JP2010249617A - 抗体測定方法及び小脳炎の診断マーカー - Google Patents

Abstract

【課題】迅速且つ的確な被験者の抗体測定方法を提供する。
【解決手段】
被験者から生物サンプルを採取する採取工程と、前記生物サンプル中のＧｌｕＲδ２のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、前記抗原性が高い部位をペプチド合成により抗原として、抗体を測定する測定工程とを有することを特徴とする。抗原性が高い部位はＮ末側のアミノ酸又はＣ末側のアミノ酸である。生物サンプルは、血清又は髄液である。抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法による。
【選択図】図３

Description

本発明は、小脳炎の診断マーカー、及び、その小脳炎の診断マーカーを使用し、小脳炎患者の自己抗体を迅速に測定する抗体測定方法に関する。

小脳炎には、上気道炎等の病原体に感染した後に、液性あるいは細胞性自己免疫が関与し、小脳症状を起こすものがある。

急性に小脳失調症状を呈する症例は、急性小脳炎又は急性小脳失調症等と呼ばれ、先行感染後一定期間をおいてから発症することが多く、症状の発症は一般に急性である。

病変部位によって症状は異なり、小脳半球病変では失調性歩行、企図振戦、眼振、構音障害等がみられ、小脳虫部病変では体幹失調が主体となる。

ときに小脳から脳幹に病変がおよび、脳神経症状（顔面神経、外転神経、舌咽神経麻痺など）又は錐体路症状を認めることもある。

小脳炎の一般血液検査及び尿検査は正常であることが多い。また、髄液所見では軽度の細胞増多、蛋白増加、オリゴクローナルバンド、ＩｇＧインデックスの上昇を認めることがあるが、疾患特異的なものはない。髄液のウイルス、細菌培養は一般には陰性である。頭部ＭＲＩでは異常所見を認めない例も多い。頭部ＣＴでは小脳に低吸収域が認められることがあるが、ＭＲＩに比して感度は低い。そのため診断の決め手となる疾患特異的検査所見は少ない。

更にその症状が慢性化したり、再発性に経過する場合は、慢性小脳炎と呼ばれる。慢性小脳炎の一部には、小脳失調症状のみならずオプソクローヌスやミオクローヌスが著明で、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）と呼ばれる一群も存在する。

グルタミン酸受容体デルタ２（ＧｌｕＲδ２）はグルタミン酸受容体ファミリーのメンバーであり、小脳プルキンエ細胞に特異的に発現し、シナプス形成・維持及びシナプス可塑性（ＬＴＤ）を制御する重要な分子である。

非特許文献１には、ＧｌｕＲδ２を欠損するマウスでは、平行線維−プルキンエ細胞シナプスは野生型の約半分しか形成されないことが記載されている。

このＧｌｕＲδ２を使用し、小脳炎に罹患している被験者の自己抗体測定方法として、非特許文献２にはイムノブロット法が記載されている。この測定方法は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてreverse tetracycline-controlled transactivator（ｒｔＴＡ）を用いた遺伝子組換えにより、ＧｌｕＲδ２全長分子を発現する細胞株（Ｄ３３）を得て、Ｄ３３のホモジネート上澄をSDS-PAGEにて電気泳動した後、ウエスターンブロットし、そのニトロセルロースメンブレンを抗原として患者血清・髄液中の自己抗体の検出を行う。

「New role of δ2-glutamate receptors in AMPA receptor trafficking and cerebellar function」NATURE NEUROSCIENCE VOLUME 6 NUMBER 8,AUGUST 2003,Hirokazu Hirai etal. 「Autoantibodies to NMDA receptor in patients with chronic forms of epilepsia partialis continua」Neurology 61: 891-896,2003,Takahashi Y, et al.

しかし、イムノブロット法では測定感度が低く、測定に長期間を要する。これでは人的・物的医療資源の有効活用が阻害される。

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、迅速且つ的確に小脳炎の診断を行うことができる小脳炎の診断マーカー、及び、迅速且つ的確な被験者の抗体測定方法を提供することを目的とする。

本発明に係る抗体測定方法は、被験者から生物サンプルを採取する採取工程と、前記生物サンプル中のＧｌｕＲδ２のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程とを有することを特徴とする。

前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定することが好ましい。

また、前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸であることが好ましい。

また、前記抗原性が高い部位は、Ｃ末側のアミノ酸であることも可能である。

また、前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、又はＭ２−Ｍ３のいずれかであることも可能である。

前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。

前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法によることが可能である。

また、本発明に係る小脳炎の診断マーカーは、配列番号２、３、４、５、６又は７のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。

前記小脳炎は、急性小脳炎、慢性小脳炎、又はオプソクローヌス・ミオクローヌス症候群の何れかである。

本発明の小脳炎の診断マーカーによれば、迅速且つ的確に、小脳炎の診断ができた。また本発明の抗体測定方法によれば、迅速且つ的確に、被験者の自己抗体を測定できた。

ＧｌｕＲδ２を説明する模式図である。 ＧｌｕＲδ２のアミノ酸配列を示す説明図である。 ペプチド合成したＮ末側のアミノ酸及びＣ末側のアミノ酸を抗原として、ＥＬＩＳＡ法にて自己抗体を測定する模式図である。 ＥＬＩＳＡ法の測定スキームを示す工程図である。 血清サンプルにおいて、Ｎ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。 血清サンプルにおいて、Ｃ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。 髄液サンプルにおいて、Ｎ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。 髄液サンプルにおいて、Ｃ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明する。本実施形態に係る抗体測定方法は、被験者から生物サンプルを採取する採取工程と、生物サンプル中のＧｌｕＲδ２のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程とを有する。

生物サンプルは、被験者の体液であり、具体的には、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、透析液、及びこれらの混合物である。

次に、生物サンプル中のＧｌｕＲδ２のうち、抗原性が高い部位を選択する。

図１は、ＧｌｕＲδ２の模式図である。ＧｌｕＲδ２ノックアウトマウスの研究から、ＧｌｕＲδ２は、成体ではプルキンエ細胞の樹状突起遠位部の平行繊維とのシナプス形成の強化・維持分子として働くのと同時に、発生過程では登上繊維支配を近位樹状突起に留めるという働きをしていることが推定されている。

図２は、ＧｌｕＲδ２のアミノ酸配列を示すものである。抗原性が高い部位は、例えば、配列番号２に示されるＮ末側（ＮＴ）のアミノ酸である（ＦＤＥＳＡＫＫＤＤＥＶＦＲＴ）。また、抗原性が高い部位は、例えば、配列番号７に示されるＣ末側（ＣＴ）のアミノ酸である（ＰＥＨＲＴＧＰＦＲＨＲＡＰＮＧ）。

抗原性が高い部位として、例えば、配列番号３に示されるＭ１（ＬＳＬＷＡＣＩＡＧＴＶＬＬＶＧＬＬＶＹＬＬ）、配列番号４に示されるＭ２（ＡＷＷＬＦＡＬＩＶＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬ）、配列番号６に示されるＭ３（ＦＡＧＶＦＣＩＬＡＡＧＩＶＬＳＣＦＩＡＭＬ）、又は配列番号５に示されるＭ２−Ｍ３（ＧＬＮＰＦＥＲＤＳＭＹＳＱ）を使用することも可能である。

抗原性が高い部位の合成は遺伝子合成ではなく、ペプチド合成を用いることが好ましい。

抗体の測定は、例えばＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法による。

図３は、ペプチド合成したＮ末側（ＮＴ）のアミノ酸（ＦＤＥＳＡＫＫＤＤＥＶＦＲＴ）及びＣ末側（ＣＴ）のアミノ酸（ＰＥＨＲＴＧＰＦＲＨＲＡＰＮＧ）を抗原として、ＥＬＩＳＡ法による自己抗体測定の模式図である。図３に示すように、抗原性が高い部位のペプチドを合成し、そのペプチドを抗原として、抗体を測定する。ＧｌｕＲδ２のうち抗原性が高い部位を選択するから、迅速に測定ができる。即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＮＴ、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＴを小脳炎の診断マーカーとして用いてＥＬＩＳＡ法にて測定するから、迅速且つ的確に被験者の自己抗体を測定できる。配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＭ１、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＭ２、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＭ２−Ｍ３、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＭ３を使用しても、迅速且つ的確に被験者の自己抗体を測定できる。また、ペプチド合成は市販のキットで行うことができるので、合成ペプチドさえあれば一般病院の検査室でも可能となり、簡易に自己抗体の測定を行うことができる。

このようにして自己抗体を測定することにより、被験者が小脳炎に罹患しているかについて迅速且つ的確に判断することができる。疾患特異的な症状に乏しく、判断が難しい小脳炎でも、迅速且つ的確な判断が可能となる。

判断可能な小脳炎は、例えば、急性小脳炎、慢性小脳炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）である。また、例えば、傍腫瘍性小脳変性症、オリーブ橋小脳萎縮症等の脊髄小脳変性症、多発性硬化症、神経ベーチェット病等についても罹患状態について有益な情報が得られる。

（実施例１）
患者の血清中のＧｌｕＲδ２のうちＮ末側のアミノ酸及びＣ末側のアミノ酸をペプチド合成し、それらを抗原としてＥＬＩＳＡ法により自己抗体を測定した。

ＥＬＩＳＡ法による測定は、図４に示されるスキームにより行った。測定時間は約２日であった。

図５はＮ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。図中のバーは平均±ＳＥを示す。図５に示すように、対照血清の抗ＮＴ抗体（平均±ＳＤ）は０．５６８±０．０３９（ＯＤ）であった。抗ＮＴ抗体は、ＯＭＳは６例中５例、慢性小脳炎は５例中４例、急性小脳炎は２例中２例が健康対照の平均＋２ＳＤを超えていた。

図６はＣ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。図中のバーは平均±ＳＥを示す。図６に示すように、対照血清の抗ＣＴ抗体（平均±ＳＤ）は０．６１７±０．０４９（ＯＤ）であった。抗ＣＴ抗体は、ＯＭＳは６例中４例、慢性小脳炎は５例中４例、急性小脳炎は２例中２例が健康対照の平均＋２ＳＤを超えていた。

（実施例２）
患者の髄液中のＧｌｕＲδ２のうちＮ末側のアミノ酸及びＣ末側のアミノ酸をペプチド合成し、それらを抗原としてＥＬＩＳＡ法により自己抗体を測定した。ＥＬＩＳＡ法のスキームは実施例１と同様であった。

図７はＮ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。図中のバーは平均±ＳＥを示す。図７に示すように、対照髄液の抗ＮＴ抗体（平均±ＳＤ）は０．１８０±０．１０９（ＯＤ）であった。抗ＮＴ抗体は、ＯＭＳは４例中４例、慢性小脳炎は６例中３例、急性小脳炎は２例中１例が健康対照の平均＋２ＳＤを超えていた。

図８はＣ末側アミノ酸を抗原とするＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。図中のバーは平均±ＳＥを示す。図８に示すように、対照髄液の抗ＣＴ抗体（平均±ＳＤ）は０．２９８±０．１１１（ＯＤ）であった。抗ＣＴ抗体は、ＯＭＳは４例中４例、慢性小脳炎は６例中３例、急性小脳炎は２例中１例が健康対照の平均＋２ＳＤを超えていた。

次に、比較例として、倫理委員会承認の方法により同意書とともに抗ＧｌｕＲ抗体測定目的で検体送付を受けたＯＭＳ症例４１例において、血清及び髄液サンプルを使用し、遺伝子組み換えによりＮＩＨ３Ｔ３細胞において合成した全長ＧｌｕＲδ２分子を抗原として、抗ＧｌｕＲδ２抗体をイムノブロット法で検出した。

表１に示すように、傍感染性のＯＭＳでは、イムノブロット法抗ＧｌｕＲδ２抗体は髄液ＩｇＧが約３０％の陽性率、傍腫瘍性においても髄液ＩｇＧが約２０％の陽性率と、検出感度は低い値であった。

また、表２に示すように、測定は５日間を必要とし、更に、抗原の精製には１０〜２０日を要した。

以上より、本発明によれば、被験者の自己抗体を迅速且つ的確に測定することができた。そのため、被験者が小脳炎に罹患しているかについて迅速且つ的確に判断することができた。

Claims (9)

1. 被験者から生物サンプルを採取する採取工程と、前記生物サンプル中のＧｌｕＲδ２のうち、抗原性が高い部位を選択する選択工程と、前記抗原性が高い部位を抗原として、抗体を測定する測定工程とを有することを特徴とする抗体測定方法。
2. 前記測定工程では、前記抗原性が高い部位のペプチドを合成し、前記ペプチドを抗原として、抗体を測定することを特徴とする請求項１記載の抗体測定方法。
3. 前記抗原性が高い部位は、Ｎ末側のアミノ酸であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗体測定方法。
4. 前記抗原性が高い部位は、Ｃ末側のアミノ酸であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗体測定方法。
5. 前記抗原性が高い部位は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、又はＭ２−Ｍ３のいずれかであることを特徴とする請求項１又は２記載の抗体測定方法。
6. 前記生物サンプルは、血清、髄液、穿刺液、培養細胞上静、及び、透析液のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の抗体測定方法。
7. 前記抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ法によることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の抗体測定方法。
8. 配列番号２、３、４、５、６又は７のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする小脳炎の診断マーカー。
9. 前記小脳炎は、急性小脳炎、慢性小脳炎、又はオプソクローヌス・ミオクローヌス症候群の何れかであることを特徴とする請求項８記載の小脳炎の診断マーカー。

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