JP2010514731A - 志賀毒素のｂサブユニットを含む組成物およびｎｋｔ細胞の刺激方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、a)抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合することができるその機能的同等物およびb)NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを含む組成物ならびに前記組成物を含む医薬組成物および医薬品に関する。

Description

本発明は、抗原関連疾患の分野、特に治療用ワクチンの分野に関する。特に、本発明は、抗原に結合した志賀毒素のBサブユニットまたはその機能的同等物およびNKT細胞を刺激する手段を使用して、免疫応答を必要とする個体に免疫応答を惹起することを目的とする。

ワクチン送達系およびヒトへの使用が承認されたアジュバント(アルミニウム塩、MF59、ビロソームなど)は、主に体液性免疫応答を誘発する。しかし、前臨床試験では、病原体(HIV、結核菌、マラリアなど)に対して有効なワクチンだけでなく癌ワクチンも、体液性および細胞性応答の両方が必要であるらしいことが強く示唆される。弱毒生病原体または完全な不活性化生物は、ヒトにおける免疫系の両方を活性化することが示されたが、これらのワクチンは製造が困難で、安全ではない可能性があり、免疫原性が不十分である。したがって、強力で特異的なCD8⁺T細胞応答を惹起するサブユニットワクチンの開発には競い合って挑戦が続けられている。

樹状細胞(DC)は、T細胞の一次応答を誘発するための最も強力な抗原提示細胞であることが示されたが、B細胞の抗体形成細胞への分化を誘発することもでき、NKおよびNKT細胞などのその他の効果的な免疫細胞を動員することもできる。ヒトにおいて、健康なレシピエントを使用した臨床試験によって、DCの免疫原性および安全性が証明され、少数の抗原パルスDCの単回注射であっても、未処理抗原およびリコール抗原両方のT細胞免疫を迅速に拡大するのに十分であることが示された。しかし、DCの生成および生体外での操作は労力を要する。したがって、in vivoにおいてDCを標的とする直接的な抗原は、いくつかの利点をもたらすであろう。

したがって、in vivoにおいて強力で特異的なCD8⁺T細胞応答を惹起する組成物は、治療用ワクチンの分野で大きな関心の的である。本発明は、抗原をDCに送達し、HLAクラスI分子による抗原由来のペプチドの最適な提示を導き、DCに成熟刺激をもたらす組成物を提供することによって、前記対象に応答することが目的である。

国際公開第02/060937号では既に、Gb3受容体発現細胞に分子を標的化するための担体が開示されており、前記担体は以下の式STxB-Z(n)-Cysを有し、式中、STxBは志賀毒素サブユニットBであり、Zはスルフヒドリル基を有さないアミノ酸リンカーであり、nは0、1またはポリペプチドであり、Cysはアミノ酸システインである。国際公開第02/060937号は、STxBをベースにしたワクチンが体液性免疫および長期にわたる強力なCD8⁺T細胞応答を誘導することを示した。これらの結果は全て、STxBが同時刺激およびDC上のMHCクラスII分子を増加させる能力、ならびに間接的にDCの成熟に有利に働くことができるいくつかの細胞上にTNFを誘導する能力によって説明することができる。しかし、骨髄由来の骨髄DCをSTxBとインキュベートしてもこれらの細胞の成熟は認められなかった。したがって、国際公開第20/060937号で開示されたSTxBをベースにしたワクチンは、in vivoにおいてはDCの成熟を誘導しない。

したがって、一態様では、本発明はDCの成熟を導く組成物を提供することが目的である。

アジュバントは、DC成熟に有利に働くことが知られているので、抗原に結合したベクターとアジュバントの組合せは既に記載されている。

例えば、欧州特許第1078007号は毒素抗原複合体の使用を記載しており、毒素は、免疫応答を誘発するためにKLHと組み合わせた志賀毒素Bサブユニットである。

さらに、特許出願の国際公開第2005/112991号は、抗原と複合化した志賀毒素のBサブユニットおよび免疫応答を誘発するためのアジュバントの使用を開示している。アジュバントは、金属塩、水中油エマルジョン、トール様受容体アゴニスト、サポニン、リピドA、アルキルグルコサミニドリン酸塩、免疫刺激オリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せからなる群から選択することができる。

しかし、本出願人は、ベクターおよびアジュバントの全組合せがCD8⁺T細胞応答の誘導について同等ではないことを観察し、確認した。多くの従来のアジュバントをスクリーニングした後、本発明者等は、NKT細胞を刺激できるCD1のリガンドとSTxBをベースにしたワクチンとの間に劇的な相乗効果があり、非常に低い用量の抗原を使用して強力なCD8⁺T細胞応答が誘導されることを発見した。STxBおよび前記リガンドの1種を組み合わせたワクチンは、自己抗原に対する寛容を破壊し、抗ウイルス免疫を惹起するのに有効であることが発見された。従来技術の教示とは対照的に、この相乗効果は、アジュバント全てには見出されなかった。特に、本出願人は、IFA(Haicheur他、JI 2000年、165:3301〜3308)などのアジュバントについはこのような相乗性を認めず、IFNα、ポリ(I:C)、またはトール様受容体アゴニストCpGなどのアジュバントについては非常に弱い相乗効果を認めた。

国際公開第02/060937号 欧州特許第1078007号 国際公開第2005/112991号 米国特許第5780441号 米国特許第5936076号 米国特許第6555372号 米国特許出願第2002/0032158号 米国特許出願第2003/0157135号 米国特許出願第2004/0127429号 米国特許出願第2005/0222048号 米国特許出願第2006/0211856号 米国特許出願第2006/0148723号 国際公開第99/51748号 国際公開第99/17741号 欧州特許第366412号 国際公開第99/28475号 国際公開第90/06951号 国際公開第99/03884号 米国特許第5843464号 欧州特許出願公開第414374号 欧州特許出願公開第0304578号 欧州特許出願公開第198-474号 国際公開第96/26277号 国際公開第99/10375号 英国特許出願第9124390.7号 第WO93/10152号 国際特許出願第PCT/EP92/02591号 国際公開第90/01496号 国際特許出願第PCT/GB89/00895号 国際公開第98/50567号 WO95/20600

NA Strockbine他、J Bacteriol 1988年、170、1116〜22 Tarrogo-Trani(Protein extraction and purification 39、170〜176頁、2004年) Natori他、Tetrahedron 1994年、50:2771〜2784 Zhou他、Science 2004年、306:1786〜1789 Wu他、J.Exp.Med. 2003年、198:173〜181 Gumperz他、Immunity 2000年、12:1211〜221 Rauch他、J.Bioch.Chem 2003年、278:47508〜47515 Liu他、Journal of Immunological Methods、312(2006)34〜39 Wu他、PNAS2005、102:1352〜1356 Biochem Biophys Acta、1989年、67、1007 Rubins他、Microbial Pathogenesis、25、337〜342 RobbinsおよびKawakami、1996年、Current Opinions in Immunology 8、628〜636頁 Van den Eynde他、International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997提出) Correale他、(1997)、Journal of the National Cancer Institute 89、293頁) Haicheur,N.他、2003年、Int Immunol 15:1〜11 Mallard, F他、2003年、Methods MoI Med 73:209〜220 Haicheur,N.他、2000年、J Immunol 165:3301〜3308

したがって、本発明の目的は、
a)抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物および
b)NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを含む組成物を提供することである。

本発明の一実施形態では、志賀毒素のBサブユニットの免疫学的機能的同等物は、志賀毒素のBサブユニットに対して少なくとも50%アミノ酸配列同一性を有する。

本発明の他の実施形態では、CD1の前記リガンドは、CD1dのリガンドである。

本発明の他の実施形態では、CD1の前記リガンドは、糖脂質またはリン脂質、スフィンゴ糖脂質、それらの誘導体もしくは類似体である。好ましい実施形態では、前記リガンドはiGb3、GD3、PEおよびPIから選択される。

他の好ましい実施形態では、CD1の前記リガンドは、グリコシルセラミドまたはそれらの類似体もしくは誘導体である。好ましくは、前記グリコシルセラミドは、α-GalCer、α-GlcCer、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、Galβ1-3Galα1-1'Cerまたはそれらの誘導体からなる群から選択され、好ましくはそれらのC-グリコシド誘導体、より好ましくはα-GalCerのC-グリコシド誘導体である。

本発明の一実施形態では、αGalCerは(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサ-コサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである。他の実施形態では、αGalCerは(2S,3S,4S)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシルオキシ)-2-ヘキサコサノイルアミノ-3,4-オクタデカンジオール(KRN7000)である。

本発明の好ましい実施形態では、CD1の前記リガンドは、3-O-スルホ-α-GalCer、β-GalCer、OCH化合物、α-C-GalCerからなる群から選択される。

他の一実施形態では、CD1の前記リガンドは、微生物由来の糖脂質である。好ましくは、前記リガンドは、
GSL-1およびGSL'1からなる群から選択されたスフィンゴモナス属由来スフィンゴ糖脂質、または
BbGL-IおよびBbGL-IIからなる群から選択されたボレリア属由来糖脂質、または
マイコバクテリア属由来リン酸糖脂質PIMである。

本発明の一実施形態では、志賀毒素のBサブユニットまたはその機能的同等物は、式STxB-Z(n)-Cysを有する汎用ポリペプチド担体中に存在し、式中、
STxBは志賀毒素サブユニットBまたはその機能的同等物であり、
Zはスルフヒドリル基を有さないアミノ酸であり、nは0、1またはポリペプチドであり、
Cysはアミノ酸システインである。

好ましい実施形態では、n=0である。

好ましい実施形態では、抗原は-S-Sまたは-S-COまたはS-CH₂または-S-NH結合によって汎用担体の-S残基に共有結合する。他の好ましい実施形態では、汎用担体は、-S-Sまたは-S-COまたはS-CH₂または-S-NH結合によってオリゴペプチドもしくはポリペプチドに共有結合し、標的となる抗原は前記オリゴペプチドまたはポリペプチドに作動可能に結合する。より好ましい実施形態では、汎用担体は、ポリリシンオリゴペプチドに共有結合し、標的となる抗原は、前記ポリリシン部分に作動可能に結合する。

本発明の一実施形態では、抗原は腫瘍抗原、ウイルスまたは細菌抗原である。

本発明の一実施形態では、前述の組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。

本発明はまた、前述の組成物を含む医薬品を提供することを目的とする。

本発明の他の目的は、前記組成物を含むワクチンである。

a)抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物を含む第1の容器、および
b)NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを含む少なくとも1個の第2の容器を含む医薬キットを提供することも本発明の目的である。

本発明は、個体における抗原関連状態を治療するための、ワクチンを含む医薬組成物または医薬品を製造するための前述したような組成物の使用に関し、前記抗原関連状態は腫瘍または感染である。

一実施形態では、本発明は抗原関連状態の治療を必要とする個体における抗原関連状態を治療するための前記組成物の使用に関し、前記組成物は、前記個体において前記抗原に対する免疫応答を誘発し、それによって前記個体における前記抗原関連状態を治療するための治療有効量で前記個体に投与される。

他の実施形態では、本発明は抗原関連状態の治療を必要とする個体における抗原関連状態を治療するための前記組成物の使用に関し、前記組成物は、サリドマイドまたはその類似体、好ましくはレナリドマイドと組み合わせて投与される。

本発明はまた、前述のキットの使用に関し、NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを、抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGB3受容体に結合できる機能的同等物の前、同時または後に投与する。

一実施形態では、前述の組成物の使用は、樹状細胞の刺激を含む免疫応答の誘発を導く。

他の実施形態では、前述の組成物の使用は、抗原特異的CD8応答の惹起を含む免疫応答の誘発を導く。

STxB-OVA結合体によって誘導される抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞のレベルに対するアジュバントの役割を示した図である。マウスは、PBSで希釈したStxB-OVA単独(50μg=0.5nmol)または様々なアジュバントと一緒にしたSTxB-OVA(IFA vol/vol、IFNα 100000IU d0、d1およびd2、ポリ(I:C)(250μg、d0およびd21)、CpG(50μg、d0およびd21)で2回(d0およびd21)皮下免疫した。α-GalCer(2μg)は、d0にのみSTxB-OVAと混合した。2回目の免疫は、STxB-OVA単独で実施した。脾臓のCD8⁺T細胞は、最終免疫の7日後に単離し、生体外においてPE標識OVA_257〜264/k^bテトラマーおよびアロフィコシアニン標識抗CD8mAbで直接染色した。示された値は、K^bに関してVSV由来ペプチドを認識する無関係なテトラマーによる値を差し引いた後、特定のテトラマーで得られた平均±SDに対応した。これらの結果は、群当たり4匹のマウスで行った3回の実験を表している。 α-GalCerは、非常に低い用量の抗原でも長期にわたって機能的に特異的な抗OVA2_57〜264CD⁸⁺T細胞を誘導するSTxBの効果を増大させることを示した図である。マウスは、様々な用量のSTxB-OVAを単独で(A左)、またはα-GalCerと一緒にして(A右、C、D)、または遊離卵白アルブミンをα-GalCerと混合して(B)2回(d0およびd21)皮下免疫した。材料と方法で触れたように、α-GalCerは最初の免疫の間にのみ投与した。A、B、C:脾臓のCD8⁺T細胞は、最終免疫の7日後に単離し、生体外においてPE標識OVA_257〜264/k^bテトラマーおよびアロフィコシアニン標識抗CD8mAbで直接染色した。示した結果は、CD8⁺T細胞にゲート設定した。K^bに関してVSV由来ペプチドを認識する関係のないテトラマーおよびアイソタイプ対照mABを対照として含めた。これらの結果は、1群当たり4匹のマウスを用い、3回行った実験を表している。D:マウスはα-GalCer(2μg)と混合したSTxB-OVA(1μg)で免疫した。左図:IFNγ産生OVA_257〜264/k^b特異的CD8⁺T細胞は、OVA_257〜264ペプチドでパルスした(■)またはパルスしていない(□)EL4を使用したIFNγELISPOTアッセイによって生体外で検出した(SL8)。SFC=スポット形成細胞は、Elispot自動化リーダーシステムを使用して読み取った。右図:CTL活性は、OVA_257〜264ペプチドでパルスした(■)またはパルスしていない(□)標的EL4細胞において、エフェクター-標的E/T比100/1として標準4時間⁵¹Cr放出アッセイによって測定した。群当たり3匹のマウスを免疫し、これらの実験は2回繰り返した。 α-GalCerはまた、STxB-E7が抗E7 CTLを惹起する効果を増大させることを示した図である。マウスは、0日目および21日目にSTxB-E_43〜57(1μg)を単独で、またはα-GalCerと混合して、あるいは遊離ポリペプチドE7_43〜57をα-GalCerと混合して免疫した。最終免疫の7日後に、脾臓のCD8⁺T細胞を単離し、PE標識E7_49〜57/D^bテトラマーで直接染色した。(細胞は既にCD8⁺T細胞にゲート設定した)。D^bに関してLCMV由来ペプチドを認識する関係のないテトラマーを対照として含めた。これらの結果は、群当たり3匹のマウスで行った2回の実験を表している。 STxB-OVAをベースにしたワクチンによって免疫した後のCD4⁺T細胞および体液性応答を示した図である。左図:マウス(群当たりn=3)は、STxB-OVA(0.01nmol)を単独で、またはα-GalCer(2μg)と混合して2回(d0およびD21)免疫した。対照として、マウスにIFAと混合した卵白アルブミン(0.01nmol)でワクチン接種した。最終免疫の7日後に、脾臓からCD4⁺T細胞を精製し、CFSEで標識した。次に、このCD4⁺T細胞をT細胞除去脾細胞とインキュベートし、APCを遊離卵白アルブミンタンパク質でパルスし、AIM V血清を含まない培地で5日間一緒に培養した。APC感作なしの増殖を卵白アルブミンパルスで得られた値から背景として差し引いた。これらの実験は、2回繰り返した。右:最終免疫の1週間後に、血清を収集し、抗OVA IgG2aおよびIgG2bをELISAによって測定した。 STxB-OVAおよびα-GalCerの組合せは樹状細胞による卵白アルブミンの交差提示を増強することを示した図である。マウス(群当たりn=3)はSTxB-OVA(1μg=0.01nmol)を単独で、またはポリ(I:C)もしくはα-GalCer(2μg)と一緒にして免疫した。ワクチン接種して7日後、CD11c⁺の豊富な樹状細胞をCFSE標識OT-1細胞と72時間共培養した。これらの実験は、3回繰り返し、類似の結果が得られた。ドットプロットは、CFSE標識CD8⁺OT-1細胞にゲート設定した。 α-GalCerと一緒にしたSTxB-OVAは、OVA-TGマウスにおいて抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞を刺激する。OVA-TGマウスはα-GalCer(2μg)と一緒にした、または一緒にしないSTxB-OVA(0.1nmol)で免疫した。14日後、脾臓からCD8⁺T細胞を単離し、PE標識OVA_257〜264/k^bテトラマーおよびAPC標識抗CD8mAbで直接染色した。四角はそれぞれ個々のマウスの値を表し、K^bに関してVSV由来ペプチドを認識する無関係なテトラマーで得られた値を差し引いた後の特異的OVA_256〜264/K^bテトラマーで得られた結果に対応する。実験は2連で実施し、類似の結果が得られた。 α-GalCerと一緒にしたSTxB-OVAは、rVV-OVA曝露に対して抗ウイルス防御免疫を誘導することを示した図である。マウス(群当たり5匹)にB-OVA単独(0.05nmol=5μg)、またはα-GalCerと一緒にしたB-OVA(0.05nmol)、またはα-GalCerと混合したOVA(0.05nmol)のいずれかを2回(d0およびd21)腹腔内注射し(200μl)、対照マウスにはPBSを注射した。以前の実験と同様に、2回目の免疫の間にはα-GalCerは添加しなかった。最後に注射して8日後に、マウスに卵白アルブミンcDNAを発現している組換えワクシニアウイルス(rVV-OVA、ウェスタンリザーブ種)2.5×10⁶PFUを腹腔内曝露した。4日後、BHK21細胞によるプラークアッセイによって卵巣のrVV力価を測定した。結果は、群当たり6匹のマウスのpfuの平均を表している。P値は、スチューデントt検定によって計算した。 NKT細胞欠損マウスではα-GalCerのアジュバント効果はないことを示した図である。Jal8^-/-マウスはStxB-OVA(1μg)またはStxB-OVA+α-GalCer(2μg)で免疫した。免疫して7日後に、免疫マウスおよび非免疫マウスの脾臓を摘出し、抗CD8抗体およびOVA_257〜264/K^bテトラマーで染色した。 STxB-Ovaと一緒にしたαGalCerによるワクチン接種が定着した腫瘍に対する防御を誘導することを示した図である。C57BL6マウスにEG7腫瘍を移植し、3日後、PBS、STxB-OVA、α-GalCerまたはSTxB-OVA+α-GalCerでワクチン接種した。

I.定義
「個体」とは、哺乳類、特に人類を意味する。

「有効量」とは、有益な、または所望する臨床結果(例えば、臨床状態の改善)を達成するために十分な量を意味する。

本明細書では、「治療」または「治療すること」とは一般的に、治療する個体または細胞の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入のことであり、予防のために、または臨床病理の経過中のいずれかで実施することができる。所望する効果には、限定はしないが、疾患の発症または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的もしくは間接的な病理学的結果の抑制、減少または阻害、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解または軽減および寛解または予後改善の誘因が含まれる。

「NKT細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は当技術分野では公知で、本明細書で使用したように、サイトカイン産生を引き起こすか、刺激するか、または関与するT細胞集団、および/または、他の実施形態では、細胞傷害性のあるT細胞集団のことである。NKT細胞は、T細胞抗原受容体(TCR)およびNK細胞マーカーの両方を発現することが特徴である(すなわち、マウスではNK1.1、C-レクチン型NK受容体、DX5、Ly49受容体およびヒトではNKR-P1A)。

「Th1サイトカイン」という用語は当技術分野では公知で、本明細書で使用したように適応免疫応答の一部としてTヘルパー細胞によって惹起されるサイトカインのことである。通常、Th1サイトカインは、例えば、インターロイキン-2またはインターフェロン-γである。

「Th2サイトカイン」という用語は当技術分野では公知で、本明細書で使用したように適応免疫応答の一部としてTヘルパー細胞によって惹起されるサイトカインのことである。通常、Th2サイトカインは、例えば、インターロイキン-4またはインターロイキン-10である。

「樹状細胞」(DC)という用語は当技術分野では公知で、本明細書で使用したようにT細胞に抗原を提示することができる抗原提示細胞のことである。

「成熟樹状細胞」という用語は当技術分野では公知で、本明細書で使用したようにCD115、CD14、CD68もしくはCD32発現の減少した樹状細胞の集団またはCD86発現の増強した樹状細胞の集団またはそれらの組合せのことである。

本明細書では、「免疫応答を誘発する」という用語は、関心のある抗原に対して免疫応答がまだ惹起されていない個体における前記抗原に対する免疫応答の惹起を意味するか、または個体によって既に開始している免疫応答の増強のことである。免疫応答の誘発に関しては、免疫系の体液性および細胞媒介性の両腕が関与し得ることを理解されたい。一実施形態では、体液性免疫応答の誘発を生じる免疫応答の誘発は、抗体産生および、例えばELISAなどの当技術分野で公知の任意の手段によって測定できるTH2サイトカイン特性(IL-2、IL-5、IL-6など)の増加によって示すことができる。他の実施形態では、細胞媒介性応答の誘発を生じる免疫応答の誘発は、同様に測定することができるIFN-γもしくはIL-12もしくはその両方の増加によって示すことができる。他の実施形態では、免疫応答の誘発は、サイトカイン発現の変化に関連する。このような変化は、当技術分野で周知の手段、例えば、ELISA、ウェスタンブロット分析、PCR分析などによって容易に測定することができる。

「抗原」という用語は当技術分野では公知で、本明細書で使用したように宿主に導入されたとき免疫応答を惹起する物質(タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸またはそれらの組合せ)および本発明による志賀毒素のBサブユニットと結合したとき、免疫応答を惹起できる物質のことである。「抗原エピトープ」という用語には、抗原性を決定できるタンパク質の断片が含まれる。例えば、抗原には、特定の種類の癌細胞、すなわち、腫瘍細胞の表面に特異的に関連するタンパク質およびその他の分子が含まれる。あるいは、抗原は、微生物または病原体の表面または分泌産物に関連することができる。「病原体」という用語は、障害を引き起こす生物を含むことを意味し、このような障害は、疾患を引き起こす生物である1種または複数の特定の種類の細菌、ウイルス、真菌および原生動物によって生じる。

本明細書では、「抗原関連状態」または「抗原関連症状」という用語は、微生物または病原体感染、アレルゲン関連状態を意味し、あるいは腫瘍の存在を意味する。

本明細書では、「アジュバント」という用語は、宿主に単独で投与したとき、免疫原性を有さなくてよいが、抗原と共同して投与したとき抗原に対する宿主の免疫応答を増強する化合物または混合物のことである。

本明細書では、「ワクチン」という用語は、レシピエントにおいて防御免疫を惹起するために使用することができる組成物のことである。本発明では、ワクチンは医薬品である。

II.本発明
本発明は、
a)抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物および
b)NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを含む組成物に関する。

志賀毒素のBサブユニットは、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)によって分泌される。このホモペンタマーは、標的細胞の原形質膜に見出される糖脂質Gb3と相互作用することによって、毒素の標的細胞への結合および内部移行に関与する。志賀毒素のBサブユニットは、NA Strockbine他、J Bacteriol 1988年、170、1116〜22に記載された配列を有する。

志賀毒素のBサブユニットの機能的な同等物とは、Gb3受容体に特異的に結合する能力、および/または抗原の内部移行およびMHCクラスI限定経路での提示、または同一抗原提示細胞上のMHCクラスIおよびクラスII両方での提示を誘発する能力を有するポリペプチド配列を意味する。

さらに、志賀毒素のBサブユニットの機能的同等物には、Gb3受容体に結合できるその他の細菌から得られた相同な毒素が含まれる。例えば、大腸菌(E.coli)のベロ毒素-1またはベロ毒素-2のBサブユニットはまた、Gb3受容体に結合することが知られている。本発明に関して、「毒素」という用語は、ヒトに対してもはや毒性がないように解毒された毒素またはヒトにおいて毒活性が実質的に回避された毒素のサブユニットまたはそれらの断片を意味するものとする。

本発明の一実施形態では、志賀毒素のBサブユニットの機能的同等物は、志賀毒素のBサブユニットに対して少なくとも50%、好ましくは60、70、80、90または95%のアミノ酸同一性を有する。

Gb3受容体に特異的に結合するポリペプチド配列の能力は、Tarrogo-Trani(Protein extraction and purification 39、170〜176頁、2004年)によって記載された方法に基づき、市販のガラビオース結合アガロースゲル(Calibochem)によるアフィニティークロマトグラフィーを必要とする以下のアッセイによって評価することができる。ガラビオース(Gala1-4Gal)は、Gb3のオリゴ糖部分の末端炭水化物部分であり、志賀毒素のBサブユニットによって認識される最小構造を表すと考えられる。PBS緩衝液(500μl)に溶かした関心のあるタンパク質を同緩衝液で既に平衡化したガラビオース固定化樹脂100μlと混合し、回転板上で4℃で30分から1時間インキュベートする。最初に5000rpmで1分間遠心した後、ペレットをPBSで2回洗浄する。次に、結合した物質は、最終ペレットをグリシン100mM、pH2.5、2×500μlに懸濁することによって2回溶出する。その後、流出物、収集した洗浄液および収集した溶出液に対応する試料をSDS Page、クーマシー染色およびウェスタンブロッティングによって分析する。

CD1分子は、古典的なMHC分子と機能的に類似している高く保存された抗原提示タンパク質のファミリーである。CD1タンパク質は様々な脂質および糖脂質を結合し、Tリンパ球に提示する。5個の公知のアイソフォームは、2つの群、群I(ヒトにおけるCD1a、CD1b、CD1cおよびCD1e)および群II(ヒトおよびマウスにおけるCD1d)に分類される。

一実施形態では、本発明の組成物に存在するCD1のリガンドは、CD1dのリガンドである。

CD1分子のある種のリガンドは、結合するとNKT細胞を刺激する。例えば、NKT細胞による迅速なTh1およびTh2サイトカイン産生を誘発する。

本発明の一実施形態では、前記リガンドは、Th1およびTh2サイトカイン産生、例えば、IL-4およびIFN-γを誘導する。このようなサイトカイン産生は、当技術分野で周知の任意の手段、例えば、ELISAまたはフローサイトメトリーなどによって容易に測定することができる。他の実施形態では、前記リガンドは、CD25、CD69またはFasリガンド分子の発現の増加またはパーフォリン産生の増加を誘導する。このような増加は、当技術分野で周知の任意の手段、例えば、フローサイトメトリーなどによって測定することができる。

本発明の一実施形態では、NKT細胞を刺激できるCD1の前記リガンドは、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ糖脂質、それらの誘導体または類似体である。

スフィンゴ糖脂質は、脂質以外の成分としてセラミドを含有する複雑な糖脂質である。例えば、日本のKirin Pharmaceuticalは、沖縄の海綿、Agela mauritianusの抽出物からアゲラスフィンと称するいくつかのスフィンゴ糖脂質化合物を同定した(Natori他、Tetrahedron 1994年、50:2771〜2784)。

糖脂質のその他の例は、リソソームのスフィンゴ糖脂質、イソグロボヘキソシルセラミドiGB3(Zhou他、Science 2004年、306:1786〜1789)、ジシアロガングリオシドGD3(Wu他、J.Exp.Med. 2003年、198:173〜181)、ホスファチジルイノシトールPI(Gumperz他、Immunity 2000年、12:1211〜221)およびホスファチジルエタノールアミンPE(Rauch他、J.Bioch.Chem 2003年、278:47508〜47515)である。本発明の一実施形態では、前記リガンドは、GD3、PEおよびPIから選択される。

本発明の一実施形態では、前記リガンドは米国特許第5780441号に記載されたようなスフィンゴ脂質であって、前記スフィンゴ糖脂質は以下の式を有する。

式中、R1はHまたは

を表し、
R2はH、

を表し、
R3およびR6はそれぞれHまたはOHを表し、
R4はH、OHまたは

を表し、
R5はHまたは

を表し、
Xは19から23までの整数であり、R7は以下の群(a)〜(g)のいずれか1つを表し、
(a)-(CH₂)₁₁-CH₃、
(b)-(CH₂)₁₂-CH₃、
(c)-(CH₂)₁₃-CH₃、
(d)-(CH₂)-CH(CH₃)₂、
(e)-(CH₂)₁₀-CH(CH₃)₂、
(f)-(CH₂)₁₁-CH(CH₃)₂、
(g)-(CH₂)₁₁-CH(CH₃)₂-C₂H₅、
R1、R2、R4およびR5の少なくとも1個がグリコシル部分である。

本発明の他の実施形態では、前記リガンドは、米国特許第5936076号で記載されたようなα-ガラクトシルセラミドであって、前記α-ガラクトシルセラミドは以下の式を有する。

式中、Rは

を表しており、
R2は、HまたはOHを表し、Xは0〜26の整数を表し、またはRは(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃であり、
R1は以下の(a)〜(e)によって定義される置換基のいずれか1つを表し、
(a)-CH₂(CH₂)_yCH₃、
(b)-CH(OH)(CH₂)₂CH₃、
(c)-CH(OH)(CH₂)_yCH(CH₃)₂、
(d)-CH=CH(CH₂)_yCH₃および
(e)-CH(OH)(CH₂)_yCH(CH₃)CH₂CH₃、
Yは5〜17の整数を表す。

本発明の他の実施形態では、前記リガンドは米国特許第6555372号に記載されたようなα-ガラクトシルセラミドまたはそれらの塩もしくは溶媒和物であって、前記α-ガラクトシルセラミドは以下の式を有する。

式中、R1はHまたはOHを表し、Xは7と27との間の整数を表し、R2は以下の(a)から(e)からなる群から選択された置換基を表し(Yは5と17との間の整数を表す)、
(a)-CH₂(CH₂)γCH₃、
(b)-CH(OH)(CH₂)γCH₃、
(c)-CH(OH)(CH₂)γCH(CH₂)₂、
(d)-CH=CH(CH₂)γCH₃、
(e)-CH(OH)(CH₂)γCH(CH₃)CH₂CH₃、
R3からR9は以下のi)およびii)のいずれか1つで定義された置換基を表し、
i)R3、R6およびR8がHを表すとき、R4はH、OH、NH₂、NHCOCH₃または以下の群(A)から(D)からなる群から選択された置換基を表し、

R5はOHまたは以下の群(E)および(F)からなる群から選択された置換基を表し、

R7はOHまたは以下の群(A)から(D)からなる群から選択された置換基を表し、

R9はH、CH₃、CH₂OHまたは以下の群(A')から(D')からなる群から選択された置換基を表し、

ii)R3、R6およびR7がHを表すとき、R4はH、OH、NH₂、NHCOCH₃または以下の群(A)から(D)からなる群から選択された置換基を表し、

R5はOHまたは以下の(E)および(F)からなる群から選択された置換基を表し、

R8は、OHまたは以下の群(A)から(D)からなる群から選択された置換基を表し、

R9は、H、CH₃、CH₂OHまたは以下の群(A')から(D')若しくはそれらの塩又は溶媒和物からなる群から選択された置換基を表す。

本発明の好ましい実施形態では、前記リガンドは以下の式、(2S,3S,4S)-1-(α-D-ガラクトピラノシルオキシ)-2-ヘキサコサノイルアミノ-3,4-オクタデカンジオールを有する化合物KRN7000である。

本発明の他の実施形態では、前記リガンドは米国特許出願第2002/0032158号に記載されたような糖脂質誘導体であって、前記糖脂質誘導体は以下の式を有する。

式中、Wは、場合によって2重結合またはヒドロキシ基を含有する9個から17個の炭素鎖を表し、Xは場合によって2重結合またはヒドロキシ基を含有する11個から25個の炭素鎖を表し、Yは-(CH₂)_a-CH=CH-(CH₂)_a'-、-(CH₂)_a-(a,a'は0〜5個の整数を表し、a+a'は5以下である)、-S(O)_0-2CH₂-、-NHCH₂を表し、Zは-CO-、-SO₂を表し、Rは-CH₂OH、-CO₂H、-CH₂OCH₂CO₂H、-CH₂OSO₃Hを表し、R₀は-OH、-NH₂、-NHAcを表す。

本発明の他の実施形態では、前記リガンドは米国特許出願第2003/0157135号に記載されたようなグリコシルセラミドであって、前記グリコシルセラミドは以下の式を有する。

式中、R1、R2およびR5はHまたは特定の単糖を表し、R3およびR6はそれぞれHまたはOHを表し、R4はH、OHまたは特定の単糖を表し、Xは1から23の整数を表し、R7は以下の群(a)〜(g)のいずれか1つを表す。
(a)-(CH₂)₁₁-CH₃、
(b)-(CH₂)₁₂-CH₃、
(c)-(CH₂)₁₃-CH₃、
(d)-(CH₂)₉-CH(CH₃)₂、
(e)-(CH₂)₁₀-CH(CH₃)₂、
(f)-(CH₂)₁₁-CH(CH₃)₂、
(g)-(CH₂)₁₁-CH(CH₃)₂-C₂H₅。

好ましい実施形態では、前記リガンドはグリコシルセラミドまたはそれらの類似体もしくは誘導体である。

より好ましい実施形態では、前記リガンドはα-ガラクトシルセラミド(α-GalCer)、α-グルコシルセラミド(α-GlcCer)、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、Galβ1-3Galα1-1'Cerまたはそれらの誘導体からなる群から選択され、好ましくはそれらのC-グリコシド誘導体、より好ましくはα-GalCerのC-グリコシド誘導体である。

本発明の他の好ましい実施形態では、前記リガンドは以下の式(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサ-コサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールを有する。

他の実施形態では、前記リガンドは以下の式(2S,3S,4S)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシルオキシ)-2-ヘキサコサノイルアミノ-3,4-オクタデカンジオール(KRN7000)を有する。

他の実施形態では、前記リガンドは、米国特許出願第2004/0127429号に記載されたようなα-C-GalCerと称するα-GalCer類似体およびそれらの薬学的に許容される塩またはエステルであって、前記リガンドは以下の式を有する。

式中、XはOまたはNHであり、R1は-(CH₂)₁₁CH₃、-(CH₂)₁₂CH₃、-(CH₂)₁₃CH₃、-(CH₂)₉CH(CH₃)₂、-(CH₂)₁₀CH(CH₃)₂、-(CH₂)₁₁CH(CH₃)₂および(CH₂)₁₁CH(CH₂)-C₂H₅からなる群から選択され、
R3はOHまたは単糖であり、R4は水素であるか、またはR3は水素であり、R4はOHまたは単糖であり、
R5は水素または単糖であり、
Q₁は場合によって存在し、C_1〜10直鎖もしくは分枝鎖アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、
X'は場合によって存在し、O、SまたはNR⁸であり、
Q₂は場合によって存在し、C_1〜10直鎖もしくは分枝鎖アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、
X''は場合によって存在し、O、SまたはNR⁸であり、
Q₃は直鎖もしくは分枝鎖C_1〜10アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは水素であり、Q¹、Q²またはQ³はそれぞれ場合によってヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、SO₂NHR⁸またはC(=O)-R⁹で置換されており、
R8は水素、C_1〜5アルキル、C_1〜5アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、SO₂またはC(=O)-R⁹であり、
R9は水素、C_1〜5アルキル、C_1〜5アルコキシまたはNHR¹⁰であり、
R10は水素、C_1〜5アルキルまたはC_1〜5アルコキシである。

他の実施形態では、前記リガンドはPBS-57であり、その構造はLiu他、Journal of Immunological Methods、312(2006)34〜39に記載された。

他の実施形態では、前記リガンドは、米国特許出願第2005/0222048号に記載されたような以下の式を有するC-糖脂質およびそれらの薬学的に許容される塩またはエステルである。

式中、XはOまたはNHであり、R3はOHまたは単糖であり、R4は水素であり、あるいはR3は水素であり、R4はOHまたは単糖であり、R⁵は水素または単糖である。

本発明の他の実施形態では、前記リガンドは米国特許出願第2006/0211856号に記載されたような以下の式を有する免疫原化合物またはその薬学的に許容される塩であり、

式中、R=COOR1またはCH₂OR1であり、
R1=Hまたはアルキル基であり、
R2=HまたはSO₃ ^-であり、
R3=HまたはOHであり、
R_3'=HまたはOHであり、
R4=H、不飽和または飽和アルキル基であり、
R_4'=H、不飽和または飽和アルキル基であり、および
R5=OH、アセトアミドまたはハロゲン原子であり、
R=CH₂OR₁、R₂=H、R_3'がOHであり、R₃がHであるとき、R₅=アキシャル位のアセトアミド、ハロゲン原子またはOHであるか、あるいはR₄=H、9個以下の炭素原子を有する不飽和または飽和アルキル鎖であり、R_4'=H、20個以下の炭素原子を有する不飽和または飽和アルキル鎖である。

本発明の好ましい実施形態では、前記リガンドは3-O-スルホ-α-GalCer、β-GalCer、OCH化合物、α-C-GalCerから選択される。

OCH化合物は、米国特許出願第2006/0148723号に記載されており、以下の式を有する。

式中、R1はアルドピラノース基であり、R2は水素原子またはヒドロキシル基であり、R3は-CH₂-、-CH(OH)-CH₂-または-CH=CH-であり、R4は水素原子またはCH₃であり、xは0〜35であり、yおよびzはy+z=0〜3を満たす整数を表す。

α-C-GalCerについては前述した。3-O-スルホ-α-GalCerはα-GalCerのスルファチド変種であり、文献Wu他(Wu他、PNAS2005、102:1352〜1356)に記載されている。

本発明の他の実施形態では、前記リガンドは、微生物由来の糖脂質である。

好ましい実施形態では、前記リガンドは、
GSL-1およびGSL'1からなる群から選択されたスフィンゴモナス属由来のスフィンゴ糖脂質、または
BbGL-IおよびBbGL-IIからなる群から選択されたボレリア属由来の糖脂質、または
マイコバクテリア属由来のリン酸糖脂質PIMである。

本発明の一実施形態では、本発明の組成物は、志賀毒素のBサブユニットまたはその機能的同等物は、式STxB-Z(n)-Cysを有する汎用ポリペプチド担体中に存在し、式中、
STxBは志賀毒素Bサブユニットまたはその機能的同等物であり、
Zはスルフヒドリル基を有さないアミノ酸であり、nは0、1またはポリペプチドであり、
Cysはアミノ酸システインである。

この汎用担体は、特許出願の国際公開第02/060937号に記載されている。

汎用担体のSTxB部分は、NA Strockbine他、J Bacteriol 1988年、170、1116〜22に記載された配列またはその機能的同等物を有する。

好ましい実施形態では、nは0であり、汎用担体は以下の配列(配列番号1)を有する。
COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVE
YTKYNDDDTFTVKVGDKELF
TNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC-NH2。

実際のところ、Zリンカーが長すぎる場合、すなわち、nが2以上の場合、内部ジスルフィド架橋がいくつか生じ、STxBのGb3受容体への結合をも妨げる。

本発明の一実施形態では、抗原は抗原提示細胞に標的化される。このような細胞は、Tリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞などを含む群で選択される。

抗原をSTxB-Z(n)-Cysに共有結合させる結合の取り組みは、当業者によって記載された、または実施された任意の方法またはプロセスであってよい。

実施できる第1の方法は、Carlsson他(5)によって記載されたSPDPヘテロ二機能性架橋剤の使用である。しかし、SPDPは、反応収率減少の原因である血清チオラーゼによって切断され得る。

STxB-Z(n)-Cysペプチドと抗原を共有結合させるための第2の方法は、P.Schelte他(4)によって記載されたように、抗原にブロモアセチル官能基またはマレイミド官能基を創出することである。

簡単に説明すると、抗原は無水ブロモ酢酸またはマレイミド基それぞれによって化学的に活性化される。適切な反応条件(pH、温度、インキュベーション時間)では、これらの基はシス脱離によって脱離し、それぞれ-S-S、-S-CH2-、-S-CO-またはS-NH-共有結合を生じる。

一例として、汎用担体のC末端システインのSH-部分に結合させる抗原は、以下の反応スキームに従って無水ブロモ酢酸によってN末端が活性化される。
Br-CH2-CO-O-CO-CH2-Br+NH2-抗原=>Br-CH2-CO-NH-抗原+Br-CH2-COOH

ブロモアセチル官能基は、ペプチドチオール基に対して官能基選択性を有し、活性化したペプチドは以下のようにSTxB-Cysと反応することができる。
STxB-Cys-SH+Br-CH2-CO-NH-抗原=>STxB-Cys-S-CH2-CO-NH-抗原+HBr

生じたチオエーテル結合は、加水分解に対して安定である。

本発明の汎用担体に対する抗原の他の結合方法は、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル)を使用する方法である。

この結合は、抗原性タンパク質または糖タンパク質などの高分子のMHCクラスIおよび/またはMHCクラスII経路による輸送およびプロセシングを可能にする。

したがって、本発明の一実施形態では、抗原は-S-Sまたは-S-COまたはS-CH₂または-S-NH結合によって汎用担体の-S残基に共有結合する。

他の実施形態では、本発明による汎用担体は、共有結合によって直接的に、またはリンカーを介して間接的に作動可能に結合することができる。

「間接的結合」という用語は、汎用担体がC末端のシステインのスルフヒドリル部分を介してリンカーに共有結合し、前記リンカーがGb3受容体を有する細胞に内部移行させる抗原に作動可能に結合することを意味する。

この結合は、リンカーと抗原との間の親和性が10^-9mole/lより高ければ、共有結合または非共有結合であってよい。

したがって、汎用担体は-S-Sまたは-S-COまたはS-CH₂または-S-NH結合によってオリゴペプチドもしくはポリペプチドに共有結合し、標的とする抗原は前記オリゴペプチドまたはポリペプチドに作動可能に結合する。好ましい実施形態では、汎用担体は、ポリリシンオリゴペプチドに共有結合し、標的とする抗原は、前記ポリリシン部分に作動可能に結合する。

本発明の一実施形態では、志賀毒素のBサブユニットに結合した抗原は腫瘍抗原、ウイルス抗原または細菌抗原である。

好ましい実施形態では、抗原はHIV、結核、クラミジア、HBV、HCVおよびインフルエンザなどの細胞内病原体に対する免疫性をもたらすように選択される。好ましくは、抗原は、HIV(例えば、gagもしくはそれらの断片、例えば、p24、tat、nef、gp120もしくはgp160などのエンベロープ、またはこれらのいずれかの断片)、ヒトヘルペスウイルス(human herpe virus)、例えば、gDもしくはそれらの誘導体またはHSV1もしくはHSV2のICP27などの最初期タンパク質、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)((特にヒト)(gBもしくはそれらの誘導体など)、ロタウイルス抗原、エプスタインバーウイルス(Epstein Barr virus)(gp350もしくはそれらの誘導体など)、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella Zoster Virus)(gpl、11およびIE63など)、またはB型肝炎ウイルス(hepatitis B virus)などの肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎表面抗原またはその誘導体)から得られ、またはA型肝炎ウイルス(hepatits A virus)、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)およびE型肝炎ウイルス(hepatitis E virus)もしくはその他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス(paramyxovirus)の抗原:呼吸器多核体ウイルス(Respiratory Syncytial virus)(例えば、F GおよびNタンパク質またはそれらの誘導体)、パラインフルエンザウイルス(parainfluenza virus)、麻疹ウイルス(measles virus)、ムンプスウイルス(mumps virus)、ヒトパピローマウイルス(human papilloma virus)(例えば、HPV6、11、16、18)、フラビウイルス(flavivirus)(例えば、黄熱病ウイルス(Yellow Fever Virus)、デングウイルス(Dengue Virus)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(Tick-borne encephalitis virus)、日本脳炎ウイルス(Japanese Encephalitis Virus))または精製されたインフルエンザウイルスもしくはそれらの組換えタンパク質、(例えば、HA、NP、NAもしくはMタンパク質、もしくはそれらの組換え体)から得られ、あるいはN.ゴノレー(N.gonorrhea)およびN.メニンギティディス(N.meningitidis)を含めたナイセリア(Neisseria)属(例えば、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PiIC、アドヘシン);S.ピオゲネス(S.pyogenes)(例えば、Mタンパク質もしくはそれらの断片、CA5プロテアーゼ)、S.アガラクチア(S.agalactiae)、S.ミュータンス(S.mutans);H.デュクレイ(H.ducreyi);カタル球菌(Branhamella catarrhalis)としても知られているM.カタラーリス(M.catarrhalis)を含めたモラクセラ(Moraxella)属(例えば、高分子および低分子量アドヘシンおよびインベイシン);B.パータシス(B.pertussis)(例えば、パータクチン、百日咳毒素またはそれらの誘導体、繊維状ヘマグルチニン、アデニレートシクラーゼ、線毛)、B.パラパータシス(B.parapertussis)およびB.ブロンキセプチカ(B.bronchiseptica)を含めたボルデテラ(Bordetella)属;結核菌(M.tuberculosis)(例えば、ESAT6、抗原85A、-Bまたは-C)、M.ボビス(M.bovis)、ライ菌(M.leprae)、M.アビウム(M.avium)、ヨーネ菌(M.paratuberculosis)、M.スメグマチス(M.smegmatis)を含めたマイコバクテリウム(Mycobacterium)属;L.ニューモフィラ(L.pneumophila)を含めたレジオネラ(Legionella)属;内毒素型大腸菌(enterotoxic E.coli)(例えば、コロニー形成因子、熱不安定性毒素またはそれらの誘導体、熱安定性毒素またはそれらの誘導体)、腸管出血性大腸菌(enterohemorragic E.coli)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic E.coli)を含めたエシェリキア(Escherichia)属、V.コレラ(V.cholera)(例えば、コレラ毒素またはそれらの誘導体)を含めたビブリオ(Vibrio)属;S.ソネイ(S.sonnei)、志賀赤痢菌(S.dysenteriae)、S.フレックスネリ(S.flexnerii)を含めたシゲラ(Shigella)属;Y.エンテロコリチカ(Y.enterocolitica)(例えば、Yopタンパク質)、ペスト菌(Y.pestis)、Y.シュードツベルクローシス(Y.pseudotuberculosis)を含めたエルシニア(Yersinia)属;C.ジェジュニ(C.jejuni)(例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン)およびC.コリ(C.coli)を含めたキャンピロバクター(Campylobacter)属;ネズミチフス菌(S.typhi)、S.パラチフィ(S.paratyphi)、S.コレラスイス(S.choleraesuis)、S.エンテリティディス(S.enteritidis)を含めたサルモネラ(Salmonella)属;L.モノサイトゲネス(L.monocytogenes)を含めたリステリア(Listeria)属;H.ピロリ(H.pylori)(例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素)を含めたヘリコバクター(Helicobacter)属;P.エルジノーサ(P.aeruginosa)を含めたシュードモナス(Pseudomonas)属;S.アウレウス(S.aureus)、表皮ブドウ菌(S.epidermidis)を含めたスタフィロコッカス(Staphylococcus)属;E.フェカリス(E.faecalis)、フェシウム菌(E.faecium)を含めたエンテロコッカス(Enterococcus)属;C.テタニ(C.tetani)(破傷風毒素およびその誘導体)、C.ボツリヌス(C.botulinum)(例えば、ボツリヌス毒素およびそれらの誘導体)、C.ディフィシル(C.difficile)(例えば、クロストリジウム毒素AまたはBおよびそれらの誘導体)を含めたクロストリジウム(Clostridium)属;炭疽菌(B.anthracis)(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)を含めたバチルス(Bacillus)属;ジフテリア菌(C.diphtheriae)(例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体)を含めたコリネバクテリウム(Corynebacterium)属;ライム病ボレリア(B.burgdorferi)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.ガリニ(B.garinii)(例えば、OSpA、OSpC、DbpA、DbpB)、B.アフゼリ(B.afzelii)(例えば、OSpA、OSpC、DbpA、DbpB)、B.アンダーソニイ(B.andersonii)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.ヘルムシイ(B.hermsii)を含むボレリア(Borrelia)属;ウマエーリキア(E.equi)およびヒト顆粒球性エーリキア症(Human Granulocytic Ehrlichiosis)の病原体を含むエーリキア(Ehrlichia)属;R.リケッチイ(richettisii)を含むリケッチア(RIchettisa)属; C.トラコーマチス(C.trachomatis)(例えば、MOMP、ヘパリン結合性タンパク質)、C.ニューモニエ(C.pneumoniae)(例えば、MOMP、ヘパリン結合性タンパク質)、C.シッタシ(C.psittaci)を含むクラミジア(Chlamydia)属;L.インタロガンス(L.interrogans)を含むレプトスピラ(Leptospira)属;梅毒トレポネーマ(T.pallidum)(例えば、稀な外膜タンパク質)、T.デンティコーラ(T.denticola)、豚赤痢菌(T.hyodysenteriae)を含むトレポネーマ(Treponema)属から得られ、あるいは熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)を含むプラスモディウム(Plasmodium)属;トキソプラズマ原虫(T.gondii)(例えば、SAG2、SAG3、Tg34)を含むトキソプラズマ(Toxoplasima)属;赤痢アメーバ(E.histolytica)を含むエントアメーバ(Entamoeba)属;ネズミバベシア(B.microti)を含むバベシア(babesia)属;T.クルージ(T.cruzi)を含むトリパノゾーマ(Trypanosoma)属;ランブル鞭毛虫(G.lamblia)を含むジアルジア(Giardia)属;森林型熱帯リーシュマニア(L.major)を含むリーシュマニア(Leshmania)属;カリニ肺炎菌(P.carinii)を含むニューモシスチス(Pneumocystis)属;トリコモナス膣炎(T.vaginalis)を含むトリコモナス(Trichomonas)属;マンソン住血吸虫(S.mansoni)を含むシストソーマ(Schistosoma)属から得られ、あるいはC.アルビカンス(C.albicans)を含むカンジダ(Candida)属;C.ネオフォルマンス(C.neoformans)を含むクリプトコッカス(Cryptococcus)属などの酵母から得られる。

結核菌のその他の好ましい特異的抗原は、例えば、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1(国際公開第99/51748号)である。

結核菌のタンパク質にはまた、結核菌の少なくとも2個、好ましくは3個のポリペプチドがより大きなタンパク質に融合した融合タンパク質およびそれらの変種が含まれる。好ましい融合物には、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(国際公開第99/51748号)が含まれる。

クラミジアの最も好ましい抗原には、例えば、高分子タンパク質(HMW)(国際公開第99/17741号)、ORF3(欧州特許第366412号)および推定膜タンパク質(Pmp)が含まれる。ワクチン製剤のその他のクラミジア抗原は、国際公開第99/28475号に記載された群から選択することができる。

好ましい細菌抗原は、肺炎球菌(S.pneumoniae)(例えば、PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質)を含むストレプトコッカス属およびタンパク質抗原ニューモリシン(Biochem Biophys Acta、1989年、67、1007;Rubins他、Microbial Pathogenesis、25、337〜342)およびそれらの変異体解毒誘導体(国際公開第90/06951号、国際公開第99/03884号)から得られる。その他の好ましい細菌ワクチンには、B型インフルエンザ菌(H.influenzae typeB)、型分離不能インフルエンザ菌(non typeable H.influenza)を含むヘモフィルス(Haemophiolus)属から得られた抗原、例えば、OMP26、高分子量アドヘシン、P5、P6、タンパク質Dおよびリポタンパク質Dおよびフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第5843464号)またはその他のマルチコピー変種もしくはそれらの融合タンパク質が含まれる。

B型肝炎ウイルス表面抗原の誘導体は当技術分野では周知で、特に、欧州特許出願欧州特許出願公開第414374号、欧州特許出願公開第0304578号および欧州特許出願公開第198-474号に記載されたPreS1、PreS2抗原が含まれる。

他の実施形態では、抗原は性器疣贅に関与すると考えられているヒトパピローマウイルス(Human Papilloma Virus)(HPV)(HPV6またはHPV11その他)および子宮頸癌に関与するHPVウイルス(HPV16、HPV18その他)から得られる。性器疣贅の予防用または治療用ワクチンの特に好ましい形態には、L1タンパク質ならびにHPVタンパク質E1、E2、E5、E6、E7、L1およびL2から選択された1種または複数の抗原を含む融合タンパク質が含まれる。最も好ましい融合タンパク質の形態は、国際公開第96/26277号で開示されたようなL2E7および国際公開第99/10375号で開示されたタンパク質D(1/3)-E7である。好ましいHPVによる子宮頚部感染または癌の予防用もしくは治療用ワクチンの組成物は、HPV16または18の抗原を含むことができる。特に好ましいHPV16抗原には、タンパク質D担体と早期タンパク質E6もしくはE7を融合させて形成したタンパク質D-HPV16のE6もしくはE7の融合物またはそれらの組合せ、あるいはL2とE6もしくはE7との組合せ(国際公開第96/26277号)が含まれる。あるいは、HPV16もしくは18の早期タンパク質E6およびE7は、単一分子、好ましくはタンパク質D-E6/E7融合物中に存在してよい。このようなワクチンは、場合によって、好ましくはタンパク質D-E6またはタンパク質D-E7融合タンパク質またはタンパク質D E6/E7融合タンパク質の形態で、HPV18のE6およびE7タンパク質のいずれか、または両方を含有してよい。

抗原はまた、マラリアの原因となる寄生虫、例えば、スポロゾイト周囲のタンパク質(CSタンパク質)、RTS、S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1およびTRAPを含めたマラリア(Plasmodia falciparum)の抗原から得ることができる。RTSは、B型肝炎ウイルスの表面(S)抗原にB型肝炎表面抗原のpreS2部分の4個のアミノ酸を介して結合したマラリアのスポロゾイド周囲(CS)タンパク質の実質的に全てのC末端部分を含むハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第9124390.7号の優先権を主張する第WO93/10152号として公開された国際特許出願第PCT/EP92/02591号に開示されている。酵母で発現するとき、RTSはリポタンパク質粒子として産生され、HBVのS抗原と共に発現させるとき、RTS、Sとして知られている混合粒子を産生する。TRAP抗原は、国際公開第90/01496号として公開された国際特許出願第PCT/GB89/00895号に記載されている。多段階のマラリアワクチンの成分の候補になりそうなマラリア原虫抗原は、マラリアのMSPl、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、セクエストリン、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびマラリア原虫のそれらの類似体である。

腫瘍抗原の例には、MAGE1およびMAGE3またはその他のMAGE抗原(黒色腫の治療用)、PRAME、BAGEまたはGAGE(RobbinsおよびKawakami、1996年、Current Opinions in Immunology 8、628〜636頁、Van den Eynde他、International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997提出)、Correale他、(1997)、Journal of the National Cancer Institute 89、293頁)が含まれる。実際に、これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌などの多種多様な種類の腫瘍で発現する。その他の腫瘍特異的抗原には、限定はしないが、腫瘍特異的ガングリオシド、前立腺特異的抗原(PSA)またはHer-2/neu、KSA(GA733)、PAP、マンマグロビン、MUC-1、癌胎児性抗原(CEA)が含まれる。その他の腫瘍関連抗原には、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、チロシナーゼ、サバイビン、NY-ES01、プロスターゼ、PS108(国際公開第98/50567号)、RAGE、LAGE、HAGEが含まれる。さらに、前記抗原は、多くの癌の治療または免疫弱化(immunocastration)において有用である、完全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン(GnRH、WO95/20600)、アミノ酸長10個の短いペプチドなどの自己ペプチドホルモンであってよい。

本発明の好ましい実施形態では、志賀毒素のBサブユニットに結合させる抗原は、MageファミリーのE6、E7抗原、Her2/neu、EGFRVIII、スルビビン、テロメラーゼ、WT1およびESAT6から選択される。

本発明の一実施形態では、前述の組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。

一実施形態では、本発明の組成物は、経口または非経口用剤形、例えば、非コーティング錠剤、コーティング錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、分散液または懸濁液として製剤化される。他の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。他の実施形態では、本発明の化合物は、経皮投与のために軟膏、クリーム、またはジェルの形態に製剤化される。他の実施形態では、本発明の化合物は、経鼻適用のためにエアロゾルまたはスプレーとして製剤化される。他の実施形態では、本発明の組成物は、液体剤形に製剤化される。適切な液体剤形の例には、水、薬学的に許容される脂肪および油、アルコールまたはエステル、エマルジョン、シロップもしくはエリキシルを含むその他の有機溶媒、溶液および/または懸濁液に溶かした溶液または懸濁液が含まれる。

本発明の実施形態による適切な賦形剤および担体は、固体または液体であってよく、その種類は一般的に、使用される投与の種類をベースにして選択される。リポソームはまた、組成物を送達するために使用することができる。適切な固形担体の例には、乳糖、スクロース、ゼラチンおよび寒天が含まれる。経口剤形は、適切な結合剤、滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香味料、流動促進剤および融解剤を含有することができる。液体剤形は、例えば、適切な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味剤、増粘剤および融解剤を含有することができる。非経口用および静脈内用剤形はまた、注射の種類または選択した送達系に適合させるために無機質およびその他の物質を含むべきである。もちろん、その他の賦形剤を使用することもできる。

本発明の組成物を含む医薬品を提供することはまた、本発明の目的である。

本発明の他の目的は、前記組成物を含むワクチンを提供することである。

各ワクチン用量における抗原の量は、通常のワクチンにおいて著しく有害な副作用を伴わずに免疫保護応答を誘導する量として選択される。一般的に、ヒトの用量はそれぞれ、抗原0.1〜1000μg、好ましくは0.1〜500μg、好ましくは0.1〜100μg、最も好ましくは0.1から50μgを含むことが予測される。特定のワクチンの最適な量は、標準的研究によって確かめることができ、ワクチン接種した対象において適切な免疫応答が認められる。最初のワクチン接種の後、対象は1回または適切な間隔をあけて数回追加免疫を受けてよい。このようなワクチン製剤は、初回または追加ワクチン接種計画のいずれかにおいて、哺乳類の粘膜表面に適用することができるか、あるいは、例えば、経皮、皮下または筋肉内経路を介して全身に投与することができる。筋肉内投与が好ましい。

本発明の他の目的は、
a)前述のように、抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物を含む第1の容器、および
b)前述のようにNKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを含む少なくとも1個の第2の容器を含む医薬キットである。

好ましくは、CD1の前記リガンドは、CD1dのリガンドである。より好ましくは、前記リガンドは、前記に引用したリガンド全てから選択される。

本発明の他の目的は、抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物を、NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドと混合する、前記組成物の調製方法を提供することである。

本発明の製剤は、予防または治療目的の両方のために使用することができる。

したがって、本発明の他の目的は、個体における抗原関連状態を治療するための、ワクチンを含む医薬組成物または医薬品を製造するための前述したような組成物の使用であり、前記抗原関連状態は腫瘍または感染である。

好ましい実施形態では、前述したような組成物は、癌を治療するための、ワクチンを含む医薬組成物または医薬品を製造するために使用される。一実施形態では、本発明は抗原関連状態の治療を必要とする個体における抗原関連状態を治療するための前記組成物の使用に関する。前記医薬組成物または医薬品は、前記個体において前記抗原に対する免疫応答を誘発し、それによって前記個体における前記抗原関連状態を治療するための治療有効量で前記個体に投与される。

他の実施形態では、本発明は抗原関連状態の治療を必要とする個体における抗原関連状態を治療するための前記組成物の使用に関し、前記組成物は、サリドマイドまたはその類似体、好ましくはレナリドマイドと組み合わせて投与される。

実際に、レナリドマイドおよびその類似体は糖脂質抗原のCD1d媒介性提示を増強し、したがって、NKT細胞の抗原特異的活性化を増強することが示された。

他の実施形態では、本発明は、前述のキットの使用に関し、NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドは、抗原に結合した志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合することができるその機能的同等物の前、同時または後に投与される。

本発明では、前記組成物の使用は抗原のGb3受容体発現細胞への送達を可能にする。

本発明では、本発明の組成物の使用によって誘導される免疫応答の誘発には、樹状細胞の刺激が含まれる。

本発明では、本発明の組成物の使用によって誘導される免疫応答の誘発には、抗原特異的CD8+応答の惹起が含まれる。

(実施例)
以下の説明において、詳細な手順を述べていない分子生物学的実験は全て、標準的手順に従って実施する。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するためのものである。以下の実施例で開示した技術は、本発明の実施で十分な機能を果たすように本発明者によって発見された技術を表し、したがって、本発明の実施のために好ましい形態をとると考えられることは当業者によって理解されよう。しかし、本発明の開示に関して、開示した特定の実施形態において多くの変更を行うことが可能で、それでもなお本発明の精神および範囲を逸脱することなく類似の、または同様の結果を得ることができることは当業者には理解されよう。

I.材料および方法
マウス
雌のC57/BL/6(H-2^b)マウスは、Charles River Laboratories(L'Arbresle, France)から購入した。H-2K^bに関して卵白アルブミン(OVA)ペプチド(SIINFEKL)に特異的なOT-I TCRトランスジェニック(TG)マウスは、C Leclerc博士(Institut Pasteur)によって供与された。OVA-TGマウスは、P.Shrikant博士(Roswell Park Cancer Institute、Buffalo、NY)からM.K Jenkins博士(University of Minnesota)の承諾を得て入手した。これらのマウスは、C57BL/6背景を表し、ほとんどのアクチン発現細胞においてトリ卵白アルブミン(OVA)の膜関連型を低レベルで発現する。特定の病原体を含まない状態下でマウスを維持し、研究所の指針に従って6周齢と8週齢の間で使用した。

化学試薬(組換えタンパク質、ペプチド、アジュバント)
精製したトリ卵白アルブミン(OVA)(第V等級)は、Sigma(St Quentin Fallavier、France)から購入した。合成OVA由来ペプチドOVA_257〜264(SIINFEKL)およびHPV16-E7由来ペプチドE7_49〜57(RAHYNIVTF)またはE7_43〜57(GQAEPDRAHYNIVTF)は、NeoMPS(Strasbourg、France)から入手し、PBS中で保存した。

STxB-OVAは、既に記載されたように化学結合によって得た(Haicheur,N.他、2003年、Int Immunol 15:1〜11)。簡単に説明すると、まずヘテロ二機能性架橋剤MBS(Pierce、Rockford、IL)を使用して、リシン側鎖のアミノ基を介してOVAを活性化した。次に、活性化したOVAをSTxB-Cysと反応させ、反応生成物をゲル濾過および免疫親和性クロマトグラフィーによって精製した。STxB-ET_43-57は、既に記載されたように(Mallard, F他、2003年、Methods MoI Med 73:209〜220)、N-ブロモアセチル化E_43〜57ペプチドとSTxB-Cys組換えタンパク質のスルフヒドリル基との間の化学結合を使用して生成した。混入したLPSの除去は、Acticlean Etoxカラム(Biotech-IgG、Kobenhavn、Denmark)を使用して実施した。精製後、リムルス測定試験(Biowhittaker、Walkersville、MD)によって測定した内毒素濃度は、<0.5EU/mgであった。

iNKT細胞リガンドα-GalCer(KRN7000)は、Kirin Brewery Co(Japan)によって恵与された。ポリ(I:C)および不完全フロイントアジュバント(IFA)はSigma(St Quentin-Fallavier、France)から購入した。CpG ODN1826は、Proligo(Paris、France)から購入した。

IFNαは、Ion Gresser(Inserm、France)によって恵与された。

細胞
マウス胸腺腫細胞系EL4(H-2^b)は、K.Rock(University of Massachusetts Medical School、Worcester、MA)およびP Jeannin(Angers University Hospital、France)によって恵与された。

ELISPOTアッセイ
StxB-OVAを注射した後誘導された抗-OVA_257〜264/K^bCD8⁺T細胞の機能性は、ELISPOTによって製造者(Diaclone、Besancon、France)の推奨に従って測定した。簡単に説明すると、CD8⁺T細胞10⁵個を抗マウスIFNγmAbで予めコーティングしたプレートに移し、既にOVA_257〜264ペプチドでパルスした(またはパルスしていない)EL4細胞10⁵個と37℃で18時間培養し、1%パラホルムアルデヒドで固定した。洗浄後、プレートをさらにビオチン化抗マウスIFNγmAbとインキュベートした。最後に、このプレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンと37℃で30分間インキュベートした。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスファターゼ/ニトロブルーテトラゾリウムを添加することによってスポットが生じた。陽性対照には、ホルボールミリステートアセテート(100ng/ml、Sigma)およびイオノマイシン(500ng/ml、Sigma)で刺激した細胞を含めた。対照は、OVA_257〜264ペプチド非存在下で培養した細胞から構成された。IFNγスポット形成細胞(SFC)は、KS-ELISPOT系(Carl Zeiss、Munich、Germany)で計数した。

細胞傷害性試験
細胞傷害性は、既に記載されたように(Haicheur,N.他、2000年、J Immunol 165:3301〜3308)⁵¹Cr標識標的細胞で評価した。

フローサイトメトリー
抗OVA_257〜264/K^bまたは抗-E7_49〜57/D^b特異的CD8⁺T細胞を検出するために、細胞を製造者の推奨に従って(Beckman-Coulter Immunomics、Marseilles、France)OVA_257〜264/K^bまたはE7_49〜57/D^bテトラマーで染色した。簡単に説明すると、細胞をPE標識テトラマーとインキュベートした(暗所において4℃で45分間)。インキュベーションして洗浄した後、標識した抗CD8mAb(ebioscience、San Diego、CA)を使用して、陽性テトラマーCD8⁺T細胞の表現型を決定した。K^bまたはD^b分子と関連したVSV由来ペプチドを認識する関係のないテトラマーを各実験で使用した。未処理の非免疫マウスもこれらの実験の対照として含めた。

特異的抗OVACD4⁺T細胞を検出するための増殖アッセイ
CD4⁺T細胞は、脾臓から精製し、CFSE(Molecular Probes、Eugene、OR)を0.5μMで20℃で30分間使用して標識した。標識は、5%FCSを補給した氷冷PBSで繰り返し洗浄することによって停止した。次に、細胞をT細胞除去脾細胞とインキュベートし、APCは遊離卵白アルブミンタンパク質でパルスするか、またはパルスせず、AIM V血清を含まない培地で5日間一緒に培養した。APC感作を行わなかった増殖を、卵白アルブミンパルス後に得られた値から背景として差し引いた。

生体外における交差提示アッセイ
OT-1マウスから得られた抗OVA特異的CD8⁺T細胞をCFSEで標識した。様々なワクチン製剤をワクチン接種したマウスから記載したように(37)単離したCD11c⁺の豊富な樹状細胞(10⁶個)をOT-1細胞(5.10⁵個)と72時間一緒に培養した。FACS分析によって検出されたCFSEの希釈度は、抗原認識後のOT-1細胞増殖の指標と考えられる。

血清学的分析
既に記載されたように実施した。(Haicheur,N.、F.他2003.Int Immunol 15:1〜11)。

抗ウイルス保護実験
C57BL/6マウス(群当たり5匹)の腹腔内に様々なワクチン製剤(200μl)を2回(d0およびd21)注射し、対照マウスにはPBSを注射した。最後の注射から8日後に、マウスは卵白アルブミンまたはN Etchart博士(INSERM、Lyon)およびLone Yu Chun博士(Institut Pasteur)それぞれから恵与されたB型肝炎ウイルスから得られたHBxcDNAのいずれかを発現している組換えワクシニアウイルス(rVV、ウェスタンリザーブ種)2.5×10⁶PFUで腹腔内曝露した。4日後、マウスの卵巣を摘出し、機械的組織粉砕器でホモゲナイズした。ホモジェネートを4000gで10分間遠心して清澄化し、得られた上清のrVV PFUの数は、これらの液体の10倍希釈系列をBHK21細胞単層に感染させることによって数え、プラークは、既に記載されたように(52)、37℃で5%CO₂中で2日間培養した後計数した。

結果
α-GalCerは、抗原に結合したSTxBが特異的CTLを誘導する効果を増大させた。
最初の一連の実験では、STxB-OVAが特異的CTL応答を誘発する効果を増大させる十分に確立された様々なアジュバントの能力を試験した。

既に報告したように、マウスはSTxB-OVA結合体(50μg)単独で2回免疫すると、CD8⁺T細胞0.4%に対応する抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞の誘導を示した(図1および2A)。IFA以外のSTxB-OVAと一緒にしたその他のアジュバントは全て(IFNα、ポリ(I:C)、CpGおよびα-GalCer)、抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞の発生率を著しく高めた。しかし、IFNα、ポリ(I:C)およびCpGでは、特異的テトラマーによって検出した抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞の誘導は中程度で総CD8⁺T細胞の1%を上回らなかった一方、糖脂質α-GalCerは特異的抗OVA CTLの割合の劇的な増加を引き起こした(図1)。実際に、STxB-OVAおよびα-GalCerで2回免疫した後、CD8⁺T細胞の4.6%がin vitroにおける再刺激段階を経ずに生体外において直接OVA_257〜264/K^bテトラマーによって陽性に染色した(図1)。したがって、STxBとα-GalCerとの間のこの相乗作用の分析に焦点を当てた。α-GalCerの繰り返し投与はアネルギーおよびTH2極性化を引き起こす可能性があることが以前の研究で報告され(53〜55)、α-GalCerを第1および第2の免疫の両方に注射したときと初回時のみのときとでは差は認められなかったので、初回の免疫中だけこのアジュバントおよびSTxB-OVAを一緒にした。

STxB-OVA結合体の様々な用量をα-GalCerと混合したとき、このアジュバントは非常に低用量の抗原であっても(STxB-OVA50ngは同等の卵白アルブミン抗原25ngに対応する)抗OVA_257〜264CTL応答を著しく誘導することが発見された(図2A)。対照的に、α-GalCerと一緒にした遊離卵白アルブミンは高用量(200μg)であっても惹起した抗OVA_257〜264CTLの発生率は低く、卵白アルブミンをSTxBに結合させ、α-GalCerと一緒にしたときの抗OVA_257〜264特異的CTLが総CD8⁺T細胞の5〜7%であったのと比較して、1%を上回らなかった(図2B)。さらに、OVA50μg未満をα-GalCerに添加したとき、またはOVAのみを免疫に使用したとき、抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞の有意な誘導は見られなかった(図2B)。その他のアジュバント(IFNα、ポリ(I:C)、CpG)では、低用量のSTxB-OVA結合体を使用してもこのようなCTLの刺激は不可能であったので、STxBとα-GalCerとの間の相乗作用の有意性が強められた(データは示さず)。

α-GalCerおよびSTxB-OVAを組み合わせた結合体によって誘導された特異的抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞は、初回免疫から202日後、生体外において直接OVA_257〜264/K^bテトラマーでCD8⁺T細胞の2.49%が陽性染色したので、長期間持続した(図2C)。テトラマー分析は、アネルギー性CD8⁺T細胞と機能性CD8⁺T細胞の間を区別しないので、in vitro誘発していない⁵¹Cr標識標的細胞に対して2種類の機能試験、Elispotアッセイおよび細胞傷害性アッセイを実施した。図2Dに示したように、α-GalCerと混合したSTxB-OVA(1μg)でワクチン接種した後、OVA_257〜264ペプチドでパルスしたEL4細胞と一緒にインキュベートすると多数のCD8⁺T細胞がIFNγを産生した(平均61/10⁵細胞)(図2D左)。同様に、図1D(右)に示したように、α-GalCerで混合したSTxB-OVAで免疫したマウスの脾細胞は、OVA_257〜264ペプチドを負荷したEL4標的細胞を効率的に溶解したが、EL4のみに対する細胞傷害性は認められなかった。マウスにSTxB-OVA単独で2回ワクチン接種したとき、高用量(50μg)を使用しても生体外において細胞傷害性は示されなかった(データは示さず)。

これらの結果が他のより臨床的に関連のある抗原で再現できるかどうかを調べるために、マウスを低用量(1μg)のHPV16-E7タンパク質由来のポリペプチドに結合させたSTxB(STxB-EL_43〜57)で2回免疫した。E7_49〜57Dbテトラマーによってまた、生体外において検出可能な抗E7 CTLの著しい誘導が示された(CD8⁺T細胞の1.12%)(図3)。これらのCTLは、機能を果たした(データは示さず)。対照的に、この用量では、STxB-E7_43〜57単独で免疫した後、検出されたE7特異的CTLはほんの低レベルであった(CD8⁺T細胞の0.12%)。α-GalCerと混合したE7_43〜57ポリペプチドはCTL応答を刺激しなかった(図3)。

次に、α-GalCerとSTxBとの間に認められる相乗性がCTLの誘導に限定されるのか、その他の免疫応答にも適用することができるのかを調べた。α-GalCerと混合したSTxB-OVA結合体でワクチン接種したマウスは、STxB-OVA単独またはIFAと混合した遊離卵白アルブミンで免疫したマウスと比較してより強力な抗OVA CD4⁺T細胞応答を示した(図4)。しかし、α-GalCerはアジュバントと一緒にした遊離卵白アルブミンと比較して抗OVA IgG2a応答を増強したが、この体液性応答は総IgGおよび様々なアイソタイプのいずれも、StxB単独と比較してStxBをα-GalCerと混合したときに増強されることはなかった。

StxBとα-GalCerとの間の相乗作用を導く可能性がある機構の分析
以前の研究では、α-GalCerのアジュバント特性は、DCの成熟を促進する能力と関連していた。マウスにα-GalCerを投与した後、共刺激分子(CD86など)およびMHCクラスIIの迅速な増加が認められた(データは示さず)。しかし、この研究で使用したその他のアジュバント(CpG、ポリ(I:C)など)も樹状細胞を活性化するが、StxB免疫原性に対するそれらの増強効果は中程度に維持されることも確認された(図1およびデータは示さず)。

CD1dのレベルは、NKT細胞活性化に影響を及ぼし得るので、StxBがCD1dの発現を調節することができるかどうかを試験した。マウスにStxBを投与した後、脾細胞由来のAPC(樹状細胞およびB細胞)上でのCD1d発現には有意な変化は検出されなかった。同様に、α-GalCerは、樹状細胞およびB細胞上のGb₃の膜発現を調節しなかった(データは示さず)。

STxBとα-GalCerとの間の相乗作用の1つの顕著な結果は、StxBワクチンの有効用量を著しく低下させる能力なので、ワクチン接種後の抗原のin vivoにおける提示を分析した。α-GalCerと一緒にした低用量のSTxB-OVA(1μg)で免疫したマウスから得られた樹状細胞は、STxB単独でワクチン接種したマウスよりも7日早く、in vivoにおいてOVA_257〜264/K^b複合体をより著しく提示した(図5)。この提示は、脾臓または流入領域リンパ節から得られた樹状細胞の両方で認められ、少なくとも12日間持続した(データは示さず)。この増加した提示はまた、STxBを他のアジュバントと混合したときに検出することができたが、抗原提示のレベルはα-GalCerで認められたものよりも低いようであった(図5およびデータは示さず)。Gb₃受容体およびCD1dはまたB細胞によって発現されるが、α-GalCerをStxB-OVAに添加しても、以前に報告されたように免疫後発現が依然として樹状細胞に限定されているOVA_257〜264/K^b複合体をこれらの細胞が発現することは不可能であった(データは示さず)。

α-GalCerと混合したSTxB結合体は自己抗原に対する寛容を破壊した。
ほとんどの腫瘍抗原は自己抗原であり、慢性感染中はウイルスタンパク質に対する寛容が既に確立されるので、卵白アルブミンおよびウイルスタンパク質などの外因性抗原は、治療用ワクチンを開発する臨床症状に似ていないことはしばしば指摘されている。したがって、これらの指摘のため、見込みのあるワクチンは自己抗原に対する寛容を破壊する能力があることが期待される。この目的のため、全細胞の表面上に卵白アルブミンを発現する新規トランスジェニックマウスモデルを選択した。これらのマウスにSTxB-OVAを単独でワクチン接種すると、初回または二次免疫の後の様々な時点において、血液または脾臓のいずれにおいても抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞の誘導は認められなかった(図6およびデータは示さず)。対照的に、特異的テトラマーアッセイでは、α-GalCerと一緒にしたSTxB-OVAで免疫したマウス11匹のうち8匹において、抗OVA_257〜264CD8⁺T細胞の顕著なレベルが検出された(図6)。それらの何匹か(ワクチン接種したマウス7匹のうち4匹)は、Elispotアッセイを使用するとIFNγを生成していたので、機能を果たしていた。これらの特異的CD8⁺T細胞は、免疫前に存在していなかったので、ワクチンによって誘導されたものと考えられた(データは示さず)。これらの抗OVA特異的CD8⁺T細胞は、初回免疫後本質的に見出され、血液および脾臓から迅速に消失した。この種類のマウスは全器官において膜卵白アルブミンを発現することを強調するべきであろう。

α-GalCerと混合したSTxB結合体は、抗ウイルス防御免疫を誘導する。
STxBとα-GalCerとの間に認められる相乗作用の臨床的関係を調べるために、卵白アルブミンをコードする組換えワクシニアウイルス(VV-OVA)でマウスを曝露し、ワクチン接種して7日後に、防御を評価して5日後に卵巣でウイルス力価を測定した。マウスをSTxB-OVAおよびα-GalCerでワクチン接種するとVV-OVAに対する強力な防御がもたらされ、卵巣におけるウイルスの力価はPBSで処理したマウス(8.28.10⁸PFU)と比較して5log減少した(3.92.10³PFU)(図7)。STxB-OVA単独で免疫すると卵巣におけるウイルス力価の>2logの統計学的に有意な減少がもたらされるが、この効果はα-GalCerを添加することによって劇的に増幅された。

この抗ウイルス防御におけるα-GalCerの直接的な役割を排除するために、卵白アルブミンおよびα-GalCerで免疫したマウスの感染ウイルス力価は7.73.10⁸PFUで、PBS処理したマウスにおける8.28.10⁸PFUよりわずかに減少しており、ウイルス力価の減少は1logに相当することを示した(図7)。防御の特異性は、STxB-OVA/α-GalCerで免疫したマウスをB型肝炎xタンパク質をコードする無関係なワクシニアウイルスに曝露することによって立証した。添加したウイルスの有意な減少は認められなかった(データは示さず)。

NKT細胞を欠如したマウスではα-GalCerのアジュバント効果はない。
Jal8^-/-マウスをStxB-OVA(1μg)またはStxB-OVA+α+GalCer(2μg)で免疫した。免疫して7日後に、免疫マウスおよび非免疫マウスの脾臓を摘出し、抗CD8抗体およびOVA_257〜264/K^bテトラマーで染色した。結果から(図8)、α-GalCerを一緒にしても、または一緒にしないでも、免疫したJal8^-/-マウスでは抗OVA_257〜264特異的CTLはほとんど認められないことが示された。これは、α-GalCerで免疫したC57BL/6マウスで認められた抗OVA_257〜264特異的CTLの6.43%と同程度である(図2A)。したがって、α-GalCerのアジュバント効果は、NKT細胞を欠損したマウスでは認めることはできず、α-GalCerのアジュバント機構におけるNKT細胞の活性化の役割が立証された。

STxB-Ovaと一緒にしたαGalCerでワクチン接種すると定着した腫瘍に対する防御が誘導される。
C57BL6マウスにEG7腫瘍、オボアルブミンをコードするcDNAで形質移入した胸腺腫を移植し、3日後、PBS、STx-B-Ova5μg、α-GalCer2μgまたは両方の組合せで処理した(図9)。

EG7の皮下移植の3日後にSTxB-OvaおよびαGalCerの組合せでワクチン接種したマウスは、腫瘍の著しい退縮を示した。対照的に、STxB-Ova単独またはαGalCer単独で免疫したマウスは、腫瘍増殖を制御しなかった。

STxB-Ovaと一緒にしたC-αGalCerでワクチン接種すると定着した腫瘍に対する防御が誘導される。
C57BL6マウスにEG7腫瘍、オボアルブミンをコードするcDNAで形質移入した胸腺腫を移植し、3日後、PBS、STx-B-Ova5μg、C-αGalCer2μgまたはSTx-B-Ova/C-αGalCerの組合せで処理する。

EG7の皮下移植の3日後にSTxB-Ova/C-αGalCerの組合せでワクチン接種したマウスは、腫瘍の著しい退縮を示す。対照的に、STxB-Ovaで免疫したマウスまたはC-αGalCer単独で免疫したマウスは、腫瘍増殖を制御しない。

Claims (30)

1. a)抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物および
   b)NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンド
   を含む組成物。
2. 志賀毒素の前記Bサブユニットの前記免疫学的機能的同等物が志賀毒素の前記Bサブユニットに対して少なくとも50%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の組成物。
3. CD1の前記リガンドがCD1dのリガンドである、請求項1または2に記載の組成物。
4. 前記リガンドが、糖脂質またはリン脂質、スフィンゴ糖脂質、それらの誘導体または類似体である、請求項1から3に記載の組成物。
5. 前記リガンドが、GD3、PEおよびPIから選択される、請求項4に記載の組成物。
6. 前記リガンドがグリコシルセラミドまたはそれらの類似体もしくは誘導体である、請求項4に記載の組成物。
7. 前記グリコシルセラミドが、α-GalCer、α-GlcCer、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、Galβ1-3Galα1-1'Cerまたはそれらの誘導体からなる群から選択され、好ましくはそれらのC-グリコシド誘導体であり、より好ましくはα-GalCerのC-グリコシド誘導体である、請求項6に記載の組成物。
8. αGalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサ-コサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項7に記載の組成物。
9. αGalCerが(2S,3S,4S)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシルオキシ)-2-ヘキサコサノイルアミノ-3,4-オクタデカンジオール(KRN7000)である、請求項7に記載の組成物。
10. 前記リガンドが、3-O-スルホ-α-GalCer、β-GalCer、OCH化合物、α-C-GalCerからなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。
11. 前記グリコシルセラミドがα-C-GalCerである、請求項6に記載の組成物。
12. 前記グリコシルセラミドがPBS-57である、請求項6に記載の組成物。
13. 前記リガンドが微生物由来糖脂質である、請求項4に記載の組成物。
14. 前記リガンドが、
    GSL-1およびGSL'1からなる群で選択されたスフィンゴモナス属由来のスフィンゴ糖脂質、または
    BbGL-IおよびBbGL-IIからなる群から選択されたボレリア属由来の糖脂質、または
    マイコバクテリア属由来のリン酸糖脂質PIMである、請求項13に記載の組成物。
15. 前記志賀毒素のBサブユニットまたは前記その機能的同等物が、式STxB-Z(n)-Cysを有する汎用ポリペプチド担体中に存在し、式中、
    STxBが前記志賀毒素Bサブユニットまたはその機能的同等物であり、
    Zがスルフヒドリル基を有さないアミノ酸であり、nが0、1またはポリペプチドであり、
    Cysがアミノ酸システインである、請求項1から14に記載の組成物。
16. nが0である、請求項15に記載の組成物。
17. 前記抗原が-S-Sまたは-S-COまたはS-CH₂または-S-NH結合によって前記汎用担体の-S残基に共有結合している、請求項15または16に記載の組成物。
18. 前記汎用担体が-S-Sまたは-S-COまたはS-CH₂または-S-NH結合によってオリゴペプチドまたはポリペプチドに共有結合し、標的とする前記抗原が前記オリゴペプチドまたはポリペプチドに作動可能に結合している、請求項15から17のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記汎用担体がポリ-リシンオリゴペプチドに共有結合し、標的とする前記抗原が前記ポリリシン部分に作動可能に結合している、請求項18に記載の組成物。
20. 前記抗原が腫瘍抗原、ウイルスまたは細菌抗原である、請求項1から19のいずれか一項に記載の組成物。
21. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物。
22. 請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬品。
23. 請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物を含むワクチン。
24. a)抗原と複合化した、志賀毒素のBサブユニットまたはGb3受容体に結合できるその機能的同等物を含む第1の容器、および
    b)NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを含む少なくとも1個の第2の容器を含む医薬キット。
25. 個体における抗原関連状態を治療するための、ワクチンを含む医薬組成物または医薬品を製造するための請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記抗原関連状態が腫瘍または感染である使用。
26. 抗原関連状態の治療を必要とする個体における抗原関連状態を治療するための請求項25に記載の使用であって、前記組成物を、前記個体において前記抗原に対する免疫応答を誘発し、それによって前記個体における前記抗原関連状態を治療するための治療有効量で前記個体に投与する使用。
27. 抗原関連状態の治療を必要とする個体における抗原関連状態を治療するための請求項25に記載の使用であって、前記組成物が、サリドマイドまたはその類似体、好ましくはレナリドマイドと組み合わせて投与される使用。
28. NKT細胞を刺激できるCD1の少なくとも1種のリガンドを、抗原と複合化した志賀毒素の前記BサブユニットまたはGb3受容体に結合することができるその機能的同等物の前、同時または後に投与する、請求項25に記載のキットの使用。
29. 前記免疫応答の誘発が樹状細胞の刺激を含む、請求項26に記載の使用。
30. 前記免疫応答の誘発が抗原特異的CD8応答の惹起を含む、請求項26に記載の使用。