JP2010533660A - 慢性疼痛の治療又は予防のためのグラニュリン又はグラニュリン様化合物の使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
神経障害モデル及びRNAi処置
成体C57B16マウスを用いた。坐骨神経部分損傷(SNI)モデルにおいて、坐骨神経の2つの枝、すなわち、腓骨神経及び脛骨神経を結紮し、遠位で切断した。腓腹神経は無傷のままである。浸透圧ポンプ(アルゼット浸透圧ポンプ2004;0.25μl/時)を用いて、アクログラニンに関するサイレンサーRNA(ステルスRNAi、Invitrogen)を、脊髄カテーテル(PTFE sub−lite wallチューブ;OD/ID 0.15mm/0.05mm)により連続的にクモ膜下腔内注入した。カテーテルの先端を腰髄のレベルにおいて、浸透圧ポンプを皮下組織中に固定した。SNI手術直後に注入を開始し、4週間継続した。3つの異なるアクログラニンRNAiの混合物(4週間の期間中、1nmol/各マウス)又は対照RNAiをそれぞれ用いた。さらに、FITC標識ダミーRNAi(20nmol)を、その後の免疫組織学的位置確認のために注入した。注入溶液は、1:40希釈リポフェクタミンを有するリンガー溶液で構成された(195μl リンガー+5μl リポフェクタミン/ポンプ)。
動物を、3×30分間、試験ケージに馴れさせた。処置について知ることなしに、行動の測定を実施した。後肢の機械的刺激に関する反応潜伏時間を、動的フォン・フレイ触覚計(Dynamic aesthesiometer, UgoBasile, Italien)を用いて測定した。「冷プレート」(4℃)を用いて、寒冷に対する疼痛感受性を、90秒の期間の間の悪反応(舐める、跳び上がる、足を持ち上げる)を計数することにより測定した。52℃「温熱プレート」を用いて、熱に対する疼痛感受性を、最初の反応までの潜伏時間を測定することにより確定した。問題損傷を回避するため、カットオフ潜伏時間は30秒であった。ロータロッド試験において、ニューロン病変後の運動協調性又は運動回復をそれぞれ測定した(90秒カットオフ)。
QiagenRNA抽出キットにより均質化脊髄又はDRG組織から全RNAを抽出し、DNAに転写した。cDNA断片をPCRにより増幅し、pCR4ベクター(TAクローニングキット、Invitrogen)に結紮した。ビオチニル化cRNAをin vitro転写により産生して、AffymetrixのRGU34Aチップのハイブリダイゼーションのために用いた。
QiagenRNA抽出キットにより均質化脊髄又はDRG組織から全RNAを抽出し、DNAに転写した。プロバイダー(Applied Biosystems)のマニュアルに従ってSybr-Green検出系を用いて、定量的実時間rt−PCRを実施した。プライマー組を、Primer Expressで選択した。アガロースゲル電気泳動により、特定PCR産物の増幅を検証した。
脊髄又はDRG組織をPhosphoSafe抽出緩衝液(Novagen)中で均質化し、ホモジネートを遠心分離(40,000g、20分)して、上清中のタンパク質をそれぞれポリアクリルアミド又はトリシンゲル電気泳動により分離した。タンパク質を湿式ブロットによりニトロセルロース膜上に移し、PBST−5%ミルク(5%低脂肪乳粉末を有する1mol/l PBS中0.05%トゥイーン20)中で遮断し、アクログラニンに対する抗体(PBST中1:1000)と共に一晩インキュベートして、洗浄し、二次抗体と共に室温で2時間インキュベートして、Odysseeウエスタンブロットスキャナーを用いて評価した。
マウスをCO2及び放血により屠殺して、L4/5DRG及び脊髄を迅速に取り出し、OCT中に包埋して、ドライアイス上で凍結させ、クリオトームで14μm切片に切断した。切片を4%パラホルムアルデヒド中で後固定し、アセチル化した。DIG標識リボ試料をcDNA断片のin vitro転写及びジゴキシゲニン標識dUTPの組入れにより生成した(Dig標識キット、Roche)。切片を、室温で2時間、プレハイブリダイゼーション溶液(5×SSC、50%ホルムアミド、2×デンハード、500μg/mlニシン精子DNA、250μg/ml酵母tRNA)中で前ハイブリダイズして、その後、オーブン中で72℃で16時間、プレハイブリダイゼーション溶液中で250ng/mlのリボプローブ(アンチセンス及びセンス)とハイブリダイズした。切片を0.2×SSC中で68℃で2時間洗浄し、抗sig−AP抗体(0.1mol/lマレイン酸緩衝液中の1%遮断試薬(Roche)中で1:1000)と共に4℃で一晩インキュベートして、NBT/BCIP/レバミゾール(Boehringer Mannheim)で発色させた。切片をグリセロール/ゼラチン中に包埋し、又は、それぞれの抗体を用いて後in situ免疫蛍光法によりさらに発色させた。
固定のために、動物を1×PBSで、その後、4%パラホルムアルデヒドで心臓内還流した。組織を調製し、4%PFA中で2時間、後固定し、1×PBS中の20%スクロース中で一晩、冷凍人工物に対して保護し、OCT中に包埋して、それぞれ12μm又は14μm切片をクリオトームで切断した。切片を、0.03%トリトンX−100及び1%遮断試薬(Roche)を有する1×PBS中で室温で2時間遮断し、4℃の遮断溶液(上記参照)中の一次抗体と共に一晩インキュベートして、洗浄し、次に、室温で2時間、遮断溶液中で種特異的Cy3、Alexa−488又はFITC標識二次抗体と共にインキュベートして、再び洗浄し、自己蛍光の低減のために0.02%スーダンブラックで処理し、Vectashieldで包埋した。それぞれ蛍光(Nikon)又はレーザー走査顕微鏡(Zeiss)で、分析を行なった。
Claims (13)
- 神経障害性疼痛の治療又は予防のためのグラニュリン又はグラニュリン様化合物の使用であって、前記グラニュリン様化合物がプログラニュリン、グラニュリン1、グラニュリン2、グラニュリン3、グラニュリン4、グラニュリン5、グラニュリン6、グラニュリン7、パラグラニュリン、プログラニュリンシグナル伝達分子、及び前記分子と機能的に等価であるこれらの分子の断片を含有する群から選択される少なくとも1つの分子である、使用。
- 前記グラニュリン又は前記グラニュリン様化合物が前記分子のうちの1つをコードする核酸である、請求項1記載の使用。
- 前記核酸が配列番号1〜10のうちの1つによる核酸又はこれらの配列のうちの1つと少なくとも50%同一である核酸である、請求項2記載の使用。
- 前記グラニュリン又は前記グラニュリン様化合物がタンパク質又はペプチドである、請求項1記載の使用。
- 前記グラニュリン又は前記グラニュリン様化合物が配列番号11〜20のうちの1つによるタンパク質若しくはペプチド、又はこれらの配列のうちの1つと少なくとも50%同一であるタンパク質若しくはペプチドである、請求項4記載の使用。
- 哺乳類における、特にペット及び家畜における、並びにヒトにおける神経障害性疼痛の治療又は予防のための薬学的組成物を製造するための請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 神経障害性疼痛の低減のための薬学的組成物を製造するための請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用。
- 哺乳類における、特にペット及び家畜における、並びにヒトにおける神経障害性疼痛の治療又は予防のための、グラニュリン又は機能的に等価なグラニュリン断片若しくはグラニュリン・アゴニストを含む薬学的組成物であって、前記グラニュリン様化合物がプログラニュリン、グラニュリン1、グラニュリン2、グラニュリン3、グラニュリン4、グラニュリン5、グラニュリン6、グラニュリン7、パラグラニュリン、プログラニュリンシグナル伝達分子、並びにこれらの分子と機能的に等価であるこれらの分子の断片を含有する群から選択される少なくとも1つの分子である、薬学的組成物。
- 前記グラニュリン又は前記グラニュリン様化合物が前記分子のうちの1つをコードする核酸である、請求項8記載の薬学的組成物。
- 前記核酸が配列番号1〜8のうちの1つによる核酸又はこれらの配列のうちの1つと少なくとも50%同一である核酸である、請求項9記載の薬学的組成物。
- 前記グラニュリン又は前記グラニュリン様化合物がタンパク質又はペプチドである、請求項8記載の薬学的組成物。
- 前記グラニュリン又は前記グラニュリン様化合物が配列番号11〜20のうちの1つによるタンパク質若しくはペプチド、又はこれらの配列のうちの1つと少なくとも50%同一であるタンパク質若しくはペプチドである、請求項11記載の薬学的組成物。
- 錠剤、糖衣錠、ピル、顆粒、エアロゾル、注入溶液、乳濁液、懸濁液又は溶液の形態である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
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