30 nM）, Kd = 10-11M
サブクラス陰性サンプル以外で９サンプルまで絞り込めた。
FIG. 5 shows the results of evaluation of 38 wells subjected to ELISA evaluation using the ratio of the values of the two flow cells at this time (ΔRU at Fc3 / ΔRU at Fc4 × 100) as an indicator of specific antibody binding ability.
Reference value: Medix commercially available antibody: 5 μg / mL (30 nM), K d = 10 -11 M
Narrow down to 9 samples other than subclass negative samples.
実施例２
限界希釈後の培養上清サンプルのスクリーニングも、実施例１と同じように行った。その結果を図６に示す。クローン名9F1では、9F1D8, 9F1E1の２株を選択した。また、クローン名22G8では、22G8A2, 22G8E6の２株を選択した。同様に、他のクローンについてもスクリーニングを行った結果を表１に示す。
Example 2
Screening of culture supernatant samples after limiting dilution was performed in the same manner as in Example 1. The result is shown in FIG. For clone name 9F1, two strains 9F1D8 and 9F1E1 were selected. For clone name 22G8, two strains 22G8A2 and 22G8E6 were selected. Similarly, the results of screening for other clones are shown in Table 1.
結合能の指標の高い9F1D8と22G8A2の２株について、マウス２０匹腹水法で抗体作製を行った。その結果を表２に示す。 For two strains 9F1D8 and 22G8A2, which have high indices of binding ability, antibodies were prepared by the ascites method using 20 mice. The results are shown in Table 2.
実施例３
各抗体の速度論解析を行った結果を図７に示す。Biacore社製T100、センサーチップはCM5を用いて行った。抗原（T4-BSA）の固定化量は、100RU、流速：10μL/min, 結合：10 min, 解離：10 minで行った。
速度論解析の結果を以下の表３に示す。
Example 3
The results of kinetic analysis of each antibody are shown in FIG. Biacore T100 and the sensor chip were CM5. The amount of antigen (T4-BSA) immobilized was 100 RU, flow rate: 10 μL / min, binding: 10 min, dissociation: 10 min.
The results of kinetic analysis are shown in Table 3 below.
22G8A2から作製したモノクローナル抗体は、市販抗体よりも解離定数が小さい高親和性の抗体であることがわかった。また、結合速度が市販抗体より約１０倍高いことが分かった。親和性の高く、結合速度の速い抗体が得られたことで、より感度の良いアッセイ系への応用が期待できる。 The monoclonal antibody prepared from 22G8A2 was found to be a high affinity antibody having a smaller dissociation constant than the commercially available antibody. It was also found that the binding rate was about 10 times higher than the commercially available antibody. By obtaining an antibody with high affinity and high binding speed, it can be expected to be applied to a more sensitive assay system.
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