JP2010256164A - 被検物質評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、親油性被検物質の、CD包接体を線虫に経口摂取させることで、経口摂取した親油性被検物質の生物機能に対する作用を評価する。
【選択図】 なし
Description
本発明の被検物質評価方法に用いる線虫(シノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans))は、1500種程度知られている中から選択された体長約1mmの土壌線虫の一種である。この線虫は、飼育が容易で体細胞数が約1000個と少なく、雌雄同体が自家受精で増殖することができる。線虫は神経系、筋肉、消化器官、生殖器官等および表皮をもち、動物としての基本的体制をもっており、その遺伝子もヒトに近く、また、ヒトと同じ真正後生動物に属する。この線虫は、老化の分子生物学研究の実験動物や、病原微生物の感染モデルとして用いられている。
本発明で評価することができる被検物質は、経口摂取してその作用を評価するものであれば特に制限はない。被検物質は、脂溶性であると、シクロデキストリンに包接されやすいので好ましい。なお、本明細書中で「脂溶性」とは、分子全体が脂溶性の物質のほか、分子中に脂溶性の基を含むものをいう。被検物質は、分子全体が脂溶性の物質の場合は、物質全体または一部が、シクロデキストリンに包接される。または、分子中に脂溶性の基を含む場合には、脂溶性の基の部分が、シクロデキストリンに包接される。
シクロデキストリンは数分子のD−グルコースがα(1→4)グルコシド結合によって結合し環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。グルコースが5個以上結合したものが知られている。本発明のシクロデキストリン包接体の製造に用いるシクロデキストリンとしては、グルコースが6個結合しているαシクロデキストリン(シクロヘキサアミロース)、7個結合しているβシクロデキストリン(シクロヘプタアミロース)、8個結合しているγシクロデキストリン(シクロオクタアミロース)などの天然型シクロデキストリンや、これらの天然型シクロデキストリンをメチル化、ヒドロキシプロピル化、アセチル化、モノクロロトリアジノ化、スルフォブチル化などの化学修飾をした化学修飾型シクロデキストリンやマルトシル化などの酵素修飾型シクロデキストリンなどの修飾型シクロデキストリン、あるいはこれらの2種以上の混合物を挙げることができる。これらのシクロデキストリンのうち、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリンを用いることが好ましく、特にγシクロデキストリンを用いることが好ましい。
被検物質は、シクロデキストリンに包接され、分散した溶液を、線虫育成用寒天平板に塗布する。この状態でしばらく置くと、溶媒が寒天に吸収され、シクロデキストリンが線虫育成用寒天平板上に残る。この寒天平板上で所定期間線虫を飼育する。線虫の寿命を観察することで、経口摂取した被検物質の生物機能に対する効果を評価する。また、薬剤、栄養補助食品などの被検物質を摂取させた後に、病原菌などを摂取させることで、薬剤、栄養補助食品などの効果を評価してもよい。
本発明で用いるシクロデキストリンに、脂溶性蛍光物質などを被検物質とともに包接しておくと、線虫が被検物質をどの程度の量を摂取したかを容易に測定できる。すなわち、蛍光物質などが包接されたシクロデキストリンを線虫に摂食させる。一定時間経過した後、線虫体内の蛍光物質の分布を蛍光顕微鏡で観察するとともに、線虫をすり潰して回収される蛍光物質の量を測定し、単位時間当たりのシクロデキストリン摂取量を算定する。これからシクロデキストリンおよび包接される被検物質の経口摂取量を求めることができる。また、寒天平板上に塗布するシクロデキストリンの量を調整することで、投与量を調整することも容易である。
線虫:Caenorhabditis elegans Briostol株N2雌雄同体型(線虫)を用いた。
線虫育成用寒天平板(Nematode Growth Medium:NGM plate):
NaCl(和光純薬工業)1.5g、Agar(和光純薬工業)8.5gを485mlの蒸留水に混合し、オートクレーブ(121℃、15min)滅菌し、60℃のウォーターバス内で1hr冷却した後、1M CaCl2を500μl、1M MgSO4を500μl、エタノール(和光純薬工業)で5mg/mlに調整したコレステロール(和光純薬工業)を500mg/ml、1M KPO4を12.5ml混合し、直径60mmのシャーレ(Kord Products Inc.、Bramptom、Ontario、Canada)に12mlずつ分注したものを用いた。
TRYPTONE SOYA AGAR(Oxoid)20gを500mlの蒸留水に混合し、オートクレーブ(121℃、15min)で滅菌して冷却後、90mmシャーレ(Greiner Bio−One)に約20mlずつ分注したものを用いた。
KH2PO4(和光純薬工業)1.5g、Na2HPO4(和光純薬工業)3g、NaCl(和光純薬工業)2.5gを蒸留水500mlに混合し、オートクレーブ(121℃、15min)で滅菌して冷却後1M MgSO4 500μlを加えて混合したものを用いた。
アジ化ナトリウム(和光純薬工業)0.65gを10mlのM9 bufferに加えて溶解させ、1Mアジ化ナトリウム−M9溶液を作製した。これを母液として、M9 bufferでそれぞれ希釈を行い、50mMアジ化ナトリウム−M9溶液と10mMアジ化ナトリウム−M9溶液を作製した。
(γCDの取り込みの確認)
蛍光物質−γCDの作製
γCD(CAVAMAX W8 Food:Wacker Chemie AG) 2gを乳鉢に量り取り、脱イオン水を適量加えペーストを調製した。1mlのエタノールに溶解した蛍光物質3、3’−Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)(Sigma製) 2mgを加えて、均一になるまで混合した。減圧乾燥によって粉末化し、DiO−γCD包接体を得た。
TSAで一晩培養した餌となるOP(Escherichia coli OP50(以下「OP」という))10mgをM9 buffer50μlに懸濁した菌液と、蛍光物質包接γCD溶液50μl(DiO換算14.25μg)をNGM plateに塗布した(14.25μg/プレート)。その上に線虫を数匹ワームピッカーを用いて移し、3時間餌を自由摂食させた。
オートクレーブ(121℃、15min)により滅菌した蒸留水3.5gとアラビアガム0.75gを遠心チューブに入れ、よく撹拌し、溶解させた。そこに、孔径0.45μmのディスクフィルター(東洋濾紙、東京)で濾過滅菌した、蛍光物質3、3’−Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO、Sigma、 D4292)2.5mgを大豆油(和光純薬工業)1.0gに加え不溶分を残して採取した上清0.75gを加え、氷上にて超音波分散機(UH−50、エスエムテー)の最大出力で2分間処理して、粒径1〜5μmのマイクロカプセルを作製した。
TSAで一晩培養した餌となるOP(Escherichia coli OP50(以下「OP」という))をM9 bufferで200mg/mlに調整したもの50μlと蛍光物質含有マイクロカプセル50μlを撹拌混合した後、NGM plateに塗布した(溶解量不明のため投与量不明だが全てのDiOが溶解したと仮定すると約18μg/プレート)。その上に線虫を数匹ワームピッカーを用いて移し、3時間餌を自由摂食させた。
15ml容量のチューブに、3mlの10mMアジ化ナトリウム−M9溶液と0.15gのAgar(和光純薬工業)を入れ、撹拌した後、チューブの蓋を緩めて電子レンジに数十秒かけて溶かし、5%寒天溶液を作った。5%寒天溶液は、固まらないうちに手早くスライドグラス(Matsunami)の上に滴下し、すぐに上からもう一枚スライドグラスをかぶせて平らなアガーパッドを作製した。アガーパッドが固まったら、上に重ねているスライドグラスをゆっくりと取り外し、アガーパッドの上に50mMアジ化ナトリウム−M9溶液を数滴のせて、その中に、ワームピッカーですくった線虫を載せた。その上に円形マイクロカバーガラス(Fisher Scientific)を被せて、顕微鏡観察用の線虫試料とした。
上記線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した。図1は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。図1(A)は、マイクロカプセルを用いたもの、図1(B)は、γCDを用いたものである。図1から、蛍光物質包接γCDを用いた場合のほうが蛍光強度が強く、蛍光物質包接γCDを用いると、同一条件で多くγCDを摂取していることがわかる。
[γCDの取り込み量の確認]
上記実施例1において、投与量を1/10にした以外は、実施例1と同様にした(1.425μg/プレート)。
上記線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した。図2は、線虫試料を蛍光顕微鏡で観察した写真である。図2から、蛍光物質包接γCDにおいて、蛍光物質量が1.425μg/プレートであっても、γCDを摂取していることがわかる。すなわち、γCDを用いることで、親油性被検物質を効率よく確実に経口的に摂取させることができることがわかった。
(蛍光物質含有γCDの線虫への取り込み量の測定)
蛍光物質−γCDの作製
実施例1と同様の方法で、蛍光物質−γCD包接体を作製した。
線虫Bristol株N2の雌雄同体を実験に供した。線虫飼育用の餌として非病原性の大腸菌Escherichia coli OP50株(OP)を用いた。湿重量10mgのOPを25μl のM9 bufferに懸濁し、ペプトン未添加の線虫育成用寒天培地(NGM)に塗布した。虫卵をNGMに散布し、25℃のふ卵器内で3日齢まで飼育したものを用いた。
次に示す3種の条件で、DiOを添加したプレートを作製した。DiOをNGMに添加または表面に塗布して、DiO濃度が、14.25μg/プレートになるようにした。また、蛍光物質−γCD包接体を用いる場合は、NGMにDiO濃度が、14.25μg/プレートになるようになるように蛍光物質−γCD包接体を塗布した。上記した3日齢の線虫を各プレートに50匹加え、3時間自由に摂食させた。
[コエンザイムQ10(CoQ10)を加えた培地上で飼育する線虫の寿命の評価]
本実施例では、以下の培地を用いた以外は、同じものを用いた。
CoQ10添加寒天培地(CoQ10寒天):
CoQ10(Sigma製)75mgをエタノール(和光純薬工業)1mlと混合し、さらに150mgのTween80と混和してから蒸留水249mlと混合した。通常の2倍濃度に調整し滅菌しておいた×2NGM250mlと混和し、10mlずつ直径60mmのシャーレ(Kord Products Inc.、Bramptom、Ontario、Canada)に分注し固化させることで1500μgのCoQ10を含むプレートを調製した。上記の実験と同様に3日齢の線虫を各プレートに50匹加え、OPを給餌して飼育し毎日その生死を確認し生存分析を行うことで、CoQ10添加NGMと対照群の間で比較検討した。
シャーレに分注する前の液状のNGM500mlを作製した。これを、直径60mmのシャーレ(Kord Products Inc.、Bramptom、Ontario、Canada)に10mlずつ分注したものを用いた。
γCD(CAVAMAX W8 Food:Wacker Chemie AG) 93.7gとCoQ10(Sigma製)25.0gを1000mLビーカーに量り取り、軽く混合した。これに脱イオン水を470mL加え、ホモジナイザー(ULTRA−TURRAX T25:IKA)を用い、8,000−12,000rpmにて30分間攪拌した。噴霧乾燥によって粉末化し、CoQ10−γCD包接体を得た。
産卵期にある線虫から卵を回収し、25℃のインキュベーター内で1日培養した。予め、TSAで37℃一晩培養したOPを3日齢まで飼育した後、対照用の寒天上、CoQ10寒天上およびCoQ10−γCD塗布寒天上に、OPを10mg/plateとなるように塗布したVE寒天上および対照用寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくOPを塗布したplateに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、CoQ10群の線虫は、全飼育期間をCoQ10寒天上またはCoQ10−γCD塗布寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。結果を図4に示す。
[レスベラトロールを加えた培地上で飼育する線虫の寿命の評価]
本実施例では、以下の培地を用いた以外は、同じものを用いた。なお、レスベラトロールは天然に存在する植物性のポリフェノールである。
レスベラトロール添加寒天培地(RES寒天):
レスベラトロール(Sigma製)14.3mgをDMSO(和光純薬工業)1mlに溶解させたレスベラトロール溶液80μlをシャーレに分注する上記液状のNGM100mlによく撹拌しながら添加し、50μMのレスベラトロール添加NGMを作製し、直径60mmのシャーレ(Kord Products Inc.、Bramptom、Ontario、Canada)に10mlずつ分注したものを用いた。100μMを作製するときは160μlをシャーレに分注するNGM100mlによく撹拌しながら添加し同様に調整した。
シャーレに分注する前の液状のNGM500mlを作製した。これを、直径60mmのシャーレ(Kord Products Inc.、Bramptom、Ontario、Canada)に10mlずつ分注したものを用いた。
γCD(CAVAMAX W8 Food:Wacker Chemie AG) 13.5gを50mLビーカーに量り取り、脱イオン水を60mL加え軽く混合した。これにレスベラトロール(Sigma製)1.5gを加え、ホモジナイザー(ULTRA−TURRAX T25:IKA)を用い、6,500−9,500rpmにて15分間攪拌した。凍結乾燥によって粉末化し、レスベラトロール−γCD包接体を得た。
産卵期にある線虫から卵を回収し、25℃のインキュベーター内で1日培養した。予め、TSAで37℃一晩培養したOPを3日齢まで飼育した後、対照用の寒天上、レスベラトロール寒天上およびレスベラトロール−γCD塗布寒天上に、OPを10mg/plateとなるように塗布したVE寒天上および対照用寒天上にそれぞれワームピッカーを用いて移し、その後、1日おきに新しくOPを塗布したplateに移しながら、毎日観察し、ピッカーで軽く触れて動かなかった個体を死亡とした。このとき、レスベラトロール群の線虫は、全飼育期間をレスベラトロール寒天上またはレスベラトロール−γCD塗布寒天上で飼育し、対照群の線虫は、全飼育期間を対照用寒天上で飼育した。また、観察期間中にシャーレの壁に登ったものや、寒天中にもぐりこんだものは試験個体数から省いた。結果を図5に示す。
Claims (3)
- 脂溶性被検物質のシクロデキストリン包接体を含有する培地中で線虫を飼育し、経口摂取した被検物質の生物機能に対する作用を評価する被検物質評価方法。
- 前記線虫がシノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)である請求項1に記載の被検物質評価方法。
- 被検物質の生物機能に対する作用を、生物学的指標および/または生化学的評価により評価する請求項1または2に記載の被検物質評価方法。
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