JP2010249588A

JP2010249588A - 遠心液―液分配クロマトグラフ装置及びリサイクル方法

Info

Publication number: JP2010249588A
Application number: JP2009097584A
Authority: JP
Inventors: Hideo Kahari; 英雄賀張
Original assignee: SENSHU SCIENT CO Ltd; SENSHU SCIENTIFIC CO Ltd
Current assignee: SENSHU SCIENT CO Ltd; SENSHU SCIENTIFIC CO Ltd
Priority date: 2009-04-14
Filing date: 2009-04-14
Publication date: 2010-11-04

Abstract

【課題】
本発明の目的は、従来のＨＰＬＣやＣＰＣによっては十分に分離されなかった試料を精度良く分離させ、且つ高い回収率を得ることを目的とする。
【解決手段】
ＣＰＣ装置に、分配セル積層ローターを通過させた移動相を循環させる機構を設け、移動相を繰返し分配セル積層ローターに通過させることにより、優れた分解能を発揮させ、且つ高い回収率を発揮させる。また、循環流路には、流路長を切換える側路を備えて、リサイクル運転時のピークの接近を防ぎつつ、試料の拡散も抑える。
【選択図】図１

Description

本発明は、遠心液−液分配クロマトグラフィー（以下、ＣＰＣとも表記する。）に用いられる遠心液−液分配クロマトグラフ装置（以下、ＣＰＣ装置とも表記する。）に関する。

ＣＰＣは、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとも表記する。）と比較して、一般に多量の試料を分離することができ、しかも貴重な試料を収率良く回収することができるため、有機物の単離精製や分析化学の分野において用いられている。

ＣＰＣは、二層系における各成分の分配係数の差を利用して分離する。このうち、一方の液層を固定相として直列に連結した多数の分配セルに予め充填しておき、他方の液層は移動相として各分配セル内を移動させる。１０００〜２０００個の分配セルは直列に接続されて分配セル積層ローターが構成される。分配セル積層ローターは高速回転されるため、充填された固定相は遠心力によって分配セル内に保持される。試料は分配セル積層ローターの外部に設置される試料導入装置から最初の分配セルに導入される。試料は移動相によって、固定相と分配を繰返しながら、順次分配セル内を最後のセル方向に移動する。移動相は送液ポンプ等により分配セル積層ローター内の各分配セルに送液される。移動相は、分配セル内において試料が保持される固定相の中を、細かな液滴となって流れる。この際、分配係数の小さい成分は、分配係数の大きい成分よりも固定相に保持される割合が小さいので、分配係数の小さい成分は早く溶出する。その後も各成分は移動相へ順次溶出する。試料中の各成分は、成分毎に分配係数が異なるため、溶出速度に差が生じ、各成分が分離される。

図１０は、従来のＣＰＣを示す説明図である。

図１０中、４０２は移動相貯槽であり、内部の移動相４０１は、配管４０３を経由して送液ポンプ４０７により吸引される。移動相４０１は、送液ポンプ４０７によって試料導入装置４０９に送られる。試料導入装置４０９から導入される試料は、移動相４０１と共に配管４１３を経由して分配セル積層ローター４１５に送られる。分配セル積層ローター４１５に組込まれている各分配セルには、予め固定相が充填されている。移動相４０１と試料とは分配セル内に導入され、試料は固定相に保持される。その後も移動相４０１は供給され続ける。分配セル内では、試料中の各成分は、移動相と固定相との分配係数の差に起因して各成分が異なる速度で各分配セルから溶出される。各成分が分配される移動相４０１は分配セル積層ローターを出た後、配管４１７を経て検出器４１９に送られる。検出器によって検出される各成分を含む移動相４０１は配管４２５を経て回収液４２７が回収槽４２６に回収される。この回収液は廃液とされる、または、不図示のフラクションコレクター等により保持時間毎に溶出成分が収集される。

しかし、分配セル積層ローター４１５の分配セル数は１０００〜２０００程度であり、分配係数の近い成分が含まれる試料は、分配セル積層ローター４１５を一回通過させただけでは各成分が十分に分離されない場合がある。これを解消するため、複数の分配セル積層ローターを直列に複数接続することが考えられる。しかし、分配セル積層ローターが複数必要となり、ＣＰＣ装置が複雑かつ高価格になる。また、分配セル積層ローター内の分配セル数を増やすことも考えられるが、分配セル積層ローターが高価格になりやすい。

特許文献１には、分離カラムで分離された試料を再度同一の分離カラムへ再循環させる液体クロマトグラフィーにおいて、それぞれ分離カラムを有する二つの流路と、前記流路の連結と切り離しを行う二つの流路切換バルブとを備え、リサイクル分離時において、前記流路切換バルブの切換えによって、二つの分離カラム間における試料の再導入の導入方向を切換えることを特徴とする液体クロマトグラフィーについて記載されている。かかる方法によれば、極少量の試料の場合には、送液ポンプ等の分離カラム外での拡散を減少させて、試料の分離精度、分解能が改善されることが期待される。しかし、ＨＰＬＣは本来多量の試料の分取には適していない。従って、多量の試料の分取を目的としてリサイクルＨＰＬＣを採用すること自体が無意味なことである。

特開２００６−２０１０３９号公報

本発明の目的は、従来のＣＰＣやリサイクル型ＨＰＬＣによっては十分に分離されなかった多量の試料を精度良く分離させる装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題を解消するため鋭意検討した結果、分配セル積層ローターを通過させた移動相を、繰返し分配セル積層ローターに通過させる方法を見出した（以下、リサイクル運転ともいう）。しかし、試料を用いてリサイクル運転を繰返し行っていくと、試料中の各成分は互いに分離していくが、早く溶出する成分が、１回前のサイクルで分離している遅く溶出する成分に追いつくことが起き、折角分離した成分同士が混合する。そこで、本発明者は、リサイクル運転時の閉流路において、その流路長を長くする側路を設けることにより、多量の試料であっても、精度良く分離されることを見出し、本発明を完成するに至った。

上記目的を達成する本発明は、以下に記載のものである。
〔１〕移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器と、後段流路切換えバルブとを介装すると共に、
前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとの間にリサイクル管を接続してなり、前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとを切換えることにより、前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器と、後段流路切換えバルブと、リサイクル管とを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
〔２〕移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器と、前記流路切換えバルブとを介装すると共に、
前記流路切換えバルブを切換えることにより、前記流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器とを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
〔３〕移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、後段流路切換えバルブと、検出器とを介装すると共に、
前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとの間にリサイクル管を接続してなり、前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとを切換えることにより、前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、後段流路切換えバルブと、リサイクル管とを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
〔４〕移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、前記流路切換えバルブと、検出器とを介装すると共に、
前記流路切換えバルブを切換えることにより、前記流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターとを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
〔５〕分配セル積層ローターに流れる移動相の送液方向を逆転させるバルブを設けた〔１〕〜〔４〕に記載の遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
〔６〕〔１〕〜〔５〕に記載の遠心液―液分配クロマトグラフ装置を用いてリサイクル運転を行う方法であって、閉流路をリサイクル運転して試料を各成分に分離していき、検出器が検出するクロマトグラムにおける前サイクルの成分ピーク群が、次サイクルの成分ピーク群に接近したときに、流路を側路に切換えてリサイクル運転を続けることを特徴とするリサイクル方法。

本発明のＣＰＣ装置を用いれば、従来分離できなかった試料を精度良く分離させることが出来る。また、多量の試料であっても分離させることが出来る。更には、リサイクル運転による試料の拡散が小さい。そのため、様々な物質の分離、精製に好適である。

本発明のＣＰＣの一例を示す、通常運転時の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣの一例を示す、リサイクル運転時の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣの一例を示す、側路を用いるリサイクル運転時の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣの他の例を示す、通常運転時の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣの他の例を示す、リサイクル運転時の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣの他の例を示す、下降法の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣの他の例を示す、上昇法の流路を示す説明図である。本発明のＣＰＣによる通常のリサイクル運転時の分析結果の一例を示すクロマトグラムである。本発明のＣＰＣによる側路を用いるリサイクル運転時の分析結果の一例を示すクロマトグラムである。従来のＣＰＣの一例を示す説明図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

図１は本発明のＣＰＣの一例を示す説明図である。
図１中、２は移動相貯槽であり、内部の移動相１は、配管３を経由して送液ポンプ７により吸引される。移動相貯槽２と送液ポンプ７との経路には前段流路切換えバルブ４が介装されている。このとき、流路切換えバルブはポート４ａとポート４ｂとが流通可能となっており、バルブ４と後述するバルブ３０とを接続するリサイクル管３２への流通は遮断されている。移動相１は、送液ポンプ７によって試料導入装置９に送られる。試料導入装置９から導入される試料は、移動相１と共に配管１３、バルブ１５、配管１７、バルブ２１を介して分配セル積層ローター２３に送られる。この際、バルブ１５、２１の流路は矢印ｃ方向、即ち配管１７へ流通可能となっており、矢印ｄ方向、即ち配管１９への流通は遮断されている。分配セル積層ローター２３に組込まれている各分配セルには、予め固定相が充填されている。移動相１と試料とは分配セル内に導入され、試料は固定相に保持される。その後も移動相１は供給され続ける。分配セル内では、試料中の各成分は、移動相と固定相との分配係数の差に起因して各成分が異なる速度で各分配セル中の固定相から溶出される。各成分が分配される移動相１は分配セル積層ローター２３を出た後、配管２５を経て検出器２７に送られる。検出器２７と回収槽３３との経路には後段流路切換えバルブ３０が介装されている。検出器２７によって検出される各成分を含む移動相１は配管３１を経て回収液３５が回収槽３３に回収される。この回収液は廃液とされる、または、不図示のフラクションコレクター等により保持時間毎に収集される。この際、流路切換えバルブ３０は３０ａと３０ｂとが流通して、リサイクル管３２への流通は遮断されている。

一方、各成分の分離が不十分で再び分配を繰返す場合（リサイクル運転）は、図２に示すように後段流路切換えバルブ３０を切換えて、移動相の配管３１への流通を遮断させて、リサイクル管３２へと流通させる。また、同時に前段流路切換えバルブ４も切換えて、リサイクル管３２と配管６とを流通可能とさせる。本図においては、後段流路切換えバルブ３０はポート３０ｃとポート３０ａとが流通可能となるように切換える。また、前段流路切換えバルブ４はポート４ｃとポート４ａとが流通可能とするように切換える。これにより、前段流路切換えバルブ４と、送液ポンプ７と、試料導入装置９と、配管１７と、分配セル積層ローター２３と、検出器２７と、後段流路切換えバルブ３０と、リサイクル管３２とを循環する閉流路が構成される。

未分離の試料と移動相は、この閉流路を循環させて、分配セルにおいて分配が繰返される（リサイクル運転）。各成分の分離が十分になされたら、再び前段流路切換えバルブ４および後段流路切換えバルブ３０を切換えて、図１の流路に復帰させる。その後、各成分を含む移動相１は、配管３１を経て回収液３５が回収槽３３に回収される。

しかし、リサイクル運転を繰返し行っていると、試料がこの閉流路内で徐々に拡散していく。その結果、クロマトグラムにおけるピークは幅広となる。さらに、試料中の前サイクルの保持時間の長い成分に次サイクルの保持時間の短い成分が追いつき、これらのピークが接近してきて、分離が不十分になる場合がある。図８はこの状況を示したクロマトグラムである。このクロマトグラムによれば、保持時間２２０分以降の部分においては、前サイクルの保持時間の長い成分に次サイクルの保持時間の短い成分が追いつき、これらのピークが重なり始めている。かかる不都合を解消するために、閉流路の流路長を予め長くしておき、次サイクルのピークの接近を防ぐことが考えられる。しかし、閉流路でのピークの拡散は流路内容積が大きいほど生じやすいため、かかる方法によっても試料の分離は達成されない。そこで、リサイクル時当初の閉流路の流路長を短くして閉流路内容積を小さくすることによりピークの拡散を少なく保っておき、ピークの重なりが生じる直前に閉流路の流路長を長く切換えることで、ピークの接近を防ぐこととした。図９はこの状況を示したクロマトグラムである。このクロマトグラムによれば、保持時間２２０分の時点で後述するように流路長を長くすることにより、保持時間２３０分以降の部分においては、前サイクルの保持時間の長い成分と次サイクルの保持時間の短い成分とのピークの重なりが起きていない。よって、精度の良い分離が可能となっている。

かかる流路長の切換えは、閉流路内でのリサイクル運転時において、閉流路内に設置されるバルブにより、流路長の長い側路へ移動相の流通を切換えることにより行う。図２は通常のリサイクル運転時の構成を示す説明図であり、図３は流路長を長くした際のリサイクル運転時の構成を示す説明図である。通常のリサイクル運転時においては、図２に示すように試料導入装置９を出た移動相１は、配管１７を経由して分配セル積層ローター２３に送液される。ここで、リサイクル運転が繰返され、前サイクルの保持時間の長い成分と次サイクルの保持時間の短い成分とのピークが接近してきたら、図３に示すようにバルブ１５、２１を切換えて、配管１７とは流路長の異なる配管１９へと送液する。これにより、前サイクルの保持時間の長い成分と次サイクルの保持時間の短い成分とのピークの接近が解消され、精度の高い分離が達成される。

図４は、本発明のＣＰＣの他の一例を示す説明図である。
図４には、図１の前段流路切換えバルブ４と後段流路切換えバルブ３０とリサイクル管３２とに替えて、流路切換えバルブ５が介装されている。その他の構成は同様である。この流路切換えバルブ５は、４以上のポートを持つバルブである。

図４はリサイクル運転をしない場合のＣＰＣ構成を示す説明図である。
この場合は流路切換えバルブ５は、ポート５ａとポート５ｂとが、ポート５ｃとポート５ｄとがそれぞれ流通可能となっている。図５はリサイクル運転時のＣＰＣ構成を示す説明図である。リサイクル運転時には、流路切換えバルブ５は、ポート５ｃとポート５ｂとが流通可能となっている。

この方法によれば、リサイクル運転終了後の流路の洗浄が、リサイクル管を用いる図１の場合よりも容易となる点で有利である。

図６は、本発明のＣＰＣの他の一例を示す説明図である。
図６には、図４の構成に加えて、分配セル積層ローター２３の手前に流路切換えバルブ１１が介装されている。その他の構成は同様である。この流路切換えバルブ１１は、分配セル積層ローター２３に流れる移動相の送液方向を逆転させるバルブである。図６では移動相は矢印ａの方向に移動し、分配セル積層ローター２３を出た後、再び流路切換えバルブ１１に戻り、検出器２７へと送られる（下降法）。図７では、流路切換えバルブ１１が切換えられて、移動相は矢印ｂの方向に移動し、分配セル積層ローター２３を出た後、再び流路切換えバルブ１１に戻り、検出器２７へと送られる（上昇法）。流路の逆転は成分を反転溶出させる場合に行われる。また、使用する移動相と固定相との比重に応じて上昇法と下降法とが選択される。

図１〜３において検出器２７は、後段流路切換えバルブ３０と分配セル積層ローター２３との経路に介装しているが、後段流路切換えバルブ３０と回収槽３３との経路に介装してもよい。同様に図４、５において検出器２７は、流路切換えバルブ５と分配セル積層ローター２３との経路に介装しているが、流路切換えバルブ５と回収槽３３との経路に介装してもよい。

側路１９は、前述した閉流路内であればいずれの場所に設置しても構わないが、検出器への負荷を避けるためには検出器よりも手前に設置することが好ましい。また、側路１９は複数箇所に設置しても構わない。側路１９は長さの異なる複数を設けても良い。

側路１９は、その容積に応じて、得られるクロマトグラムにおける前サイクルの成分ピーク群と次サイクルの成分ピーク群との間隔を変更させる。例えば、ポンプ７の送液量が５ｍＬ／ｍｉｎ．の場合において、５０ｍＬの内容積を有する側路１９を装着すると、前サイクルの成分ピーク群と次サイクルの成分ピーク群との間隔は１０分間拡がる。側路１９の内容積は、成分ピーク群を拡げる間隔に応じて適宜選択する。

また、通常はＣＰＣ装置を構成する配管（図１における配管３、６、１３、１７、２５、２９、３１、３２）と同一の径のものが用いられる。ピークの拡散を防止するためである。側路１９はどの様な形状であっても良いが、設置スペースを小さくすることが出来るため、ループ形状のものが好ましい。

図１〜３においては側路１９に流路を切換える流路切換えバルブは、３のポートを有するバルブ１５と２１との２つを用いているが、例えば、試料導入装置に使用される４以上のポートを有する１つのバルブを用いても良い。

側路１９は、試料が試料導入装置９に導入される前に、予め移動相１で満たしておくことが好ましい。

本発明において、移動相供給部や流路切換えバルブ、送液ポンプ、試料導入装置、分配セル積層ローター、検出器はいずれも公知のものを用いて構成することが出来る。送液ポンプは試料の拡散を小さくするためには、ポンプヘッドの容積が小さいものほど好ましい（例えば１００μＬ以下）。また、ＣＰＣ装置にはガス除去装置や保温装置などの公知の機器を接続することを妨げない。

以下、本発明によるＣＰＣによる試料の分離結果を説明する。

送液ポンプ：ＳＳＣ―３４６５（株式会社センシュー科学製）、検出器：ＳＳＣ―５４１０（株式会社センシュー科学製、波長２５４ｎｍ）、試料導入装置：レオダイン７１２５ｉ（ＲＨＥＯＤＹＮＥ社製）、分配セル積層ローター：ＣＰＣ２４０（株式会社センシュー科学製）を用いて図１の装置を構成した。側路は１ｍｍ×５０ｍ、内容積３９ｍＬのループ形状ものを図１と同様に取付けた。

この装置を用いて、移動相としてアセトニトリル、固定相としてヘキサンを用いて、２成分含有試料の分離を行った。分配セル積層ローターの回転数は１４００ｒｐｍとし、温度は室温（２５℃）とした。移動相の流速は５ｍＬ／ｍｉｎ．とし、圧力は５．５ＭＰａとなった。

図８は側路を介さずにリサイクル運転をした場合における試料の検出結果を示すクロマトグラムである。リサイクル回数１回目ではピークは１本であるが、リサイクル回数４回目辺りからピークの分裂が確認できる。リサイクル回数１８回（時間２４０〜２５０分辺り）以降は各成分のピークが重なってしまい、各成分が分取出来なくなっている。図９は時間２０５分で閉流路を側路を介するように切換えた場合の試料の検出結果を示すクロマトグラムである。その結果、２２０分以降の試料ピークの間隔が広がり、各成分が分取しやすくなった。

１００・・・本発明のＣＰＣ装置の一例
２００・・・本発明のＣＰＣ装置の他の一例
３００・・・本発明のＣＰＣ装置の他の一例
１・・・移動相
２・・・移動相貯槽
３、６、１３、１７、２５、２９、３１・・・配管
４・・・前段流路切換えバルブ
４ａ、４ｂ、４ｃ・・・バルブのポート
５・・・流路切換えバルブ
５ａ、５ｂ、５ｃ・・・バルブのポート
７・・・送液ポンプ
９・・・試料導入装置
１１・・・流路切換えバルブ
１５・・・流路切換えバルブ
１９・・・側路
２１・・・流路切換えバルブ
２３・・・分配セル積層ローター
２７・・・検出器
３０・・・後段流路切換えバルブ
３０ａ、３０ｂ、３０ｃ・・・バルブのポート
３２・・・リサイクル管
３３・・・回収槽
３５・・・回収された試料と移動相
４００・・・従来のＣＰＣ装置
４０１・・・移動相
４０２・・・移動相貯槽
４０３、４１３、４１７、４２５・・・配管
４０７・・・送液ポンプ
４０９・・・試料導入装置
４１５・・・分配セル積層ローター
４１９・・・検出器
４２６・・・回収槽
４２７・・・回収された試料と移動相

Claims

移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器と、後段流路切換えバルブとを介装すると共に、
前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとの間にリサイクル管を接続してなり、前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとを切換えることにより、前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器と、後段流路切換えバルブと、リサイクル管とを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器と、前記流路切換えバルブとを介装すると共に、
前記流路切換えバルブを切換えることにより、前記流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、検出器とを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、後段流路切換えバルブと、検出器とを介装すると共に、
前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとの間にリサイクル管を接続してなり、前記前段流路切換えバルブと後段流路切換えバルブとを切換えることにより、前段流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、後段流路切換えバルブと、リサイクル管とを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
移動相通過管の一端側から他端側に向かって順次流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターと、前記流路切換えバルブと、検出器とを介装すると共に、
前記流路切換えバルブを切換えることにより、前記流路切換えバルブと、送液ポンプと、試料導入装置と、分配セル積層ローターとを循環する閉流路に切換えるように構成し、
前記閉流路内に、所定の内容積を有する側路を流路切換えバルブを介して備えてなることを特徴とする遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
分配セル積層ローターに流れる移動相の送液方向を逆転させるバルブを設けた請求項１〜４に記載の遠心液―液分配クロマトグラフ装置。
請求項１〜５に記載の遠心液―液分配クロマトグラフ装置を用いてリサイクル運転を行う方法であって、閉流路をリサイクル運転して試料を各成分に分離していき、検出器が検出するクロマトグラムにおける前サイクルの成分ピーク群が、次サイクルの成分ピーク群に接近したときに、流路を側路に切換えてリサイクル運転を続けることを特徴とするリサイクル方法。