JP2010539994A

JP2010539994A - 大型核酸のアッセンブリー

Info

Publication number: JP2010539994A
Application number: JP2010528976A
Authority: JP
Inventors: ジー．ギブソン、ダニエル; エー．ベンダーズ、グウィネズ; ヤング、レイ; アイ．グラス、ジョン; ベンター、ジェイ．クレイグ; エー．ハッチンソン、Ｉｉｉ、クライド; オー．スミス、ハミルトン
Original assignee: シンセティックゲノミクス、インク．
Priority date: 2007-10-08
Filing date: 2008-10-07
Publication date: 2010-12-24
Anticipated expiration: 2028-10-07
Also published as: IL204892A0; AU2008311000A1; AU2008311000A2; CA2701923A1; EP2207899A4; MX2010003644A; JP5618413B2; US9593329B2; CN101932725A; WO2009048885A2; AU2008311000B2; WO2009048885A3; IL204892B; EP2207899A2; MY161418A; DK2207899T3; CA2701923C; EP2207899B1; US20090275086A1

Abstract

インビトロでカセットを結合してインビボで更に結合される組み立て物を形成すること、あるいは、酵母培養物内の組み換えによって多数のＤＮＡ断片を組み立てることによって、任意の所望の核酸分子を組み立ててかなりのサイズの所望のＤＮＡ分子を取得する方法が記載される。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２００７年１０月８日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６０／９７８，３８８、２００７年１０月２９日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６０／９８３，５４９、２００８年１月２３日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０６２，２１４、２００８年１月２４日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０２３，３９２、及び２００８年９月１１日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６１／０９６，２７０の利益を主張する。これらの出願の内容は、本願に引用によって組み込まれる。

本発明は、インビトロ及びインビボの組み立て（ないしアセンブル）ステップの組み合せを採用することによって大型核酸分子を組み立てる方法、そして、酵母における複数の重複する核酸断片の組み立てに関する。この視点において、本発明は、多数の構成要素から長いＤＮＡ分子を組み立てる酵母の能力を利用する（ないしアクセスする）ことに関連する。

自動化された段階的な合成を使用して、合理的な程度に大きい核酸分子を合成することは可能である。しかしながら、そのような方法が実用的であるための上限は、５−３０ｋｂの大きさ（ないしオーダ）であると思われる。本願発明者らが知る最長の合成ＤＮＡ配列は、Kodumal, S. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101:15573-15578によって報告された、３２ｋｂのポリケチド合成遺伝子クラスターのものである。目的とする多くの核酸分子は、かなり大きく、純粋培地で増殖することが知られた細胞（ゲノムがおよそ６００ｋｂであるＭ．ゲニタリウム（M. genitalium））の最小のゲノムを含む。現在までに報告された完全な合成ゲノムは、ウイルスゲノムのみであり、Cello, J., et al., Science, (2003) 297:1016-1018によるポリオウイルスの合成、Smith, H. O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:15440-15445による合成オリゴヌクレオチドから組み立てたφＸ１７４バクテリオファージの合成、及びBlight, K. J., et al., Science (2000) 290:1972-1974によるＨＣＶの合成を含む。

より大型のＤＮＡ分子を合成することは有益だろう。１つの応用形態（application）では、これを、必須及び必須でない遺伝子の決定の根拠を提供するために実施することができる。他の応用形態では、自然には発生しない完全な合成ゲノムを構築することができる。

本発明において、インビトロ及びインビボの両方の組み立て方法が採用される。インビトロの組み立て方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１３９４に基づくＰＣＴ出願公開ＷＯ２００７／０２１９４４及び、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１２１４に基づくＰＣＴ出願公開ＷＯ２００７／０３２８３７に開示される。

酵母におけるインビボの組み換え(recombination)も知られている。酵母の組み換えは、その後に、プラスミド及び酵母合成染色体(YACs)の構築に適用されている。１９８７年に、Ｍａらは、相同領域（ないしホモロガスな領域）を含む２つの共形質転換された(co-transformed)ＤＮＡ断片からプラスミドを構築した。リンカー媒介組み立て（linker mediated assembly）と呼ばれる他の工程では、酵母において、末端を架橋する短い合成リンカーを使用して、任意のＤＮＡ配列をベクターＤＮＡに連結することができる(Raymond, C. K., et al., Biotechniques (1999) 26:134-138, 140-141; and Raymond, C. K., et al., Genome Res. (2002) 12:190-197)。同様に、４つ又は５つの重複するＤＮＡ断片を組み立て、そしてベクターＤＮＡに連結することができ(Raymond, C. K., et al., Biotechniques (1999) 26:134-138, 140-141; and Ebersol, T., et al., Nucleic Acids Res. (2005) 33 e130)、（ｉ）酵母細胞は複数のＤＮＡ断片（ないし部分）を取り込むことができ、（ii）相同性の酵母組み換えは、複数の断片（pieces）を単一の組み換え分子へ正確に組み入れることに十分に有効であることが実証されている。

以前の研究では、ベクターがヒトゲノムの分節（ないしはセグメント）の側面に末端６０ｂｐの相同性（homologies）(「hooks」)を有する場合に、ヒトゲノムの比較的大型なセグメント(＞１００ｋｂ)を環状酵母ベクターにクローン化できることが確立された(Noskov, V. N., et al, Nucleic Acids Res. (2001) 29:E32)。更に、酵母は、Marschall, P., et al., Gene Ther. (1999) 6:1634 1637に開示されたリニア状（線状）のセントロメアの酵母合成染色体（ＹＡＣ）の少なくとも２ＭｂのＤＮＡを支持（サポート）するだろうということが知られており、そして、このことは、Kouprina, N., et al., EMBO Rep. (2003) 4:257 262によって開示されているように、大腸菌内で不安定な配列をクローン化することに使用されている。

更なる生物の核酸断片を組み換える能力もまた、研究されている。Holt, R. A., et al., Bioessays (2007) 29:580-590は、ラムダレッド組み換えシステム（lambda Red recombination system）を用いて、１８３０ｋｂのインフルエンザ菌のゲノム(Haemophilus influenzae genome)を大腸菌細胞の中で組み立てることを提案している。Itaya, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102:15971-15976、及び、Yonemura, I., et al., Gene (2007) 391:171-177は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)内で大型ＤＮＡのセグメントを組み立てる方法を開発している。これらのＤＮＡ分子は、宿主生物内で、サブフラグメントの段階的な追加の後に限り、１つずつの重複セグメントの追加によって、構築される。

完全なゲノムを製造するための、初期段階におけるインビトロの酵素的な組み換え、及び最終段階におけるインビボの酵母の組み換えの組合せを採用する全体の合成Ｍ．ゲニタリウムのゲノムの組み立ては、Gibson, D. G., et al., Science (2008) 319:1215-1220において、本願発明者らによって開示されている。

［発明の開示］
１つの視点において、本発明は、目的のヌクレオチド配列に基づくか、又は任意の所望のヌクレオチドを有する大型で、任意的に合成的でも良い（optionally synthetic）核酸分子の組み立て方法に関する。該方法は、およそ５０キロベース以上を含む任意の配列に簡単に適用することができる。

一般的には、所望の核酸配列が確認（ないし同定）され、所望の核酸配列用のビルディングブロックを設計（ないしデザイン）するためのテンプレートとして使用される。ターゲット分子は、自然に発生（存在）する配列を含むことができ、あるいは、実施者（practitioner）が設計しても良い。この配列の重複するセグメント（segments）を示すカセット（cassettes）は、全体的な所望の配列をカバーするように設計される。１つの好ましい実施形態では、いくつかのカセットは、確認（同定）できるようにするための透かし配列（watermark sequences）を含むように設計される。透かし配列は、ノンコーディング又は、コーディング配列のいずれかであり得る。典型的には、透かし配列は、最終的な所望の核酸配列に対する生物学的な影響を最小化するように、トランスポゾン挿入を許容（tolerate transposon insertion）することが知られている部位（sites）に配置される。一度設計されると、当該カセットは、個々のヌクレオチドを使用して新たに配列を合成することなどの標準的な技術を使用して合成されるか、又は、天然資源から得られる。

本発明の方法の１つの実施形態において、典型的には２−１０ｋｂの大きさ（ないしオーダ）のカセットは、例えば、前記ＰＣＴ出願公開（複数）に開示された技術に従って、インビトロで組み立てられ、所望のヌクレオチド配列のサブセット（部分集合：subsets）が得られる。所望の配列のより大きな部分を逐次的に（progressively）組み立てるように、いくつかのインビトロステップを実行することができる。このようにして、およそ１００ｋｂのオーダの配列を含むサブセットが得られる。次に、これらの所望の配列のより大型のサブセットは、宿主細胞に導入され、そこで、再結合ないし組み換えられ（recombined）、そして組み立てられる（assembled）。このステップも、所望の大型の核酸分子が完成するまで、必要であれば繰り返される。

合成の核酸カセット及びサブセットは、プラスミド、メガプラスミド、或いは、植物合成染色体、微生物合成染色体、哺乳類合成染色体、酵母合成染色体、サテライト(satellite)合成染色体、ソーセージ(sausage)染色体、ギガ染色体、及びメガ染色体などの合成染色体の形態で製造することができる。原核生物又は真核生物の宿主細胞（大腸菌のような微生物宿主細胞、出芽酵母などの酵母宿主細胞、そしてヨトウガ（Spodoptera frugiperda）などの昆虫宿主細胞を含むがこれらに限定されない）は、両方とも記載の方法で使用することが考慮される。

従って、１つの視点において、本発明は、
所望の核酸分子の合成方法であって、
下記のステップａ）〜ｃ）：
ａ）複数のカセットを提供するステップ、＜但し、ステップａ）において、該カセットの各々は、所望の核酸の一部のヌクレオチド配列を含み、該カセットは、所望の核酸分子のヌクレオチド配列の重複部分（複数）を含み、そして、該カセットは、該重複部分（複数）に従って結合（コンバイン：combine）した場合には、所望の核酸の完全なヌクレオチド配列を提供すること＞、
ｂ）インビトロで前記カセットを結合して、結果として形成される複数のサブセットを得るステップ、＜但し、ステップｂ）において、前記サブセットは、所望の配列の重複部分（複数）を含み、そして、該サブセットは、重複部分（複数）に従って組み立てた場合には、所望の核酸のヌクレオチド配列を提供すること＞、
ｃ）インビボで該サブセット（複数）を組み立て（assemble）て、所望の核酸分子を得るステップ、＜但し、ステップｃ）において、前記組み立て物は、複製起点を更に含むこと＞、
を含む方法に向けられる。

上記のように、ステップｂ)及び／又はｃ)を、オリジナルのカセットのサイズ及び所望の核酸分子の長さに依存して、繰り返すことができる。ステップｃ)の組み立て物は、複製起点を示す追加の核酸配列を含むべきであり、また、セントロメア及び/又は選択可能なマーカーを含むことができる。これらは、別個のベクター（単数又は複数）に存在することができるか、又は、インビボの組み換えにおいて採用される１つ以上のサブセットに含むことができる。

少なくともいくつかのカセットは、組み立てられたサブセット又は所望の核酸の中のカセットを確認（同定）するための役割を果たす外来（foreign）ＤＮＡである「透かし配列」も含むことができる。

他の実施形態では、非常に大きい核酸分子を多数のカセットからインビボで組み立てることができるように、酵母又は他の宿主細胞が重複配列で多数の核酸の断片を組み立てることが可能であることの実証の利点が得られる。従って、他の視点において、本発明は、
宿主細胞において、重複配列を有する少なくとも10個の核酸断片を同時に組み立てる方法であって、下記のステップを含む方法に向けられる：
前記細胞の培養物（ないしは、培養液）を前記複数断片の混合物で形質転換するステップ、＜但し、複製起点をコードするＤＮＡ、そして、好ましくはセントロメア、が前記複数断片の中（among）に含まれること＞、及び
組み立てた複数断片を形質移入した前記宿主又は他の複製細胞を培養するステップ。

１つの実施形態では、選択可能なマーカーが、さらに、複数断片の中（among）に含まれる。

この実施形態の１つのバリエーションにおいて、２つの前記断片は、それらの１つの末端において、エキソヌクレアーゼ活性に対する保護のためのテロメア配列(telomeric sequence)を含む。この実施形態の更なる他のバリエーションにおいて、異なる宿主において作動可能な複製起点を前記複数断片の中に含む。これらのバリエーションは、上記のインビトロ／インビボのステップの組み合わせを採用する方法のインビボのステップ（単数又は複数）にも適用することができる。

インビボ組み換え（recombination）の視点では、断片は、二本鎖又は一本鎖のいずれであっても良い。二本鎖の断片は、一般的には、１００−５×１０^６塩基対であり、一本鎖の断片は、一般的には、より短いが、４０−１０００ヌクレオチドの範囲にわたることができる。断片のサイズの広い範囲は、すべての中間の整数値(intermediate integral value)を含むものとする。もちろん、すべての断片が同一のサイズである必要はなく、サイズが同じ桁（order）の大きさである必要すらない。

従って、この視点において、本発明は、
１０個以上のＤＮＡ断片をターゲットＤＮＡ分子に組み立てる方法であって、下記のステップ（ａ）〜（ｃ）を含む方法に向けられる：
（ａ）宿主細胞の培養物を十分な数の前記１０個の断片（fragments）の各々のコピーを含む混合物で形質転換して、前記培養物の平均の細胞によって異なる断片の数の少なくともおよそ２倍に達する量のコピーを取り込ませるステップ、
＜但し、ステップａ）において、前記断片は少なくとも１０塩基対の重複配列を含み、該重複配列は、配列が重複して所望の順番の組み立て物を提供するように整列し、そして、複製起点が、前記断片の中に含まれること＞、
（ｂ）前記酵母培養物における前記断片の組み立てのために十分な時間を許容するステップ、さらに、
（ｃ）以下のいずれかのステップ：
（i）前記宿主を培養して、回収のための組み立てた核酸分子の十分なコピーを得るステップ、又は
（ii）前記宿主からＤＮＡを抽出し、他の培養物に形質移入して、前記他の培養物が前記回収のための組み立てた核酸分子の十分なコピーを複製するようにするステップ。

選択肢（i）を採用する場合には、複製起点は、宿主細胞において作動可能な複製起点である。選択肢（ii）を実行する場合には、複製起点は、他の培養物と適合可能でなければならない。セントロメアを欠くことの意義は、単純に、複数の娘細胞に分配されるというよりもむしろ複製したＤＮＡが単一の細胞に蓄積することであるので、選択肢（i）を実行する場合には、セントロメアの包含は任意的（optional）である。複数の娘細胞への複製したＤＮＡ分子の分配を保証することは、必ずしも必要ではない。更に選択可能なマーカーを含むことができる。

複製起点（及び／又は２つの任意的な要素‐セントロメア及び選択可能なマーカー）をコードするＤＮＡは、別個の断片、又は組み立てられる１つ以上の断片の部分として、供給される。さらに、以下で説明するように、複製起点として作動（ないし作用）可能（operable）なＤＮＡ配列は、組み立てることが意図される断片において、本来的に発見することができ、別途に供給することは必ずしも必要ではない。

ＤＮＡ分子を、環状の組み立て物に組み込むことができ、かくして、エキソヌクレアーゼ活性から保存することができるか、あるいは、組み立てた断片の２つが、テロメア（複数）によって囲まれたリニアな組み立て物となるように、各々の１つの末端においてテロメアを含んでも良い。

いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーを、断片（複数）の中に含み、培養を選択条件下において実行して、本発明の方法がオリジナルの培養物又は他の培養物のいずれかから組み立てたＤＮＡを回収することをさらに含むようにしても良い。組み立てた断片は、培養物から、又は個別の細胞より生育したコロニーから回収することができる。本発明の方法に従えば、少なくとも１つのターゲットＤＮＡ分子は、１０個以上の断片から組み立てなければならないが、ＤＮＡ分子の複数（multiple）の組み立てを、同一の細胞の中で、同時に行うことができる。

ここで記載した全ての特徴は、上記のインビトロ／インビボ合成の組み合わせの中の最終のインビボのステップにも採用される。

他の視点（複数）では、本発明は、本発明の方法によって合成され、かつ、自然には発生しない合成大型（large）核酸分子に向けられる。一般的には、インビボ組み換えステップ（recombination steps）が、宿主細胞において作動可能な複製起点の包含を少なくとも必要とするので、該方法の結果物は新規である。本発明は、また、本発明の方法によって合成した合成大型核酸分子を含む細胞の培養物及びそのような培養物を使用する方法にも向けられる。

図１は、コンピューターシミュレーションに従った、２５個のＤＮＡ断片のセット全体が取り込まれる（成功の）確率に対する、個々の細胞によって取り込まれたＤＮＡ断片の数のプロットを示す。

図２は、５８２，９７０ｂｐのM.ゲニタリウムＪＣＶＩ−１．０合成ゲノムの図である。

図３は、Ｍ．ゲニタリウム染色体の５段階の組み立ての手法（strategy）を示す。

図４Ａ−４Ｃは、インビトロ組み換えによる、カセットの組み立てを示す。

図５Ａ−５Ｄは、Ａ−、Ｂ−、及びＣ−シリーズの組み立て反応、及びそれらのクローン化された産物の、選択された例のゲル電気泳動解析を示す。

図６は、相同性ではない3´及び5´のＮｏｔＩ配列を含むアニールした連結部の修復を示す図である。3´−ＧＣヌクレオチドは、チューバック反応の間に除去される。修復反応において、5´ＧＧＣＣＧＣのＮｏｔＩ突出部分（overhang）は、Ｔａｑポリメラーゼに含まれる5´エキソヌクレアーゼ活性によって除去される。

図７Ａ−７Ｃは、酵母ＴＡＲクローニング及びクローンの特徴（付け）を示す。

図８は、完全な組み立て物の酵母ＴＡＲクローンのサイズの特徴（付け）を示す。

図９は、酵母における合成Ｍ．ゲニタリウムのゲノムの構築物の図である。

図１０Ａ−１０Ｄは、２５個のDNAのセグメントで形質転換した酵母細胞をスクリーニングする多重（multiplex）ＰＣＲ分析を示す。

図１１Ａ−１１Ｃは、制限分析による、完全に無傷なＭ．ゲニタリウムゲノムの確認結果を示す。

図１２Ａ−Ｂは、図１１で調査したクローン１の更なる解析を示す。

本発明の方法は、単純なインビトロの構築が適用できない十分に大きな核酸分子の容易な構築に適する。現在、およそ３００ｋｂよりも大きい核酸分子のインビトロの組み立ては、問題がある。しかしながら、より大型の断片は、重複する末端を有する配列を組み換えることと、２−１０Ｍｂ以上の大型ＤＮＡ分子を許容すること（tolerating）との両方が可能な適切な宿主細胞での再結合ないし組み換え（recombination）によって組み立てることができる。

従って、本発明の１つの応用は、生物から得られた遺伝情報に基づく合成ゲノム又はゲノム断片の構築に関する。全体（whole）のゲノム由来の遺伝情報は、目的の合成配列を設計するための基盤（ないし基礎）として使用することができる。例えば、哺乳類の全体的な染色体又はその断片の核酸配列は、人工的に生産する構築物のための鋳型であり得る。いくつかの生物からのゲノム配列は、公共的に入手可能であり、開示の方法と共に使用することができる。これらゲノム配列は、アエロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix); アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens); アナベナ(Anabaena); ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae); ミツバチ(Apis mellifera); アクイフェックス・エオリカス(Aquifex aeolicus); シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana); アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus); アシュビア・ゴシピイ(Ashbya gossypii); 炭疽菌(Bacillus anthracis); セレウス菌(Bacillus cereus); バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans); バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis); バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis); バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis); バクテロイデス・テタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron); ヘンセラ菌(Bartonella henselae); 塹壕熱菌(Bartonella Quintana); デロビブリオ・バクテリオボラス(Bdellovibrio bacteriovorus); ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum); ブロヒマニア・フロリダヌス(Blochmannia floridanus); ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica); パラ百日咳菌(Bordetella parapertussis); 百日咳菌(Bordetella pertussis); ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi); ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum); ヤギ流産菌(Brucella melitensis); ブタ流産菌(Brucella suis); ブフネラ・アフィジコラ(Buchnera aphidicola); 鼻疽菌(Burkholderia mallei); 類鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei); ブリグサ線虫(Caenorhabditis briggsae); エレガンス線虫(Caenorhabditis elegans); カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni); カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata); イヌ(Canis familiaris); カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus); クラミジア・ムリダルム(Chlamydia muridarum); クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis); クラミドフィラ・カビアエ(Chlamydophila caviae); クラミドフィラ・ニューモニエ(Chlamydophila pneumoniae); クロロビウム・テピヅム(Chlorobium tepidum); クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum); ユウレイボヤ(Ciona intestinalis); クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum); ウェルシュ菌(Clostridium perfringens); 破傷風菌(Clostridium tetani); ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae); コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens); コクシエラ菌(Coxiella burnetii); クリプトスポリジウム・ホミニス(Cryptosporidium hominis); クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum); シアニディオシゾン・メローラエ(Cyanidioschyzon merolae); デバリオマイセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii); デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans); デスルホタレア・サイクロフィラ(Desulfotalea psychrophila); デスルホビブリオ・ブルガリス(Desulfovibrio vulgaris); キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster); エンセファリトゾーン・クニクリ(Encephalitozoon cuniculi); フェカリス菌(Enterococcus faecalis); 軟腐病菌(Erwinia carotovora); 大腸菌（Escherichia coli）; フフソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum); ニワトリ(Gallus gallus); ジオバクター・スルフレデュセンス(Geobacter sulfurreducens); グロエオバクター・ビオラセウス(Gloeobacter violaceus); ギラルディア・テータ(Guillardia theta); 軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi); インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae); ハロバクテリウム（Halobacterium）; ヘリコバクター・ヘパティカス(Helicobacter hepaticus); ピロリ菌(Helicobacter pylori); ヒト(Homo sapiens); クリベロミセス・ワルティー(Kluyveromyces waltii); ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii); ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum); レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila); レイフソニア・キシリー(Leifsonia xyli); ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis); レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans); リステリア・イノクア(Listeria innocua); リステリア菌(Listeria monocytogenes); イネいもち病菌(Magnaporthe grisea); マンヘミア・サクシニシプロデューセンス(Mannheimia succiniciproducens); メソプラズマ・フローラム(Mesoplasma florum); メソリゾビウム・ロチ(Mesorhizobium loti); メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカ(Methanobacterium thermoautotrophicum); メタノコッコイデス・ブルトニイ(Methanococcoides burtonii); メタノコッカス・ジャナシイ(Methanococcus jannaschii); メタノコッカス・マリパルディス(Methanococcus maripaludis); メタノゲニウム・フリギダム(Methanogenium frigidum); メタノピルス・カンドレリ(Methanopyrus kandleri); メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans); メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei); メチロコッカス・カプスラタス(Methylococcus capsulatus); マウス(Mus musculus); マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis); らい菌(Mycobacterium leprae); ヨーネ菌(Mycobacterium paratuberculosis); 結核菌(Mycobacterium tuberculosis); マイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum); マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium); マイコプラズマ・ミコイデス(Mycoplasma mycoides); マイコプラズマ・ペネトランス(Mycoplasma penetrans); マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae); マイコプラズマ・プルモニス(Mycoplasma pulmonis); マイコプラズマ・モービレ(Mycoplasma mobile); ナノ古細菌(Nanoarchaeum equitans); ネイッセリア・メニンギチディス(Neisseria meningitides); アカパンカビ（Neurospora crassa）; ニトロソモナス・ユーロピア（Nitrosomonas europaea）; ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）; オセアノバシラス・イヘエンシス(Oceanobacillus iheyensis); タマネギ萎黄病菌（Onions yellows phytoplasma）; イネ(Oryza sativa); チンパンジー(Pan troglodytes); パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida); 白色腐朽菌(Phanerochaete chrysosporium); フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens); ピクロフィラス・トリダス(Picrophilus torridus); 熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum); プラスモディウム・ヨエリ (Plasmodium yoelii yoelii［sic, Plasmodium yoelii］); ポプルス・トリコカルパ(Populus trichocarpa); ジンジバリス菌(Porphyromonas gingivalis); プロクロロコッカス・マリナス(Prochlorococcus marinus); アクネ菌(Propionibacterium acnes); プロトクラミジア・アモエボフィリア（Protochlamydia amoebophila）; 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa); プチダ菌(Pseudomonas putida); シリンゲ菌(Pseudomonas syringae); ピロバクルム・アエロフィルム(Pyrobaculum aerophilum); パイロコッカ・アビシ(Pyrococcus abyssi); パイロコッカ・フリオサス(Pyrococcus furiosus); パイロコッカ・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii); ピロロブス・フマリイ(Pyrolobus fumarii); 青枯病菌(Ralstonia solanacearum); ラット(Rattus norvegicus); ロドピレルーラ・バルティカ(Rhodopirellula baltica); ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris); リケッチア・コノリイ(Rickettsia conorii); リケッチア・チフィ(Rickettsia typhi); 発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii); リケッチア・シビリカ(Rickettsia sibirica); 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae); サッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora erythraea); サルモネラ菌(Salmonella enterica); ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium); 分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe); シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis); シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneria [sic, Shigella flexneri]); アルファルファ根粒菌(Sinorhizobium meliloti); 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus); 表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis); ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae); ミュータンス菌(Streptococcus mutans); 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae); 化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes); ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）; ストレプトマイセス・アヴェルミチリス(Streptomyces avermitilis); ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor); スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus); スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii); シネココッカス(Synechococcus); シネコシスティス(Synechocystis); タキフグ・ルブリペス(Takifugu rubripes); テトラオドン・ニグロビリディス(Tetraodon nigroviridis); タラシオシラ-シュードナナ(Thalassiosira pseudonana); サーモアナエロバクター・テンコンジェンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis); サーモプラズマ−アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum); サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium); サーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongates); サーモトガ・マリティマ(Thermotagoa maritime); サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus); トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola); 梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum); トロフェリマ・ウィッペリ(Tropheryma whipplei); ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum); コレラ菌(Vibrio cholerae); 腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus); ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus); ウィグレスウォルチア・グロスインディア(Wigglesworthia glossinidia); ウォルバキア・ピピエンティス(Wolbachia pipientis); ウォリネラ・スクシノゲネス(Wolinella succinogenes); かいよう病菌(Xanthomonas axonopodis); ザントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris); ピアス病菌(Xylella fastidiosa); ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）; 仮性結核菌(Yersinia pseudotuberculosis); 及びペスト菌(Yersinia pestis)から得られる情報を含むが、それに限定されない。

更に、本願に記載の方法は、とうもろこし及びコメのような高等植物、マウス、豚、牛及びコンパニオンアニマルのような哺乳動物等の多細胞生物を特徴付けるものを含む現在公開されていない核酸配列が、利用可能になった場合に、同様に適用することが可能である。これらの多くは、現在では利用可能である。

本発明の方法の以下の実施例及び考察を読めば、これらの適応性は、天然に存在するものを模倣する合成ゲノムを構築することに限られないことは明白である。より大型のＤＮＡ分子の構築に有用な最初のカセットは、実施者が所望する任意の仕方で選択することができる。従って、種々の生物のゲノムの一部（portions）を、同一のＤＮＡ分子に含むことができるか、又は、任意のデザインのカセットを採用することができる。オリジナルのカセットは、自然に発生（存在）するＤＮＡから、又は、ＲＮＡの逆転写によって、合成することもできるし、単離することもできる。

この方法に従って、単純に個々の代謝経路のメンバーを組み立てること、又は、複数の代謝経路を組み立てることも望ましい。天然に存在しない代謝経路をこのようにして構築することができる。従って、１つの生物に存在し、下流の酵素を欠く異なる生物によって製造される所望の基質に作用する酵素は、両方の酵素をコードする組み立て物を構築するお陰で同一の生物にコードすることができる。従って、複数の酵素を含んで、複雑な代謝経路を構築することができる。更に、組み合わせライブラリーは、断片（ここで、１つ以上の断片は、同一の重複配列（overlapping sequences）を有するが、酵素又は他のタンパク質をコードする異なる介在配列を有する）を混合することによって調製することができる。

遺伝経路は、組み合わせライブラリーの各メンバーが遺伝子変異体の異なる組み合せを有するような組み合せ様式で構築することができる。例えば、５つの断片から組み立てられ、そして、５個の各々の断片が６つの変異体を有する６^５個の変異体の組み合わせライブラリーは、３０個の個々のDNAエレメントから構築することができる。

１つの実施形態において、本発明の方法は、２つの合成の段階を採用する。最初の段階において、比較的小さい（small）核酸分子がインビトロライゲーション反応において組み立てられる。前記ＰＣＴ出願公開（複数）に開示の方法においては二重鎖DNAが使用されるが、しかしながら、これら及びその他の方法が一本鎖ＤＮＡを組み立てることに使用することができる。一本鎖又は二本鎖ＤＮＡについては、これらの方法に加えて、等温性の方法も使用できる。１つの形態において、二本鎖核酸の操作が可能な有効な反応組成物が使用される。それは、３つの酵素−Ｔ５エキソヌクレアーゼ、進行性ポリメラーゼ（processive polymerase）及びＴａｑリガーゼを採用する。このシステムの詳細は以下のとおりである：反応混合液は、Ｔ−５エキソヌクレアーゼ、Phusion（登録商標）ポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、ＩＳＯバッファー(Tris pH 7.5、MgCl₂、dNTP's、NAD、DTT、PEG 8000)などの適切なバッファーを含み、そして、組み立ては、１時間以内の時間で、等温条件下で起こる。この反応混合液を凍結し、オリゴマーの断片（その二重鎖の形態を含む）に反応混合液を加え、そして５０℃で１０−６０分間インキュベートすることにより直接的に使用することができる。この組成物を使用する方法は、Ｔ−５エキソヌクレアーゼが、二重鎖の１つの鎖をチューバック（chew back）して、重複配列を露出させるので、二本鎖核酸を採用する。次に、Phusion（登録商標）ポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼは、重複鎖のアニーリングの後に、修復の作用を行う。ＩＳＯバッファーの組成の典型的な濃度は、100mM Tris-Cl、5% PEG 8,000、10mM MgCl₂、10 mM DTT、1 mM NAD、及び 200 μM dNTP'sである。

第２段階において、所望の配列のより大型のサブセットが得られた場合には、インビボの組み換え技術が採用される。場合によって、特に、サブセットが比較的小さい場合には、原核生物の細胞を使用することができる。しかしながら、より大型なサブセットのライゲーションのためには、真核生物のシステム、特に酵母が好ましい。インビボ組み換えの特徴は、以下に記載の完全なインビボのアセンブリを採用する他の実施形態に関連して詳細に検討する。

複数のＤＮＡ断片（一般的に、１０個以上のＤＮＡ断片）のインビボのアセンブリを、以下では、酵母を宿主培養物（液）として用いて例示する。しかしながら、デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus Radiodurans)などの他の宿主で、酵母を置換することができる。組み換えを促進することができる他の生物が知られている。

更に、相同性でない連結（non-homologous enjoining）を起こすことが知られる遺伝子を変異させること、又は削除することは、有利であり得る。出芽酵母においては、これらの遺伝子は、Ｋｕ及びＤＮＡリガーゼIV、並びにＲａｄ５０、Ｍｒｅｌｌ、そしてＸｒｓ２を含む。このことは、望ましくない組み換えの背景（ないしバックグラウンド）を最小化するだろう。

従って、酵母における、複数の断片の組み立ての実証は、説明のみのためである。本願で定義の場合に、「閉鎖」（close）培養物とは、組み立てのために、断片が形質移入された培養物である。そして、「他の」（alternate）培養物とは、更なる複製のために、組み立てられたＤＮＡを移入することができる、他のタイプの生物又は細胞の培養物を意味する。

酵母で説明したようなインビボの組み換えの使用は、単一の効果的な組み立てステップでの複数のＤＮＡ断片の組み立てのための強力なツールを提供するため、他の実施形態においては、インビトロのサブセットの組み立ての前もった実施は、採用されない。この実施形態は、複数の断片を吸収して組み換えて、この組み換えの結果生じる大型の組み立て物を許容して増殖する酵母又は他の宿主の能力の利点を利用する。インビボの組み立ては、１０−５００と同等数の断片の組み立てに適する。以下に説明するように、２５個の断片の組み立てが成功したことが実証されている。記載した基本的な技術は、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００のそのような断片を組み立てることができる。組み立てられる断片は、二本鎖であって、１００−５×１０^６塩基対、又は、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００又は１０^６を含む任意の中間の数の塩基対を含むことができ、あるいは、一本鎖であって、４０−１０００個のヌクレオチド又は、１００若しくは５００のような中間の任意の整数値のヌクレオチドを含むことができる。組み立てられる［断片の］好ましい数は、その断片自身のサイズに依存し得る。上記の様に、全ての断片が、同一サイズである必要はなく、また、同じ桁の大きさである必要すらない。従って、単一の混合物中の断片（の寸法）は、その範囲にわたって変動することができる。非常に大型の組み立て物を許容することができる。

任意のサイズの構築物は、サブフラグメントが核に入ることができる限り、酵母細胞内で組み立てることができ、そして構築されたＤＮＡセグメント（segment）は、完全にかつ正確に複製され、宿主細胞への毒性を発生しない。

酵母内で組み立てられた分子のＤＮＡ複製は、高度に保存され、必須のＡエレメント又は自己複製配列(ARS)の共通配列(5'-^T _ATTTA^T _C ^A _GTTT^T _A-3') に依存する(Bell, S. P., Curr. Opin. Genet. Dev. (1995) 6:1634-1637参照)。統計的には、この配列は、全ての４つの塩基が等しく現れる場合、組み立てられた構築物の内で、〜２６２ｋｂに１回存在するべきである。上記のように、これら複製起点は、組み立てが望まれる断片に自動的に存在することができるため、特定の複製起点の計画（意図）的な供給を必ずしも必要でなくすることができる。以下の実施例４の説明において、これらエレメントは、ゲノム自体が高いＡ＋Ｔの組成を有するM.ゲニタリウムのゲノムを表す断片において、より頻繁に存在するべきである(平均で２６．９回、あるいは〜１６ｋｂに１回)。これは、ベクターから２つを含むゲノムを組み立てたＡＲＳ共通配列の２０個の事例があることとして確認されている。これは、有効な複製起点を欠く１７０ｋｂのＹＡＣが、酵母において細胞周期チェックポイント(checkpoint)の応答を引き起こすことができることが示されているので、重要な考察（事項）である(van Brabant, A. J., et al., Mol. Cell (2001) 7:705-713)。

従って、５Ｍｂと同程度から２０Ｍｂまでの組み立て物を、酵母において組み立てることができ、そして本発明の方法のインビボの視点は、本発明の方法を使用して、６−１０００、又は中間の数の独立のＤＮＡ断片を組み立てて、２０Ｍｂくらいの長さの配列を組み立てる機会を提供する。

宿主に関わらず、組み立てを生じさせるためには、組み立てられるべき断片は、それらの末端で重複する配列を含まなければならない。１つの実施形態においては、重複は約１０ｂｐであり、他の実施形態においては、重複は１５、２５、５０、６０又は８０ｂｐそして、この範囲内の全ての整数の［塩基対］であり得る。全ての断片の重複の長さは、全て同じである必要はない。しかしながら、誤った組み立てを回避するために、個々の重複（部分）は、断片間で重複するべきではない。

インビボの組み立ての方法において、組み立てられる全ての断片の混合物は、標準の形質転換技術を使用して、宿主である組み換え及び組み立て細胞に形質移入することに使用される。混合物中の断片分子数の、形質転換される培養物中の細胞の数に対する比率は、少なくともいくつかの細胞が、混合物中に存在する異なる断片よりも、多くの断片の分子を取り込むことができるように、十分に高くなければならない。以下の実施例においてこのことが説明される。すなわち、以下の実施例では、２５個の異なる断片を含む混合物に関し、平均の細胞が少なくとも４０個の断片を吸収するのに十分な断片分子が混合物中に存在することが見積もられており、この説明において、およそ１０００個に１個の細胞が、２５個の異なった断片の各々を含む。しかしながら、平均的細胞が少なくとも１００個の断片を取り込むように取り込みのレベルを増強させることによって、十分に高い割合の細胞が、２５個の異なった断片全てを含有するだろう。平均的細胞によって取り込まれる数が大きければ大きいほど、各異なった断片を代表する１つが、その取り込まれるものに含まれる可能性が大きくなる。

従って、１０個の断片の組み立てのためには、混合物が十分な数の断片分子を含み、１５−２０個の断片を含む平均的細胞を提供することが望ましく、同様に、１００個の異なる断片がある場合には、１つの実施形態において、平均細胞が１５０−２００の断片を取り込むために十分な濃度の混合物が供給されることが望ましい。

実施可能な方法を提供するために、組み立てられる断片は、複製起点を提供するＤＮＡを含まなければならず、任意であり好ましくはセントロメア、そして、任意であり好ましくは選択可能なマーカーを含むべきである。複製起点は、複製を実行することを意図した最初の又は他のタイプの細胞においてのみ作動可能（operable）であってよく、あるいは、シャトルベクターは、例えば、最初の宿主における複製、そして、次に、大腸菌又はバチルスなどの他の宿主への形質移入の両方ができるようにするために使用することができる。単一の断片の１つに、これらエレメントの２つ、又は３つの全てを含むことは、都合がよいが、必ずしも必要ではない。これらのエレメントが存在する場合には、組み立てられた配列を複製することができた細胞のみが回収される。テロメアによって保護されていないリニア状のＤＮＡは消化を受けるため、組み立てられた環状のＤＮＡ又は、テロメアで保護した組み立てＤＮＡのみが生存し、複製する。

複製起点は、実施者により選択された一つであり得、組み立てが望まれる断片の一つに含むこと、あるいは、組み立てに含まれる別のベクター断片上に含むことができる。しかしながら、断片の性質次第では、断片自身に常在する複製起点として作動（機能）することができる配列が同時に存在することに起因して、追加の複製起点が必要でない場合もあろう。実際には、むしろ、そのような配列が実際に生ずる高い可能性がある。

セントロメアの存在は、複製されたＤＮＡが、複製中に母細胞と娘細胞の間で分配されることを単に保証するに過ぎない。いくつかの実施形態では、組み立てられたＤＮＡの複数のコピーが、同じ細胞に残り、さらに効率的に回収されるようにすることができる。従って、セントロメアの存在は好ましいが、それが必要不可欠であるということではない。同様に、選択可能なマーカーの存在は任意的（optional）であるが、ＤＮＡを環状パターンに組み立てた、あるいは、ＤＮＡがテロメアで保護された細胞において、成功した変異体の回収を容易にする。

いくつかの実施例では、環状ＤＮＡは、上記のように形成される。しかしながら、他の実施形態では、酵母ゲノム自身の消化から保護されたリニア状の分子を組み立てるように、酵母ゲノム自身を模倣して、２つの断片にテロメアを供給することができる。そして、選択可能なマーカーは、成功したコロニーの同定を容易にする。

いくつかの実施形態では、単一の宿主細胞において断片から単一のターゲットＤＮＡ分子のみを形成するというよりはむしろ、複数の断片組み立て物が得られる。従って、例えば、２つの別々の産物（一方は１０個の断片から組み立てられ、他方が５個の断片から組み立てられた産物、あるいは、一方は２０個の断片から組み立てられ、もう一つは５０個の断片から組み立てられた産物）が、一つの宿主細胞において形成され得る。

１つの実施形態では、成功裏に組み立てられた環状の又はテロメア−保護されたＤＮＡ配列を有する細胞は、宿主内で増殖し、そして、宿主培養物、あるいは、個々の宿主細胞コロニー（colonies）から得られた培養物（複数）から単離される。他の一実施形態では、宿主培養物を断片の混合物と共に短時間(およそ１５分から２時間)処理し、次に、全てのＤＮＡを抽出し、大腸菌又はバチルスなどの他の細胞種に形質移入する。この実施形態では、他の細胞種に適切な複製起点を含むベクターが利用される。いくつかのケースにおいて、この実施形態は、これらの他の細胞の複製時間の短縮に起因して、十分な量の組み立てられたＤＮＡの回収に必要な時間を短縮するという利点を有する。例えば、酵母では、分析のために十分な組み立て物の分子を得るためには２−３日間が必要であるが、これに対し、大腸菌の複製時間は、数時間のうちでそのような回収ができるようにする。

成功裏の再組み立てを提供するためには、処理した培地に含まれるほんの少しの割合（percentage）の細胞が、十分な数の断片を取り込み、それらを組み換える必要がある。組み立てが生じていない細胞中のＤＮＡは、複製されないから、［組み立てが］失敗した細胞は、培地内に現れないだろう。上述のように、所望であれば、いくつかの実施形態において、ＤＮＡが抽出される細胞を、所望の構築物を有する細胞に限定する、追加的で、おそらくは冗長的な方法を提供するように選択可能なマーカーをも含むことができる。

複数のＤＮＡの断片の単一の環状の、又は、テロメア−保護された分子（telomere-bracketed molecule）への組み立ては、任意の所望の組み立て物の構築のために使用することができる。以下に示すM.ゲニタリウムなどの天然に存在するゲノムは、この様式で組み立てることができ、そのため、合成的に調製することができる。

大腸菌のゲノム又はインフルエンザ菌（H. influenzae）等の他のゲノムなどの他のゲノムはこの様式で組み立てることができるであろう。複数の断片を組み立てる宿主の能力のため、単純にゲノムを単離して、それを最初の宿主において複製することは可能であるだろうが、ゲノムを生物から完全な形（無傷：intact）で抽出する必要はない。分離された形態（disassembled forms）は、自動的に、再組み立てに必要とされる重複配列を含むだろう。

十分量のＤＮＡ分子の組み立ての際に、それらを、宿主又は他の宿主細胞培養物から回収することができる。標準的な単離技術が採用され、これらの単離技術は本発明の分野において周知である。「単離された」とは、ＤＮＡがその自然環境の外に存在することを意味する。従って、この意味において、再組み立てが起こった培養物に含まれる再組み立てされたＤＮＡでさえ、「単離された」と考えることができる。しかしながら、これらの細胞からのＤＮＡの回収は、組み立てられたＤＮＡの更なる操作のために、あるいは、動物、植物又は昆虫細胞を含む他の細胞内で培養するために望まれ得る。

酵母のような宿主細胞培養物を形質転換するために必要な断片の濃度の決定は、上記のように、実験的に（ないし経験的に）決定される。細胞が複数存在すること（multiplicity of cells）は、十分な数の細胞が適切な数の断片を取り込むことを保障するために必要とされ、この取り込みを生ずるように十分な断片を供給しなければならない。本願明細書における下記実施例４において達成されるような、２５個の断片の組み立て物（assembly）に関する説明的な決定は、次のように説明される。

この説明において、個々の宿主細胞は、２５個の断片の完全な組み立て物を構築するためには、２５個のＤＮＡ断片の各々を、少なくとも１つずつ取り込まなければならない。細胞が無作為に正確に２５個の断片を取り込む場合には、細胞が各々を１つずつ取り込む可能性は、２５！（２５の順列）／２５^２５＝１．７×１０^−１０であり、非常にまれな出現率（occurrence）である。従って、平均の宿主細胞が実質的に２５個を上回る断片を取り込むことが望まれる。宿主細胞が、無作為に、Ｎ＞２５個の等しく現れる断片を取り込む場合には、全ての２５個の異なる断片を得る可能性はどれくらいだろうか？。「収集者の問題」のこのバージョンに関する解答は、全体的な範囲の可能性にわたって計算することが難しいが(Feller, W.,An Introduction to Probability Theory and Its Applications (1950) Wiley, New York)、しかしながら、おおよその答えは、図１（Ｙ軸は、成功の確率を示し、Ｘ軸は、宿主細胞によって取り込まれるコピー数を示す）に示すように、コンピューターシミュレーションによって容易に得られる。このプロットを得るために、対象物（object）を引くごとに対象物を置き換えつつ、２５個の対象物（ＤＮＡの断片）のバッグからのＮ回引き（draws）を行った。この試みは、全ての２５個の対象物を少なくとも１回引いた場合に、成功とした。各Ｎについて多数の試みを実行して、本当（true）の成功確率の良い近似値を得た。図１は、１つの細胞が〜９０個の断片を取り込む場合には、２５個全ての異なる断片を取り込む可能性が５０％あることを示す。平均の細胞が４０個の断片しか取り込まない場合であっても、１０^８個の宿主細胞をＤＮＡに曝せば、およそ１０００個に１つは、完全な断片のセットを得るだろう。

酵母及び他の組み立て宿主（assembly hosts）におけるＤＮＡの取り込みと組み立ての効率は知られていない。組み換えが高い効率である場合には、母集団の中のわずかな細胞のみが、重複する断片の完全なセットを取り込むことが必要であろう。効率が低い場合には、比較的より多くの細胞が完全なセットを必要とするだろう。

本発明の方法を使用して任意の大型ＤＮＡ分子を組み立てることができる。１つの特に有用な応用は、微生物からのゲノムの組み立て（assembly）である。１つの応用において、組み立てられるべき配列は、１つの組織（ないし生物）の全体的なゲノム又はその分画のヌクレオチド配列を含むことができる。記載の方法によって組み立てられるヌクレオチド配列は、原生生物界、古細菌、真正細菌、真菌、植物(Platae［sic,Plantae］)あるいは動物などの、任意の生物から得ることができる。ウイルスゲノムからの配列情報も、記載の方法で使用することが考慮される。

インビトロ／インビボ合成方法の組み合せ、又は、全てインビボで組み換え合成する方法のいずれかに関して使用されるときには、「カセット」（cassette）は、単一のヌクレオチド（複数）から合成されたか、制限消化したゲノムＤＮＡの分画によって生物自身のゲノムから取得されたか、あるいは生物のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから得られた所望のターゲット核酸分子の配列の一部を含む出発（starting）核酸分子を意味する。典型的には、最初の（initial）カセットは、およそ２−１０ｋｂのオーダ及び全ての中間値であり、好ましくは、およそ５ｋｂのオーダである。これらのカセットは、より小さいオリゴヌクレオチドの連結によっても、組み立てることができる。典型的には、このカセットは、二本鎖であるが、一本鎖のカセットも同様に使用することができる。用語「カセット」は、インビトロのライゲーションの方法から得られる出発カセットの更なる組み合わせも含む。所望の配列の最初の部分のインビトロライゲーションによって取得可能なカセットは、典型的には、およそ１５ｋｂからおよそ２００ｋｂまでの範囲及びその間の全ての中間値にわたる。これら組み立て物は、「カセット」、又は「サブセット」のいずれかと称することができ、ここで、「サブセット」とは、所望のターゲット核酸分子の配列のサブセットを意味し、所望のターゲット核酸分子は、インビトロ／インビボの方法における、インビボの組み換えに使用する断片を意味する。

「サブセット」は、インビトロ／インビボの方法における、インビボの組み換えに適する大きさのカセットの組み立て物を意味する。これらも一本鎖又は二本鎖であり得る。ターゲット核酸分子のサイズに依存して、そのようなサブセットは、典型的には、５０−５００ｋｂの範囲内及びこれらの両端値の間の整数値である。従って、この、本発明の方法の実施形態は、最初のカセットで開始し、その組み立て物を介して、次にインビボで組み立てられる「サブセット」（複数）に結果としてなる。インビトロにおいておよそ７５−２００ｋｂのサイズまでカセットを組み立てて、次に、インビボにおいてこのサイズのサブセットの組み立てをさらに実行することは、好都合であるが必要ではない。

下記実施例１−３において記載のように、Ｍ．ゲニタリウムＪＣＶＩ−１．０の染色体全体は、Ｍ．ゲニタリウムＧ３７に基づいて調製され、そして、ＴＡＲＢＡＣクローニングベクターを使用して酵母で増殖された。この構築物は、既に報告されている合成ＤＮＡ産物よりも大きい大きさの桁（オーダ）を上回る。この染色体を受容性のマイコプラズマの細胞質に導入して、生きた「合成の」細胞を生産することができる(Lartigue, C., et al., Science (2007) 317:632-638)。この合成染色体は、トランスポゾン挿入を許容する配列である遺伝子間において５つの短い透かし配列を含み、そして、これら挿入配列が生存能力に影響するとは予測されない。遺伝子ＭＧ４０８の中に、病原性を除く目的の挿入配列もあり、合成ゲノムは、移植実験における選択に使用することができるアミノグリコシド耐性遺伝子を保有する。特に、この挿入配列が生存可能なＭ．ゲニタリウム株に存在ので、生存能力に影響を与えることは予測されない。

インビトロの手順の効率は、組み立て物がより大型になるときに低下する。これは、反応中に、環状の形態よりも優先的に形成され得るコンカテマーの形成が原因であり得る。更に、大型の微生物の合成染色体（ＢＡＣ’ｓ）（＞１００ｋｂ）は、より低い効率で形質転換される。Shengらは、同一の大腸菌のレシピエント株において、８０ｋｂのＢＡＣよりも３０倍も低い効率で２４０ｋｂのＢＡＣが形質転換されることを発見した(Sheng, Y., et al., Nucleic Acids Res. (1995) 23 : 1990-1996)。

下記実施例２及び４では、インビボ酵母組み換えを使用した。実施例２において、各々が隣接する断片に対する末端の８０ｂｐの相同配列（homologies）を有する重複断片を効率的に組み立てて、次に酵母における形質転換関連組み換え(transformation associated recombination)（ＴＡＲ）メカニズムによって、重複するベクターDNAに連結した。２つの１／４（two quarters）のＭ．ゲニタリウムゲノムは、酵母ベクターにおいて、半分のゲノムとして効率的にクローン化することができ、そして、さらに驚くべきことに、４つの１／４のゲノムは、組み換えられて、１つの全体ゲノム（whole genome）としてクローン化された。

合成染色体の構築及びマイコプラズマ種への移植が成功することは、合成ゲノムのアプローチを使用して最小の細胞を作製する試みの第１のステップである。カセットをベースとする組み立て手法（strategy）は、最小の細胞の構築を容易にする。推定上の不必要（dispensable）な遺伝子を、個々のカセットから削除することができる。次に、ネイティブなカセット及び削除されたカセットの混合物を、組み立てることができる。このアプローチは、完全にネイティブなゲノムから広範囲に削除されたゲノムにわたる個々のメンバーを有するライブラリーを作製するだろう。レシピエントたるマイコプラズマへのゲノムライブラリーの移植は、多くの新しい生存可能な変異体を産出するだろう。その際には、移植されたゲノムＤＮＡのゲル電気泳動は、減少したゲノム、又は、おそらく最小であるゲノムとしての研究のために、最小のゲノムを選択することに使用することができる。

Ｍ．ゲニタリウムＪＣＶＩ−１．０は、終止コドン（ＵＧＡ）のトリプトファンへの特定の使用を有する小さいゲノムである。Ｍ．ゲニタリウムの大部分のタンパク質は切断される（truncate）から、これは、大腸菌や他の生物におけるクローニングを低毒性にする。他の構築物がこのコードを使用する場合には、合成細胞を生産する移植は、適切にＵＧＡをトリプトファンに翻訳することができる細胞質において実行する必要があるだろう。適切なコドンの使用を有する受容性の細胞質がある限り、他のコドン変化を使用することができるかもしれない。

下記の実施例において、目的は、正確な設計した配列を有する５８２，９７０塩基対の長さのクローン化した合成ゲノムを生産することであった。いくつかの仕方で、実際の配列と設計した配列との間で、カセットを調製することに使用する配列におけるエラー、生産されたカセットにおけるエラー、及び組み立て接合部の修復の間に起こるエラーを含む差（エラー）が起こり得るので、このことはささい（trivial）なことではない。大腸菌又は酵母における組み立て物の増殖もエラーに導き得る。後の２つの（エラーの）例では、エラーは組み立ての後期の段階で生じ得るだろう。従って、組み立て中のいくつかの時点で、ゲノム組み立てクローンをシーケンスすることは、賢明である。下記の実施例において、上述の全てのタイプのエラーが発見されたが、エラーの数は小さく、それらは成功裏に訂正された。

例えば、下記のＣ５０−Ｃ７７の１／４分子のシーケンスの確認中に、２つの単一塩基対の欠損を検出した。１つは、カセット５４における合成エラーであることが追跡された。カセット６８におけるエラーは、間違った配列がこのカセットのシンセサイザー（synthesizer）へ伝達したので生じた。カセット５４のエラーは、シンセサイザーによって訂正した。カセット６８は、エラーを含む制限断片を新しく合成された断片で置き換えることによって訂正した。Ｃ５０−７７は、再組み立てを行って、シーケンスした。２つのエラーは訂正したが、２つの新しい単一塩基の置換エラーが出現した。連結部分におけるＴａｑポリメラーゼの取り込みミスは、これらのエラーの１つを起こしやすい。他の残りのものは未解明であるが、大腸菌における増殖中に生じたものであり得る。１つの最終的な再組み立ては、全体の染色体を組み立てることに使用したＣ５０−Ｃ７７の正しい配列を産出した。

調製Ａ
Ｍ．ゲニタリウムゲノム配列の確認

Ｍ．ゲニタリウムＧ３７ゲノムは、１９９５年に最初にシーケンスされた。しかしながら、配列内のエラーが生存できない合成ゲノムになり得るので、ゲノムは単離され、再シーケンスされた。決定した配列は、オリジナル（最初）の配列と、３４箇所で異なった。See Glass, J. I., et al., PNAS (USA) (2006) 103:425-430参照。この改定したシーケンスは、生存可能なＭ．ゲニタリウムＧ３７ゲノムを正確に特定する。

以下の実施例は、説明のために提供されるが、この発明を限定せず、完全なＭ．ゲニタリウムゲノムの合成を詳細に記載する。実施例１−３で提供されるインビボ／インビトロ合成の組み合わせにおいて、合成の概要は以下のように概説することができる：

合成の５８２，９７０塩基のマイコプラズマ・ゲニタリウムＪＣＶＩ１．０ゲノムは、病原性を遮断するために破壊したＭＧ４０８を除いた、野生型のＭ．ゲニタリウムＧ３７の全ての遺伝子を含む。このゲノムはまた、ゲノムの構成物としての同定のために、許容性トランスポゾン挿入配列として知られる遺伝子間の部位に位置する追加の「透かし」配列も含む。抗生物質耐性マーカーは、選別を可能にするために含まれる。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられた５−７ｋｂの重複する「カセット」を、インビトロで連結して、大腸菌において細菌性合成染色体(BAC)として全てクローン化した〜２４ｋｂ、〜７２ｋｂ(「１／８ゲノム」)、〜１４４ｋｂ(「１／４ゲノム」)の中間の組み立て物を生産した。これらの中間のクローンの大部分をシーケンスし、そして正確な配列を含む１／４ゲノムの４つの全てのクローンを同定した。完全な合成ゲノムを、出芽酵母における組み換え関連形質転換(ＴＡＲ)クローニングによって組み立てて、次に、単離し、シーケンスした。正確な配列を含むクローンを同定した。この合成M.ゲニタリウムゲノムも、単離できる。

図２は、合成ゲノムを示す。図２に示す特徴は、透かし配列、アミノグリコシド耐性マーカー、生存可能なＴｎ４００１トランスポゾン挿入配列の位置、全体ゲノム配列を含む重複する合成ＤＮＡカセットの位置、４８５個のM.ゲニタリウムタンパク質をコードする遺伝子の位置及び、４３個のＭ．ゲニタリウムｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び構造上の（structural）ＲＮＡ遺伝子の位置、を含む。

図３は、全体的なプランを示す。最初の組み立て段階において、４個のカセットを連結し、およそ２４ｋｂの長さのＡ−シリーズの組み立て物を作製した。次の段階では、３個のＡ−組み立て物を一緒にして、合計８個のおよそ７２ｋｂのＢ−シリーズの組み立て物を作製した。１／８ゲノムであるＢ−組み立て物を一度に２つ採用して、１／４ゲノムであるＣ−シリーズの組み立て物を作製した。これらの組み立て物は、全てインビトロ組み換えによって作製し、ＢＡＣベクターを使用して大腸菌にクローン化した。半分のゲノムと、全長（full）ゲノムの組み立て物は、インビボの酵母組み換えによって作製した。太いボックス内の組み立て物をシーケンスし、その正確性を確認した。

最初の段階では、４個の隣接するカセットのセット（sets）を下記ようなインビトロ組み換えによって組み立てて、ＢＡＣベクターＤＮＡに連結して、〜２４ｋｂの挿入配列を有する環状化した組み換えプラスミドを形成した。例えば、カセット１からカセット４を一緒に連結してＡ１−４組み立て物を形成し、カセット５からカセット８を組み立ててＡ５−８を形成した。カセット４０及び４１を合併してラベルした単一のカセット４１＊を形成したため、１０１個のオリジナルなカセットは１００個まで減少し、２５個のＡ−シリーズの組み立て物（assemblies）が産出した。第２の段階において、２５個のＡ−シリーズの組み立て物を、１度に３個採用して、Ｂ−シリーズの組み立て物を形成した。例えば、Ｂ１−１２を、Ａ１−４、Ａ５−８及びＡ９−１２から構築した。１つの例外は、５個のＡ−組み立て物から作製したＢ６２−７７である。このことは、２５個のＡ−組み立て物を、各々がサイズでおよそ１／８ゲノム(〜７２ｋｂ)であるたった８個のＢ−組み立て物まで減少させる。第３の段階において、１／８ゲノムのＢ−組み立て物を１度に２つ採用して、各々がサイズでおよそ１／４ゲノム(〜１４４ｋｂ)である４個のＣ−組み立て物を作製した。これら最初の組み立ての３つの段階を、インビトロ組み換えによって実行し、そして大腸菌にクローン化した。

部分的なＭ．ゲニタリウムゲノムのインビトロでの組み立て
天然の５８０，０７６ｋｂのＭ．ゲニタリウムゲノム配列(Mycoplasma genitalium G37 ATCC 33530ゲノム配列；アクセッション番号：L43967 (Glass, J. I., et al. PNAS (USA) (2006) 103:425-430))を、個々に合成してシーケンスするおよそ５から７ｋｂの長さの１０１個のカセットに分割した。通常、各カセットが１又は数個（several）の完全な遺伝子を含むように、カセットの境界を遺伝子の間に設置して、個々のカセットの、後における遺伝子の欠損（ないしは削除）又は操作を簡素化した。大部分のカセットは、それらの隣接するカセットに８０ｂｐだけ重複したが、いくつかのセグメントは、３６０ｂｐぐらいだけ重複した。カセット１０１をカセット１に重複させて、それにより、円を完成させた。

カセット１４、２９、３９、５５、及び６１の許容性トランスポゾン挿入配列（tolerate transposon insertions）として知られる遺伝子間の部位に、短い「透かし（watermark）」配列を挿入し、天然ゲノムから合成ゲノムを区別できるようにした。さらに、アミノグリコシド耐性遺伝子を含む遺伝子ＭＧ４０８(ｍｓｒＡ)中の２，５２０ｂｐの挿入配列(insertion)を、カセット８９に設置した。この毒性因子に特異的な欠損（ないしは異常）を有する株は、哺乳動物細胞に付着（adhere）できないことが示されており、そのため、最適な利用可能モデルシステム中の病原性が排除される。このカセットは、GENEART (Regensburg, Germany)によって合成された。全ての上記挿入配列を有する合成ゲノムは、５８２，９７０ｂｐである。

カセット１から３１、３６から３９、５２から８８、及び９０から１０１は、ブルーヘロンテクノロジー（Blue Heron Technology）(Bothell, WA)によって合成され、そして、それらの配列を確認した。カセットは、組み換えプラスミドＤＮＡとして、及びその組み換えプラスミドを保有する大腸菌クローンとしての両方が供給された。シーケンスに使用する配列［データ］、追跡データ及び、プライマーが、各カセットに付与された。カセットは、ＴｙｐｅIIＳ制限酵素を用いる切断によってそれらのベクターＤＮＡから遊離可能である。カセット３２から３５、及び４０から５１は、ＤＮＡ２．０(Menlo Park, CA)によって作製された。

８つのＢ−シリーズの組み立て物は、ＮｏｔＩによって切断されたＡ−シリーズのクローンから構築した。相補的な突出部分（オーバーハング）が無く、後の反応において不活性だったので、一般的には、切断されたベクターＤＮＡからの挿入配列をゲル精製することは必ずしも必要でなかった。４つのＡ−組み立て物から構築されたＢ６２−７７を除いて、Ａ−組み立て物を一度に３つ採用してＢ−組み立て物を作製した（図３）。図３に示すように、４つのＣ−シリーズ１／４ゲノムの組み立て物を、各々、２つの１／８ゲノムのＢ−組み立て物から構築した。正しいサイズのクローンであることを確認し、配列を確認し、そして−８０℃で保存した。

個々のカセットＤＮＡ挿入配列を有する組み換えプラスミドを、適切なＴｙｐｅIIＳ制限酵素で切断して、挿入ＤＮＡを遊離させた。フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿の後に、ベクターＤＮＡを除かずにカセットを使用した。図３に示すように、インビトロの組み換え反応を使用して、ＢＡＣベクターＤＮＡの存在下で、一度に４つ、カセットを組み立てた。反応のステップでは、最初に、3´エキソクレアーゼで重複するDNA分子を消化して、重複部分を露出させ、次に、相補的な重複部分をアニール(anneal)し、そして、結合部（joints）を修復する。

図示するために、等モル量の４つのカセットＤＮＡと、カセット６６及び６９への末端の重複部分を有するリニア状（線状）のＢＡＣベクターとを共に混合することによって、６６−６９組み立て物を構築した。ＢＡＣをＢａｍＨＩクローニングサイトの近くに設置したプライマーを使用してＰＣＲ増幅して、重複部分を作製した。プライマー６６（６８ｂｐ）は、ＢａｍＨＩサイトの右側でのベクターとの２０ｂｐの重複部分、次にＮｏｔＩサイト、そして、その次にカセット６６の最初の４０ｂｐとの重複部分を含んだ。プライマー６９（６８ｂｐ）は、サイトの左側でベクターと２０ｂｐ重複し、次にＮｏｔＩサイト、その次にカセット６９の最後の４０ｂｐとの重複部分を［含んだ］。次に、二本鎖のベクター及びカセットＤＮＡの混合物の３´末端を、ｄＮＴＰ´ｓの不在下でＴ４ポリメラーゼを使用して消化し、重複部分（ないし領域）を露出させた。７５℃でのインキュベーションによってＴ４ポリメラーゼを不活性化した後に、ゆっくりと冷却して、相補的な重複部分をアニールさせた。アニールした結合部をＴａｑポリメラーゼとＴａｑリガーゼを用いて、４５℃で、４つ全てのｄＮＴＰ´ｓ、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下で修復した。

図４のパネルＡに示すように、ｄＮＴＰ´ｓの不在下で、Ｔ４ポリメラーゼの３´エキソヌクレアーゼ活性を用いて、４つのカセットＤＮＡ（６６から６９）を、それらの３´末端から十分な程度まで消化して、隣接する断片との間の重複部分（８０ｂｐ）を露出させる。次にＴ４ポリメラーゼを、７５℃で不活性化し、ゆっくりと冷却することによって相補的な重複部分をアニールさせる。次に、Ｔａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰ´ｓを使用してギャップ(gaps)を埋め、そして、Ｔａｑリガーゼを用いてニックを閉じる個別の反応において、組み立て物を修復し、それによって共有結合性の組み立て物を作製する。図４のパネルＢに示すように、組み立て反応のために、ＢａｍＨＩクローニングサイトのいずれかのサイドと２０ｂｐ重複し、次にＮｏｔＩサイト、そして、カセット６６又は６９のいずれかとの４０ｂｐの重複部分を含む２つのプライマーを使用するＰＣＲ増幅によってＢＡＣベクターを調製する。パネルＣに示すように、所望の組み立て物が４つのカセットと、ＢＡＣのＤＮＡとを含有する環状ＤＮＡであるように、リニア状の増幅産物は、ゲル精製の後、パネルＡの組み立て反応に含まれる。

図５に示すように、組み立て反応のサンプルを電場反転ゲル電気泳動（field inversion gel electrophoresis：FIGE）にかけて、組み立て物の出来（success）を評価した。パネルＡにおいて、Ａ６６−６９に関するチューバック組み立て（chew-back assembly：CBA）反応（８０μｌ）は、５％のＰＥＧ８０００、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、４．８ＵのＴ４ポリメラーゼ（ＮＥＢ）、各々１５０ｎｇのカセット６６、６７、６８及び６９、そして１５０ｎｇのＢＡＣ６６−６９のＤＮＡを含有する２５０μｌのＰＣＲチューブ中で、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ２００サーモサイクラーにおいて実行した。３７℃で５分間、７５℃で２０分間インキュベーションし、−６℃／分で６０℃まで冷却して３０分間保持し、次に、−６℃／分で４℃まで冷却して保持した。修復（ＴＲＢ）反応（４０μｌ）は、１０μｌのチューバック反応液、４０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、１．２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、５％のＰＥＧ８０００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＤＴＴ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２００μＭの各々のｄＮＴＰ´ｓ、及び１ｍＭのＮＡＤを含んだ。４５℃で１５分間インキュベーションした。５μｌのＣＢＡ反応のサンプル及び、２０μｌのＴＲＢ反応のサンプルを、０．８％Ｅ−ｇｅｌ（Cat. No. G5018-08, BioRad、登録商標）に載せ、Ｕ−５プログラム（２）を使用するＦＩＧＥに３時間かけた。ＤＮＡバンドは、ＧｅｌＤｏｃ（BioRad、登録商標）で可視化した。ＤＮＡサイズの基準は、１ｋｂ伸長ラダー（extension ladder）(Invitrogen Cat. No. 10511-012)であった。

パネルＢは、パネルＡに示すように実行した、Ｂ５０−６１に関する組み立て反応を示す。Ａ５０−５３、Ａ５４−５７、及びＡ５８−６１のＤＮＡの量は、各々およそ４５０ｎｇであった。ＢＡＣ５０−６１のＤＮＡは、１５０ｎｇであった。ＣＢＡ反応のサンプルは、パネルＡのように分析した。

パネルＣは、パネルＡに示すように実行した、Ｃ２５−４９に関する組み立て反応を示す。およそ３００ｎｇ、２５０ｎｇ、６０ｎｇのゲルで精製したＢ２５−３６、Ｂ３７−４９、及びＢＡＣ２５−４９のＤＮＡをそれぞれ使用した。１０μｌのＣＢＡ反応のサンプルをＢｉｏＲａｄ「Ready Agarose Mini Gel」(Catalog 161-3016、登録商標)に載せ、ＨｏｅｆｅｒＨＥ３３のmini horizontal submarine electrophoresisのトレイの中で、０．５μｇ／ｍｌのＥｔＢｒを含む１×ＴＡＥバッファーを使用して、サーキュレーション（circulation）なしでＦＩＧＥ（Ｕ−９プログラム（２））に２３℃で１４時間かけた。ＤＮＡサイズの基準は、低レンジＰＦＧマーカー（low range PFG marker）＃ＮＯ３５０Ｓ（ＮＥＢ）であった。バンドは、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０蛍光イメージャー（Typhoon 9410 Fluorescence Imager、Amersham）を用いて、５３２ｎｍの励起波長、及び６１０ｎｍの発光波長で可視化した。

パネルＤは、パネルＣにおいて記載されたＵ−９プログラムを使用するＦＩＧＥによって測定された、ＮｏｔＩで切断した組み立て物の大きさを示す。

追加のサンプルをＤＨ１０Ｂ(InvitroGen)、ＥＰＩ３００(Epicentre)及び/又はＳｔｂｌ４(InvitroGen、登録商標)の細胞に電気穿孔処理し、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに蒔いた。コロニーは、２４から４８時間後に出現した。これらを採取し、３ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ培養液の中で、オーバーナイトで成長させた。プラスミドＤＮＡを１．５ｍｌの培養液からアルカリ溶解法を使用して調製した。次に、ＤＮＡを、ＮｏｔＩで切断し、ＦＩＧＥによって解析し、組み立て物の大きさが正しいことを確認した。正しいサイズを有するクローンを１５％グリセロール含有ＬＢ培養液中で凍結し、−８０℃で保存した。、いくつかのクローン化した組み立て物をシーケンスして、図３の太枠（ボックス）によって示されるような合成の精度を確認した。

２５個のＡ−シリーズの組み立て物と、全てのより大きな組み立て物とを、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのｐＣＣ１ＢＡＣベクターにクローン化した。ｐＣＣ１ＢＡＣクローンは、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅのプロトコールに従って、ＥＰＩ３００細胞において、単コピーレベル(single copy level)で増殖させることができ、次に、細胞あたり１０コピーに誘導できた。誘導した１００ｍｌの培養物は、２００ｕｇまでプラスミドＤＮＡを産生した。切断が各末端に付与したＮｏｔＩサイトの部分を有する挿入ＤＮＡ切断を効率的に産出するように、ＢＡＣ中の組み立て挿入配列は、各端にＮｏｔＩサイトに近接して隣り合わせた（Ｍ．ゲニタリウムゲノムはＮｏｔＩサイトを含まない）。ＮｏｔＩが隣接する組み立て物をより大きな（higher）組み立て物に使用する場合には、ＮｏｔＩサイトの3´部分(２個のヌクレオチド)を、チューバック反応によって除去した。図６に示すように、ＮｏｔＩサイトの５´部分は、アニーリングの後、６個のヌクレオチドの突出部分（overhang）を産出したが、その突出部分を、Ｔａｑポリメラーゼの５´エキソヌクレアーゼ活性による修復の際に、除去した。

酵母におけるインビボでの組み換え
半分のゲノムクローンは、上記のインビトロ組み換え法では、大腸菌において増殖できなかった。Ｃ７８−１０１クローンでさえ、Ｓｔｂｌ４（登録商標）大腸菌細胞中を除いては、維持することが難しかった。そのため、出芽酵母（S. cerevisiae）を、クローニングの宿主として使用した。

リニア状のＹＡＣクローンは、通常、制限酵素クローニングサイトへの挿入配列の連結によって構築される(Burke, D. T., et al., Science, (1987) 236:806-812)。この方法の改良法は、重複する挿入配列及びベクターＤＮＡの、それらを相同組み換えによって連結する酵母スフェロプラストへの同時形質導入(co-transfection)を使用することである（図７Ａ）。これは、環状クローンを産出し、ＴＡＲクローニングとして知られる(Larionov, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:491-496)。リニア状のＹＡＣのようなＴＡＲクローンは、セントロメアを含むため、ネイティブの酵母ゲノムと同じ（ないし沿った）染色体コピー数で維持される。環状のＴＡＲクローンは、リニア状の酵母染色体からのそれらの分離を容易にする。

図７のパネルＡは、ＴＡＲクローニングに使用したベクターを示す。それは、ＢＡＣ及びＹＡＣ配列（目盛に示される）の両方を含む。ベクターと挿入配列の組み換えは、ＰＣＲ増幅によりＴＡＲＢＡＣに加えられた「フック（hooks）」で生じる。複製起点（ＡＲＳ）様の配列(Newlon, C. S., et al., Curr. Opin. Genet. Dev. (1993) 3:752-758)がＭ．ゲニタリウムゲノム中に存在しないので、酵母の複製起点は、クローンが増殖できるようにする。酵母における選択は、宿主株におけるヒスチジン栄養要求性の補完によって実行される。ＢＡＣ配列は、電気穿孔法によって大腸菌に導入される可能性を酵母から精製したクローンに付与する。

酵母内で、１／４（quarter）ゲノムを半分［のゲノム］及び全体［のゲノム］へ組み立てるために、ｐＴＡＲＢＡＣ３ベクター(Zeng, C., et al., Genomics (2001) 11:27-34)を使用した。このベクターは、ＹＡＣ及びＢＡＣの配列の両方を含む (図７Ａ)。このベクターを、ＢＡＣベクターのための上記手法（strategy）と同様の手法を使用して調製した。１つの１／４ゲノムの内の単一の切断制限サイトの両サイドとの６０ｂｐの重複部分と、その後にベクター末端からＮｏｔＩサイト及び２０ｂｐとを含むプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、末端部分において重複部分を作製した。ベクターを、３番目の１／４［ゲノム］であるＣ５０−７７内の遺伝子間ＢｓｍＢＩサイトに挿入した。ＴＡＲクローニングにおいて、二本鎖切断での組み換えは、およそ２０倍刺激される(Leem, S. H., et at, nucleic Acids Res. (2003) 31 :E29)。形質転換されるＤＮＡは、６つの断片(ベクター、３番目の１／４ゲノムの２つの断片、及び１、２及び４番目の１／４ゲノムの断片)から構成される。ｐＴＡＲＢＡＣ３中の挿入配列として全長ゲノムを得るためには、単一の酵母細胞が、６つの全ての断片を取り込み、相同組み換えによってそれらを組み立てなければならない。

図７のパネルＢは、Ｍ．ゲニタリウムＪＣＶＩ−１．０の１／４ゲノムの組み立てを示す。これらは、出芽酵母に共形質転換するために、大腸菌から精製し、ＮｏｔＩ消化した後、ＴＡＲＢＡＣベクターと混合し、６０−２６４ｂｐの重複部分での組み換えが６つの断片を単一のクローンへと結合させた。ＴＡＲＢＡＣを、Ｃ５０−７７のＢｓｍＢＩサイトに挿入した。

酵母細胞の形質転換は、公開された方法(Kouprina, N., et al., Methods Mol. Biol. (2006) 349:85 101)を使用して実行した。酵母細胞を、オーバーナイトで培養した培地から回収し、そして、水で洗浄し、次に１Ｍのソルビトールで洗浄した。１Ｍのソルビトールの存在下で、ザイモリエース（Zymolyase、登録商標）及びβ−メルカプトエタノール処理することによって、細胞をスフェロプラストに転換した。スフェロプラストをソルビトールで洗浄し、ソルビトール及びＣａＣｌ_２を含むバッファーに再懸濁した。元の５ｍｌの酵母の培養液に相当するスフェロプラストを、２００μｌの容量において、室温で１０分間、１０ｎｇのベクター及び１２０ｎｇの各々の１／４ゲノムとインキュベーションした。次に８００μｌの２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００(US Biochemicals)を加え、１０分間インキュベーションを継続した。富栄養培地に回収した後、ヒスチジン不在下のソルビトールプレート上の上層寒天(top agar)において、３０℃で形質転換した細胞を選択した。最初にPCRによって、次にサザンブロットによって形質転換体をスクリーニングした(図７Ｃ)。

パネルＣでは、最初は、ＰＣＲによってＴＡＲクローンをスクリーニングした。次に、全ての挿入断片の増幅に関してポジティブなクローンをサザンブロットによって特徴付けた。全ての酵母ＤＮＡを、アガロースプラグ中で調製し(BioRad CHEF DRIIIマニュアルプロトコールにより)、ＮｏｔＩで消化してＭ．ゲニタリウムの配列からベクターを分離し、パルスフィールドゲル電気泳動(Bio Rad CHEF DRII or DRIII)によって分離し、吸引（vacuum）(BioRad Model 785 Vacuum Blotter)によってアマシャムハイボンドＮ＋膜に転写し、９つのＭ．ゲニタリウムのＭｇＰａ反復部分の中にハイブリダイズする２つのジゴキシゲニン標識された(Roche)ＰＣＲ産物の混合物でプローブし、ＡＰ標識の抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片の後に、蛍光基質ＨＮＰＰ(Roche)で検出した。望ましいクローンは、ネイティブなＭ．ゲニタリウムゲノムのアガロースプラグから分離した染色体と同じ大きさの単一のバンドを示した。ここでは、パルスフィールド電気泳動による、シーケンスした最終クローンのより詳細な消化分析を示す。電気泳動のレーンは以下の通りである：１）低レンジパルスフィールドゲルマーカー(NEB)、２）消化していない宿主酵母株ＶＬ６−４８Ｎ(Larionov, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:7384-7387)、ネイティブなＭ．ゲニタリウムΔＭＧ４０８(このゲノムは、環状であるが、アガロースプラグ中の分子の分画は破壊され、これらリニア状の分子はおよそ６００ｂｐにおいて電気泳動され、ＴＡＲクローン用のサイズマーカー及びブロットシグナルコントロールを提供する）、４）消化していない酵母株ｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７、５）ＮｏｔＩで消化した酵母株ｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７。６００ｋｂの環状物は、大きすぎて、ゲルの中で電気泳動できないので、レーン４は、クローンのトポロジーを示す。クローンの小さい分画は、破壊されており、これらリニア状の分子はかすかなブロットシグナル状態で検出される。レーン５における、ＮｏｔＩで消化されたサンプルは、ＴＡＲＢＡＣベクターから分離された挿入Ｍ．ゲニタリウムＤＮＡの大きさを示す。

ＰＣＲ及びサザンブロットによるポジティブなクローンを、更なるサブクローンのサザンブロットによって安定性に関してテストした。これら２つの分析に基づくと、およそ１０％の形質転換体のコロニーが、完全な合成ゲノムを保有した。これらのクローンの１つである、ｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７をシーケンス用に選択した。

さらに、ＴＡＲクローニングを、２つの隣接する１／４ゲノムの４つのセットの各々を用いて、そして、１から３番目の１／４ゲノムを用いて実行した。これら多種の実験の形質転換体からのＤＮＡを単離し、そして大腸菌に電気穿孔処理した(Silverman, G. A., Methods Mol. Biol. (1996) 54:65-68)。この方法では、本願発明者らは、Ｄ１−４９、，Ｄ５０−１０１、そして組み立て物２５−７７及び１−７７であることが予測される大きさのＢＡＣクローンを得た。そのうち、Ｄ１−４９をシーケンス用に選択したところ、正確だった。

酵母からの合成Ｍ．ゲニタリウムゲノムの回収及びその配列の確認
ｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７のアガロースプラグを、酵母用のＢｉｏＲａｄＣＨＥＦマニュアルプロトコールに従って、０．５のＯＤまで３０℃で培養した１．５ＬのＣＭ−ＨＩＳ培養液から調製した。プラグを洗浄し、１×ＮＥＢバッファー４の中で透析し、そしてオーバーナイトで、３７℃で、酵母を切断するがｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７は切断しない制限酵素ＲｓｒＩＩ、ＦｓｅI、及びＡｓｉＳIと共にインキュベーションした。４．５Ｖ／ｃｍで２時間のアガロースゲル電気泳動によって消化したリニア状の酵母ＤＮＡをプラグから除去した。無傷の環状ｓＭＧＴＡＲＢＡＣ３７のＤＮＡは、これら条件下ではプラグ内に残った。１つのプラグをＮｏｔＩと共にインキュベートし、そして、プラグ中のＤＮＡを電気泳動によって解析して、ｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７のＤＮＡのサイズ及び純度を評価した。ゲルは、ＳＹＢＲゴールドで染色した。

図８は、ＮｏｔＩで消化したおよそ５９０ｋｂのバンドを示すが、未消化のコントロールにはバンドがない。ｓＭｇＴＡＲＢＡＣ３７のＤＮＡは、Ｘカバー領域（X coverage）をシーケンスして、設計されたようになったことを確認した。

酵母における２５個のＤＮＡ断片の組み立て
採用したＤＮＡ断片は、マイコプラズマ・ゲニタリウムのゲノムの重複部分であり、Gibson, D. G., et al., Science (2008) 319:1215 1220 (前記)に、詳細に記載される。

Ａ．Ａ−シリーズの組み立て物の作製：
テーブル１に示した２５個のＡ−シリーズの組み立て物の各々は、ｐＣＣ１ＢＡＣ（登録商標）中に含まれ、ＥＰＩ３００大腸菌株(Epicentre、登録商標)において増殖した。

［表１］
Ｍ．ゲニタリウムＪＣＶＩ−１．１合成ゲノムの構築に使用した２５個のＡ−シリーズの組み立て物の概要

必須でない遺伝子内に挿入されたベクターを有する、公開された詳細と比較したＡ８６−８９の変異体を使用した。ベクターは、酵母中における選択及び維持のための、ヒスチジン栄養要求性マーカー、セントロメア、そして複製起点を含む。酵母増殖因子を有するベクターを包含することは、組み立て物の結果の評価を可能にする。

該クローニングシステムは、細胞あたり、１０コピー以上のＢＡＣを許容する。これらの２５個の組み立て物を有する大腸菌株を１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、及び１ｘ誘導溶液(Epicentre、登録商標)を含有する１５０ｍＬのＬＢに植菌し、そして３７℃で、１６時間インキュベーションした。培養液を回収し、ＢＡＣをQiagenのHiSpeed Plasmid Maxi Kitを使用して精製した。ＤＮＡを５００μｌのＴＥバッファーを使用して溶出した。ＢＡＣから断片を遊離させるために、制限消化を３７℃で１６時間実行し、そしてフェノール、クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって終了させた。産物をＴＥバッファーに、１２０ｎｇ／μｌの最終濃度まで溶解した。

消化［サイト］の次に、２５個の組み立て物の各々は、いずれかの端（either end）に目的の隣接する分子との少なくとも８０ｂｐの重複配列を有する。

Ｂ．酵母スフェロプラストの形質転換：
ＶＬ６４８Ｎ酵母株(Kouprina, N., et al., 前記)を使用して、酵母細胞をザイモリエース（登録商標）で処理して細胞壁を弱くし、コンピテント化して、ＰＥＧ及びＣａＣｌ_２での処理によって、外来ＤＮＡを取り込ませた。細胞は、酵母スフェロプラストの調製の前に、１．３のＯＤ_６００(〜5×10⁷cells/ml)まで成長させた。消化した２５個のＡ−シリーズの組み立て物をそれぞれ９６ｎｇ（１２０ｎｇ／μｌを０．８μｌ）の添加によってプールし、そして〜１０^８個の酵母スフェロプラストと混合した。〜１００ｎｇ又は〜４×１０^９のゲノムに相当する、節（ないしパラグラフ）Ａからの等量の各々消化された断片を、ゲル精製せずにプールした。およそ１０^８個の酵母スフェロプラストをこのＤＮＡプールに加え、酵母形質転換を実行した(Kouprina, N., et al., Nat. Protoc. (2008) 3:371-377)。これは、〜４０個のＭ．ゲニタリウムゲノムに相当するか、あるいは、酵母スフェロプラストあたり、〜１０００個のＤＮＡ分子(４０×２５)の量である。形質転換の次に、酵母スフェロプラストを再び作製し、ヒスチジンを含まない完全補充培地(ＣＳＭ−Ｈｉｓ)にアデニンと１Ｍのソルビトールとを添加した寒天プレート上で３日間３０℃で選別した。３日間、３０℃で選択培地でインキュベーションした後に、およそ８００個のコロニーを得た。次に、各コロニーを小さい（small）パッチのようにＣＭＳ−Ｈｉｓ寒天プレート上に移し、２日間３０℃でインキュベーションした。一度選別して、所望の組み立て物を有することを確認した、これらプレートからの個々のコロニーを解析した。

全体の過程を図９に示す。図９に示すように、酵母細胞を、Ｍ．ゲニタリウムゲノムを含む２５個の異なる重複Ａ−シリーズのＤＮＡセグメント(それぞれ、〜１７ｋｂから〜３５ｋｂ)で形質転換した。これらを完全なゲノムに組み立てるためには、単一の酵母細胞は、２５個の異なったＤＮＡ断片の少なくとも１つの代表的な断片を取り込み、相同組み換えを実行する核に各々を組み込まなければならない。図９のＪＣＶＩ−１．１で標識された組み立てゲノムは、ベクター配列(三角形) の中に示したＡ８６−８９を含む５９０，０１１ｂｐである。上記のように、ベクター内に含まれる酵母の増殖因子は、複製起点(ＡＲＳＨ４)、セントロメア(Ｃｅｎ６)、そしてヒスチジン選択可能マーカー(Ｈｉｓ３)である。

Ｃ．多重の（multiplex）ＰＣＲ解析：
ＤＮＡを、ChargeSwitch Plasmid Yeast Mini Kit(Invitrogen、カタログ番号CS10203、登録商標)を用いて、提供されたマニュアルに従って、培養した酵母細胞から抽出した。多重ＰＣＲを、１０μｌの反応で、ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ´ｓ混合物、及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、カタログ番号 206143)を含むマスターミックスを使用して実行した。２μｌのＤＮＡ及び、２０個のオリゴを各々５μＭで含有する１μｌの１０×プライマーストック、を各反応に添加した。サイクルのパラメーターは、９４℃で１５分間、次に、９４℃で３０秒間、４５℃(プライマーセット１)又は５５℃(プライマーセット２−４)で９０秒間、７２℃で９０秒間の３５サイクル、その後、１回の７２℃での３分間のインキュベーションである。２μｌの各反応液を２％のＥ−ｇｅｌ(Invitrogen)に載せ、７２Ｖを３０分適用した。バンドは、ＡｍｅｒｓｈａｍＴｙｐｈｏｏｎ９４１０蛍光イメージャーを使用して可視化した。

本願発明者らは、最初に全ての２５個の断片を取り込んだ酵母細胞についてスクリーニングした。大きさで１００ｂｐから１０７５ｂｐにわたる単位複製配列(amplicon)を生産する４０個のプライマー対を、４個の別個の多重ＰＣＲ反応の各々においてそれらが１０個の単位複製配列を生産できるように設計した。多重プライマーセット1及び2は、既に開示した(Gibson, D. G., et al., 前記)。４０個の単位複製配列は、Ｍ．ゲニタリウムゲノムにわたって、およそ１５ｋｂごとに位置する。ＰＣＲによって全ての４０個の単位複製配列が生じるためには、全ての25個のセグメントが存在することが必要であり、そのため、全ての２５個の断片が酵母細胞に取り込まれたことについての非常に良い兆候（indication）を提供する。これは、図１０Ａ−１０Ｂに図示される。図１０Ａに示すように、４０個の単位複製配列を、１０個の産物が、４個の別個の多重ＰＣＲ反応において生産できるように設計した(セット１−セット４)。図１０Ｂに示すように、４０個のセットのプライマーは、およそ１５ｋｂごとに１つのM.ゲニタリウムゲノムの小さな部分をそれぞれ増幅する。２５個の各セグメント(矢印)は、４０個の単位複製配列 (線として示す)の少なくとも１つに関するプライマー結合部位を提供する。１０個の個々のコロニーを、単一の選択プレートに小さなパッチとして移した。３０℃で２日間のインキュベーションの後に、これら各１０個のパッチからのおよそ１０^７の細胞を１ｍｌの水に採取した（scraped）。多重プライマーセット１及びこれら１０個のコロニーから抽出したＤＮＡを使用して、多重ＰＣＲを実行し、ゲル電気泳動により解析した。クローン１及び４は、１０個全ての単位複製配列を生産した。単位複製配列１−ｈは、露光時間を増加した場合に観察することができる弱いシグナルを与えた（データは示さない）。このＰＣＲ解析は、クローン１及び４における２５個のＡ−シリーズの組み立て物の１０個の存在を証明した。

１００ｂｐから１０７５ｂｐの範囲の大きさのＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルの電気泳動によって容易に分離することができる。図１０Ｃに示す結果において、ＤＮＡは、１０個の酵母クローンから抽出し、プライマーセット１を使用する多重ＰＣＲを実行した。クローン１及び４(ｃ１及びｃ４)は、１０個の予測される単位複製配列（アンプリコン）の内で、９個を効率的に生産した。単位複製配列１−ｈは、ゲルから発するシグナルを増加した場合に、観察することができた。

Ｄ．クローン４の詳細な解析
多重プライマーセット１−４を使用して多重ＰＣＲを実行し、ゲル電気泳動によって解析した。全ての４０個ののＰＣＲ産物は、単位複製配列１−ｈを除いて、クローン４から抽出したＤＮＡから効率的に生産された。このことは、全て２５個のＡ−シリーズの組み立て物の存在を証明する(図１０Ｂと比較)。Ａ７０−７３は、単位複製配列１−ｈ及び３−ｈによって表される。単位複製配列１−ｈは、他の単位複製配列と比較して低レベルで生産されるが、単位複製配列３−ｈは、効率的に生産されため、クローン４中のＡ７０−７３の存在の強力な証拠が提供される。クローン４を、更なる解析用に選択した。図１０Ｄに示した結果において、多重ＰＣＲを、全ての４つのプライマーセットを使用して、クローン４に対して実行した。単位複製配列１−ｈを除く全ての４０個の単位複製配列を、このクローンから効率的に生産することができた。「L」でラベルした列に、１００ｂｐラダー(NEB)を載せ、そしてサイズを示した。

Ｅ．合成Ｍ．ゲニタリウムゲノムＪＣＶＩ−１．１の制限解析
Bio Rad Yeast DNA Plug Kitを使用し、そして提供された指示マニュアルに従って(カタログ番号 170-3593)クローンから１％アガロースにＤＮＡを調製した。このプロトコールの完了した後に、プラグをhorizontal submarine electrophoresisトレイ中で、１ｘＴＡＥに浸し、５．４Ｖ／ｃｍを２時間適用した。プラグは、ＢｉｏＲａｄマニュアルに従って、ＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩＩ又はＡａｔＩＩで消化した(制限酵素及びバッファーはNEBによって供給された)。３７℃で１６時間インキュベーションした後、同量の各プラグ(およそ２０μｌ)を、１％のＢｉｏＲａｄのレディーアガロースミニゲル(Bio Rad Ready Agarose Mini Gels（登録商標）)に載せ、そして、ＨｏｅｆｅｒＨＥ３３（登録商標）のmini horizontal submarine electrophoresisトレイの中で、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含有する１×ＴＡＥバッファーを使用して、Ｕ−２プログラムを使用して、循環なしで、電場反転ゲル電気泳動(ＦＩＧＥ)に、２３℃で１４時間供した。ＦＩＧＥＵ−２に関するパラメーターは、、前進９０Ｖ、初期のスイッチ５．０秒、最終的なスイッチ３０秒、リニア状の傾斜、そして逆行６０Ｖ、初期のスイッチ５．０秒、最終的なスイッチ３０秒である。バンドは、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０蛍光イメージャー(Amersham、登録商標)を用いて、５３２ｎｍの励起波長、６１０ｎｍの発光波長で可視化した。

全ての２５個の断片がクローン４において完全なゲノムに組み立てられたことを確認するために、上述のように、制限分析用のアガロースプラグ内のこれらの酵母細胞からＤＮＡを調製した。ネガティブコントロールとして、ＤＮＡを形質転換していない宿主株のからも抽出した。プラグ中の環状ゲノムを濃縮するために、大部分のリニア状の酵母染色体ＤＮＡを、定電圧電気泳動によって除去した。図１１Ｃに示すように、ＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩＩ及びＡａｔＩＩで消化した後に、消化されたプラグを電場反転ゲル電気泳動に供した場合には、完全なゲノム組み立て物のこれらの消化物によって予測される５つの制限断片が確認された。宿主酵母コントロールは、これらのバンドを示さず、１５０ｋｂ未満のＤＮＡのスメアのみを示した。このスメアは、組み立てられたゲノムの他の予測される断片を不明瞭にしただろう。多重ＰＣＲ解析（図１０）と共に、これら結果は、クローン４が、少なくとも２５個のＤＮＡの重複するセグメントを取り込み、そしてインビボで、それらを組み換えた結果、組み立てられたＪＣＶＩ−１．１合成ゲノムを有することを示す。

クローン１は、プライマーセット１を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を分析した場合には、クローン４と同様のパターンを生じた（図１０Ｃ）。従って、本願発明者らは、更にクローン１を分析した。図１０で示した４つの多重ＰＣＲプライマーセットを使用して、全ての４０個の単位複製配列がクローン１について確認され、そして、図１１に示すようにＥａｇＩ消化の後に、図１２に示すように予想される５９０ｋｂのバンドが存在する。

図１２Ａにおいて、図１０のように、全ての４つのプライマーセットを使用してクローン１から抽出したＤＮＡに多重ＰＣＲを実行した。２％アガロースゲルの電気泳動の後に、全ての４０個の単位複製配列が確認された。次に、図１２Ｂにおいて、クローン１からアガロースプラグ中のＤＮＡを調製し、次にＥａｇＩで消化して、図１１のように解析した。１％アガロースゲルを用いた電場反転ゲル電気泳動の後に、予想される５９０ｋｂのバンドを確認することができる(＊によって示される)。

従って、解析した１０個の酵母クローンの内で、２個が完全なゲノムを含む。

Claims

下記のステップを含む所望の核酸分子の合成方法であって、
ａ）複数のカセットを提供するステップ、但し、ステップａ）において、該カセットの各々は、所望の核酸の一部のヌクレオチド配列を含み、該カセットは、所望の核酸分子のヌクレオチド配列の重複部分（複数）を含み、そして、該カセットは、該重複部分（複数）に従って結合（コンバイン：combine）した場合には、所望の核酸の完全なヌクレオチド配列を提供すること、
ｂ）インビトロで前記カセットを結合して、結果として形成される複数のサブセットを得るステップ、但し、ステップｂ）において、前記サブセットは、所望の配列の重複部分（複数）を含み、そして、該サブセットは、重複部分（複数）に従って組み立てた場合には、所望の核酸のヌクレオチド配列を提供すること、
ｃ）インビボで宿主培養物において該サブセット（複数）を組み立て（assemble）て、所望の核酸分子を得るステップ、但し、ステップｃ）において、前記組み立て物は、複製起点を更に含むこと、
を特徴とする方法。
前記重複部分（複数）は、少なくとも２０ベースをそれぞれ含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップｂ）及び／又はステップｃ）を、少なくとも１回繰り返すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップｃ）を酵母において実行し、前記複製起点は、酵母において作動可能（operable）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
ステップｃ）の前記組み立て物は、セントロメア及び／又は選択可能マーカー含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
前記複製起点を、追加のベクターに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記セントロメア及び／又は選択可能マーカーを、追加のベクターに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
ステップａ）の１以上のカセットが、透かし配列（watermark）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
１０個以上のＤＮＡ断片を単一のＤＮＡ分子に組み立てる方法であって、
下記のステップ：
（ａ）宿主細胞の培養物を十分な数の前記１０個の断片（fragments）の各々のコピーを含む混合物で形質転換して、前記培養物の平均の細胞によって異なる断片の数の少なくともおよそ２倍に達する量のコピーを取り込ませるステップ、
但し、ステップａ）において、前記断片は少なくとも１０塩基対の重複配列を含み、該重複配列は、配列が重複して所望の順番の組み立て物を提供するように整列し、そして、複製起点を、前記断片の中に含むこと、
（ｂ）前記酵母培養物における前記断片の組み立てのために十分な時間を許容するステップ、さらに、
（ｃ）以下のいずれかのステップ：
（ｉ）前記宿主を培養して、回収のための組み立てた核酸分子の十分なコピーを得るステップ、又は
（ｉｉ）前記宿主からＤＮＡを抽出し、他の培養物に形質移入して、前記他の培養物が前記回収のための組み立てた核酸分子の十分なコピーを複製するようにするステップ、
を含むことを特徴とする方法。
組み立てたＤＮＡ分子を、宿主培養物又は他の培養物から単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
少なくとも２つのターゲットＤＮＡ分子を前記宿主培養物において組み立てることを特徴とする請求項９に記載の方法。
複製起点が宿主において作動可能（operable）であり、宿主において作動可能なセントロメアを前記複数断片の中に含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
他のシステムにおいて作動可能な複製起点を前記複数断片の中（among）に含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
選択可能なマーカーを前記複数断片の中に含み、前記培養を選択条件下で実行することを特徴とする請求項９に記載の方法。
断片（複数）が二重鎖であり、１００−５ｘ１０^６塩基対を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
断片（複数）が一重鎖であり、４０−１０００ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
前記断片の２つが、各々、１つの末端にテロメアを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
組み立てたＤＮＡ分子が自然に発生するゲノムを表すことを特徴とする請求項９に記載の方法。
組み立てたＤＮＡ分子が所望の代謝経路を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
宿主培養物が酵母であることを特徴とする請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって組み立てた単離状態のＤＮＡ分子。
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って組み立てたＤＮＡ分子を含む宿主培養物又は他の培養物。
酵母であることを特徴とする請求項２２に記載の宿主培養物、及び大腸菌又はバチルスの培養物であることを特徴とする請求項２２に記載の他の培養物。
遺伝子の決定的性質（criticality）を評価する方法であって、
細胞培養物に形質移入した請求項２１に記載の合成核酸分子から候補遺伝子を削除する又は破壊すること、及び前記削除すること又は破壊することの培養物の生存に対する影響を評価すること
を含む方法。