JP2010518825A - 遺伝子組み換え単子葉植物における組み換えインスリン様成長因子i(igf−i)およびインスリン様成長因子結合タンパク質3(igfbp−3)の産生 - Google Patents
遺伝子組み換え単子葉植物における組み換えインスリン様成長因子i(igf−i)およびインスリン様成長因子結合タンパク質3(igfbp−3)の産生 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2007年2月20日に出願された米国仮特許出願第(“USSN”)60/890,823号に対する優先権の利益を主張する。前記出願は、その全体が本明細書中に参考として、そして全ての目的のために明白に援用される。
本願は、MPEP§1730II.B.2(a)(A)において公認され定められたように、USPTO EFS−WEBサーバーを介して電子的に出願され、そしてこの電子出願は、電子的に提出された配列(配列番号)表を含む。この配列表の全ての内容は、全ての目的のために参考として本明細書中に援用される。配列表は、以下に示す電子的に出願されたテキストファイル上で確認される:
IGF−IおよびIGFBP−3構築物を用いたAgrobacteriaの形質転換
ヒトIGF−I(図1)およびIGFBP−3(図2)のDNA配列に、2つの種子貯蔵タンパク質に用いられる優先コドンに基づいて改変を加えた。シカクマメ由来のリジンに富んだタンパク質(LRP)およびパラダイスナッツ由来のメチオニンに富んだ2Sアルブミン(PN2S)のコドン使用頻度(表1)を改変のベースとして選択したが、これは、過去の研究において、形質転換シロイヌナズナ中での高度な発現および安定した蓄積(LRPおよびPN2Sについて、それぞれ全抽出種子タンパク質の3〜10%および3〜15%)が観察されたためである。
1) (Gt−1pro)+SP+IGF−I*+NOSter
2) (Gt−1pro)+SP+IGF−I*+KDEL+NOSter
IGFBF−3:
3) (Gt−1pro)+SP+IGFBF−3*+NOSter
4) (Gt−1pro)+SP+IGFBF−3*+KDEL+NOSter
ここで、*はIGF−IまたはIGFBP−3の改変cDNAを示し、NOSterはノパリンシンターゼ停止剤を示す。
イネの形質転換、選択、および培養
カルス誘導のためにjaponica9983の成熟種子の胚盤を切除し、カルス誘導培地(N6基礎培地、2mg/lの2,4−D、0.5g/lのカゼイン加水分解液、30g/lのスクロース、2.5g/lのPhytagel(登録商標)、pH5.8)上で培養した。カルス誘導培地で4〜7日間培養した後すぐに、未熟胚由来のカルスを使用し、標的遺伝子を含有するAgrobacterium EHA105と共培養した。
遺伝子組み換えイネの分析
サザンブロット分析
遺伝子組み換えイネ苗を分析し、イネゲノムへの標的遺伝子の組込みを確認した。臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)法により葉ゲノムDNAを抽出した(Doyle,J.D.ら、Focus(1990)12:13−15)。15μgのゲノムDNAをBamHIを用いて一晩かけて消化し、0.8%のアガロースゲル上で分離し、VacuGeneXL真空ブロッティングシステム(Pharmacia Biotech)を用いて正に帯電したナイロン膜(Roche)に移した。DIG核酸検出キット(Roche)に記載の方法に従ってハイブリダイゼーションおよび検出を行った。DIG DNA標識キット(Roche)を用いてPCRにより二本鎖DIG標識DNAプローブ(IGF−IおよびIGFBP−3)を準備した。これらのプローブを使用前に99℃で加熱して変性させた。
種子をすりつぶして粉末状にし、タンパク質抽出緩衝液(50mMのトリスHCl、pH6.8、0.1MのNaCl、および10%SDS)と混合することにより全種子タンパク質を成熟イネ種子から抽出した。遠心分離した後、上澄液を新しいエッペンドルフチューブに移し、種子全タンパク質抽出液として保存した。次に、異なる量の全タンパク質を17%トリシンSDS−PAGE中で分解し、PVDF膜上にブロットした。抗ヒトIGF−IまたはIGFBP−3ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。最後に、Aurora(登録商標)Western Blot Chemiluminescent Detection System(ICN)のマニュアルに記載のとおり、化学発光Starlight(登録商標)基質(ICN)を用いてブロットの非放射性検出を行った。
イネで生成したrhIGF−Iの生物活性
インスリンと同様に、IGF−Iは、筋細胞中で膜ラッフルおよびグルコース摂取を生じることが示されている。IGFBP−3は、IGF−Iと結合して、ALS複合体を形成することができ、これにより、IGF−Iにより生じた膜ラフリング作用が阻害される。イネで生成した組み換えhIGF−Iをインスリンと同時にテストし、それらの生物活性を比較した。
イネで生成したrhIGFBP−3タンパク質の抗癌活性
ヒトIGFBP−3は、エストロゲン依存性および非依存性乳癌細胞の増殖を阻害することが示されている。イネで生成したrhIGFBP−3が制癌作用を有するか否かを検査するために、MCF−7ヒト乳癌細胞を用いた。
組み換え技術によって生成したタンパク質の精製
親和性クロマトグラフィーを用いて上記実施例に記載の粗抽出液をさらに精製する。IGF−IおよびIGFBP−3の各々をクロマトグラフィーカラムに塗布し、さらに精製するために、これらのカラムをそれぞれの抗体に結合する。カラムを介して不純物を洗浄し、pHおよび塩濃度を調節してタンパク質を溶出する。
組み換えタンパク質収量の向上
実施例2に記載の苗から種子を得て、第2および第3世代の作物を得るために移植する。収量が向上した組み換えIGF−IおよびIGFBP−3が得られる。
Claims (17)
- インスリン様成長因子I(IGF−I)をコードするヌクレオチド配列またはインスリン様成長因子結合タンパク質3(IGFBP−3)をコードするヌクレオチド配列の発現のためのDNA構築物を含有するように改変した単子葉植物細胞であって、該DNA構築物は、単子葉植物細胞中での発現のために制御配列と作動可能に連結した該コードするヌクレオチド配列を含む、細胞。
- 前記IGF−IおよびIGFBP−3はヒトタンパク質である、請求項1に記載の細胞。
- 前記制御配列は、単子葉植物の種子中で作動可能なプロモーターおよび単子葉植物の種子中で作動可能な終止配列を含む、請求項1または2に記載の細胞。
- 前記コードするヌクレオチド配列は、小胞体(ER)分泌経路に導くシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列によりN末端で伸長される、請求項1または2に記載の細胞。
- 前記コードするヌクレオチド配列は、ER保持シグナルをコードするヌクレオチド配列によりC末端で伸長される、請求項1または2に記載の細胞。
- 前記細胞はイネ細胞である、請求項1または2に記載の細胞。
- 請求項1または2に記載の細胞を含む遺伝子組み換え植物または植物部位。
- IGF−IまたはIGFBP−3を含む単子葉植物細胞。
- 前記IGF−IおよびIGFBP−3はヒト由来のものである、請求項8に記載の細胞。
- 前記細胞はイネ細胞である、請求項8または9に記載の細胞。
- 請求項8または9に記載の細胞を含む植物または植物部位。
- 前記植物部位は種子組織である、請求項11に記載の植物部位。
- 前記植物または植物部位はイネである、請求項11に記載の植物または植物部位。
- 前記植物部位は種子組織である、請求項13に記載の植物部位。
- 単子葉植物においてIGF−IまたはIGFBP−3を産生する方法であって、請求項1または2に記載の植物細胞を培養する工程を包含する、方法。
- 単子葉植物においてIGF−IまたはIGFBP−3を産生する方法であって、請求項11に記載の植物を培養する工程を包含する、方法。
- 前記植物はイネである、請求項16に記載の方法。
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