JP2010501200A - ｍｉｃｒｏＲＮＡの内在性ｍＲＮＡ標的のインビボでの同定のための方法 - Google Patents

Abstract

インビボの細胞において非コード調節ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ）の遺伝子発現プロフィールを生成する方法は、（ａ）細胞から少なくとも１つのｍＲＮＡ−タンパク質（ＲＮＰ）複合体を分離することであって、前記ＲＮＰ複合体は、（ｉ）ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡＢＰ）またはＲＮＡ会合タンパク質、（ｉｉ）前記タンパク質と結合または会合した少なくとも１つのｍＲＮＡ、および（ｉｉｉ）前記タンパク質と結合または会合した少なくとも１つのｎｃＲＮＡを含み、そしてその後（ｂ）少なくとも１つのＲＮＰ複合体中の少なくとも１つのｎｃＲＮＡを同定し、それによりＲＮＰ複合体中のｎｃＲＮＡの固有情報を含む遺伝子発現プロフィールを作製することにより実行される。

Description

［政府の資金援助］
本発明は、米国国立癌研究所の助成金番号ＣＡ７９９０７の下、政府の援助によりなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。

［関連出願］
本出願は、２００６年８月２５日出願の米国特許仮出願第６０／８２３，５８１号の恩典を主張し、その開示内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

［発明の分野］
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび対応するそのｍＲＮＡ標的を同定する方法に関する。

ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡＢＰ）と共に、真核生物の転写後遺伝子発現の主な制御因子を構成し、広範な細胞プロセスにおいて機能する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性または翻訳に影響を及ぼすことにより遺伝子発現を抑制する小さな非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の大きなファミリーである（１〜３）。全体的なｍＲＮＡのｍｉＲＮＡターゲッティングの現在の理解は、複数の種にわたる進化的相同性を検討することにより絞り込まれる相補的配列要素を計算によって予測することに基づく（４）。これらのアルゴリズムは１つのｍｉＲＮＡにつき数百の可能性のあるｍＲＮＡ標的を予測するが、各ｍｉＲＮＡが一連の条件下で細胞中のこれらの標的ｍＲＮＡに機能的に接近することは確かでない。実際に、最近の証拠から、ＲＮＡＢＰが、条件に依存する形でｍｉＲＮＡにより標的化されるｍＲＮＡの制御の方向付け（ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｔｅ）に影響を及ぼし得ることが示唆される（５、６）。

ＲＮＡＢＰは、真核生物ゲノムにコードされている最大のタンパク質ファミリーの中で、複数の転写後レベルで遺伝子発現を調節することができる（７、８）。ｍｉＲＮＡのように、ＲＮＡＢＰも、標的ｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）内にしばしば含有されている結合特異的ＲＮＡ配列モチーフによって機能する。細胞質画分に生じる場合、これらの相互作用はｍＲＮＡ局在性、安定性および／または翻訳活性化を決定し得る（９）。転写後の基礎構造は高度に組織化され、複数のシス−トランス相互作用を利用してより高次の遺伝子発現を組合せ的に調節することがますます明らかになってきている（７、１０）。インビボの組成物およびこの転写後の基礎構造の組織化の全体的な探求は最近始まったばかりである。多数の研究が、類似の代謝過程を有するか、または機能的に関連のあるタンパク質をコードする、ｍＲＮＡサブセットに会合したＲＮＡＢＰを同定した（７）。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の予測された機能的相互作用のいくつかはレポーター系を用いて確認されているが、一方で、主に多数の生物情報学的アプローチにより、全ての細胞ｍＲＮＡの大部分について、ｍｉＲＮＡによる全体的なターゲッティングが予測された（２、４；１１）。ｍｉＲＮＡは、組合せ的にそれらのｍＲＮＡ標的に作用すると予測されるが、一方、メッセンジャーリボヌクレオタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体内の内在性ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびＲＮＡＢＰの組成および組織化は不明なところが多い。

本発明の第１の態様は、インビボの細胞において非コード調節ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の遺伝子発現プロフィールを生成する方法であり、次のステップを含む。
（ａ）細胞から少なくとも１つのｍＲＮＡ−タンパク質（ＲＮＰまたはｍＲＮＰ）複合体を分離するステップと、ここで、前記ＲＮＰ複合体は、（ｉ）ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡＢＰ）またはＲＮＡ会合タンパク質と、（ｉｉ）前記タンパク質と結合または会合した少なくとも１つのｍＲＮＡと、（ｉｉｉ）前記タンパク質と結合または会合した少なくとも１つのｎｃＲＮＡとを含み、
（ｂ）少なくとも１つのｍＲＮＰ複合体中の少なくとも１つのｎｃＲＮＡを同定するステップであって、それによりＲＮＰ複合体中のｎｃＲＮＡの固有情報を含む遺伝子発現プロフィールを作製するステップ。

一部の実施形態では、該ｎｃＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡである。

一部の実施形態では、本発明は、１以上のｍｉｃｒｏＲＮＡのｍＲＮＡ標的を同定および／または確認する方法を提供する。そのような方法は、
（ａ）生体試料から少なくとも１つのＲＮＰ複合体を分離する（前記複合体は、ＲＮＰ複合体に会合したｍＲＮＡのサブセットを含む）ステップと、
（ｂ）ＲＮＰ複合体に会合したｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットを同定するステップと
を含み、それによりｍｉｃｒｏＲＮＡとｍＲＮＡ標的との間の会合を決定する。一部の実施形態では、分離するステップは、ＲＮＰ複合体を固相支持体上に捕獲するステップを含む。その他の実施形態では、該方法は、１以上の同定されたｍＲＮＡに関して、少なくとも１つの同定されたｍｉＲＮＡの活性をアッセイするステップをさらに含んでよい。さらなる実施形態では、該方法は、コンピュータによる（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの）方法を用いて（例えば、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＳアルゴリズムを用いて）ｍｉｃｒｏＲＮＡのｍＲＮＡ標的を予測し、コンピュータによる結果を上記のように実験的に確認するステップを含んでよい。

細胞ｍＲＮＡのサブセットは、生体試料中の全てのｍＲＮＡよりも少ないｍＲＮＡを含む、複数のｍＲＮＡである。一部の実施形態では、そのようなサブセットは、全てのｍＲＮＡの７５％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満またはそれ以下で表される。ｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットは、生体試料中の全てのｍｉｃｒｏＲＮＡよりも少ないｍｉｃｒｏＲＮＡを含む、複数のｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、そのようなサブセットは、全てのｍｉｃｒｏＲＮＡの７５％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満またはそれ以下で表される。ｍＲＮＡのサブセットは、少なくとも２つのｍＲＮＡであるが、３、４、５、１０、１５、２０以上のｍＲＮＡを含んでよい。同様に、ｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットは、少なくとも２つのｍｉｃｒｏＲＮＡであるが、３、４、５、１０、１５、２０以上のｍｉｃｒｏＲＮＡを含んでよい。ｍＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットは、例えば、核酸アレイ、例えば、マイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡアレイ）を用いることにより、本発明の方法において同定されてよい。

一部の実施形態では、分離するステップは、ｍＲＮＰ複合体を（ｉ）ｍＲＮＰ複合体の少なくとも１つの成分に特異的に結合する抗体、または（ｉｉ）異所的に発現させたエピトープタグ付きＲＮＡ結合タンパク質もしくはＲＮＡ会合タンパク質に接触させるステップを含み得る。一部の実施形態では、抗体がＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ会合タンパク質に結合するためのｍＲＮＰ複合体の成分は、ｍＲＮＰ複合体に存在する。一部の実施形態では、そのようなＲＮＡ結合タンパク質は、天然のＨｕタンパク質またはタグ付きＨｕタンパク質（例えば、ＨｕＲ）またはポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）である。一部の実施形態では、同定されたｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットには、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７ｍ ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１６、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、およびｌｅｔ−７ｆからなる群から選択されるｍｉＲＮＡが含まれる。

一部の実施形態では、分離するステップは、細胞由来の前記ＲＮＰ複合体を含む生体試料を、ＲＮＰ複合体の少なくとも１種類の成分に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドに接触させるステップと、リガンドと該リガンドに特異的な抗体とを結合させることによりＲＮＰ複合体を分離するステップと、ここで該抗体は固相支持体に固定されており、ＲＮＰ複合体を固相支持体から取り外すことによりＲＮＰ複合体を回収するステップとを含み得る。

一部の実施形態では、前記ＲＮＰ複合体中のｍＲＮＡは予め決められており、一部の実施形態では、本方法は、（ｃ）ｍＲＮＰ複合体中のｍＲＮＡを同定するステップであって、それにより前記ｍｉＲＮＡに会合したｍＲＮＡの固有情報をさらに含む遺伝子発現プロフィールを作製するステップをさらに含む。

任意の適した１以上の細胞を用いて本発明を行ってよく、それには、限定されるものではないが、植物細胞、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、および原生動物細胞が含まれる。

一部の実施形態では、分離するステップは、複数のＲＮＰ複合体を分離するステップを含み、同定するステップは、複数のＲＮＰ複合体に会合した複数のｎｃＲＮＡを同定するステップを含む。該方法は、（ｃ）前記複数のＲＮＰ複合体に会合した複数のｍＲＮＡを同定するステップであって、それにより、ｍＲＮＡのサブセットに会合したｎｃＲＮＡのサブセットの固有情報をさらに含む遺伝子発現プロフィールを作製するステップをさらに含む。

本発明は、本明細書中の図面および下記に示される本明細書において、より詳細に説明される。

ＨｕＲに会合したｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが、全細胞ＲＮＡの別個のサブセットであることを示す。ベン図は、全細胞ＲＮＡ、ＰＡＢＰ−ｍＲＮＰおよびＨｕＲ−ｍＲＮＰ中に存在する別個の（Ａ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および（Ｂ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を表す。全てのＲＮＡ集団を、対数期のジャーカット細胞由来の単一の試料として単離し、その後特定のマイクロアレイプラットフォームでのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの解析のために分離した。３つの生物学的複製および三重のアレイ解析からデータを集めた。 ＲＮＡ結合タンパク質およびｍｉＲＮＡを介した、組合せ的転写後制御を示す。核（Ｎ）および細胞質に局在する遺伝子発現ネットワークの図である。核のネットワークにはＤＮＡ結合転写因子が関与し、一方、細胞質のネットワークにはＲＮＡＢＰおよびｍｉＲＮＡが関与する。核において、複数のプロモータ要素が転写因子により制御され得る。転写後制御は、主に、ＲＮＡ結合因子とｍＲＮＡの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との相互作用によって起こる。図示されるように、所与のＲＮＡＢＰにより調節されるｍＲＮＡサブセットは、組合せ的にｍｉＲＮＡにより調節される別個のｍＲＮＡ下位集団にさらに細分することができる。ここに図示される調整された結果は、コードされたタンパク質間の機能的関連または会合したｍＲＮＡの運命（安定性／翻訳状態）に反映される。

本発明は、下記の限定されない明細書および実施例においてより詳細に説明される。本明細書において引用される全ての米国特許参照文献の開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

本発明の好ましい実施形態が示される、添付される図面および明細書を参照して、これから本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は異なる形態で実現されてよく、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が詳細かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。

本明細書における本発明の説明に用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明を制限することを意図するものではない。本発明の説明および添付される特許請求の範囲において用いられるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のものを指している場合を除いて複数形も同様に含むことが意図される。別に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照文献は、参照によりその全文が援用される。

本明細書において用いられる「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、当分野においてその通常の意味を有し、一般に、翻訳によってそのｍＲＮＡからコード化された情報をタンパク質合成部位に運ぶ、ＤＮＡから転写されたＲＮＡを指す。本明細書において用いられるｍＲＮＡは、プロセシングされていなくても（プレｍＲＮＡ）またはプロセシングされていてもよく、従ってこの用語は両方を含む。本明細書において用いられるｍＲＮＡは任意の適した供給源、一般に脊椎動物、好ましくは、哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ウサギなど）に由来してよい。

本明細書において用いられる「非コード調節ＲＮＡ」または「ｎｃＲＮＡ」は、当分野での通常の意味を有する。例としては、限定されるものではないが、ｐｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子非メッセンジャーＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｍＲＮＡ）（ｓｎｍＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、一過性低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）およびｍＲＮＡと相互作用してその機能を調節するその他のＲＮＡが含まれる。例えば、ＰＣＴ出願公開第２００５／１０２２９８号参照。

本明細書において用いられる「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、当分野での通常の意味を有する。一般に、ｍｉＲＮＡは、局所性ＲＮＡ前駆体ｍｉＲＮＡ構造を形成することのできる転写物からプロセシングされたゲノム遺伝子座に由来するＲＮＡ分子である。成熟したｍｉＲＮＡは、通常、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドを有するが、一部の例では、その他の数のヌクレオチド、例えば、１８〜２６ヌクレオチドが存在し得る。ｍｉＲＮＡは多くの場合ノーザンブロットで検出可能である。ｍｉＲＮＡは、ゲノムのフランキング配列と対になることができ、より長い前駆体転写物からそのプロセシングのために必要とされ得る不完全なＲＮＡ二本鎖の中に成熟ｍｉＲＮＡを配置することができる。動物において、このプロセシングは、より長い一次転写産物のヘアピン部分由来のｍｉＲＮＡ二本鎖を切り出す、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼの作用によって起こり得る。ｍｉＲＮＡ二本鎖は、ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ^＊（ｍｉＲＮＡスター）として知られている、ステムループのもう一方のアーム由来の同様の大きさのセグメントを含む。ｍｉＲＮＡは、サイレンシング複合体に入る鎖であるのに対し、ｍｉＲＮＡ^＊はサイレンシング複合体を分解する。さらに、ｍｉＲＮＡは、一般に、予測されたタンパク質コード領域とは異なるゲノムのセグメントに由来する。例えば、米国特許出願公開第２００６０１８５０２７号参照。本明細書において用いられるｍｉＲＮＡは、任意の適した供給源、一般に脊椎動物、好ましくは、哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ウサギなど）に由来してよい。

本明細書において用いられる「ｍＲＮＡ結合タンパク質」または「ＲＮＡＢＰ」は、ＲＮＡ会合タンパク質とともに、当分野でそれらの通常の意味を有し、全体的なＲＮＡＢＰ（ユニーク配列を識別せずにほぼ全てのｍＲＮＡに結合するタンパク質）、グループ特異的ＲＮＡＢＰ（全体的なｍＲＮＡ集団のサブセットに会合するタンパク質）、および種特異的ＲＮＡＢＰ（極めて特異なｍＲＮＡ配列を認識するタンパク質、一部の場合では、高い特異性でただ１つのｍＲＮＡに存在する）が含まれる。例えば、Ｊ．Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８，７０１８，７０２１（２００１）参照。例としては、限定されるものではないが、ＥＬＡＶ／Ｈｕファミリー（例えばＨｕＲ／Ｈｕ１）、ｅｌＦ−４Ｅ、ポリ（Ａ）結合タンパク質、ＰＵＭＩＬＩＯファミリー（例えば、Ｐｕｍｌ）などが含まれる。さらなる例は、次のように、Ｋｅｅｎｅｅｔ ａｌ．、米国特許第６，６３５，４２２号の表１に示される。

本明細書において用いられるＲＮＡＢＰ−ｍｉＲＮＡ、およびｍＲＮＡは、任意の適した供給源に由来してよく、それには、細菌、原生動物、植物および動物が含まれる。植物は、単子葉植物および双子葉植物などの維管束植物であってよく、特定の例としては、限定されるものではないが、トウモロコシまたはメイズ、小麦、大豆、カノーラ、トマトなどが含まれる。動物は、一般に、脊椎動物、好ましくは哺乳類であり、特定の例としては、限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ウサギなどが含まれる。本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡＢＰ、ｍｉＲＮＡ、およびｍＲＮＡはすべて、起源の同じ種由来の同じ細胞または組織に由来する天然（非トランスジェニック）のものであってよい。

ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの「サブセット」は、当分野でその通常の意味を有し、その複数の形、一般にＲＮＰ複合体の形である。言い換えれば、サブセットは、特定のＲＮＰ複合体またはＲＮＰ複合体のサブセットの中における結合能力、または特定のＲＮＰ複合体またはＲＮＰ複合体のサブセットに対する結合能力により定義される。サブセットは、好ましくは、細胞の全集団の定量的もしくは定性的画分である。さらに、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡのサブセットの中のサブセットは、本発明を用いて同定することができる。例えば、米国特許第６，６３５，４２２号参照。

本明細書において用いられる「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、天然のＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）または人工のＲＮＡ（例えば、外から投与された二本鎖ＲＮＡ）が、例えば、その通常の翻訳を干渉する様式でのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、標的または対応するｍＲＮＡの翻訳を干渉する、遺伝子発現を弱くするための転写後プロセスを指す。

本発明は、Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，６３５，４２２号に一部記載される技法、または当業者に明らかなその変形形態を利用して、ｍｉＲＮＡなどのｎｃＲＮＡのさらなる選択および同定段階が必要であるという条件で行ってよい（ｍＲＮＡの選択および同定と本質的に同じ様式で、一般に、ｍｉＲＮＡなどのｎｃＲＮＡの選択および同定のために最適化された異なるプローブセットまたはマイクロアレイチップで行ってよい）。

別に指定される場合を除いて、本発明に従うクローン化された遺伝子、発現カセット、ベクター、ならびに形質転換細胞および植物の作製のためには標準法を用いてよい。このような方法は当業者に公知である。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）参照。

ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会、または（アミノ酸に関して）３文字コードに推奨される方法で、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用法に従って表される。例えば、Ｐａｔｅｎｔｉｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ，９９〜１０２（１９９０年１１月）（米国特許商標局）参照。

用語「核酸」または「核酸配列」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに関して用いられ得る。用語「遺伝子」は、広く生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指すために用いられる。従って、遺伝子には、それらの発現に必要なコード配列および／または調節配列が含まれる。遺伝子にはまた、発現されないＤＮＡセグメント、例えば、その他のタンパク質のための認識配列を形成するものも含まれる。遺伝子は多様な供給源から得ることができ、対象の供給源からのクローニング、あるいは、公知のまたは予測される配列情報からの合成がそれに含まれる。

本明細書において用いられる核酸分子は、ＲＮＡ（用語「ＲＮＡ」は全てのリボ核酸を包含し、それには、限定されるものではないが、ｎｃＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびｔＲＮＡが挙げられる）；ＤＮＡ；ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，５３９，０８２号、およびＡｒｌｉｎｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，８２１，０６０号に記載される通り）；ならびにそれらの類似体および変更形態が含まれる。本発明の核酸分子は、直線状であっても環状であってもよく、全遺伝子であってもそのフラグメントであってもよく、全長であっても断片化／消化されていてもよく、複数の核酸を含むという意味で「キメラ」であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。任意の供給源由来の核酸を本発明で用いてよい。つまり、本発明の核酸には、限定されるものではないが、ゲノム核酸、合成核酸、プラスミドから得た核酸、ｃＤＮＡ、組換え核酸、および本明細書にさらに記載されるよう公知の化学的手法により修飾されている核酸が含まれる。また、核酸は、インビトロ選択実験の産物（アプタマーとも呼ばれる）および、その他のリガンドにより結合するかまたは結合されるそれらの能力に関して有用なその他の核酸分子であってもよい。Ｄ．Ｋｅｎａｎ，ＴＩＢＳ １９，５７−６４（１９９４）；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，７６３−７９８（１９９５）；Ｓ．Ｅ．Ｏｓｂｏｒｎｅ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）参照。

上記に要約されるように、本発明は、ＲＮＰ複合体を細胞から分離するためのインビボ法に関する。本発明のｍＲＮＰ複合体は、好ましくは、生体試料、例えば、組織試料、全組織、全器官（例えば、全脳、肝臓、腎臓など）、体液試料、細胞培養、細胞溶解物、細胞抽出物などに由来する。好ましい実施形態では、生体試料は、細胞の集団を含むか、または細胞の集団から得られる。「細胞の集団」は、本明細書において、少なくとも２個の細胞を意味し、少なくとも約１０^３個が好ましく、少なくとも約１０^６個が特に好ましく、少なくとも約１０^８〜１０^９個が特に好ましい。集団または試料は、一次培養かまたは二次培養のいずれかに由来する、あるいは腫瘍などの複合組織に由来する異なる細胞種の混合物を含んでよく、またあるいは単一の細胞種のみを含んでもよい。好ましい実施形態では、増殖型細胞が用いられる。あるいは、非増殖型細胞を用いてもよい。

上に要約されるように、本発明の一態様は、内在性細胞ｍＲＮＡ結合タンパク質（ｍＲＮＰ）複合体を分離するインビボ法である。「内在性」は、本明細書においてｍＲＮＰ複合体が細胞中に生じることを意味するために用いられる（すなわち、インビボまたはインサイチュー）。ｍＲＮＰ複合体は、細胞中に自然に形成され得る（すなわち、ｍＲＮＰ複合体の成分が細胞中に自然に生じ、ｍＲＮＰ複合体を形成する）。あるいは、ｍＲＮＰ複合体は、たとえ複合体の１以上の成分が、例えば感染または形質転換により細胞に導入されている場合でも、細胞中で形成される。例えば、ｍＲＮＰ複合体は、ｍＲＮＰ複合体の成分であるＲＮＡ結合タンパク質が、（例えば）細胞を形質転換することにより、またはタンパク質をコードする核酸を有する発現ベクターに細胞を感染させることにより、細胞中で異所性発現された場合、細胞中で内在的に形成され、タンパク質の結合するｍＲＮＰ複合体が形成される。

本方法は、一実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＰ複合体を含む生体試料を、ｍＲＮＰ複合体の成分に特異的に結合するリガンドに接触させることを含む。ｍＲＮＰ複合体の成分は、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ会合タンパク質、ｍＲＮＰ複合体に関連する核酸（ｍＲＮＡ自体、ｎｃＲＮＡ、またはｍＲＮＰ複合体に会合する別の分子もしくは化合物（例えば、炭水化物、脂質、ビタミンなど）を含む）であってよい。成分は、それが約１０^６〜約１０^９のＫｄを有するｍＲＮＰ複合体に結合するかまたあるいは付着するならば、ｍＲＮＰ複合体に「会合する」。好ましい実施形態では、成分は、約１０^７〜約１０^９のＫｄを有する複合体に会合する。より好ましい実施形態では、成分は、約１０^８〜約１０^９のＫｄを有する複合体に会合する。

リガンドは、ｍＲＮＰ複合体の成分に特異的に結合する任意の分子であってよい。例えば、リガンドは、成分に特異的に結合する抗体、成分に結合する核酸（例えば、アンチセンス分子、成分に結合するＲＮＡ分子）、または複合体の成分に特異的に結合する任意のその他の化合物または分子であってよい。特定の実施形態では、リガンドは、ｍＲＮＰ複合体特異的抗体またはタンパク質の産生が関与することが知られている障害を有する被験体（すなわち、ヒトもしくは動物被験体）の血清を用いることにより得ることができる。これらの障害の例としては、自己免疫障害、例えば全身性紅斑性狼瘡（「狼瘡」またはＳＬＥ）など、および多数の癌が含まれる。特定の実施形態では、リガンドは、リガンドの分離、観察または検出を促進するために、別の化合物または分子で「タグを付加されて（ｔａｇｇｅｄ）」いてよい。本発明の一実施形態では、リガンドは、当分野に記載されるように「エピトープタグが付されている」。適したタグは当分野で公知であり、限定されるものではないが、ビオチン、ＭＳ２タンパク質結合部位配列、Ｕ１ｓｎＲＮＡの７０ｋ結合部位配列、Ｕ１ｓｎＲＮＡのＡ結合部位配列、ｇ１０結合部位配列（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡより市販されている）、およびＦＬＡＧ−ＴＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）が含まれる。

ｍＲＮＰ複合体は、次に、リガンド（現在ｍＲＮＰ複合体に結合している）をリガンドに特異的に結合する結合分子に結合させることにより、分離させることができる。結合分子は、リガンドに直接結合してもよいし（すなわち、リガンドに特異的な抗体またはタンパク質であってよい）、またはリガンドに間接的に結合してもよい（すなわち、抗体またはリガンド上のタグの結合パートナーであってよい）。適した結合分子としては、限定されるものではないが、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジンが含まれる。結合分子はまた、例えば、自己免疫障害または癌に罹患している被験体の血清を用いることにより得ることができる。特定の実施形態では、リガンドは、抗体のＦａｂ領域を介してｍＲＮＰ複合体の成分に結合する抗体、および抗体のＦｃ領域に順に結合する結合分子である。結合分子は、当分野で公知の固相支持体、例えば、ビーズ、ウェル、ピン、プレートまたはカラムなどに付着する。従って、ｍＲＮＰ複合体は、リガンドおよび結合分子を介して固相支持体に付着する。

次に、固相支持体からｍＲＮＰ複合体を取り外すことにより回収することができる（すなわち、複合体は、当業者により決定され得る適当な溶媒を用いて、適当なストリンジェンシー条件下で固相支持体から洗い落とされる）。

本発明の特定の実施形態では、ｍＲＮＰ複合体をリガンドと結合させる前に、ｍＲＮＰ複合体を架橋することにより安定化することができる。本明細書において用いられる架橋とは、共有結合（例えば、ｍＲＮＰ複合体の成分との共有結合）を意味する。架橋は、一般に、非共有結合であるリガンド−標的結合、または結合分子−リガンド結合に対比され得る。架橋は、物理的手段により（例えば、熱または紫外線により）、または化学的手段により（例えば、複合体をホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはその他の公知の架橋剤に接触させることにより）行ってよく、それらの手段は当業者に公知であるか、または当業者により決定できる。その他の実施形態では、リガンドは、ｍＲＮＰ複合体への結合の後にｍＲＮＰ複合体に架橋されてよい。さらなる実施形態では、結合分子は、リガンドへの結合の後にリガンドに架橋されてよい。さらに他の実施形態では、結合分子は固相支持体に架橋されてよい。

当業者は、本方法が複数のｍＲＮＰ複合体の同定を同時に（例えば、「一斉に」）可能にすることを理解する。例えば、生体試料は、異なるｍＲＮＰ複合体成分に特異的な複数のリガンドに接触させてよい。試料由来の複数のｍＲＮＰ複合体は、多様なリガンドに結合する。次に、複数のｍＲＮＰ複合体は、適当な結合分子を用いて分離することができ、従って複数のｍＲＮＰ複合体を単離することができる。ｍＲＮＰ複合体ならびに複合体に含有されるｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡは、次に、本明細書に記載される方法および当分野で公知の方法により特性決定され、かつ／または同定されてよい。あるいは、本方法は１つの試料で何度も行ってよく、本発明の段階は、段階の各反復には異なるリガンドを利用して、連続法で行われる。

上記に示すように、ｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡのサブセットは、その試料中のＲＮＡの構造的または機能的ネットワークの特徴であるパターン認識プロフィールを識別する。任意の特定の細胞または組織試料に対するｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡサブセットのコレクションは、その細胞または組織に関する遺伝子発現プロフィール、より具体的には、リボノミック（ｒｉｂｏｎｏｍｉｃ）遺伝子発現プロフィールを構成する。リボノミック発現プロフィールが、試料中の細胞の種類（例えば、その細胞がどんな種類または組織種であるか）、細胞の分化の状態、細胞の生存力（すなわち、細胞が有害な遺伝子、例えば癌遺伝子などに感染しているかまたはそれを発現しているか、あるいは、細胞が特定の遺伝子を欠くか、または特定の遺伝子を発現していないか）、ｍＲＮＰ複合体を単離するために用いた特定のリガンドなどに応じて、細胞ごとに異なり得ることは当然理解される。従って、細胞のリボノミック発現プロフィールは、細胞の識別子として用いることができ、当業者が異なる細胞のプロフィールまたはサブプロフィールを比較および識別することを可能にする。各リボノミックパターンに存在するＲＮＡにより同定された遺伝子は、特定の細胞周期、分化の段階、アポトーシスもしくはストレス誘導、ウイルス感染、または癌に関連し得る別個のサブセットを形成する。

ｃＤＮＡは、リガンドまたはｍＲＮＰ複合体の成分に特異的なリガンドによって分離されたｍＲＮＰ複合体を同定するために使用できる。ｃＤＮＡマイクロアレイグリッドを、例えば、ｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡサブセットを一斉に同定するために用いることができる。あるいは、ゲノムマイクロアレイ（例えば、標的核酸がイントロンとエキソンを含有し得るマイクロアレイ）を用いてよい。すなわち、マイクロアレイで検査されるそれぞれの遺伝子または標的核酸は、位置づけられる正確な位置情報を有しているため、結合を定量化することができる。シリコン化されたチップの形態のマイクロアレイまたはナイロンまたはニトロセルロース上のｃＤＮＡブロットに基づくマイクロアレイが市販されている。スライドガラスも、相補的ＲＮＡ配列の検出のためのオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡでカスタマイズすることができる。これらの場合のすべてにおいて、ハイブリダイゼーションプラットフォームは、結合および洗浄のストリンジェンシーに基づく、試料中のｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡの同定を可能にする。これは、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」と呼ばれている。マイクロアレイ技術は分析の一方法であるが、ｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡサブセット中のｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡの同定および／または配列決定のための唯一の方法である。代替的アプローチとしては、限定されるものではないが、ディファレンシャルディスプレイ、ファージディスプレイ／分析、ＳＡＧＥまたは単にｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡ調製物からｃＤＮＡライブラリーを調製し、そのライブラリーの全てのメンバーを配列決定することが含まれる。

当分野で周知であり、一般に利用可能なＤＮＡ塩基配列決定法のための方法を用いて、本発明の実施形態のいずれかを実践することができる。該方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．）、または、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）により市販されているＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システムに見出されるものなどのポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組合せなどの酵素を用いてよい。好ましくは、本プロセスは、機械、例えばＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖ．）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓ．）ならびにＡＢＩ触媒および３７３および３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）などで自動化される。

好ましい実施形態では、本発明に従って単離されたｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡから得たｃＤＮＡの増幅は、核酸の同定の間には行われず、本発明に必要または必須ではない。しかし、当業者であれば、便宜上同定の対象である核酸（例えば、マイクロアレイ解析および／または配列決定により同定される核酸）を増幅すること、好みの問題として、および／あるいは特定の市販のマイクロアレイまたはマイクロアレイ解析システムの仕様書／取扱説明書に従うことを選択することができる。従って、所望であれば、核酸は、当分野で周知の多数の公知の核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＣ−ＰＣＲ、ＳＤＡなど）のいずれかに従って増幅させてよい。

本発明の方法は、実施者の必要に応じて、および本発明の実施される目的に従って、いくつかの方法で実施してよい。例えば、一実施形態では、対象の細胞種に特有のｍＲＮＡ結合タンパク質複合体が同定される。そのような実施形態の例では、ｍＲＮＰ複合体に特異的な抗体を用いて、複合体をそれと会合したｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡとともに免疫沈降させることができる。次に、ＲＮＡを同定してその細胞種のリボノミック発現プロフィールを形成するか、またあるいは、（例として）薬物スクリーニングのために単離することができる。転写後制御のためのｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡ候補物を、サブセットとして、細胞周期または発生に伴う諸現象中のｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡ安定性の変化について一斉に解析してよい。特定の実施形態では、本方法は、発生または細胞周期の変化を受けている細胞から核を単離し、公知の技法に従う核ランオフアッセイを行って転写ｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡを得、次に、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて同じ細胞中での転写ｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡを全体的なｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡレベルと比較することにより実施され得る。これらの方法は、従って、定常状態のｍＲＮＡおよび／またはｎｃＲＮＡレベルでの転写の効果と転写後の効果を一斉に識別する能力をもたらす。

もう１つの実施形態では、培養中の細胞を形質転換してＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）または、対象の細胞種において特定のｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡのみと会合するＲＮＡ会合タンパク質（ＲＡＰ）を発現させる。ＲＢＰまたはＲＡＰをコードするＤＮＡは、組換えベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター）により運ばれ、公知の手段により細胞を形質転換することができ、その後ＲＢＰまたはＲＡＰが細胞中で発現される。本明細書においてさらに説明されるような、任意のＲＢＰまたはＲＡＰを用いてよい。タンパク質はその天然の形態であってもよいし、細胞から回収しやすくするためにタグを付加されていてもよい（例えば、エピトープタグ）。ＲＢＰまたはＲＡＰに結合または会合している複数のＲＮＡ標的のインビボでの検出は、必要に応じて、結合しやすいエピトープを用いて行ってよいが、好ましくはタグを用いずに実施する。ＲＢＰまたはＲＡＰ上のエピトープが結合しにくいかまたは不明瞭である場合、異所性発現した組換えタンパク質のエピトープタグを用いてよい。形質転換細胞は、その他の細胞種と混合してもよいし、動物またはヒト被験体に埋め込んでもよい。タンパク質に特異的なリガンド（例えば、抗体）を用いて、タンパク質をその会合したメッセンジャーＲＮＡとともに、形質転換細胞を含有する組織の抽出物から免疫沈降させることができる。ｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡ複合体およびその会合したＲＮＡは、次に同定されてその細胞種の発現プロフィールを形成するか、またあるいは分析される（例えば、薬品開発のため）。

さらに別の実施形態では、動物において特定の細胞種を１以上の細胞種特異的遺伝子プロモータを用いて操作して、対象の細胞種においてＲＢＰまたはＲＡＰを発現させる。上記に示したように、遺伝子プロモータおよびＲＢＰまたはＲＡＰは、１以上のベクターで運ばれ、細胞に形質転換されることができ、そこでＲＢＰまたはＲＡＰが発現される。一実施形態では、このタンパク質に特異的なリガンド（例えば、抗体）を用いて、タンパク質をその付着または会合したｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡとともに、対象の細胞種を含有する組織の抽出物から免疫沈降させることができる。次に、ＲＮＡを同定してその細胞種の発現プロフィールを形成するか、または、例えば、薬品開発のために単離する。

本発明の実践において有用なＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）およびＲＮＡ会合タンパク質（ＲＡＰ）は、当分野で公知であり、またあるいは、本明細書に記載される方法により同定および発見され得る。ＲＮＡ結合タンパク質は、現在、様々な細胞の調節および発生過程、例えばＲＮＡプロセシングおよびコンパートメント化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）、ＲＮＡ安定化、ｍＲＮＡ翻訳およびウイルス遺伝子発現などの制御に関与しているとして公知である。ＲＮＡ結合タンパク質には、ポリＡ結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」、全ｍＲＮＡ集団とは定量的に異なる全ｍＲＮＡ集団のサブセットに生じる）、およびその他の一般的なＲＮＡ結合タンパク質、ならびに特定の細胞種において唯一または少数のメッセンジャーＲＮＡに付着するＲＮＡ結合タンパク質が含まれる。その他の有用なタンパク質は、ＲＮＡおよびＲＮＡ結合タンパク質に反応性の自己抗体である。

有用なＲＮＡ結合タンパク質およびＲＮＡ会合タンパク質の例は、上に記載され、ショウジョウバエＥＬＡＶ−ＲＮＡ結合タンパク質の４つのＥＬＡＶ／Ｈｕ哺乳類相同体を含む（Ｇｏｏｄ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，４５５７−４５６１；Ａｎｔｉｃ ａｎｄ Ｋｅｅｎｅ、前掲。ＨｕＡ（ＨｕＲ）は遍在的に発現し、一方、ＨｕＢ、ＨｕＣおよびＨｕＤ（およびそれらの各自の選択的にスプライスされたイソ型）は主に神経組織で見出されるが、一部の小細胞癌、神経芽腫、および髄芽細胞腫において腫瘍細胞特異的抗原として発現することもできる（Ｋｅｅｎｅ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，５−７に概説）。全てのＨｕタンパク質は３つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含有し、それはそれらのＡＲＥに対する結合特異性を付与する（Ａｎｔｉｃ ａｎｄ Ｋｅｅｎｅ，前掲；Ｋｅｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６，２１４−２２０；Ｂｕｒｄ ａｎｄ Ｄｒｅｙｆｕｓｓ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，６１５−６２１）。Ｈｕタンパク質によるＡＲＥ結合の根拠は、組換えＨｕＢでスクリーニングされたランダム化コンビナトリアルＲＮＡライブラリー由来の、ＡＵに富む結合コンセンサス配列の同定から始まった。（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１）。これらおよびその他の研究は、Ｈｕタンパク質がインビトロで、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＡＰ−４３を含む数個のＡＲＥ含有ＥＲＧ ｍＲＮＡと結合することを実証した（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，１９４３−１９５２；Ｌｉｕ ｅｔ ａ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５，５４４−５５０；Ｍａ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，８１４４−８１５１；Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２０１１−２０１６；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６５９３−６５９８；Ｆａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４４８−３４６０；Ａｎｔｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１）。

Ｈｕタンパク質とＡＲＥ含有ｍＲＮＡの結合は、ｍＲＮＡ転写物の安定化および増大した翻訳可能性をもたらし得る（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７，９５４−９６２；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，６４１７−６４２３；Ｆａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４４８−３４６０；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４６１−３４７０）。ニューロン特異的Ｈｕタンパク質は、テラトカルシノーマ細胞で産生され、その後レチノイン酸（ＲＡ）処理されてニューロン分化を誘導する最も初期神経細胞マーカーの１つである（Ａｎｔｉｃ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｇａｏ ａｎｄ Ｋｅｅｎｅ（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０９，５７９−５８９）。

一実施形態では、本発明を実施するために用いたリガンドは、プレメッセンジャーＲＮＡプロセシングに関与する細胞タンパク質のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）ファミリーから選択されるＲＮＡ結合タンパク質である。そのようなタンパク質の一例は、Ｕ１Ａ ｓｎＲＮＰタンパク質である。ＲＲＭスーパーファミリーの２００を超えるメンバーがこれまでに報告され、その大多数は遍在的に発現し、系統発生において保存されている（Ｑｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ（１９８９）５７：８９−１０１；Ｋｅｎａｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９１）１６：２１４−２２０）。大部分は、ポリアデニル酸ｍＲＮＡまたは核内低分子リボ核酸（例えば、Ｕ１、Ｕ２など）トランスファーＲＮＡ、５Ｓまたは７ＳＲＮＡに対する結合特異性を有することが公知である。それらとしては、限定されるものではないが、ｈｎＲＮＰタンパク質（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ）、ＲＲＭタンパク質ＣＡｒＧ、ＤＴ−７、ＰＴＢ、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、ＨｕＤ、ＨＵＣ、ｒｂｐ９、ｅｌＦ４Ｂ、ｓｘｌ、ｔｒａ−２、ＡＵＢＦ、ＡＵＦ、３２ＫＤタンパク質、ＡＳＦ／ＳＦ２、Ｕ２ＡＦ、ＳＣ３５、およびその他のｈｎＲＮＰタンパク質が含まれる。ＲＲＭファミリーの組織特異的メンバーはあまり一般的ではないが、ＩＭＰ、Ｂｒｕｎｏ、ＡＺＰ−ＲＲＭＩ、プレＢ細胞で発現するＸ１６、パフ（ｐｕｆｆ）特異的ショウジョウバエタンパク質であるＢｊ６、およびニューロン特異的なＥＬＡＶ／Ｈｕが含まれる。

本発明の実践に有用なＲＮＡ結合およびＲＮＡ会合タンパク質としては、限定されるものではないが、上に記載されるものが含まれる。

ｍＲＮＰ複合体に特異的に結合する抗体は公知であり、例えば、Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，６３５，４２２号に記載されている。

本発明を用いて、ｎｃＲＮＡ、例えば、ＲＮＰに結合するかまたはＲＮＰの中で相互作用するｍｉＲＮＡ、疾病の進行に関係するタンパク質（対象のタンパク質）をコードするｍＲＮＡなどを同定することができる。そのようなｍＲＮＡは、予め決められていても、亜集団、本発明の方法により生成されたｍＲＮＡのサブセット（例えば、対象のタンパク質を発現することの分かっている細胞を本方法の実施に利用する場合）から同定されてもよい。このようなタンパク質をコードするｍＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、Ｒａｎａに対する米国特許第６，５０３，７１３号の§５．１に記載されているものが含まれる。具体的な例としては、限定されるものではないが、タンパク質、例えば、アミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、コラーゲン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、ＷＡＦ１、ｃｄｋ４阻害剤、ＭＴＳ１、嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン、ＢＮＤＦ、ＢＭＰ、ＧＧＲＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＧＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＫＧＦ、ミオトロフィン、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ、ソマトトロフィン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ、インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、カテプシンＫ、シトクロムＰ−４５０、ファメシルトランスフェラーゼ、グルタチオン−ｓトランスフェラーゼ、ヘパラナーゼ、ＨＭＧ ＣｏＡシンセターゼ、ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ｒａｓカルボキシル末端プロテアーゼ、テロメラーゼ、ＴＮＦ変換酵素、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、セレクチン、ＣＤ４０、５−αレダクターゼ、心房性ナトリウム利尿因子、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトトロピン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン、レプチン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗体、ＣＴＬＡ４、血球凝集素、ＭＨＣタンパク質、ＶＬＡ−４、カリクレイン−キニノゲン−キニン系、ＣＤ４、ｓｉｓ、ｈｓｔ、ｒａｓ、ａｂｌ、ｍｏｓ、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｈ−ｒａｓ、ｋｉ−ｒａｓ、ｃ−ｆｍｓ、ｂｃｌ−２、Ｌ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ＨＥＲ−２、ボンベシン受容体、エストロゲン受容体、ＧＡＢＡ受容体、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＧＴＰ−結合調節タンパク質、インターロイキン受容体、イオンチャネル受容体、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、リポタンパク質受容体、オピオイド疼痛受容体、サブスタンスＰ受容体、レチノイン酸およびレチノイド受容体、ステロイド受容体、Ｔ細胞受容体、甲状腺ホルモン受容体、ＴＮＦ受容体、組織プラスミノーゲン活性化因子；膜貫通型受容体、カルシウムポンプ、プロトンポンプ、ナトリウム／カルシウム交換輸送体、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、Ｐ１７０、ＬＲＰ、ｃＭＯＡＴ、トランスフェリン、ＡＰＣ、ｂｒｃａ１、ｂｒｃａ２、ＤＣＣ、ＭＣＣ、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ｎｍ２３、ｐ５３およびＲｂなどをコードするｍＲＮＡが含まれる。例えば、米国特許第６，５０３，７１３号参照。さらなる例が米国特許出願第２００３／００７３６１０号の表１に記載され、それには、限定されるものではないが、異常な（ａｂｅｒａｎｔ）タンパク質堆積に関与するタンパク質、例えば、α−シヌクレイン（パーキンソン病）；アミロイド−β（アルツハイマー病）Ｔａｕ（アルツハイマー病）、ＰｒＰ（プリオン病）；ハンチンチン（ハンチントン病）；アタキシン−１（脊髄小脳失調症１型）アタキシン−２（脊髄小脳失調症２型）；アタキシン−３（脊髄小脳失調症３型）；カルシウムチャネル（脊髄小脳失調症６型）；アタキシン−７（脊髄小脳失調症７型）；アンドロゲン受容体（球脊髄性筋萎縮症）；アトロピン（Ａｔｒｏｐｈｉｎ）−１（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）；ＳＯＤ１（筋萎縮性側索硬化症）；免疫グロブリン軽鎖（原発性全身性アミロイドーシス）；トランスサイレチン（家族性アミロイドポリニューロパチー；老人性全身性アミロイドーシス）；血清アミロイドＡ（続発性全身性アミロイドーシス）；膵島アミロイドポリペプチド（２型糖尿病）；インスリン（注射による局所性アミロイドーシス（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ））；β２−ミクログロブリンン（血液透析に関連するアミロイドーシス）；シスタチン−Ｃ（遺伝性脳アミロイド血管症）；ゲルゾリン（フィンランド型遺伝性全身性アミロイドーシス（Ｆｉｎｎｉｓｈ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ））；およびリゾチームをコードするｍＲＮＡが含まれる。

本発明の方法により同定されたｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性物質、例えば米国特許第７，０７８，１９６号；米国特許第６，５０３，７１３号（特にその中の§５．２）；および米国特許出願第２００４／００８６８８４号に記載されるものなどとして、天然型または誘導体型で有用である。さらに、本発明を用いて定義される分子間相互作用および相互作用部位は、化合物および試薬、例えば干渉ＲＮＡなどの開発のための有効な標的を提供することができる。

本発明により同定されるｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、１以上の特定のタンパク質またはペプチドの産生を下方制御し（例えば、細菌細胞、植物細胞、動物細胞、または酵母細胞の増殖期の間のＲＮＡ干渉）、その後、続いて起こる産生期の間にその下方制御を除去することを望む場合に、インビトロまたはインビボでのタンパク質またはペプチドの産生に有用である。このような適用は、本明細書に記載されるものなどの疾患を治療する際に、さらに組換えタンパク質およびペプチドの産生において有用である。

一部の例では、例えば、タンパク質の発現の下方制御が望ましくないかまたは病態である場合、ｎｃＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをインビボで阻害または不活化することが望まれる。そのような場合には、本発明のｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、それとハイブリダイズする抗ｍｉＲＮＡまたは抗ｎｃＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）を設計するのに有用であり、ＡＭＯは、そのように定義されたｍＲＮＡ標的にコードされる所与タンパク質の発現を調節するために、公知の技法に従って設計および合成することができる。例えば、Ｊ．Ｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＡＭＯｓ）；ａｍｍｕｎｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｍｉＲＮＡｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：４９６−５０２（２００６）参照。

本発明の方法により同定されたｎｃＲＮＡＳおよびｍｉＲＮＡ（またはそのサブセットおよび組合せ）は、それらが結合するかまたは会合するＲＮＡＢＰおよび対応するｍＲＮＡ（またはそのサブセット）とともに、仮説上のまたは提案されるｍｉＲＮＡを対応するｍＲＮＡ、例えば、米国特許出願第２００６／０１８５０２７号に記載されるものなどから同定または生成するためのモデルおよびアルゴリズムを改良するための、確認データ、検証データ、または訓練データを得るのに有用である。例えば、下の表２に示されるデータは、市販のアルゴリズムにより可能性のあるｍｉＲＮＡ標的と予測された１０１３のｍＲＮＡのクラスを１０８のｍＲＮＡのより小さなサブセットに絞り、それによりｍｉＲＮＡ標的の同定を加速および促進させることを例示する。

本発明を、以下の限定されない実施例においてより詳細に説明する。

ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび予測されたｍＲＮＡ標的の個別のサブセットはＨｕＲ ｍＲＮＰの成分に富む
内在性ＲＮＰのＲＮＡおよびタンパク質成分を調査するため、本発明者らは、ヒトジャーカットＴ細胞系統中の調節ＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＲに会合したｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ集団のゲノム規模での分析を行った。遍在的に発現した哺乳類ＨｕＲタンパク質は、全てが主に標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中のＡＵに富む要素（ＡＲＥ）との会合によって機能し、その結果、伝達安定性および／または翻訳が強化されている、ＥＬＡＶ／Ｈｕファミリーの４つのメンバーの中の１つである（１２〜１４）。近年、ＨｕＲもストレス条件に付されたヒト肝細胞癌細胞系統において陽イオン性アミノ酸輸送体１（ＣＡＴ−１）ｍＲＮＡのｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−１２２翻訳抑制を抑制解除することが示された（６）。

本発明者らは、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの別個のサブセットは、ヒトジャーカットＴ細胞においてＨｕＲと会合すること、およびｍＲＮＡの下位集団が、計算によって予測された、多くの成長調節タンパク質をコードするｍｉＲＮＡ標的について高度に濃縮されていることをここに報告する。ＨｕＲの中に見出された１４のｍｉＲＮＡの中で、ｍＲＮＰは既に癌遺伝子に関連があるとされているｍｉｒ−１７−９２クラスター、ならびにアポトーシス、慢性リンパ性白血病およびＡＲＥ介在性ｍＲＮＡ崩壊に関連すると報告されているｍｉＲ−１６のメンバーである（５、１５〜１７）。この報告は、ｍｉＲＮＡのサブセットが、これも機能的に関連する標的ｍＲＮＡについて濃縮されている、特定のＲＮＰ複合体の成分であることの最初の実証である。生物学的に誘導された共通のサブセットであるので、これらのＨｕＲ ＲＮＰ会合ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡは、所与細胞内容におけるｍｉＲＮＡターゲッティングおよび予測されたｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用の成果を調べるための、非常に減少した配列スペースをもたらす。本発明者らはＲＮＡＢＰとｍｉＲＮＡの間の可能性のある組合せの関係、標的化されたｍＲＮＡ下位集団の調節および得られる遺伝子発現ネットワークに取り組む。本発明者らは、例えばＲＮＡＢＰなどの転写後機構によって調節されたｍＲＮＡが、選択的に進化するか、または遺伝子発現の結果を多様化または調整するためのさらなる転写後制御因子を獲得し得ることを提案する。

この研究において、内在性ＨｕＲおよびポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）ｍＲＮＰは、ジャーカット細胞溶解物から特異的抗体を用いた免疫沈降により直接単離された。これらのｍＲＮＰ、ならびに全細胞ＲＮＡから抽出されたＲＮＡを、市販のｍＲＮＡマイクロアレイプラットフォームおよび既に有効とされているｍｉＲＮＡに特異的なアレイプラットフォームで解析した（「材料および方法」参照）。結果は、ＨｕＲがインビボで全細胞ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの両方の別個のサブセットに会合することを示す（図１）。興味深いことに、ＨｕＲは、ｍＲＮＡ（１０％）よりも大きな細胞ｍｉＲＮＡの画分（２３％）に会合し、一方、ＰＡＢＰは各々比例的に会合する（それぞれ８５％および８４％）。その他の２つのＲＮＡＢＰについても試験したが、これらのＲＮＡサブセットは作製されなかった（データは示さず）。ＨｕＲに会合した１４のｍｉＲＮＡを、シード配列保存（表１Ａ）に基づくおよそ６２の公知のファミリーの中から７つのｍｉＲＮＡファミリーに分類する（１８、１９）。いくつかのＨｕＲ会合ｍｉＲＮＡが、Ｈｕタンパク質が十分確立された制御因子であるＡＲＥ介在性ＲＮＡ安定性および翻訳にも関連するプロセスにおいて機能すると既に報告されている。これらには、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７ ｏｎｃｏｍｉｒクラスター（ｍｉＲ１７−５ｐおよびｍｉＲ−１９ｂを含む）およびｌｅｔ−７ファミリー（１３、１５、１６、２０、２１）による細胞増殖およびアポトーシスへの影響が含まれる。さらに、ｍｉＲ−１６は、ＲＮＡＢＰトリステトラプロリン（ＴＴＰ）およびＨｕＲの予期される結合部位でもあるＡＲＥ配列モチーフによって介在されるＴＮＦ−αｍＲＮＡの不安定性に関与する（５）。

ＨｕＲ会合ｍｉＲＮＡサブセットによるｍＲＮＡターゲッティングに対処するため、本発明者らは、標的ｍＲＮＡを予測するためのｍｉＲＮＡシードマッチの進化的保存に依存するＴａｒｇｅｔＳｃａｎＳアルゴリズムを利用した（１９）。７つのＨｕＲ会合ｍｉＲＮＡファミリーが予測されて、５つの脊椎動物種の３’ＵＴＲ中に保存された１０８４の位置づけられたｍＲＮＡを標的化する（「材料および方法」参照）。これらのｍＲＮＡの中の４３９は、ジャーカット細胞の全ＲＮＡで発現され、一方、１０８はＨｕＲと会合する（表２）。これらの１０８のｍＲＮＡのＨｕＲとの会合は、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＳを用いて決定されるｍｉＲＮＡ標的の例外的な濃縮を表し、２．６ｅ〜１６のｐ値（ＨｕＲ ｍＲＮＰ中のｍｉＲＮＡ標的の濃縮が偶然起こる確率）を生じる超幾何統計的検定（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｔｅｓｔ）により確認した。全ｍｉＲＮＡ（６２ファミリーを表す）から無作為に選択される７つのｍｉＲＮＡファミリーセットの群のさらなる分析も、ＨｕＲ ｍＲＮＰ中のｍＲＮＡに対する標的濃縮を示す。興味深いことに、さらなる１３０のｍＲＮＡのみがこの場合標的化された下位集団に加えられる（データは示さず）。総合すると、これらのデータは、ＨｕＲ会合ｍＲＮＡの別個の下位集団がｍｉＲＮＡにより選択的に標的化されることを実証する。これは、Ｈｕファミリータンパク質の多くのｍＲＮＡ標的が、細胞増殖および分化に関与する初期応答遺伝子タンパク質をコードし、プロセスもｍｉＲＮＡ調節に関与するという事実に一致する（１、２、１２、１３、２２）。

ＨｕＲ会合ｍｉＲＮＡの標的であると予測されたｍＲＮＡの遺伝子オントロジー分析により、いくつかの機能的アノテーショングループの濃縮が明らかとなる（表３）。ＨｕＲ会合ｍｉＲＮＡ標的は、１０のアノテーショングループにおいて統計上有意な濃縮を示すタンパク質をコードし、一方、包括的にジャーカット全ＲＮＡに発現されるものは１６のカテゴリーにおいて濃縮されている。興味深いことに、２つの分析間でたった３つの官能基しか重複せず、この場合も、予測されたｍｉＲＮＡ標的のＨｕＲとの会合が無作為ではなく、別個の機能クラスでの濃縮を表すことを示唆する。ＨｕＲと会合することが見出された予測されたｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的は、主に転写制御およびＲＮＡ代謝に関する機能カテゴリーにおいて濃縮され、２つの区域はＨｕＲ調節にも寄与する（１３、２３）。これらの知見は、ＲＮＡＢＰおよびｍｉＲＮＡによる転写および転写後制御ネットワークの相互接続および潜在的協調に一致する（７、２２〜２４）。

ｍｉＲＮＡに直接標的化され得るｍＲＮＡの包括的集団の現在の理解は、ほぼ完全に計算によるアプローチに依存し、これらのアルゴリズムは、これらの相互作用のかなり進化した機能予測を有する。しかし、これらの予測における厳密な進化的保存に対する信頼は、種特異的であるｍＲＮＡ標的を見過ごす可能性がある。ここに報告される内在的に会合したｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ下位集団の単離は、生産的相互作用について調査されるべき配列スペースを実質的に減らし、その多くは細胞種、成長条件または細胞内の状況に依存し得る。例として、ＲＮＡＢＰ、およびＲＮＰは、概して、ｍＲＮＡ標的との条件依存性会合を提示することが実証されている（２２）。ＲＮＡＢＰおよび標的ｍＲＮＡが所与細胞中に単に存在しているだけでは、それらのインビボ相互作用の単独の決定因子とならないことは明らかである。これらの動態に内在する機構は十分理解されていないが、細胞内コンパートメント化、ＲＮＰの成分の翻訳後修飾、タンパク質または非コードＲＮＡアクセサリー因子のいずれかの存在、およびその他の転写後メディエーターとの競合または協調が含まれ得る（１３、２５）。ＲＮＡＢＰ ＴＴＰが、腫瘍壊死因子ｍＲＮＡのＡＲＥ介在性崩壊においてｍｉＲ−１６と相互依存的に機能し、ＨｕＲがｍｉＲ−１２２に介在される翻訳阻害を条件的に抑制解除することができるという以前の報告も、転写後メディエーター間の機能的相互作用を調査する細胞の状況の重要性を示す（５、６）。ＨｕＲによるｍｉＲ−１２２抑制の開放の結果、活発に翻訳するポリソームに対して標的化ｍＲＮＡが補充され、ニューロンＨｕＢタンパク質を用いる以前の研究に一致する（１２）。本発明者らの現在の結果は、ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用が同時に標的化された転写物のＨｕＲ結合により維持されるという示唆を支持する（６）。しかし、ｍｉＲＮＡに介在される翻訳阻害の解除がＨｕＲによるｍＲＮＡの同時標的化の普遍的な結果であるかどうかは不明である。これらのＨｕＲによる活性ポリソームへのｍＲＮＡ補充が、ｍｉＲＮＡ抑制解除のより一般的な機構であり、ｍＲＮＡとのｍｉＲＮＡの相互作用が維持されるならば、より包括的な抑制解除の動的可逆性に対する可能性が、細胞の条件変化およびＨｕＲ会合が失われた場合に、もたらされる。本明細書に報告されるＨｕＲおよびＨｕＲ−ＲＮＰ会合ｍｉＲＮＡサブセットが、広範な同時会合ｍＲＮＡ集団および得られるタンパク質発現の状況的運命にどのように影響を及ぼすかを理解するためには、さらなる研究が必要である。

本明細書に提示されるデータは、転写後ＲＮＡオペロン理論に対する推論を支持する（７、２４）。このモデルの中心的な断定は、機能的に関連する遺伝子が、転写後レベルでトランス活性化因子、例えば、それぞれのｍＲＮＡ中の関連調節配列要素を認識するＲＮＡＢＰおよびｍｉＲＮＡなどにより、組合せによって同時調節されるということである。本発明者らによる、ＨｕＲ−ｍＲＮＰにおいて別個のｍｉＲＮＡサブセットと標的の濃縮された特定のｍＲＮＡ群が会合するという実証は、このモデルを支持している。さらに、それはＲＮＡＢＰ会合ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡなどのその他の転写後調節因子による可能性のある調節に基づいて、さらに下位集団に分離され得ることを示唆する。組合せ的調節に加えられた層は潜在的に広大であり、遺伝子発現ならびにアジリティの広範な微調整を可能にし、同時に発達プログラムのより広範な方向付けを維持することができる（２６）。

ＨｕＲは、ｍｉＲＮＡの予測された標的について濃縮されたｍＲＮＡのサブセットに加えて、別個のｍｉＲＮＡのサブセットと会合することが報告された最初のＲＮＡＢＰである。ＨｕＲはＡＲＥ結合および調節タンパク質として確立されているので、これらのデータは、ＡＵに富む３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡのヒトｍｉＲＮＡによる選択的ターゲッティングを予測するために用いられてきた生物情報科学アプローチに一致する（２７）。さらに、ＵＴＲの進化および遺伝子発現プログラムのロバスト性は、転写後制御因子によりかなりの影響を受けていると思われる（７〜９、２８〜３０）。本発明者らのデータは、異なるクラスの転写後因子の組合せ的効果がこの進化的前進を実際に仲介することを示唆する。哺乳類細胞において、ＨｕＲ会合ｍＲＮＡの下位集団が、予測されたｍｉＲＮＡ標的について高度に濃縮されたという本発明者らの知見から、本発明者らは、転写後制御されるｍＲＮＡの多くが進化し、または複数の機構を介した組合せ的調節を可能にする配列要素を獲得し得ることを提示する。これらのＲＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−タンパク質相互作用の協調のより徹底した理解には、ＲＮＡＢＰ、ｍｉＲＮＡおよびそれらが同時に標的化するメッセンジャーＲＮＡを含む、生物学的に定義されたネットワークの解明が必要とされる。

［参考文献］

＜材料および方法＞
細胞培養および細胞溶解物の調製。ヒト急性Ｔ細胞白血病ジャーカット細胞を、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞溶解物は（１）に本質的に記載されるように調製した。例外としては、ポリソーム溶解バッファーに１０％グリセロールを添加したことと、回収した細胞を溶解バッファーに再懸濁した後に細胞溶解物を２７ゲージ針に１０回通過させたことが含まれる。

ＩＰアッセイおよびＲＮＡの単離。内在性ＨｕＲおよびＰＡＢＰ−ｍＲＮＰ複合体のＩＰを用いて内在性標的ｍＲＮＡの会合を評価した。アッセイは（１、２）に本質的に記載されるように行った。ＩＰには、６０μｇの抗ＨｕＲ（３Ａ２）を負荷した、既に膨潤し充填された２００μｌのプロテインＡセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）（３）、抗ＰＡＢＰ（４）、ＩｇＧ１（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）または正常なウサギ血清免疫グロブリンを利用した。抗体負荷ビーズを、５ｍｇ（全タンパク質）細胞溶解物とともに４℃にて４時間インキュベートし、氷冷ＮＴ２バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．０５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）で４回洗浄し、それに続いて１Ｍ尿素を追加した氷冷ＮＴ２で３回洗浄した。会合したＲＮＡの抽出を（１）に記載されるように行い、トリゾール試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを単離した。全てのＲＮＡ試料を、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡアレイによるその後の分析のために２つのアリコートに分けた。

ｍＲＮＡアレイ解析。全ＲＮＡおよびＲＮＰ会合ＲＮＡ（および陰性対照ＩＰ）を、ｍＲＮＡについて２色のＯｐｅｒｏｎ社製Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ Ａｒｒａｙｓ（バージョン２．１）を用いて、（５）に記載されるようにアッセイした。プローブ作製には実験試料（Ｃｙ３）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｃｙ５）の直接標識を用いた。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、スポットあたりおよびチップあたりの（ｌｏｗｅｓｓ）正規化を行って結果を解析した。ｍＲＮＡは、３つの生物学的複製アレイのうち２つについて、実験チャネルにおいてローカルバックグラウンドの２倍以上、ならびに平行陰性対照ＩＰ（ＩｇＧ１または正常なウサギ血清）のシグナル／ノイズ比の１０倍以上のレベルで存在するならば、全ＲＮＡの成分または所与ＲＮＡＢＰの特定の内在標的であると決定された。

ｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ解析。全ＲＮＡおよびＲＮＰ会合ＲＮＡ（および陰性対照ＩＰ）を、（６）に本質的に記載されるように、１５６のヒトｍｉＲＮＡを検出できるカスタムアレイプラットフォームを用いてｍｉＲＮＡについてアッセイした。例外として、標識バッファー中１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および標識のための基準オリゴヌクレオチド濃度０．０５μＭを使用した。アレイを、２５℃にて２×ＳＳＣ／０．０２５％ＳＤＳ中で１回、２３℃にて０．８×ＳＳＣ中で３回、そして４℃にて０．４×ＳＳＣ中で２回洗浄した。各アレイでの計算による解析を（６）に記載されるように行った。ｍｉＲＮＡは、３つの生物学的複製アレイのうち２つについて、複製スポットにおいてローカルバックグラウンドの２倍以上、ならびに平行陰性対照ＩＰ（ＩｇＧ１または正常なウサギ血清）のシグナル／ノイズ比の１０倍以上のレベルで存在するならば、全ＲＮＡの成分または所与ＲＮＡＢＰと会合した成分であると決定された。

ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的濃縮解析。ｍｉＲＮＡ標的予測は、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．の補足データから選んだ（７）。このアルゴリズムは複数のアラインメントを用いて、ｍｉＲＮＡの８位に対するワトソン／クリック対の一方、または標的の１位の保存されたアデノシンのいずれかに隣接するｍｉＲＮＡの２〜７塩基に対して対となる保存されたワトソン／クリック六量体を同定する。本発明者らは、５つの種のアラインメント（ヒト、マウス、ラット、イヌ、およびニワトリ）において保存された１２９２８の予測を用いた。Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．は、これらの予測を、ＵＣＳＣゲノムアノテーションから得たｃＤＮＡのＩＤとして提供し、それは１つの遺伝子に対して報告される数個のｃＤＮＡの形態で重複エントリーをもたらし得る。これら重複を取り除くため、本発明者らは、予測されたｍＲＮＡ標的を２００５年８月現在で特有のＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤに位置づけ、１０１８２の予測を残した。また、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤにより、本発明者らは予測された標的遺伝子とｍＲＮＡマイクロアレイプローブを照合することが可能となった（表２）。本発明者らは、６２全てのｍｉＲＮＡファミリーに対する標的を、ｍＲＮＡアレイプラットフォームに示された２５１８の遺伝子に対してマッピングし、その中の１００３をジャーカット細胞において発現されたとして検出した。ＨｕＲに会合した標的ｍＲＮＡの濃縮は、全細胞ＲＮＡと比較する超幾何学的試験により決定された。

遺伝子オントロジー濃縮解析。ＨｕＲ会合ｍｉＲＮＡの標的であると予測されたｍＲＮＡの遺伝子リストを、Ｐａｎｔｈｅｒデータベースを用いて、完全なＮＣＢＩ Ｈ．サピエンス遺伝子リストに対して比較した（８）。機能カテゴリー中の有意な濃縮は、多重検定のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正をしたＢｉｎｏｍｉａｌ統計値により決定した（ｐ値＜０．０５）。

［参考文献］

前述の内容は本発明を例証するものであり、それを限定すると解釈されるものではない。本発明は以下の特許請求の範囲により定義され、その中には特許請求の範囲の同等物も含まれる。

Claims (25)

1. インビボ細胞における非コード調節ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の遺伝子発現プロフィールを生成する方法であって、
   （ａ）細胞から少なくとも１つのｍＲＮＡ−タンパク質（ＲＮＰ）複合体を分離するステップと、ここで、前記ＲＮＰ複合体は、（ｉ）ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡＢＰ）またはＲＮＡ会合タンパク質と、（ｉｉ）前記タンパク質と結合または会合した少なくとも１つのｍＲＮＡと、（ｉｉｉ）前記タンパク質と結合または会合した少なくとも１つのｎｃＲＮＡとを含み、
   （ｂ）少なくとも１つのＲＮＰ複合体中の少なくとも１つのｎｃＲＮＡを同定するステップであって、これによりＲＮＰ複合体中のｎｃＲＮＡの固有情報を含む遺伝子発現プロフィールを作製するステップと
   を含む方法。
2. 前記ｎｃＲＮＡはｍｉｃｒｏＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. 前記分離するステップは、
   細胞由来の前記ＲＮＰ複合体を含む生体試料を、ＲＮＰ複合体の少なくとも１種類の成分に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドに接触させるステップと、
   前記リガンドと前記リガンドに特異的な抗体とを結合させることによりＲＮＰ複合体を分離するステップと、ここで前記抗体は固相支持体に固定されており、
   ＲＮＰ複合体を固相支持体から取り外すことによりＲＮＰ複合体を回収するステップと
   を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＲＮＰ複合体中の前記ｍＲＮＡが予め決定されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. （ｃ）ｍＲＮＰ複合体中のｍＲＮＡを同定するステップであって、これにより前記ｍｉＲＮＡに会合したｍＲＮＡの固有情報をさらに含む遺伝子発現プロフィールを作製するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ｍＲＮＡは、アミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、コラーゲン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、ＷＡＦ１、ｃｄｋ４阻害剤、ＭＴＳ１、嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン、ＢＮＤＦ、ＢＭＰ、ＧＧＲＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＧＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＫＧＦ、ミオトロフィン、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ、ソマトトロフィン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ、インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、カテプシンＫ、シトクロムＰ−４５０、ファメシルトランスフェラーゼ、グルタチオン−ｓトランスフェラーゼ、ヘパラナーゼ、ＨＭＧ ＣｏＡシンセターゼ、ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ｒａｓカルボキシル末端プロテアーゼ、テロメラーゼ、ＴＮＦ変換酵素、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、セレクチン、ＣＤ４０、５−αレダクターゼ、心房性ナトリウム利尿因子、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトトロピン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン、レプチン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗体、ＣＴＬＡ４、血球凝集素、ＭＨＣタンパク質、ＶＬＡ−４、カリクレイン−キニノゲン−キニン系、ＣＤ４、ｓｉｓ、ｈｓｔ、ｒａｓ、ａｂｌ、ｍｏｓ、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｈ−ｒａｓ、ｋｉ−ｒａｓ、ｃ−ｆｍｓ、ｂｃｌ−２、Ｌ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ＨＥＲ−２、ボンベシン受容体、エストロゲン受容体、ＧＡＢＡ受容体、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＧＴＰ−結合調節タンパク質、インターロイキン受容体、イオンチャネル受容体、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、リポタンパク質受容体、オピオイド疼痛受容体、サブスタンスＰ受容体、レチノイン酸およびレチノイド受容体、ステロイド受容体、Ｔ細胞受容体、甲状腺ホルモン受容体、ＴＮＦ受容体、組織プラスミノーゲン活性化因子；膜貫通型受容体、カルシウムポンプ、プロトンポンプ、ナトリウム／カルシウム交換輸送体、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、Ｐ１７０、ＬＲＰ、ｃＭＯＡＴ、トランスフェリン、ＡＰＣ、ｂｒｃａ１、ｂｒｃａ２、ＤＣＣ、ＭＣＣ、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ｎｍ２３、ｐ５３およびＲｂからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記分離するステップは、複数のＲＮＰ複合体を分離するステップを含み、
   前記同定するステップは、複数のＲＮＰ複合体に会合した複数のｎｃＲＮＡを同定するステップを含む方法であって、
   （ｃ）前記複数のＲＮＰ複合体に会合した複数のｍＲＮＡを同定するステップであって、これによりｍＲＮＡのサブセットに会合したｎｃＲＮＡのサブセットの固有情報をさらに含む遺伝子発現プロフィールを作製するステップと
   をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記細胞は植物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記細胞は動物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記細胞は細菌細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記細胞は酵母細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記細胞は原生動物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
13. １以上のｍｉｃｒｏＲＮＡのｍＲＮＡ標的を同定および／または確認する方法であって、
    （ａ）生体試料から少なくとも１つのＲＮＰ複合体を分離するステップと、ここで、前記複合体は、ＲＮＰ複合体に会合したｍＲＮＡのサブセットを含み、
    （ｂ）ＲＮＰ複合体に会合したｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットを同定するステップであって、これによりｍｉｃｒｏＲＮＡとｍＲＮＡ標的との間の会合を決定するステップと
    を含む方法。
14. 前記分離するステップは、ＲＮＰ複合体を固相支持体上に捕獲することを含む、請求項１３に記載の方法。
15. １以上の同定されたｍＲＮＡに関して、少なくとも１つの同定されたｍｉＲＮＡの活性をアッセイすることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
16. インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）でｍｉｃｒｏＲＮＡのｍＲＮＡ標的を予測することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
17. ｍＲＮＡのサブセットは、生体試料中の全ｍＲＮＡの７５％未満で示される、請求項１３に記載の方法。
18. ｍＲＮＡのサブセットは、少なくとも２つのｍＲＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
19. ｍｉＲＮＡのサブセットは、生体試料中の全ｍｉＲＮＡの７５％未満で示される、請求項１３に記載の方法。
20. ｍｉＲＮＡのサブセットは、少なくとも２つのｍｉＲＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
21. ｍｉＲＮＡのサブセットおよび／または細胞ｍｉＲＮＡのサブセットは、核酸アレイを用いて同定される、請求項１３に記載の方法。
22. 前記分離するステップは、ｍＲＮＰ複合体を、（ｉ）ｍＲＮＰ複合体の少なくとも１つの成分に特異的に結合する抗体、または（ｉｉ）異所的に発現させたエピトープタグ付きＲＮＡ結合タンパク質もしくはＲＮＡ会合タンパク質に接触させるステップ含む、請求項１３に記載の方法。
23. 前記ＲＮＡ結合タンパク質は、天然のＨｕタンパク質もしくはタグ付きのＨｕタンパク質またはポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）である、請求項１９に記載の方法。
24. 前記同定されたｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットは、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７ｍ ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１６、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、およびｌｅｔ−７ｆからなる群から選択されるｍｉＲＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
25. １以上のｍｉｃｒｏＲＮＡのｍＲＮＡ標的を同定および／または確認する方法であって、
    （ａ）ｍＲＮＰ複合体を含む生体試料を得るステップと、
    （ｂ）ｍＲＮＰ複合体を、（ｉ）ｍＲＮＰ複合体の少なくとも１つの成分に特異的に結合する抗体、または（ｉｉ）異所的に発現させたエピトープタグ付きＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）もしくはＲＮＡ会合タンパク質（ＲＡＰ）に接触させるステップと、
    （ｃ）固相支持体上に抗体、ＲＢＰ、またはＲＡＰを捕獲するステップであって、これにより生体試料から少なくとも１つのＲＮＰ複合体を分離するステップと、
    （ｄ）ＲＮＰ複合体に会合したｍｉｃｒｏＲＮＡのサブセットを同定するステップであって、これによりｍｉｃｒｏＲＮＡとｍＲＮＡ標的との間の会合を決定するステップと
    を含む方法。

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