JP2010268688A - Virus infection system using enterovirus 71 receptor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エンテロウイルス71受容体遺伝子を含む非霊長類由来細胞およびこれらの動物又は細胞を用いた抗ウイルス薬のスクリーニング方法などに関する。 The present invention relates to a non-primate-derived cell containing the enterovirus 71 receptor gene, a method for screening an antiviral agent using these animals or cells, and the like.
エンテロウイルス71は、コクサッキーウイルスA16などと共に、ピコルナウイルス科エンテロウイルス属のA群ヒトエンテロウイルスに分類される（非特許文献８）。エンテロウイルス71やコクサッキーウイルスA16は、ヒトの手足口病の原因ウイルスとして知られている（非特許文献８）。手足口病はそれ程重篤な感染症ではないが、EV71による手足口病の場合においてのみ、稀に重篤な無菌性髄膜炎、脳炎および急性弛緩性麻痺などを引き起こすことがある。近年、神経病原性を示すEV71の局所的な流行が、台湾、マレーシア、シンガポール、日本および中国などの東南アジアや東アジアの国々で報告されている（非特許文献1-3、5、7）。そのためEV71による手足口病の流行時には、迅速にウイルスを分離して解析する必要がある。さらにウイルスの毒力を判定したり、抗ウイルス薬を開発するのに必要な感染実験モデル系を構築する必要がある。しかし、EV71の神経病原性を実験的に再現することは非常に難しく、サルを用いた感染実験でのみ評価可能である。 Enterovirus 71 is classified into group A human enteroviruses belonging to the genus Picornaviridae together with Coxsackievirus A16 (Non-patent Document 8). Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 are known as causative viruses for human hand-foot-and-mouth disease (Non-patent Document 8). Hand-foot-and-mouth disease is not a serious infection, but only in the case of hand-foot-and-mouth disease caused by EV71, it can cause severe aseptic meningitis, encephalitis and acute flaccid paralysis. In recent years, a local epidemic of EV71 showing neuropathogenicity has been reported in Southeast Asia and East Asian countries such as Taiwan, Malaysia, Singapore, Japan, and China (Non-patent Documents 1-3, 5, and 7). Therefore, it is necessary to quickly isolate and analyze the virus during hand-foot-and-mouth disease epidemic caused by EV71. Furthermore, it is necessary to construct an infection experiment model system necessary for judging the virulence of viruses and developing antiviral drugs. However, it is very difficult to experimentally reproduce the neuropathogenicity of EV71, and it can be evaluated only by infection experiments using monkeys.
SCARB2（scavenger receptor class B, member 2）は、LIMPII（Lysosomal Integral Membrane Protein II）として知られており、N末端とC末端の両方を細胞質内領域として持つ膜2回貫通型蛋白質である。SCARB2は、エンドソームやライソゾームの膜の輸送や認識に関与すること(非特許文献6）、また、SCARB2をノックアウトしたマウスでは、尿管の形成不全、難聴および末梢性神経障害が観察されることが報告されている(非特許文献４）。 SCARB2 (scavenger receptor class B, member 2) is known as LIMPII (Lysosomal Integral Membrane Protein II) and is a transmembrane protein having both N-terminus and C-terminus as cytoplasmic domains. SCARB2 is involved in membrane transport and recognition of endosomes and lysosomes (Non-patent Document 6), and ureteral dysplasia, hearing loss and peripheral neuropathy may be observed in mice knocked out of SCARB2 It has been reported (Non-Patent Document 4).
本発明は、エンテロウイルスレセプター71遺伝子を含む非霊長類細胞又は非霊長類動物を提供することを目的とする。 The object of the present invention is to provide a non-primate cell or non-primate animal comprising the enterovirus receptor 71 gene.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、エンテロウイルスレセプターであるＥＶ７１Ｒを非ヒト動物細胞にトランスフェクトすることで、ヒトのウイルスの感染系を非霊長類動物又は細胞において構築することに成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor constructed a human virus infection system in a non-primate animal or cell by transfecting EV71R, an enterovirus receptor, into a non-human animal cell. The present invention has been completed successfully.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物細胞。
（２）エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物。
（３）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物にウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを回収する工程を含む、ウイルスの分離方法。
（４）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物に被検試料を接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを検出する工程を含む、ウイルスの検出方法。
（５）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物に候補物質及びウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物のウイルス感染に関する病態を評価する工程を含む、抗ウイルス薬のスクリーニング方法。
（６）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物にウイルスを接触させることによりウイルスの毒力を試験することを特徴とするウイルス毒力試験方法。
（７）前記（１）に記載の細胞又は（２）に記載の動物を含む、ウイルスの分離用、ウイルスの検出用、抗ウイルス薬のスクリーニング用又はウイルス毒力試験用キット。
That is, the present invention is as follows.
(1) Non-primate animal cells into which a gene encoding enterovirus 71 receptor has been introduced.
(2) A non-primate animal into which a gene encoding enterovirus 71 receptor has been introduced.
(3) A method for separating a virus, comprising a step of bringing the virus into contact with the cell according to (1) or the animal according to (2), and collecting the virus from the cell or animal after the contact.
(4) A method for detecting a virus, comprising a step of contacting a test sample with the cell according to (1) or the animal according to (2) and detecting the virus from the cell or animal after the contact.
(5) An antiviral agent comprising a step of contacting a candidate substance and a virus with the cell according to (1) or the animal according to (2), and evaluating a pathological condition regarding viral infection of the cell or animal after the contact Screening method.
(6) A viral virulence test method comprising testing a viral virulence by contacting a virus with the cell according to (1) or the animal according to (2).
(7) A kit for virus isolation, virus detection, antiviral drug screening, or virus toxicity test, comprising the cell according to (1) or the animal according to (2).
本発明において、非霊長類動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリが挙げられる。また、ウイルスとしてはエンテロウイルス71及び/又はコクサッキーウイルスA16が挙げられる。 In the present invention, examples of non-primate animals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, dogs, cats, and chickens. Examples of viruses include enterovirus 71 and / or coxsackievirus A16.
本発明により、エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物および非霊長類動物細胞が提供される。本発明の細胞及び動物は、ウイルスの分離試験や抗ウイルス薬のスクリーニング、あるいは薬剤の有効性試験等に用いることができる点で極めて有用である。 The present invention provides non-primate animals and non-primate animal cells into which a gene encoding enterovirus 71 receptor has been introduced. The cells and animals of the present invention are extremely useful in that they can be used for virus isolation tests, screening for antiviral drugs, drug efficacy tests, and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、エンテロウイルス71レセプターをコードする遺伝子が導入された非霊長類動物及び非霊長類動物細胞に関する。また本発明は、前記動物又は細胞を利用して、ウイルスを分離する方法、ウイルスを検出する方法、抗ウイルス薬をスクリーニングする方法、及びウイルスの毒力を試験する方法に関する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to non-primate animals and non-primate animal cells into which a gene encoding enterovirus 71 receptor has been introduced. The present invention also relates to a method for isolating viruses using the animals or cells, a method for detecting viruses, a method for screening antiviral drugs, and a method for testing the virulence of viruses.
本発明は、抗ウイルス薬の作製、ウイルスの検出、ウイルスの分離、あるいはウイルスの毒力試験を行うため、当該ウイルスのレセプター分子に着目して完成されたものである。
従来、目的とするヒトのウイルス分離試験をする際にはヒト由来の細胞などが使用されていたが、これらの細胞には他のウイルスも感染するため、ウイルスを分離した後に、目的のウイルスであるかどうかについて、特異的抗体やPCR法などを用いてそのウイルス種の同定を行なう必要がある。
The present invention has been completed by paying attention to a receptor molecule of the virus in order to produce an antiviral drug, detect a virus, isolate a virus, or test a viral virulence.
Conventionally, human-derived cells have been used to perform target human virus isolation tests, but these cells are also infected with other viruses. It is necessary to identify the virus type using a specific antibody or PCR method.
そこで本発明においては、エンテロウイルス71レセプター（SCARB2という）遺伝子を非ヒト由来の細胞又は非ヒト動物で発現させることにより、この細胞又は動物ではエンテロウイルス71とコクサッキーウイルスA16を選択的に検出することが可能となった。非ヒト由来の細胞又は非ヒト動物にエンテロウイルス71レセプター（SCARB2という）遺伝子を導入したため、本来ヒトに感染することができる他のウイルスは、上記細胞及び動物には感染することができない。従って、本発明の細胞及び動物は、ウイルス分離試験や検出を効率よく行なうことができる新たな実験系に使用することができる。 Therefore, in the present invention, by expressing the enterovirus 71 receptor (SCARB2) gene in a non-human cell or non-human animal, it is possible to selectively detect enterovirus 71 and coxsackievirus A16 in this cell or animal. became. Since the enterovirus 71 receptor (SCARB2) gene has been introduced into non-human cells or non-human animals, other viruses that can infect humans cannot infect the cells and animals. Therefore, the cells and animals of the present invention can be used in new experimental systems that can efficiently carry out virus separation tests and detection.
また、本発明者は、レセプター分子の機能をレセプターに対する抗体で阻害することで、ウイルスの感染が阻害されることを示した。レセプターが同定されていない場合にこのような薬剤の開発は困難であることから、本発明は、薬剤の開発に大きく寄与するものである。
さらに、薬剤のスクリーニングには感染モデル動物が必要である。したがって、ヒトSCARB2を発現する遺伝子改変非霊長類トランスジェニック動物を用いて、薬物の有効性試験を効率よく行なうことが可能となる。
このように、本発明においては、SCARB2を細胞あるいは非霊長類動物で発現させることにより、従来存在しなかった新たなウイルス検出系、ウイルス感染モデルとして利用することができる。
In addition, the present inventor has shown that viral infection is inhibited by inhibiting the function of the receptor molecule with an antibody against the receptor. Since it is difficult to develop such a drug when a receptor has not been identified, the present invention greatly contributes to the development of the drug.
Furthermore, infectious model animals are required for drug screening. Therefore, it becomes possible to efficiently perform a drug efficacy test using a genetically modified non-primate transgenic animal expressing human SCARB2.
Thus, in the present invention, SCARB2 can be expressed in cells or non-primate animals and used as a new virus detection system and virus infection model that did not exist in the past.
１．エンテロウイルス71レセプター遺伝子
（１） 遺伝子の同定
エンテロウイルス71（EV71)はヒト由来のRD細胞、サル由来のVero細胞などに感染することができ、これらの細胞がEV71の分離に使用されている。一方でマウスのL929細胞などはウイルス感受性が低く、ほとんど感染することができない。その理由は、ウイルスの感染を効率よく成立させる細胞表面のレセプターがヒトまたはサルの細胞には存在し、それ以外の種においてはその機能を持つ分子がないことに起因すると考えられた。
1. Enterovirus 71 receptor gene (1) Identification of gene Enterovirus 71 (EV71) can infect RD cells derived from humans, Vero cells derived from monkeys, etc., and these cells are used for the separation of EV71. On the other hand, mouse L929 cells and the like have low virus sensitivity and can hardly be infected. The reason for this is thought to be that cell surface receptors that efficiently establish viral infection are present in human or monkey cells, and in other species there are no molecules with that function.
そこで本発明者は、エンテロウイルス感染の種特異性を利用して、ウイルスレセプターを単離することができると考えた。まずマウスL929細胞にヒトRD細胞染色体DNAをトランスフェクションした形質転換細胞株ライブラリーを作製した。各々の細胞にはヒトDNAが一部分だけ挿入されているので、その中にはEV71感受性を獲得した細胞が存在する可能性が高い。また本発明者は、EV71にGFPを挿入して、感染が成立すると感染細胞がGFPの蛍光を発するように操作した組換えEV71を用いて、感受性を獲得した細胞を選抜した。 Therefore, the present inventor considered that the virus receptor can be isolated by utilizing the species specificity of enterovirus infection. First, a transformed cell line library was prepared by transfecting human RD cell chromosomal DNA into mouse L929 cells. Since only a portion of human DNA is inserted into each cell, there is a high possibility that cells that have acquired EV71 sensitivity are present in them. In addition, the present inventor selected cells that acquired sensitivity using recombinant EV71, which was prepared by inserting GFP into EV71 and infecting cells to emit GFP fluorescence when infection was established.
感受性を獲得した細胞株Ltr051細胞から形質転換に直接関わったヒト由来の遺伝子を同定するために、この細胞株とL929細胞からRNAを調製し、Whole Human Genome Microarray kit 4x44K (Agilent社)を用いてLtr051細胞が新たに発現するようになったヒト由来mRNAを選抜した。
候補からSCARB2を選び、そのcDNAを単独でL929細胞で発現したところ、L929細胞はEV71感受性を示した。また本発明者は、SCARB2はウイルス粒子と直接結合すること、両者の結合や細胞への感染は抗SCARB2抗体によって阻止できることを証明した。従ってSCARB2はEV71のレセプターの機能を果たす分子であると結論づけられた。
SCARB2を発現するL929細胞(L-SCARB2細胞)は、EV71の様々な株に感受性を示すほか、コクサッキーウイルスA16にも感受性を示したが、ポリオウイルスやコクサッキーウイルスB、さらに近縁のウイルスであるA群エンテロウイルスに属するCVA2, 3, 4, 5, 6, 8, 12には感受性を示さなかった。これらのことから、この細胞株はEV71, CVA16に選択性が高いウイルス分離が可能であることが明らかになった。
In order to identify human-derived genes directly involved in transformation from the Ltr051 cell line that acquired sensitivity, RNA was prepared from this cell line and L929 cells, and the whole human genome microarray kit 4x44K (Agilent) was used. Human-derived mRNA that was newly expressed in Ltr051 cells was selected.
When SCARB2 was selected from the candidates and its cDNA was expressed alone in L929 cells, L929 cells showed EV71 sensitivity. The inventor has also demonstrated that SCARB2 directly binds to virus particles, and that the binding and infection of cells can be blocked by an anti-SCARB2 antibody. Therefore, it was concluded that SCARB2 is a molecule that functions as a receptor for EV71.
SCARB2-expressing L929 cells (L-SCARB2 cells) were sensitive to various strains of EV71 and also to Coxsackievirus A16, but poliovirus, Coxsackievirus B, and more closely related group A CVA2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 belonging to enterovirus was not sensitive. From these results, it was clarified that this cell line can isolate viruses with high selectivity to EV71 and CVA16.
（２）SCARB2遺伝子
本発明において使用されるエンテロウイルス71レセプター（EV71R）遺伝子は、SCARB2と呼ばれるものであり、公知のデータベースから容易に入手することができる。例えばNCBIのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において「アクセッション番号：NM_005506」として公表されている。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列を有する。本発明においては、配列番号１に示す塩基配列の全長配列、及びコード領域（340〜1776番）の塩基配列のどちらを使用することもできる。
(2) SCARB2 gene The enterovirus 71 receptor (EV71R) gene used in the present invention is called SCARB2, and can be easily obtained from a known database. For example, it is published as “Accession Number: NM_005506” on the NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Such a polynucleotide has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In the present invention, either the full-length sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence of the coding region (340 to 1776) can be used.
さらに、本発明は、上記EV71R又はその変異型をコードする遺伝子を使用することもできる。EV71Rのアミノ酸配列情報は配列番号２である。
「変異型」とは、EV71Rのアミノ酸配列（配列番号２）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、EV71R活性を有するタンパク質、あるいは、EV71Rのアミノ酸配列において少なくとも80％のホモロジーを有し、かつ、EV71R活性を有するタンパク質を意味する。
Furthermore, the present invention can also use a gene encoding the above-mentioned EV71R or a mutant form thereof. The amino acid sequence information of EV71R is SEQ ID NO: 2.
“Mutant” refers to a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of EV71R (SEQ ID NO: 2) and having EV71R activity, or EV71R Means a protein having at least 80% homology in the amino acid sequence and having EV71R activity.
例えば、EV71Rの変異型は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは約95％以上、さらに好ましくは約98％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、EV71R活性を有するアミノ酸配列などがあげられる。 For example, the mutant form of EV71R has an amino acid sequence having about 80% or more, preferably 90% or more, more preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more of homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. And an amino acid sequence having EV71R activity.
ホモロジーは、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列の他、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸に欠失、挿入、置換若しくは付加等の変異、又はこれらの組み合わせ変異が生じたアミノ酸配列であって、かつ、EV71R活性を有するタンパク質のアミノ酸配列が挙げられる。 Homology can be performed using a homology search site using the Internet. Further, in addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, mutation such as deletion, insertion, substitution or addition in one or more (for example, one or several) amino acids, or An amino acid sequence in which these combination mutations have occurred and an amino acid sequence of a protein having EV71R activity can be mentioned.
例えば、
(i) 配列番号２に示されるアミノ酸配列の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号２に示されるアミノ酸配列の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
ここで、「EV71R活性」とは、エンテロウイルス７１の細胞への感染の初期過程、すなわちウイルス粒子の細胞表面への吸着、ウイルス粒子もしくはウイルスゲノムRNAの細胞内への侵入、またはウイルス粒子からウイルスゲノムRNAの放出を引き起こす活性を意味する。
For example,
(i) an amino acid sequence in which 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have been deleted;
(ii) an amino acid sequence obtained by adding 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(iii) an amino acid sequence in which 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(iv) an amino acid sequence in which 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids;
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
Here, “EV71R activity” refers to the initial process of infection of enterovirus 71 into cells, ie, adsorption of virus particles to the cell surface, entry of virus particles or viral genome RNA into cells, or virus particles to virus genome. It means the activity that causes the release of RNA.
本発明において使用可能な変異型DNAとして、配列番号１に示される塩基配列若しくはそのコード領域の塩基配列、又はこれらの塩基配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、EV71R活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 As a mutant DNA that can be used in the present invention, it hybridizes under stringent conditions to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence of its coding region, or a sequence complementary to these base sequences, And a polynucleotide encoding a protein having EV71R activity.
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、DNA濃度、DNAの長さ、反応時間等の条件を適宜設定することができる。 In the hybridization conditions of the present invention, stringent conditions include, for example, “2 × SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.”, “2 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “1 × SSC, 0.1% For example, “2 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”, “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “0.2 × SSC, 0.1% SDS, The conditions such as “65 ° C.” can be mentioned. A person skilled in the art can appropriately set conditions such as DNA concentration, length of DNA, reaction time, etc. in addition to such conditions as salt concentration and temperature of the buffer.
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。 For the detailed procedure of the hybridization method, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) and the like can be referred to.
ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列若しくはそのコード領域の塩基配列又はこれらの塩基配列に相補的な塩基配列に対して、少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、さらに好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには99％以上)の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。 The hybridizing polynucleotide is at least 50% or more, preferably 70%, more preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence of the coding region, or the base sequence complementary to these base sequences. Is a polynucleotide comprising a base sequence having an identity of 80%, more preferably 90% or more (for example, 95% or more, further 99% or more).
変異型EV71R遺伝子は、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。 Mutant EV71R gene by known techniques such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, can be prepared using the mutagenesis kit utilizing site-directed mutagenesis, as is the kit, for example, QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.), etc. Preferably mentioned.
２．EV71R遺伝子の細胞又は動物への導入
（１）細胞への導入
EV71R遺伝子を細胞に導入するには、例えばヒト染色体DNAをトランスフェクションする手法が採用される。ヒト染色体DNAをトランスフェクションする手法としては、特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを使用することができる。
ヒト遺伝子を発現するようになった細胞の中には、EV71Rを発現しているものがある。そこで、EV71Rを発現している細胞を、ウイルス感受性を指標にして選択し、細胞をクローニングする。クローニング後は、ヒトDNA 特異的反復配列などを指標にしてDNAが組み込まれたか否かを確認する。
2. Introduction of EV71R gene into cells or animals (1) Introduction into cells
In order to introduce the EV71R gene into cells, for example, a technique of transfecting human chromosomal DNA is employed. The method for transfection of human chromosomal DNA is not particularly limited, and calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used.
Some cells that have expressed human genes are expressing EV71R. Therefore, cells expressing EV71R are selected using virus sensitivity as an indicator, and the cells are cloned. After cloning, whether or not DNA has been incorporated is confirmed using human DNA-specific repetitive sequences as an index.
一旦遺伝子が同定されると、その後は、EV71R遺伝子を細胞に導入する方法として、EV71R遺伝子を含むDNAをトランスフェクションする手法、EV71R遺伝子を発現するウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルス等）を用いる方法等が採用される。DNAをトランスフェクションする手法としては、特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを使用することができる。EV71Rを細胞で発現させる手法は、特に限られた方法ではない。
遺伝子導入の宿主細胞としては、非霊長類由来の細胞を挙げることができる。例えば、げっ歯類細胞、鳥類細胞などを例示することができる。
げっ歯類細胞は、L929、NIH3T3などのマウス由来細胞、PC-12、NRKなどのラット由来細胞、BHK21、CHOなどのハムスター由来細胞などを使用することができ、L929細胞が好ましい。
Once the gene has been identified, then, as a method of introducing the EV71R gene into cells, a method of transfecting DNA containing the EV71R gene, or a method using a viral vector (such as an adenovirus or retrovirus) that expresses the EV71R gene Etc. are adopted. The technique for transfecting DNA is not particularly limited, and calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used. The technique for expressing EV71R in cells is not particularly limited.
Examples of host cells for gene transfer include cells derived from non-primates. For example, rodent cells, avian cells and the like can be exemplified.
As rodent cells, mouse-derived cells such as L929 and NIH3T3, rat-derived cells such as PC-12 and NRK, hamster-derived cells such as BHK21 and CHO, and the like, L929 cells are preferred.
（２）動物への導入
以下に、本発明の非ヒト非霊長類トランスジェニック動物の作出方法について説明する。これらの非ヒト動物は、ヒト由来のEV71R遺伝子を前記動物に導入することにより、ウイルスに感受性を示すトランスジェニック動物となる。非霊長類動物としてはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリが挙げられる。
(2) Introduction into animals A method for producing a non-human non-primate transgenic animal of the present invention will be described below. These non-human animals become transgenic animals that are susceptible to viruses by introducing a human-derived EV71R gene into the animals. Non-primate animals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, dogs, cats or chickens.
本発明に使用するマウスとしては、いずれの系統のマウスを用いてもよいが、BALB/c系、129系、ICR系、C57BL/10系等がある。トランスジェニックマウスは、公知の作出方法、すなわち受精卵前核へのDNAマイクロインジェクションによる方法、胚性幹細胞（ES細胞）にDNAを導入した後キメラを作製する方法、及びレトロウイルスベクターを初期発生胚に感染させて導入する方法のいずれの方法を用いることができる。これらの方法については、例えば、「Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1994) Hogan B et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor」、「マウス ラボマニュアル 第２版−ポストゲノム時代の実験法−（第271〜296頁）, 発行日：2003年5月26日（初版）, 編集：東京都臨床医学総合研究所 実験動物研究部門, 発行者：平野皓正, 発行所：シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社」、「発生工学実験マニュアル (1987) 勝木元也（編）講談社サイエンティフィク, 東京」、「マウス胚の操作マニュアル 第２版 (1997) Hogan B et al.（著）, 山内一也ら（訳）近代出版, 東京」、「Gordon, J. W. (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, P. M., and DePamphilis, M. L., Eds.), Academic Press, San Diego」等に記載されており、これらの記載を適宜参照してトランスジェニックマウスを作出することができる。 As a mouse used in the present invention, any strain of mouse may be used, including BALB / c strain, 129 strain, ICR strain, C57BL / 10 strain and the like. Transgenic mice can be produced by a known production method, that is, a method by DNA microinjection into the pronucleus of a fertilized egg, a method of producing a chimera after introducing DNA into embryonic stem cells (ES cells), and a retroviral vector as an early embryo. Any method of infecting and introducing can be used. Regarding these methods, for example, “Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1994) Hogan B et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor”, “Mouse Lab Manual Second Edition-Post” Experimental methods in the genome era (pp.271-296), Publication date: May 26, 2003 (first edition), Editing: Laboratory for Animal Research, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Publisher: Masamasa Hirano, Publisher: Springer Fairlark Tokyo Co., Ltd., Developmental Engineering Experiment Manual (1987) Motoya Katsuki (ed.) Kodansha Scientific, Tokyo, Operation Manual for Mouse Embryo 2nd Edition (1997) Hogan B et al. ), Kazuya Yamauchi et al. (Translation) Modern Publishing, Tokyo, “Gordon, JW (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, PM, and DePamphilis, ML, Eds.), Academic Press, San Diego” And refer to these descriptions as needed. It is possible to produce a Kkumausu.
ここでは、非霊長類動物としてマウスを用いた場合を例に挙げて説明したが、他の非霊長類動物を用いる場合についても同様の方法を適用することができる。例えば、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ及びネコは、ウイルス感受性トランスジェニックマウスを樹立した方法と同じ手法にて、クローニングされたヒトEV71R遺伝子を各種動物の受精卵の雌性あるいは雄性前核に微量注入した後、偽妊娠させた仮親の卵管にもどし、生育、出産した動物について、ヒトEV71R遺伝子が導入されている動物を選別する方法によって得ることができる。ラットの場合はＷ（Wister）系、Spraque-Dawky系、F344系等が、ハムスターの場合はNSJ系等が、モルモットの場合はHartley等を使用することができる。 Here, the case of using a mouse as a non-primate animal has been described as an example, but the same method can be applied to the case of using another non-primate animal. For example, rats, guinea pigs, hamsters, dogs and cats were microinjected into the female or male pronucleus of fertilized eggs of various animals using the same method as that used to establish virus-sensitive transgenic mice. Thereafter, it can be obtained by returning to the oviduct of a foster mother who has been pseudo-pregnant and growing and giving birth by a method of selecting an animal into which the human EV71R gene has been introduced. For rats, W (Wister), Spraque-Dawky, F344, etc., for hamsters, NSJ, etc., for guinea pigs, Hartley, etc. can be used.
３．ウイルスの分離方法
本発明はウイルスの分離方法を提供し、本発明の上記細胞又は動物にウイルスを接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを回収する工程を含む。
前記の通り、一般にヒトのウイルス分離試験をする際にはRD細胞などヒト由来の細胞などを使用している。しかし、これらの細胞にはヒトに感染することが出来る多くのウイルスが感染するため、ウイルスを分離したのちに特異的抗体やPCR法などを用いてそのウイルス種の同定を行なう必要がある。これに対し、例えばL929細胞はマウスに由来する細胞であるため、本来ヒトに感染する多くのウイルスは感染することができない。
そこで、エンテロウイルス71レセプターであるSCARB2を例えばマウス細胞で発現させると、この細胞ではエンテロウイルス71及び/又はコクサッキーウイルスA16を選択的に検出することができる。この細胞はウイルス分離試験を効率よく行なうことができる新たな実験系に使用することができる。
本発明において、SCARB2が導入された細胞にウイルスを接触させると、これらのウイルスは細胞内で増殖する。この増殖したウイルスを回収することにより、ウイルスを分離することができる。
3. Method for Separating Virus The present invention provides a method for separating a virus, and includes the steps of bringing a virus into contact with the cell or animal of the present invention and recovering the virus from the cell or animal after the contact.
As described above, human-derived cells such as RD cells are generally used for human virus isolation tests. However, since these cells are infected with many viruses capable of infecting humans, it is necessary to identify the virus species using a specific antibody or PCR method after the virus is isolated. On the other hand, for example, since L929 cells are cells derived from mice, many viruses that originally infect humans cannot be infected.
Thus, when SCARB2, which is an enterovirus 71 receptor, is expressed in, for example, mouse cells, enterovirus 71 and / or coxsackievirus A16 can be selectively detected in these cells. This cell can be used in a new experimental system that can efficiently carry out a virus separation test.
In the present invention, when viruses are brought into contact with cells into which SCARB2 has been introduced, these viruses grow in the cells. By collecting the propagated virus, the virus can be isolated.
ここで、本明細書において「接触」とは、本発明の細胞又は動物が、ウイルス、被検物質又は被検試料と接触し得るように処理することを意味し、接種、投与、培養、混合又は感染等の広い意味で使用することができる。例えば、細胞を用いるときは細胞とウイルスと被検物質又は被検試料とを混合すること、細胞をウイルス及び被検物質又は被検試料とともに培養することなどが挙げられる。また、動物を用いるときは、動物体内にウイルス、被検物質又は被検試料を注射すること、経口投与すること、経皮投与することなどが挙げられる。
分離の対象となるウイルス（上記細胞に接触させるウイルス）としては、エンテロウイルス71及びコクサッキーウイルスA16のいずれか一方又は両者が挙げられる。
接触後は細胞を適当な期間培養する。例えば、SCARB2が導入された細胞に上記ウイルスを含むと思われるサンプルを感染させ、１〜４日程度培養する。培養後、培養細胞を凍結融解することによりウイルスを回収する。
SCARB2遺伝子が導入されたトランスジェニック動物からウイルスを分離する場合は、細胞の場合と同様にサンプルをトランスジェニック動物に接触させ、１〜14日程度の後にトランスジェニック動物の各種臓器からウイルスを回収する。
As used herein, the term “contact” means that the cell or animal of the present invention is treated so as to be able to come into contact with a virus, a test substance or a test sample. Inoculation, administration, culture, mixing Or it can be used in a broad sense such as infection. For example, when cells are used, the cells, virus, test substance or test sample can be mixed, and the cells can be cultured together with the virus and test substance or test sample. In addition, when an animal is used, injection of virus, test substance or test sample into the animal body, oral administration, transdermal administration, and the like can be mentioned.
Examples of the virus to be separated (the virus to be brought into contact with the cells) include one or both of enterovirus 71 and coxsackievirus A16.
After contact, the cells are cultured for an appropriate period. For example, a cell that has been introduced with SCARB2 is infected with a sample that seems to contain the virus and cultured for about 1 to 4 days. After culture, the virus is recovered by freezing and thawing the cultured cells.
When isolating a virus from a transgenic animal into which the SCARB2 gene has been introduced, the sample is brought into contact with the transgenic animal as in the case of cells, and the virus is collected from various organs of the transgenic animal after about 1 to 14 days. .
４．検出方法
前記の通り、SCARB2が導入された細胞又は動物にウイルスを接触させると、これらのウイルスは細胞内又は動物内で増殖する。したがって、この特徴を利用してウイルスを検出し、被検試料を検査することが可能である。すなわち、本発明の検出方法は、前記細胞又は動物に被検試料を接触させ、当該接触後の細胞又は動物からウイルスを検出する工程を含む。
例えば、被検試料を本発明の細胞又は動物に接触させる。接触後の本発明の細胞又は動物からウイルスが検出されると、被検試料中にはウイルスが含まれていたものと判断することができる。
4). Detection Method As described above, when a virus is brought into contact with a cell or animal into which SCARB2 has been introduced, these viruses grow in the cell or animal. Therefore, it is possible to detect a virus using this feature and to inspect a test sample. That is, the detection method of the present invention includes a step of contacting a test sample with the cell or animal and detecting a virus from the cell or animal after the contact.
For example, a test sample is brought into contact with the cell or animal of the present invention. When a virus is detected from the cell or animal of the present invention after contact, it can be determined that the virus was contained in the test sample.
上記ウイルスの検出は、上記ウイルスの分離の項で述べた方法を適用することができる。
検出されたウイルスが目的のウイルス（エンテロウイルス71及びコクサッキーウイルスA16）であることの確認は、特異的抗体を利用したウイルス種や株の識別、ウイルスのゲノムRNAを標的としたPCR等により増幅することで行うことができる。また、ウイルスに対する特異的抗体を利用した間接蛍光抗体法を利用することにより行うことも可能である。
For the detection of the virus, the method described in the section of virus isolation can be applied.
Confirmation that the detected virus is the target virus (Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16) can be achieved by identifying the virus species and strains using specific antibodies, and amplifying them by PCR targeting the genomic RNA of the virus. It can be carried out. It is also possible to use an indirect fluorescent antibody method using a specific antibody against a virus.
５．スクリーニング方法
本発明は、前記細胞又はトランスジェニック動物に候補物質及びウイルスを接触させ、当該接触後の前記細胞又は動物のウイルス感染に関する病態を評価する工程を含む、抗ウイルス薬をスクリーニングする方法である。また、本発明は、前記細胞に、ウイルスの存在下で候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性又は生存状況を測定し、得られる測定結果を指標として抗ウイルス薬をスクリーニングする方法である。
本発明に使用するウイルスとしては、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスA16などが挙げられる。
5). Screening method The present invention is a method for screening an antiviral drug, comprising the step of contacting the cell or transgenic animal with a candidate substance and a virus, and evaluating a pathological condition relating to viral infection of the cell or animal after the contact. . In addition, the present invention is a method of screening an antiviral drug using the obtained measurement result as an index by contacting the cell with a candidate substance in the presence of a virus to measure the cell activity or survival status of the cell.
Examples of viruses used in the present invention include enterovirus 71 and coxsackievirus A16.
本明細書において「候補物質」とは、ウイルス感染、ウイルスによる病態発現を変化させることのできる任意の分子である。例えば、天然又は合成の低分子化合物ライブラリー由来の化合物、遺伝子ライブラリーの発現産物（ペプチド、タンパク質等）、天然又は合成のオリゴ核酸、天然又は合成のペプチドライブラリー由来のペプチド、抗体、細菌由来の物質（細菌から代謝により放出される物質等）、微生物、植物細胞抽出液、動物細胞抽出液、培養液（微生物、植物細胞、動物細胞等の培養物）由来の化合物、土壌中の化合物、ファージディスプレイライブラリー等に含まれる化合物などが挙げられる。化合物は、従来の化学的手段、物理的手段及び／又は生化学的手段により改変したものであってもよく、たとえばアルキル化、エステル化、アミド化などの直接的化学修飾又はランダムな化学修飾に付して構造的類似体に改変させることができる。 In the present specification, the “candidate substance” is any molecule that can change viral infection and expression of a disease state caused by a virus. For example, compounds derived from natural or synthetic low molecular compound libraries, gene library expression products (peptides, proteins, etc.), natural or synthetic oligonucleic acids, peptides derived from natural or synthetic peptide libraries, antibodies, bacteria Substances (substances released by metabolism from bacteria, etc.), microorganisms, plant cell extracts, animal cell extracts, compounds derived from cultures (cultures of microorganisms, plant cells, animal cells, etc.), compounds in soil, Examples include compounds contained in phage display libraries and the like. The compounds may be modified by conventional chemical, physical and / or biochemical means such as direct chemical modification such as alkylation, esterification, amidation or random chemical modification. Can be modified to structural analogs.
さらに、候補化合物は、ファーマコフォア検索、又はコンピューターを用いた構造比較プログラムにより同定される化合物であってもよい。本発明において、ファーマコフォア検索、コンピューターを用いた構造比較プログラムなどにより同定される化合物を用いる場合は、EV71とEV71Rとの結合部位の構造解析の結果に基づき、これらタンパク質間の相互作用を阻害する化合物の候補をIn silicoにおいて選別することができる。 Further, the candidate compound may be a compound identified by a pharmacophore search or a structure comparison program using a computer. In the present invention, when a compound identified by a pharmacophore search, a computer-based structure comparison program, or the like is used, the interaction between these proteins is inhibited based on the result of structural analysis of the binding site between EV71 and EV71R. Candidate compound candidates can be screened in silico.
これら化合物は新規な化合物であっても公知の化合物であってもよく、また塩を形成していてもよい。「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、前記化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、たとえば好ましくはハロゲン化水素酸塩（たとえばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（たとえば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（たとえば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（たとえばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（たとえばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（たとえばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。 These compounds may be novel compounds or known compounds, and may form a salt. The “salt” refers to a pharmaceutically acceptable salt and is not particularly limited as long as it forms a pharmaceutically acceptable salt with the compound. Specifically, for example, preferably a hydrohalide (eg, hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, etc.), an inorganic acid salt (eg, sulfate, nitrate, perchlorate) Acid salt, phosphate, carbonate, bicarbonate, etc.), organic carboxylate (eg acetate, oxalate, maleate, tartrate, fumarate, citrate, etc.), organic sulfonate (Eg methane sulfonate, trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, benzene sulfonate, toluene sulfonate, camphor sulfonate, etc.), amino acid salts (eg aspartate, glutamate, etc.), quaternary Amine salt, alkali metal salt (eg lithium salt, sodium salt, potassium salt etc.), alkaline earth metal salt (eg magnesium salt, calcium salt) And the like) and the like.
前記細胞又はトランスジェニック動物に候補物質及びウイルスを接触させる時期は、１回の実験スケジュール内において候補物質とウイルスを動物又は細胞に接触させることができれば同時であっても異なる時期であってもよい。例えば候補物質を動物又は細胞に接種した後にウイルスを接種してもよく、その逆の順で接種することもできる。 The time when the candidate substance and the virus are brought into contact with the cell or the transgenic animal may be at the same time or different times as long as the candidate substance and the virus can be brought into contact with the animal or cell within one experiment schedule. . For example, the candidate substance may be inoculated into an animal or cell and then inoculated with the virus, or vice versa.
本明細書において、「病態を評価する」とは、候補物質を接種した後における本発明の細胞又はトランスジェニック非霊長類動物のウイルス性疾患に関する病態の表現型を解析することを意味し、候補物質の投与前後の細胞又はトランスジェニック非霊長類動物におけるウイルス性疾患に関する病態を比較検討すること、あるいは、候補物質を投与した被験動物又は細胞と投与しない対照動物又は細胞との比較検討を行うことのいずれをも意味するものである。 In the present specification, “evaluating a disease state” means analyzing a phenotype of a disease state relating to a viral disease of a cell of the present invention or a transgenic non-primate animal after inoculation with a candidate substance, Comparing pathological conditions related to viral diseases in cells before and after administration of the substance or transgenic non-primate animals, or comparing test animals or cells to which the candidate substance is administered and control animals or cells to which the substance is not administered Either of these is meant.
「ウイルス性疾患に関する病態」としては、例えば、細胞を用いたときは、感染細胞の活性、感染細胞の生存状況、感染細胞の形態などが挙げられる。また、動物を用いたときは、手足の麻痺、神経障害、生死、生化学検査値の変化などが挙げられる。
上記試験の結果、被検化合物を用いたときの解析結果（病態）が、対照と比較して改善又は治癒したときは、被検化合物は抗ウイルス薬として選択することができる。
Examples of the “pathology relating to viral diseases” include, for example, the activity of infected cells, the survival status of infected cells, and the form of infected cells when cells are used. When animals are used, paralysis of limbs, neuropathy, life and death, changes in biochemical test values, and the like can be mentioned.
As a result of the above test, when the analysis result (pathological condition) when the test compound is used is improved or cured as compared with the control, the test compound can be selected as an antiviral agent.
６．ウイルス毒力試験方法
本発明は、前記細胞又は動物にウイルスを接触させることによりウイルスの毒力を試験することを特徴とするウイルス毒力試験方法を提供する。
本発明のウイルス毒力試験に使用するための非霊長類動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ又はニワトリなどが挙げられる。
また、毒力試験に使用される細胞としては、上記非霊長類動物由来の細胞を用いることができる。
本発明に使用するウイルスとしては、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスA１６などが挙げられる。
本発明に使用するウイルス量は、ウイルス株の感染価を指標として使用される。感染価は、例えば「TCID50（tissue culture infective dose）」又は「PFU（Plaque forming unit）」で表される。
本発明において感染価とは、培養細胞にウイルスを接種した時に、その感染率50％を与えるようなウイルスの量、あるいは１つの感染性ウイルス粒子から生じるプラック数から算定するウイルスの量を単位として表現する。
例えば、「106TCID50」と記載した場合は、培養細胞にウイルスを接種した時に、その感染率50％を与えるウイルスの量を１としたとき、その106倍のウイルス量を有することを意味する。TCID50の測定は、Reed-Muench法やKarber法等で行うことができる。
接種量（投与量）としては、１μｌ〜５ｍｌが好ましく、マウスでは１〜500μｌを通常の接種量とする。
6). The present invention provides a viral virulence test method characterized by testing the virulence of a virus by bringing the cell or animal into contact with the virus.
Non-primate animals for use in the viral virulence test of the present invention include mice, rats, guinea pigs, hamsters, dogs, cats or chickens.
Moreover, as a cell used for a toxic test, the cell derived from the said non-primate animal can be used.
Examples of viruses used in the present invention include enterovirus 71 and coxsackievirus A16.
The amount of virus used in the present invention is used with the infectivity titer of the virus strain as an index. The infectious titer is represented by, for example, “TCID 50 (tissue culture infective dose)” or “PFU (Plaque forming unit)”.
In the present invention, the infectious titer is expressed in units of the amount of virus that gives an infection rate of 50% when inoculated with cultured cells, or the amount of virus calculated from the number of plaques generated from one infectious virus particle. Express.
For example, when “10 6 TCID 50 ” is described, when the amount of virus giving an infection rate of 50% is 1 when the cultured cells are inoculated with virus, the virus amount is 10 6 times that amount. means. TCID 50 can be measured by the Reed-Muench method, the Karber method, or the like.
The inoculum (dose) is preferably 1 μl to 5 ml, and 1 to 500 μl is the normal inoculum for mice.
ウイルス接種後、一定期間臨床観察を行う。観察期間は１〜３０日、好ましくは２１日間とし、臨床症状を指標としたLD50（50％のトランスジェニック動物を死亡させるウイルス量）、又は手、足、口、全身の臓器等の病理検査により、ウイルス毒力の数量化を行う。但し、観察期間は上記期間に限定されるものではなく、観察目的に応じて適宜変更することができる。
臨床観察の項目としては、活動性、毛並み、体重、体温等が挙げられる。病理検査をするには、薄切切片をつくり、HE染色、KB染色等による病理組織標本を作製し、各種顕微鏡で炎症像、細胞死、ウイルス抗原等を指標としてウイルス毒力を観察する。
細胞を毒力試験に使用する場合は、感染細胞の生存状況、感染細胞の活性、感染細胞の形態などを指標とすることができる。
Clinical observation is performed for a certain period after the virus inoculation. Observation period is 1 to 30 days, preferably 21 days, LD 50 (amount of virus that kills 50% of transgenic animals) using clinical symptoms as an index, or pathological examination of organs of hands, feet, mouth, whole body, etc. Quantify viral virulence. However, the observation period is not limited to the above period, and can be appropriately changed according to the observation purpose.
The items of clinical observation include activity, fur, weight, body temperature and the like. To conduct a pathological examination, a sliced slice is prepared, a histopathological specimen is prepared by HE staining, KB staining, etc., and the viral virulence is observed with various microscopes using inflammatory images, cell death, viral antigens and the like as indicators.
When cells are used for a toxic test, the status of infected cells, the activity of infected cells, the form of infected cells, and the like can be used as indicators.
７．キット
本発明のキットは、本発明の細胞及び動物を含むものであり、上記ウイルスの分離方法、検査方法、スクリーニング方法及びウイルス毒力試験方法のために使用することができる。
本発明のキットは上記細胞及び/又は動物を含むが、その他に、検出に必要なプライマー、制限酵素、標識物質などを含めることができる。標識物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等が挙げられる。また、本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の方法を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液などを含めることができる。さらに、本発明のキットには、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、注射器、洗浄剤、実験操作マニュアル（説明書）等を含めることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
7). Kit The kit of the present invention comprises the cell and animal of the present invention, and can be used for the above-mentioned virus isolation method, test method, screening method and virus virulence test method.
The kit of the present invention includes the above-described cells and / or animals, but can also include primers, restriction enzymes, labeling substances, etc. necessary for detection. Examples of the labeling substance include enzymes, radioisotopes, fluorescent compounds, and chemiluminescent compounds. In addition to the above components, the kit of the present invention includes other reagents for carrying out the method of the present invention, such as an enzyme substrate (chromogenic substrate, etc.), an enzyme substrate when the label is an enzyme label. A lysis solution, an enzyme reaction stop solution, and the like can be included. Furthermore, the kit of the present invention may include various buffers, sterilized water, various cell culture containers, syringes, cleaning agents, laboratory operation manuals (instructions), and the like.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
＜材料＞
ヒトのSCARB2は、pCAGGS-PUR（Hatakeyama, S. et. al., 2005. J Clin Microbiol 43:4139-46.）にcDNA（No. NM_005506）をクローニングして発現させた。
実験に用いたEV71のBrCr株、SK-EV006株、Nagoya株およびIsehara株はそれぞれEV71のGenogroup A、B、BおよびCに分類される。
CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA10、CVA12、CVA14およびCVA16は、それぞれ代表的な株であるFreetwood株、Olson株、JR株、Swartz株、Parker株、Donovan株、Kowalik株、Texas12株、G14株およびG10株を用いた。
細胞への感染が成立したことのレポーター（細胞内でウイルスの転写・複製が開始したことに依存）としてGFPを組み込んだ組み換えEV71ウイルス（EV71-GFP）は、EV71（SK-EV-006株）ゲノムの5’-NTRとVP4の間にGFPのシークエンスをインフレームで挿入して作出した（pSVA-EV71-GFP）。
Ltr051細胞およびLtr246細胞は、L929細胞にRD細胞のゲノムDNAをトランスフェクトした細胞群の中から、上記３のEV71-GFPに感受性に変化した細胞をクローニングすることによりそれぞれ独立して得られた。
L-SCAEB2細胞は、L929細胞に上記１のプラスミドをトランスフェクトし、プラスミドが導入されSCARB2を安定発現する細胞をクローニングして得られた。
<Material>
Human SCARB2 was expressed by cloning cDNA (No. NM_005506) in pCAGGS-PUR (Hatakeyama, S. et. Al., 2005. J Clin Microbiol 43: 4139-46.).
EV71 BrCr strain, SK-EV006 strain, Nagoya strain and Isehara strain used in the experiment are classified into Genogroup A, B, B and C of EV71, respectively.
CVA2, CVA3, CVA4, CVA5, CVA6, CVA7, CVA8, CVA10, CVA12, CVA14 and CVA16 are representative strains Freetwood, Olson, JR, Swartz, Parker, Donovan, Kowalik Texas12 strain, G14 strain and G10 strain were used.
EV71 (SK-EV-006 strain) is a recombinant EV71 virus (EV71-GFP) that incorporates GFP as a reporter of cell infection (depending on the start of viral transcription and replication in the cell). A GFP sequence was inserted in-frame between 5′-NTR and VP4 of the genome (pSVA-EV71-GFP).
Ltr051 cells and Ltr246 cells were obtained independently by cloning the cells changed in sensitivity to EV71-GFP in the above 3 from a group of cells in which L929 cells were transfected with genomic DNA of RD cells.
L-SCAEB2 cells were obtained by transfecting L929 cells with the above plasmid 1 and cloning the cells into which the plasmid was introduced and stably expressing SCARB2.
＜方法＞
Ltr051細胞からSCARB2を同定する方法には、Human Microarray（Agillent）を用いた。これにより、マウスのL9292細胞へ持ち込まれたヒトの遺伝子を効率よく、また網羅的に検出することを目的とした。
ウイルス力価は、Vero細胞を用いて50%細胞培養感染量 TCID50として求めた（Reed, L. J., and H. Muench. 1938. Am. J. Hyg. 27:493-499.）。
抗原の発現確認は間接蛍光抗体法で行っており、1次抗体としてSCARB2に対する抗体（R&DSystemsから購入）を、2次抗体としてAlexa488標識抗体を用いた。
<Method>
As a method for identifying SCARB2 from Ltr051 cells, Human Microarray (Agillent) was used. Thus, an object was to efficiently and comprehensively detect human genes brought into mouse L9292 cells.
Viral titer was determined as 50% cell culture infectious dose TCID50 using Vero cells (Reed, LJ, and H. Muench. 1938. Am. J. Hyg. 27: 493-499.).
Antigen expression was confirmed by the indirect fluorescent antibody method. An antibody against SCARB2 (purchased from R & DSystems) was used as the primary antibody, and Alexa488-labeled antibody was used as the secondary antibody.
EV71粒子とSCARB2分子が直接結合しているかを確認するためにPull-Down Assayを行った。0.1〜10μgのSCARB2/Fc（SCARB2分子の細胞外ドメイン部分とヒトのIgGのFc部分を融合させたもの。R&DSystemsから購入）もしくは10μg のControl/Fc（R&DSystemsから購入）とProtein G-sepharose（SIGMA）を混和し、4°Cで1時間感作させた。その後、8.55×106TCID50のEV71（SK-EV006株）を加え、さらに2時間反応させた。その後、感作させたビーズを培地で3回洗浄し、SDS-PAGE用のサンプルバッファーおよび10mMのDTTを加え、95°Cで5分間加熱した。この上清をサンプルとして、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットでEV71の粒子を形成する主要な蛋白質であるVP1の検出を行った。
Pull-Down AssayにおいてEV71とSCARB2の結合を阻害する実験では、2μgのSCARB2/FcとProtein G-sepharoseの感作の後に、1〜25μgの抗SCARB2抗体もしくは25μgのコントロール抗体を加え、4°Cで1時間反応させた。そして、8.55×106TCID50のEV71（SK-EV006株）を加え、さらに2時間反応させ、以下は上記と同様な操作を行った。
Pull-Down Assay was performed to confirm whether EV71 particles and SCARB2 molecules were directly bound. 0.1-10 μg SCARB2 / Fc (fused from the extracellular domain part of SCARB2 molecule and Fc part of human IgG; purchased from R & DSystems) or 10 μg Control / Fc (purchased from R & DSystems) and Protein G-sepharose (SIGMA ) And sensitized for 1 hour at 4 ° C. Thereafter, EV71 (SK-EV006 strain) with 8.55 × 10 6 TCID50 was added, and the mixture was further reacted for 2 hours. Thereafter, the sensitized beads were washed with a medium three times, a sample buffer for SDS-PAGE and 10 mM DTT were added, and the mixture was heated at 95 ° C. for 5 minutes. Using this supernatant as a sample, VP1, which is a major protein forming EV71 particles, was detected by SDS-PAGE and Western blotting.
For experiments that inhibit the binding of EV71 and SCARB2 in the pull-down assay, add 1-25 μg of anti-SCARB2 antibody or 25 μg of control antibody after sensitization with 2 μg of SCARB2 / Fc and Protein G-sepharose at 4 ° C. For 1 hour. Then, 8.55 × 10 6 TCID50 EV71 (SK-EV006 strain) was added, and the reaction was further continued for 2 hours.
＜感染阻害実験＞
抗SCARB2抗体による感染阻害
50μg/mlの抗SCARB2抗体もしくはコントロール抗体を含んだ培地で37°Cで30分処理したRD細胞にEV71-GFPを感染させ、18時間の培養後、GFP陽性細胞数を感染効率の指標として数えた。EV71-GFPは未処理の細胞において、GFP陽性細胞が100個前後になるように調整して用いた。
SCARB2/Fcによる競合的感染阻害
12μg /mlのSCARB2/FcもしくはBSAとEV71-GFPを37°Cで1時間反応させた後に、RD細胞に感染させ、18時間の培養後、GFP陽性細胞数を感染効率の指標として数えた。EV71-GFPは未処理での感染時に約100個の細胞をGFP陽性にするような濃度に調節した。
<Infection inhibition experiment>
Inhibition of infection by anti-SCARB2 antibody
Infect RD cells treated with 50 μg / ml anti-SCARB2 antibody or control antibody for 30 minutes at 37 ° C with EV71-GFP. After 18 hours of incubation, count the number of GFP positive cells as an indicator of infection efficiency. It was. EV71-GFP was used after adjusting so that about 100 GFP-positive cells were obtained in untreated cells.
Competitive infection inhibition by SCARB2 / Fc
After reacting 12 μg / ml SCARB2 / Fc or BSA and EV71-GFP for 1 hour at 37 ° C., the cells were infected with RD cells, and after culturing for 18 hours, the number of GFP positive cells was counted as an index of infection efficiency. EV71-GFP was adjusted to a concentration that made about 100 cells positive for GFP upon untreated infection.
＜結果＞
結果を図１〜３に示す。
図１
Ltr051細胞およびLtr246細胞におけるEV71（SK-EV006株）の増殖曲線を、高感受性であるRD細胞および非感受性であるL929細胞での増殖曲線と比較した。すると、Ltr051細胞でのEV71の増殖は、RD細胞とほぼ同程度であったのに対し、Ltr246細胞での増殖はL929細胞より明らかに上昇しているものの、RD細胞より劣っていた。
<Result>
The results are shown in FIGS.
FIG.
The growth curves of EV71 (SK-EV006 strain) in Ltr051 and Ltr246 cells were compared with those in highly sensitive RD cells and insensitive L929 cells. Then, the growth of EV71 in Ltr051 cells was almost the same as that of RD cells, while the growth in Ltr246 cells was clearly higher than that of L929 cells, but was inferior to that of RD cells.
図２
パネルa.
レセプター分子であるSCARB2を安定発現させたL-SCARB2細胞におけるEV71およびCVA16の各株の増殖性を検討した。エンテロウイルス71（EV71）のSK-EV006株、Nagoya株、Isehara株およびBrCr株およびコクサッキーウイルスA16（CVA16）のG10株を、RD細胞、L929細胞およびL-SCARB2細胞に、それぞれmoi=0.01で感染させた。48時間の培養の後、ウイルス力価（TCID50）を用いて測定した結果、L-SCARB2細胞におけるそれぞれのウイルスの力価は、L929細胞と比べ明らかに上昇しており、RD細胞とほぼ同程度であった。これらの結果は、SCARB2がEV71およびCVA16の感染受容体として機能していることを示している。
パネルb.
EV71がSCARB2と直接結合しているかを検討した。まず、Protein G-sepharoseビーズに0.1〜10μgのSCARB2/Fc （SCARB2分子の細胞外ドメイン部分とヒトのIgGのFc部分を融合させたもの）を結合させた。これにEV71を4℃で感作させ、ウイルス粒子がSCARB2-ビーズ複合体に結合したかどうかをウエスタンブロットにより確認した。
その結果、SCARB2/Fcの濃度依存的にEV71の構造蛋白質VP1のバンドが濃くなっていることが確認された。つまり、EV71はSCARB2に直接結合していることが示された。
FIG.
Panel a.
The proliferation of each of EV71 and CVA16 strains in L-SCARB2 cells stably expressing the receptor molecule SCARB2 was examined. Enterovirus 71 (EV71) SK-EV006, Nagoya, Isehara, BrCr and Coxsackievirus A16 (CVA16) G10 strains were infected with RD cells, L929 cells and L-SCARB2 cells at moi = 0.01, respectively. . After 48 hours of culture, the virus titer (TCID 50 ) was measured. As a result, the titer of each virus in L-SCARB2 cells was clearly higher than that in L929 cells, almost the same as in RD cells. It was about. These results indicate that SCARB2 functions as an infection receptor for EV71 and CVA16.
Panel b.
We examined whether EV71 is directly bound to SCARB2. First, 0.1-10 μg SCARB2 / Fc (a fusion of the extracellular domain part of SCARB2 molecule and the Fc part of human IgG) was bound to Protein G-sepharose beads. This was sensitized with EV71 at 4 ° C., and it was confirmed by Western blot whether virus particles were bound to the SCARB2-bead complex.
As a result, it was confirmed that the band of the structural protein VP1 of EV71 became dark depending on the concentration of SCARB2 / Fc. In other words, EV71 was shown to be directly bound to SCARB2.
パネルc.
EV71とSCARB2の結合が、SCARB2に対する抗体で阻害されるかを検討した。2μgのSCARB2/Fcを結合させたProtein G-sepharoseビーズに1〜25μg のSCARB2に対する抗体を感作させた後、EV71を結合させた。その結果、EV71とSCARB2/Fcの結合は、抗体の濃度依存的に阻害されていた。
パネルd.
EV71の感染がSCARB2に対する抗体で阻害されるかを検討した。RD細胞にSCARB2に対する抗体を反応させた後に、感染するとGFPを発現するように改変したEV71（EV71-GFP）を感染させた。18時間後にGFP陽性細胞の数を指標に感染効率を比較したところ、EV71-GFPの感染はSCARB2に対する抗体で約70％阻害された。
パネルe.
EV71-GFPの感染がSCARB2/Fcにより競合的に阻害されるかを検討した。EV71-GFPとSCARB2/Fcを感作させ後にRD細胞に感染させ、GFP陽性細胞の数を指標に感染効率を比較したところ、SCARB2/Fcと感作させることによりEV71-GFPの感染が約60％阻害された。
Panel c.
We examined whether the binding of EV71 and SCARB2 is inhibited by an antibody against SCARB2. Protein G-sepharose beads conjugated with 2 μg SCARB2 / Fc were sensitized with 1-25 μg of antibody against SCARB2, and then EV71 was bound. As a result, the binding between EV71 and SCARB2 / Fc was inhibited depending on the antibody concentration.
Panel d.
We examined whether EV71 infection was inhibited by antibodies against SCARB2. After reacting an antibody against SCARB2 with RD cells, EV71 (EV71-GFP) modified to express GFP upon infection was infected. When the infection efficiency was compared 18 hours later using the number of GFP positive cells as an index, EV71-GFP infection was inhibited by an antibody against SCARB2 by about 70%.
Panel e.
We investigated whether EV71-GFP infection is competitively inhibited by SCARB2 / Fc. EV71-GFP and SCARB2 / Fc were sensitized and then infected with RD cells, and the infection efficiency was compared using the number of GFP-positive cells as an indicator.By sensitizing with SCARB2 / Fc, EV71-GFP infection was about 60 % Inhibited.
図３
EV71やCVA16と同じA群ヒトエンテロウイルスに分類されるCVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA7、CVA8、CVA10、CVA12およびCVA14が、L-SCARB2細胞で増殖可能になっているのかを調べた。
RD細胞、L929細胞およびL-SCARB2細胞に、それぞれのウイルスを感染させ、48時間後に細胞の写真を撮影した。CVA7、CVA10およびCVA14は、RD細胞のみでなくL929細胞でも増殖した。他のウイルスは、L-SCARB2細胞で増殖することが出来るようにならなかった。以上のことから、L929細胞とL-SCARB2細胞を組み合わせることで、CVA16およびEV71を選択的に分離することが可能である。
FIG.
It was investigated whether CVA2, CVA3, CVA4, CVA5, CVA6, CVA7, CVA8, CVA10, CVA12 and CVA14 classified into the same group A human enteroviruses as EV71 and CVA16 can grow on L-SCARB2 cells.
RD cells, L929 cells and L-SCARB2 cells were infected with the respective viruses, and 48 hours later, photographs of the cells were taken. CVA7, CVA10 and CVA14 proliferated not only in RD cells but also in L929 cells. Other viruses did not become able to grow on L-SCARB2 cells. From the above, CVA16 and EV71 can be selectively separated by combining L929 cells and L-SCARB2 cells.
本発明の細胞およびトランスジェニック非霊長類動物は、抗ウイルス薬を開発するためのツールとして有用である。また、本発明の動物は、ウイルス感染に関する実験モデルとして有用である。 The cells and transgenic non-primate animals of the present invention are useful as tools for developing antiviral drugs. The animal of the present invention is useful as an experimental model for viral infection.
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2009
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