JP2010236945A - Method for immobilization of specimen, and micro analysis device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置に関するものである。特に、検出物質に含まれている特定の物質であるアレルゲン、アディポネクチン、サイトカイン、免疫抗体などの検体を検出するため、該検体と結合可能な被検体物質を固定化する被検体物質の固定化方法、および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置に関するものである。 The present invention relates to a method for immobilizing an analyte and a microanalyzer. In particular, a method for immobilizing an analyte substance that immobilizes an analyte substance that can bind to the analyte in order to detect an analyte such as an allergen, adiponectin, cytokine, or immune antibody that is a specific substance contained in the analyte , And a microanalyzer using the immobilization method.
抗原抗体反応を用いた免疫分析法は、医療や生化学分野、アレルゲン等の測定分野などにおける分析・計測方法として有用である。しかし、従来の免疫分析法は、分析に長時間を要すると共に操作が煩雑であるという等の問題を有している。 An immunoassay method using an antigen-antibody reaction is useful as an analysis / measurement method in the fields of medicine, biochemistry, and measurement fields such as allergens. However, the conventional immunoassay has problems such as a long time required for analysis and complicated operation.
そのような状況の中、近年、半導体の微細加工技術などを応用したマイクロ化技術(Micro Electro Mechanical System、MEMS)が開発され、タンパク質、遺伝子などの生化学分野における分析においては、抗原抗体反応を用いるマイクロ化技術(Micro Total Analytical System、μ−TAS)が急速に発展している。 Under such circumstances, in recent years, a micro technology (Micro Electro Mechanical System, MEMS) using semiconductor microfabrication technology has been developed, and in the analysis in the biochemistry field of proteins, genes, etc., antigen-antibody reaction has been performed. The micro technology to be used (Micro Total Analytical System, μ-TAS) is rapidly developing.
例えば特許文献1には、基板にマイクロオーダーのチャネル(以下、「マイクロチャネル」ともいう)を形成し、このマイクロチャネルに抗体等を固定化することにより、抗原などの検体を分析する分析時間の短縮化や分析操作の簡略化を図るマイクロチャネルデバイス技術が提案されている。 For example, Patent Document 1 discloses an analysis time for analyzing a specimen such as an antigen by forming a micro-order channel (hereinafter also referred to as “microchannel”) on a substrate and immobilizing an antibody or the like on the microchannel. Microchannel device technology has been proposed to shorten and simplify analysis operations.
具体的に、特許文献1には、マイクロチャネル内に、リガンド固定部、およびそのリガンド固定部に固定された抗体または人工抗体などのリガンドを備えるマイクロチャネルデバイスに関する技術が開示されている。 Specifically, Patent Document 1 discloses a technique related to a microchannel device including a ligand fixing part and a ligand such as an antibody or an artificial antibody fixed to the ligand fixing part in the microchannel.
図13は、特許文献1に開示されたマイクロチャネルデバイスの構造を示す。図13に示すように、このマイクロチャネルデバイスは、ガラスまたはプラスチックなどの透光性を有する材料からなる基板200の表面に、マイクロチャネル101、注入孔102、液溜め部103および排出孔104が形成されている。さらに、マイクロチャネル101には、リガンド固定部105が形成されている。リガンド固定部105には、検体と特異的に反応するリガンドが、物理吸着や、リガンドが有するアミノ基との共有結合を用いた固定などの周知の固定方法で固定化されている。ここで、リガンドとは、検体とする物質に対して特異的に親和性を持つ化学物質を意味し、被検体物質とも称する。 FIG. 13 shows the structure of the microchannel device disclosed in Patent Document 1. As shown in FIG. 13, in this microchannel device, a microchannel 101, an injection hole 102, a liquid reservoir 103, and a discharge hole 104 are formed on the surface of a substrate 200 made of a light-transmitting material such as glass or plastic. Has been. Furthermore, a ligand fixing part 105 is formed in the microchannel 101. A ligand that specifically reacts with the specimen is immobilized on the ligand immobilization unit 105 by a known immobilization method such as physical adsorption or immobilization using a covalent bond with an amino group of the ligand. Here, the ligand means a chemical substance having a specific affinity for a substance to be analyzed, and is also referred to as an analyte substance.
図14は、図13に示すマイクロチャネルデバイスを使用した検体の検出方法を説明するための図面である。図14に示すように、まず、検体120を含む液体と、標識抗体123を含む液体とを混合して反応させる。ここで、標識抗体123は、光学的に検出可能な標識物質121と、検体120に結合可能な抗体122とが結合して形成されるものである。この標識抗体123と検体120とが反応して、免疫複合体124(標識抗体と検体との反応結合物)が形成される。 FIG. 14 is a diagram for explaining a specimen detection method using the microchannel device shown in FIG. As shown in FIG. 14, first, the liquid containing the specimen 120 and the liquid containing the labeled antibody 123 are mixed and reacted. Here, the labeled antibody 123 is formed by binding an optically detectable labeling substance 121 and an antibody 122 capable of binding to the specimen 120. The labeled antibody 123 and the specimen 120 react to form an immune complex 124 (reaction conjugate between the labeled antibody and the specimen).
次いで、上記免疫複合体124を含む混合液を、図13に示す注入孔102から外部ポンプを用いて注入し、マイクロチャネルに流通させて、図14に示すように、免疫複合体124とリガンド固定部105に固定された抗体125とを反応させる。これにより、リガンド固定部105に、抗体125−検体120−標識抗体123からなる複合体126が形成される。 Next, the liquid mixture containing the immune complex 124 is injected from the injection hole 102 shown in FIG. 13 using an external pump, and is circulated through the microchannel. As shown in FIG. 14, the immune complex 124 and the ligand are immobilized. The antibody 125 immobilized on the part 105 is reacted. As a result, a complex 126 composed of the antibody 125 -the specimen 120 -the labeled antibody 123 is formed in the ligand fixing part 105.
この後、リガンド固定部105に結合した免疫複合体124の標識物質121を、標識物質の種類に応じて、紫外可視分光分析、蛍光分析、化学発光分析または熱レンズ分析などの所定の分析機器を用いて、標識物質の光吸収、蛍光または発光等を検出する。これにより、検出物質中の検体120の量などを測定することができる。 Thereafter, the labeling substance 121 of the immune complex 124 bound to the ligand fixing part 105 is subjected to a predetermined analytical instrument such as ultraviolet-visible spectroscopic analysis, fluorescence analysis, chemiluminescence analysis, or thermal lens analysis according to the type of the labeling substance. It is used to detect light absorption, fluorescence or luminescence of the labeling substance. As a result, the amount of the specimen 120 in the detection substance can be measured.
上述した特許文献1の技術によると、反応場(リガンド固定部)を小さくすることができ、かつ反応表面積を大きくすることができるので、装置の小型化、チップ構造の簡便化とともに、反応に要する時間を大幅に短縮することができる。 According to the technique of Patent Document 1 described above, the reaction field (ligand fixing part) can be reduced, and the reaction surface area can be increased. Therefore, the reaction is required in addition to downsizing the device and simplifying the chip structure. Time can be significantly reduced.
しかし、特許文献1では、1つのマイクロチャネル内で1つの検体を検出しているが、1つのマイクロチャネル内で複数の検体を検出したい場合、1つのマイクロチャネル内に複数のリガンドを固定化する必要がある。 However, in Patent Document 1, one specimen is detected in one microchannel, but when a plurality of specimens are to be detected in one microchannel, a plurality of ligands are immobilized in one microchannel. There is a need.
ここで、マイクロスポッターを用いれば、1つのチャネル内に複数のリガンドを固定化することが可能であるが、この場合、リガンドの固定化を、マイクロチップを貼り合わせる前に行うことになる。しかし、マイクロチップを貼り合わせる前に固定化を行うと、貼り合わせるときの熱圧着や有機溶剤による接着などが、固定化後のリガンドにとって悪条件になってしまうため、リガンドの固定化が難しくなり、正確な測定を行うことができなくなってしまう。そのため、リガンドの固定化は、分析装置などの貼り合わせ工程の後に行う必要がある。 Here, if a micro spotter is used, a plurality of ligands can be immobilized in one channel. In this case, the ligand is immobilized before the microchips are bonded together. However, if the immobilization is performed before the microchip is bonded, it becomes difficult to fix the ligand because the thermocompression bonding and bonding with an organic solvent during bonding are adverse conditions for the immobilized ligand. , You will not be able to make accurate measurements. For this reason, it is necessary to immobilize the ligand after the bonding step of the analyzer or the like.
特許文献2ないし5には、リガンドの固定化後に上記のような貼り合わせ工程を施す必要がなく、マイクロチャネル内の任意の部位のみにリガンドを固定化することができる技術が開示されている。具体的には、これらの特許文献に開示されている分析装置または方法を用いれば、複数のリガンドを1つずつチャネル内に導入して固定化を繰り返すことで、複数のリガンドを1つのチャネル内に固定化することができるとも考えられる。 Patent Documents 2 to 5 disclose a technique capable of immobilizing a ligand only at an arbitrary site in a microchannel without the need for the bonding step as described above after immobilization of the ligand. Specifically, by using the analysis apparatus or method disclosed in these patent documents, a plurality of ligands are introduced into the channel one by one and the immobilization is repeated. It is also considered that it can be immobilized on.
しかしながら、特許文献2ないし5の技術により、複数のリガンドを1つのチャネル内に固定化する場合、以下のような問題が生じる。 However, when a plurality of ligands are immobilized in one channel by the techniques of Patent Documents 2 to 5, the following problems arise.
一番目の問題として、リガンドの非特異吸着による問題が挙げられる。具体的には、リガンドを1つずつ固定化する際、チャネル内にリガンドを導入し規定の位置のみにそれぞれの方法を用いて固定化を行う必要がある。しかしながら、リガンドはチャネル内の任意の部位以外にも非特異的に吸着してしまうため、結果的に規定の部位以外に複数のリガンドがランダムに固定化されてしまう可能性がある。これにより、検出物質中の検体の量を正確に測定することができなくなるという問題がある。 The first problem is a problem due to nonspecific adsorption of the ligand. Specifically, when immobilizing ligands one by one, it is necessary to introduce the ligand into the channel and perform immobilization using each method only at a specified position. However, since the ligand adsorbs nonspecifically at any site other than an arbitrary site in the channel, there is a possibility that a plurality of ligands may be immobilized at random other than the specified site. Accordingly, there is a problem that the amount of the specimen in the detection substance cannot be accurately measured.
二番目の問題として、特許文献2ないし5による方法は、広く使用されているマイクロタイタープレートでの検出に使用される固定化リガンド溶液の濃度(10μg/ml以下)と比較して、非常に高い濃度が必要とされる。例えば、特許文献2ではHSA500μg/ml、特許文献3では2.5mg/ml、特許文献4では10μg/ml、特許文献5では1.25mg/mlと記載されている。高い濃度の固定化リガンド溶液を添加してもその一部のみが固定化され、大部分が固定化されず廃液と化すため、非常に生産性が悪くなる。また、リガンド溶液の濃度が高ければ高いほど、マイクロチャネル内の非特異吸着が増加する。非特異吸着が増加すると、リガンドはチャネル内の任意の部位以外にも非特異的に吸着してしまい、上述した問題が生じる。 As a second problem, the methods according to Patent Documents 2 to 5 are very high compared to the concentration of the immobilized ligand solution (less than 10 μg / ml) used for detection on a widely used microtiter plate. Concentration is required. For example, Patent Document 2 describes HSA 500 μg / ml, Patent Document 3 describes 2.5 mg / ml, Patent Document 4 describes 10 μg / ml, and Patent Document 5 describes 1.25 mg / ml. Even if a high concentration of the immobilized ligand solution is added, only a part of the ligand is immobilized, and most of the immobilized ligand solution is not immobilized and becomes a waste liquid. In addition, the higher the concentration of the ligand solution, the more nonspecific adsorption in the microchannel increases. When non-specific adsorption increases, the ligand is non-specifically adsorbed in addition to any site in the channel, causing the above-described problems.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、被検体物質の非特異的な吸着を抑えるとともに、マイクロチャネル内の規定の部位のみに固定化を行って、検体の分析を正確に行うことができる被検体物質の固定化方法および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置を提供することにある。特に、マイクロチャネル内に複数の異なる被検体物質を固定化する際に、1つのチャネルで複数の被検体物質を規定の位置に確実に固定化することができ、微量の検出物質で複数の検体を検出できる被検体物質の固定化方法および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to suppress non-specific adsorption of a substance to be analyzed, and to immobilize only a specified site in a microchannel, thereby It is an object of the present invention to provide a method for immobilizing a specimen substance capable of accurately performing the above analysis and a microanalyzer using the immobilization method. In particular, when a plurality of different analyte substances are immobilized in a microchannel, a plurality of analyte substances can be reliably immobilized at a predetermined position with a single channel, and a plurality of analytes can be detected with a small amount of detection substance. It is an object of the present invention to provide a method for immobilizing a test substance capable of detecting urine and a microanalyzer using the immobilization method.
本発明に係る被検体物質の固定化方法は、上記課題を解決するために、検体と結合可能な被検体物質をマイクロ分析装置におけるマイクロチャネルに固定化する被検体物質の固定化方法であって、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルに非特異吸着防止処理剤を接触させ、前記マイクロチャネルの中および固定化用電極に対して非特異吸着防止処理を行う非特異吸着防止工程、前記被検体物質を含む溶液のpHを調整して前記被検体物質を帯電させ、pH調整後の溶液に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤を混合して、混合液を作製する混合液作製工程、並びに、前記混合液を前記マイクロチャネルに接触させ、前記マイクロチャネルの中に設けられた前記固定化用電極と前記対向電極との間に電流を流し且つ前記固定化用電極に前記被検体物質が帯電した電位と極性が反対の電位を供給するような可変電圧を印加し、さらに前記固定化用電極に活性化エネルギーを付与して、前記被検体物質を、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と架橋させて固定化する固定化工程を含むことを特徴としている。 An analyte substance immobilization method according to the present invention is an analyte substance immobilization method for immobilizing an analyte substance that can bind to an analyte in a microchannel in a microanalyzer, in order to solve the above-described problem. The microchannel is provided with an immobilizing electrode and a counter electrode, and a nonspecific adsorption preventing treatment agent is brought into contact with the microchannel so that the microchannel and the immobilizing electrode are nonspecific. A non-specific adsorption preventing step for performing an adsorption preventing treatment, the pH of the solution containing the analyte substance is adjusted to charge the analyte substance, and the pH-adjusted solution can react with the non-specific adsorption preventing treatment agent Mixing step of preparing a mixed solution by mixing a functional group and a cross-linking agent having a functional group capable of reacting with the analyte, and bringing the mixed solution into contact with the microchannel A current is allowed to flow between the immobilization electrode provided in the microchannel and the counter electrode, and an electric potential having a polarity opposite to that of the charged electric potential of the analyte is supplied to the immobilization electrode. A non-specific adsorption prevention treatment is applied to the immobilization electrode that has been subjected to a non-specific adsorption prevention treatment by applying a variable voltage to the immobilization electrode and applying activation energy to the immobilization electrode. It is characterized by including an immobilization step of immobilizing by crosslinking with an agent.
上記の構成によれば、被検体物質を含む混合液をマイクロチャネル内に接触させて被検体物質を電気的に固定化用電極に誘引し、且つ被検体物質を架橋剤により固定化する前に、マイクロチャネルに対し非特異吸着防止処理を行うため、被検体物質がマイクロチャネル内に非特異的に吸着されることを防ぐことができる。電気的に固定化用電極に誘引した被検体物質は、架橋剤を介して結合するため、任意の場所にのみ被検体物質を固定化することが可能となる。これにより、検体の分析を正確に行うことができる。特に、本発明の固定化処理を繰り返すことにより、複数の異なる被検体物質をマイクロチャネル内の任意の場所に固定化することが可能となる。これにより、マイクロチャネル内に複数の被検体物質を固定化する際に、1つのチャネルで複数の被検体物質を規定の位置に確実に固定化することができ、検出物質中の複数の異なる検体をより正確に分析することができる。 According to the above-described configuration, before the analyte substance is electrically attracted to the electrode for immobilization by bringing the mixed liquid containing the analyte substance into contact with the microchannel, and the analyte substance is immobilized by the cross-linking agent. Since the non-specific adsorption preventing process is performed on the microchannel, the analyte substance can be prevented from being nonspecifically adsorbed in the microchannel. Since the analyte substance electrically attracted to the immobilizing electrode is bonded via the cross-linking agent, the analyte substance can be immobilized only at an arbitrary place. As a result, the sample can be accurately analyzed. In particular, by repeating the immobilization process of the present invention, it is possible to immobilize a plurality of different analyte substances at arbitrary locations in the microchannel. Thus, when a plurality of analyte substances are immobilized in the microchannel, a plurality of analyte substances can be reliably immobilized at a predetermined position in one channel, and a plurality of different specimens in the detection substance can be fixed. Can be analyzed more accurately.
本発明に係る被検体物質の固定化方法は、前記架橋剤は、光架橋剤であり、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基は、光反応性置換基であり、前記被検体物質と反応可能な官能基は、光反応性置換基を有しており、かつ前記活性化エネルギーは、光エネルギーであることが好ましい。 In the method for immobilizing an analyte according to the present invention, the crosslinking agent is a photocrosslinking agent, the functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent is a photoreactive substituent, and the analyte The functional group capable of reacting with a substance preferably has a photoreactive substituent, and the activation energy is preferably light energy.
上記の構成によれば、光架橋剤を活性化する光を照射するという簡単な操作により、被検体物質を固定化することができるという更なる効果を奏する。 According to said structure, there exists the further effect that an analyte can be fix | immobilized by simple operation of irradiating the light which activates a photocrosslinking agent.
本発明に係る被検体物質の固定化方法は、前記非特異吸着防止処理を行う前に、前記固定化用電極の少なくとも一部を合成高分子の層で被覆することが好ましい。 In the method for immobilizing an analyte substance according to the present invention, it is preferable that at least a part of the immobilization electrode is covered with a synthetic polymer layer before the nonspecific adsorption preventing treatment.
上記の構成によれば、固定化用電極上に固定化可能な領域が立体的に構築されるため、被検体物質をより高密度に固定化することができる。これにより、検体をより高感度に検出することができるという更なる効果を奏する。 According to said structure, since the area | region which can be fix | immobilized on the electrode for fixation | immobilization is built in three dimensions, a to-be-analyzed substance can be fix | immobilized more densely. Thereby, there is an additional effect that the specimen can be detected with higher sensitivity.
本発明に係る被検体物質の固定化方法では、前記固定化用電極と前記対向電極との間に印加する可変電圧は、1V以上であることが好ましい。 In the immobilization method of the analyte substance according to the present invention, it is preferable that the variable voltage applied between the immobilization electrode and the counter electrode is 1 V or more.
上記の構成によれば、より効率的に電極間に存在する被検体物質を前記固定化用電極に誘引することができる。 According to said structure, the to-be-analyzed substance which exists between electrodes can be attracted to the said electrode for fixation more efficiently.
本発明に係る被検体物質の固定化方法では、前記pH調整後の溶液における被検体物質の濃度は、0.01μg/ml以上、10μg/ml以下であることが好ましい。 In the method for immobilizing an analyte substance according to the present invention, the analyte substance concentration in the solution after pH adjustment is preferably 0.01 μg / ml or more and 10 μg / ml or less.
上記の構成によれば、被検体物質の濃度が十分に低いため、被検体物質の非特異的吸着をより抑制することができるという更なる効果を奏する。 According to said structure, since the density | concentration of analyte substance is low enough, there exists the further effect that the nonspecific adsorption | suction of analyte substance can be suppressed more.
本発明に係るマイクロ分析装置は、上記課題を解決するために、マイクロチャネルを備え、検体と結合可能な被検体物質が前記マイクロチャネルに固定化されたマイクロ分析装置であって、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルの固定化用電極は非特異吸着防止処理剤で被覆されており、前記被検体物質は、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤により、前記非特異吸着防止処理剤と架橋して固定化されていることを特徴としている。 In order to solve the above problems, a microanalyzer according to the present invention is a microanalyzer provided with a microchannel, in which an analyte substance that can bind to a specimen is immobilized on the microchannel, Is provided with an immobilization electrode and a counter electrode, the immobilization electrode of the microchannel is coated with a non-specific adsorption prevention treatment agent, and the analyte is subjected to non-specific adsorption prevention treatment. The immobilized electrode is cross-linked with the non-specific adsorption preventing treatment agent by a crosslinking agent having a functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent and a functional group capable of reacting with the analyte. It is characterized by being fixed.
上記の構成によれば、固定化用電極上に非特異吸着防止処理剤が被覆して形成された非特異吸着防止層が配置されているため、被検体物質が非特異的に吸着されることを防ぐことができる。これにより、検体の分析を正確に行うことができる。また、上記の構成によれば、固定化用電極上に非特異吸着防止処理剤で被覆されているが、架橋剤を介することで、非特異吸着防止処理剤と被検体物質とを結合させることができる。 According to the above configuration, the non-specific adsorption preventing layer formed by coating the non-specific adsorption preventing treatment agent is disposed on the immobilizing electrode, so that the analyte is adsorbed non-specifically. Can be prevented. As a result, the sample can be accurately analyzed. Further, according to the above configuration, the immobilization electrode is coated with the nonspecific adsorption preventing treatment agent, but the nonspecific adsorption preventing treatment agent and the analyte can be bound through the cross-linking agent. Can do.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記架橋剤は、光架橋剤であり、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基は、光反応性置換基であり、前記被検体物質と反応可能な官能基は、光反応性置換基を有していることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the crosslinking agent is a photocrosslinking agent, and the functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent is a photoreactive substituent, and can react with the analyte. Such functional groups preferably have a photoreactive substituent.
上記の構成によれば、光架橋剤を活性化する光を照射するという簡単な操作により、被検体物質を固定化することができるという更なる効果を奏する。 According to said structure, there exists the further effect that an analyte can be fix | immobilized by simple operation of irradiating the light which activates a photocrosslinking agent.
本発明に係るマイクロ分析装置では、固定化用電極の少なくとも一部は、合成高分子の層で被覆されており、前記合成高分子の層は、前記非特異吸着防止処理剤で被覆されていることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, at least a part of the immobilization electrode is covered with a synthetic polymer layer, and the synthetic polymer layer is covered with the non-specific adsorption preventing treatment agent. It is preferable.
上記の構成によれば、前記固定化用電極と前記非特異吸着防止層との間に、合成高分子層が配置されているため、固定化用電極上に固定化可能な領域が立体的に構築されるため、被検体物質をより高密度に固定化することができる。これにより、検体をより高感度に検出することができるという更なる効果を奏する。 According to the above configuration, since the synthetic polymer layer is disposed between the immobilization electrode and the nonspecific adsorption prevention layer, the immobilizable region is three-dimensionally formed on the immobilization electrode. As a result, the analyte substance can be immobilized at a higher density. Thereby, there is an additional effect that the specimen can be detected with higher sensitivity.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記マイクロチャネルには、2つ以上の前記固定化用電極が設けられ、前記2つ以上の固定化用電極の下流側または上流側には、対向電極が設けられていることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the microchannel is provided with two or more fixing electrodes, and a counter electrode is provided downstream or upstream of the two or more fixing electrodes. It is preferable that
上記の構成によれば、マイクロチャネル内に2つ以上の固定化用電極が設けられることで、複数の異なる被検体物質を固定化することが可能となり、1つのマイクロチャネルで複数の異なる検体を分析することができるという更なる効果を奏する。 According to the above configuration, by providing two or more immobilization electrodes in the microchannel, it is possible to immobilize a plurality of different analytes, and a plurality of different analytes can be obtained in one microchannel. There is a further effect that it can be analyzed.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための1つの注入孔および液体を排出するための1つの排出孔を更に備えており、前記注入孔と前記排出孔とは、1本の前記マイクロチャネルにより接続されていることが好ましい。 The microanalyzer according to the present invention further comprises one injection hole for bringing the liquid into contact with the microchannel and one discharge hole for discharging the liquid, and the injection hole and the discharge hole are: It is preferable that they are connected by one microchannel.
上記の構成によれば、マイクロチャネルに注入孔および排出孔が設けられているため、溶液の注入(接触)および排出が容易であるという更なる効果を奏する。 According to said structure, since the injection hole and the discharge hole are provided in the microchannel, there exists the further effect that injection | pouring (contact) and discharge | emission of a solution are easy.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための1つの注入孔および液体を排出するための2つ以上の排出孔を更に備えており、前記1つの注入孔と前記2つ以上の排出孔とを接続する前記マイクロチャネルは、前記1つの注入孔からの経路が分岐点で分岐した構造を有し、前記分岐点より下流側の前記マイクロチャネル内で、分岐されたマイクロチャネルの分岐路ごとに前記固定化用電極が設けられており、前記分岐点より上流側の前記マイクロチャネル内で、前記対向電極が設けられていることが好ましい。 The microanalyzer according to the present invention further includes one injection hole for bringing the liquid into contact with the microchannel and two or more discharge holes for discharging the liquid, the one injection hole and the 2 The microchannel connecting two or more discharge holes has a structure in which a path from the one injection hole is branched at a branch point, and the microchannel branched in the microchannel downstream from the branch point. It is preferable that the immobilizing electrode is provided for each channel branch, and the counter electrode is provided in the microchannel upstream of the branch point.
上記の構成によれば、1つの検出物質のサンプルが注入孔から注入されて、マイクロチャネル内の分岐点で分岐した後、それぞれの分岐路に設けられた固定化用電極上で検出されることになり、1つの検出物質のサンプルで複数の性質(複数の検体)を分析できるという更なる効果を奏する。例えば、酵素基質反応により基質が変化する反応を検出しようとする際、非常に有効である。 According to the above configuration, a sample of one detection substance is injected from the injection hole and branched at the branch point in the microchannel, and then detected on the immobilization electrode provided in each branch path. Thus, it is possible to analyze a plurality of properties (a plurality of specimens) with one detection substance sample. For example, it is very effective when detecting a reaction in which a substrate changes due to an enzyme substrate reaction.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記固定化用電極の下流側に、電気化学的に活性な物質を検出するための検出用電極が設けられていることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, it is preferable that a detection electrode for detecting an electrochemically active substance is provided on the downstream side of the immobilization electrode.
上記の構成によれば、検体が電気化学的に活性を持つ物質に変化する場合、その下流側にある検出用電極で変化後の物質を検出することが可能となり、より迅速かつ簡単に検体の検出を行うことができるという更なる効果を奏する。例えば、酵素基質反応により基質が電気化学的に活性を持つ物質に変化する場合に、非常に有効である。 According to the above configuration, when the specimen changes to an electrochemically active substance, the changed substance can be detected by the detection electrode on the downstream side thereof, and the specimen can be detected more quickly and easily. There is a further effect that detection can be performed. For example, it is very effective when the substrate is changed into an electrochemically active substance by an enzyme substrate reaction.
本発明に係る被検体物質の固定化方法は、上記課題を解決するために、マイクロチャネルを備え、検体と結合可能な被検体物質が前記マイクロチャネルに固定化されるマイクロ分析装置であって、前記マイクロチャネルに、該マイクロチャネルに沿う長尺状の固定化可能領域が設けられ、前記マイクロチャネルの両端には、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための1つの注入孔および液体を排出するための1つの排出孔がそれぞれ設けられており、前記注入孔の付近に誘引用電極が設けられかつ前記排出孔の付近に対向電極が設けられているか、あるいは、前記排出孔の付近に誘引用電極が設けられかつ前記注入孔の付近に対向電極が設けられており、前記被検体物質を前記マイクロチャネルに固定化する場合、非特異吸着防止処理剤により非特異吸着防止処理が施された前記固定化可能領域において、前記被検体物質と光架橋剤とを含む液体を前記注入孔から注入して前記排出孔に電気的に誘引する途中で、フォトマスクを使用して前記固定化可能領域の任意の複数の位置のみに光を照射して、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する前記光架橋剤が活性化されることにより、前記被検体物質が前記非特異吸着防止処理剤と架橋して前記固定化可能領域の任意の複数の位置に固定化されることを特徴としている。 In order to solve the above problems, a method for immobilizing an analyte according to the present invention is a microanalyzer that includes a microchannel, and an analyte that can bind to an analyte is immobilized on the microchannel, The microchannel is provided with an elongate immobilizable region along the microchannel, and at both ends of the microchannel, one injection hole for bringing the liquid into contact with the microchannel and the liquid are discharged. Each of which is provided with a reference electrode in the vicinity of the injection hole and a counter electrode in the vicinity of the discharge hole, or a reference electrode in the vicinity of the discharge hole. And a counter electrode is provided in the vicinity of the injection hole, and when immobilizing the analyte substance on the microchannel, non-specific adsorption prevention treatment In the immobilizable region that has been subjected to the non-specific adsorption prevention treatment by the liquid, the liquid containing the analyte and the photocrosslinking agent is injected from the injection hole and electrically attracted to the discharge hole. The mask has a functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent and a functional group capable of reacting with the analyte, by irradiating only a plurality of positions in the immobilizable region with light. When the photocrosslinking agent is activated, the analyte substance is cross-linked with the non-specific adsorption preventing treatment agent and immobilized at any of a plurality of positions in the immobilizable region.
上記の構成によれば、被検体物質を含む混合液をマイクロチャネル内に接触させて被検体物質を排出孔に電気的に誘引し、且つ被検体物質を架橋剤により固定化する前に、マイクロチャネルに対し非特異吸着防止処理を行うため、被検体物質がマイクロチャネル内に非特異的に吸着されることを防ぐことができる。電気的に固定化用電極に誘引した被検体物質は、架橋剤を介して結合するため、任意の場所にのみ被検体物質を固定化することが可能となる。これにより、検体の分析を正確に行うことができる。特に、フォトマスクを使用して前記固定化可能領域の任意の複数の位置のみに光を照射することにより、複数の異なる被検体物質をマイクロチャネル内の任意の場所に固定化することが可能となる。これにより、マイクロチャネル内に複数の被検体物質を固定化する際に、1つのチャネルで複数の被検体物質を規定の位置に確実に固定化することができ、検出物質中の複数の異なる検体をより正確に分析することができる。 According to the above configuration, before the sample substance is electrically attracted to the discharge hole by bringing the liquid mixture containing the substance to be in contact with the inside of the microchannel, and the analyte substance is immobilized by the cross-linking agent, Since the nonspecific adsorption preventing process is performed on the channel, it is possible to prevent the analyte substance from being nonspecifically adsorbed in the microchannel. Since the analyte substance electrically attracted to the immobilizing electrode is bonded via the cross-linking agent, the analyte substance can be immobilized only at an arbitrary place. As a result, the sample can be accurately analyzed. In particular, it is possible to immobilize a plurality of different analyte substances at arbitrary locations in the microchannel by irradiating only a plurality of positions in the immobilizable region using a photomask. Become. Thus, when a plurality of analyte substances are immobilized in the microchannel, a plurality of analyte substances can be reliably immobilized at a predetermined position in one channel, and a plurality of different specimens in the detection substance can be fixed. Can be analyzed more accurately.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記非特異吸着防止処理剤がタンパク質、合成高分子、または合成高分子とタンパク質の混合物質であることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the nonspecific adsorption preventing treatment agent is preferably a protein, a synthetic polymer, or a mixed substance of a synthetic polymer and a protein.
タンパク質の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質が非常に容易に入手することができ、且つ非特異吸着防止能が高いため、コストを減少し、非特異吸着防止をより確実に行うことができる。また、合成高分子の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質と比較して保存による劣化が非常に少ないという優位性がある。また、合成高分子とタンパク質との混合物質の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、合成高分子およびタンパク質の両方の効果を共に奏することができる。 When using a non-specific adsorption inhibitor for proteins, the protein can be obtained very easily and the non-specific adsorption prevention capability is high, thereby reducing costs and ensuring non-specific adsorption prevention more reliably. it can. In addition, when a non-specific adsorption preventing treatment agent for a synthetic polymer is used, there is an advantage that deterioration due to storage is very small as compared with protein. Moreover, when using the non-specific adsorption preventing treatment agent for the mixed substance of the synthetic polymer and protein, both the effects of the synthetic polymer and protein can be exhibited.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記合成高分子は非特異吸着防止処理剤の機能を有していることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the synthetic polymer preferably has a function of a non-specific adsorption preventing treatment agent.
これにより、合成高分子は非特異吸着防止処理剤の機能を有しているため、非特異吸着をより一層防止することができる。 Thereby, since the synthetic polymer functions as a non-specific adsorption preventing treatment agent, non-specific adsorption can be further prevented.
本発明に係るマイクロ分析装置では、上記タンパク質が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、またはゼラチンであることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the protein is preferably bovine serum albumin, casein, or gelatin.
これらのタンパク質は、入手容易性の観点から好ましい。 These proteins are preferable from the viewpoint of availability.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記合成高分子が電気的に中性であることが好ましい。また、該合成高分子としてホスホリルコリン基を有する合成高分子であることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the synthetic polymer is preferably electrically neutral. The synthetic polymer is preferably a synthetic polymer having a phosphorylcholine group.
これらの合成高分子は、タンパク質と比べ保存による劣化が非常に少ないというの観点から好ましい。更に、合成高分子により被検体物質固定化場が3次元的に形成されるため、よりたくさんの被検体物質を固定化することができる。結果として検体の検出感度が高くなる効果が期待できる。 These synthetic polymers are preferable from the viewpoint that deterioration due to storage is very small compared to proteins. Furthermore, since the analyte substance immobilization field is three-dimensionally formed by the synthetic polymer, more analyte substances can be immobilized. As a result, an effect of increasing the detection sensitivity of the sample can be expected.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記架橋剤が、4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル、または、ビス−[(4−アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド{Bis−[(4−Azidosalicylamido)ethyl]disulfide}であることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the cross-linking agent is 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid succinimide ester or bis-[(4-azidosalicylamido) ethyl] disulfide. {Bis-[(4-Azidosalylamido) ethyl] disulphide} is preferable.
これらの架橋剤は、入手容易性の観点から好ましい。 These crosslinking agents are preferable from the viewpoint of availability.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記被検体物質は、抗体または人工抗体であることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the analyte is preferably an antibody or an artificial antibody.
上記の構成によれば、抗体または人工抗体は検体との特異性が非常に高く、耐久性にも優れているという更なる効果を奏する。 According to said structure, the antibody or the artificial antibody has the further effect that specificity with a test substance is very high, and it is excellent also in durability.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記人工抗体は、合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーであることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the artificial antibody is preferably a synthetic peptide, an aptamer, or a molecular imprinting polymer.
上記の構成によれば、合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーは周知の技術にて容易に作製することができるという更なる効果を奏する。 According to said structure, there exists the further effect that a synthetic peptide, an aptamer, or a molecular imprinting polymer can be easily produced with a well-known technique.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記検体は、血液内成分であることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the specimen is preferably a blood component.
上記の構成によれば、血液検査で本発明のマイクロ分析装置を用いれば、短時間で複数検体(項目)を検出することが可能となる。 According to said structure, if the microanalyzer of this invention is used for a blood test, it will become possible to detect several samples (item) in a short time.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記血液内成分が、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびTNF−αの中の少なくとも1つを含むことが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, the blood component preferably contains at least one of adiponectin, leptin, resistin, and TNF-α.
これにより、脂質代謝異常の指標とすることが可能になる。 This can be used as an index of abnormal lipid metabolism.
本発明に係るマイクロ分析装置では、前記注入孔にポンプが接続されていることが好ましい。 In the microanalyzer according to the present invention, it is preferable that a pump is connected to the injection hole.
これにより、ポンプで送液しながら固定化を行えば、前記被検体物質は電気だけの誘引力だけでなく、ポンプによる拡散速度の影響も受けるため、より効果的に固定化することが可能となる。 This makes it possible to immobilize more effectively because the analyte is affected not only by the attraction of electricity but also by the diffusion rate of the pump. Become.
本発明に係る被検体物質の固定化方法は、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルに非特異吸着防止処理剤を接触させ、前記マイクロチャネルの中および固定化用電極に対して非特異吸着防止処理を行う非特異吸着防止工程、前記被検体物質を含む溶液のpHを調整して前記被検体物質を帯電させ、pH調整後の溶液に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤を混合して、混合液を作製する混合液作製工程、並びに、前記混合液を前記マイクロチャネルに接触させ、前記マイクロチャネルの中に設けられた前記固定化用電極と前記対向電極との間に電流を流し且つ前記固定化用電極に前記被検体物質が帯電した電位と極性が反対の電位を供給するような可変電圧を印加し、さらに前記固定化用電極に活性化エネルギーを付与して、前記被検体物質を、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と架橋させて固定化する固定化工程を含むことを特徴としている。 In the method for immobilizing an analyte according to the present invention, the microchannel includes an immobilization electrode and a counter electrode, and a nonspecific adsorption preventing treatment agent is brought into contact with the microchannel, so that the microchannel A non-specific adsorption preventing step for performing non-specific adsorption preventing treatment on the electrode for immobilization and the electrode for immobilization, adjusting the pH of the solution containing the analyte substance, charging the analyte substance, A mixed solution preparation step of preparing a mixed solution by mixing a functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent and a cross-linking agent having a functional group capable of reacting with the analyte, and the mixed solution A potential that is brought into contact with the microchannel, causes a current to flow between the immobilization electrode provided in the microchannel and the counter electrode, and the analyte is charged on the immobilization electrode; Applying a variable voltage that supplies a potential opposite in nature, and further applying activation energy to the immobilization electrode, the analyte substance is subjected to non-specific adsorption prevention treatment. The electrode includes an immobilization step of immobilizing the electrode by crosslinking with the non-specific adsorption preventing treatment agent.
本発明に係るマイクロ分析装置は、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルの固定化用電極は非特異吸着防止処理剤で被覆されており、前記被検体物質は、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤により、前記非特異吸着防止処理剤と架橋して固定化されていることを特徴としている。 In the microanalyzer according to the present invention, the microchannel includes an immobilization electrode and a counter electrode, and the microchannel immobilization electrode is coated with a non-specific adsorption preventing treatment agent, The analyte substance has a functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent and a functional group capable of reacting with the analyte substance on the immobilizing electrode that has been subjected to non-specific adsorption preventing treatment. Thus, the non-specific adsorption preventing treatment agent is cross-linked and immobilized.
それゆえ、本発明における被検体物質の固定化方法および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置は、被検体物質の非特異的な吸着を抑えるとともに、マイクロチャネル内の規定の部位のみに固定化を行って、検体の分析を正確に行うことができるという効果を奏する。 Therefore, the immobilization method of the analyte substance and the microanalyzer using the immobilization method in the present invention suppress nonspecific adsorption of the analyte substance and immobilize it only at a specified site in the microchannel. Thus, there is an effect that the sample can be analyzed accurately.
つまり、本発明によれば、微量な1サンプルから複数項目を誤認識なく、それぞれ独立して検出することができる。 That is, according to the present invention, it is possible to independently detect a plurality of items from a minute sample without erroneous recognition.
以下、本発明に係る被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置の実施形態について、図面を参照しながら説明する。 Hereinafter, embodiments of a method for immobilizing an analyte and a microanalyzer according to the present invention will be described with reference to the drawings.
〔実施の形態1〕
以下、図1〜3に基づいて、本発明の実施の形態1について説明する。図1は、本発明の実施の形態1におけるマイクロ分析装置の平面図であり、図2は、該マイクロ分析装置の固定化用電極の断面図である。また、図3は、本発明の実施の形態1における他のマイクロ分析装置の固定化用電極の断面図である。
[Embodiment 1]
Hereinafter, the first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a plan view of a microanalyzer according to Embodiment 1 of the present invention, and FIG. 2 is a cross-sectional view of an immobilizing electrode of the microanalyzer. FIG. 3 is a cross-sectional view of an immobilization electrode of another microanalyzer according to Embodiment 1 of the present invention.
<マイクロ分析装置の本体>
本発明の実施の形態1にかかるマイクロ分析装置(マイクロチャネルチップ)は、図1に示すような基板100および該基板100を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板100と蓋基板とは接着されている構造である。基板100には、注入孔1、排出孔7、および注入孔1と排出孔7とを接続する凹面のマイクロチャネル2が形成されている。
<Main body of micro analyzer>
A microanalyzer (microchannel chip) according to a first embodiment of the present invention includes a substrate 100 as shown in FIG. 1 and a lid substrate (not shown) that adheres and seals the substrate 100. The substrate 100 and the lid substrate are bonded to each other. The substrate 100 is formed with the injection hole 1, the discharge hole 7, and the concave microchannel 2 that connects the injection hole 1 and the discharge hole 7.
基板100として、絶縁性を有する基板を用いることができる。絶縁性を有する基板としては、例えば、表面に酸化膜などの絶縁性材料が形成されたシリコン基板、石英基板、酸化アルミニウム基板、ガラス基板又はプラスチック基板などを用いることができる。また、検出する時の化学発光を用いるのであれば、例えば、特開2003−149252号公報に開示されている自発蛍光が小さく且つ透明性のあるプラスチック材料を用いることもできる。 As the substrate 100, an insulating substrate can be used. As the insulating substrate, for example, a silicon substrate, a quartz substrate, an aluminum oxide substrate, a glass substrate, a plastic substrate, or the like having an insulating material such as an oxide film formed on the surface can be used. If chemiluminescence at the time of detection is used, for example, a plastic material having a small spontaneous fluorescence and transparent as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-149252 can also be used.
基板100の厚みは0.1〜5mm程度が好ましい。また、マイクロチャネル2の深さは0.1〜1000μm程度、幅は0.1〜1000μm程度が好ましい。 The thickness of the substrate 100 is preferably about 0.1 to 5 mm. The depth of the microchannel 2 is preferably about 0.1 to 1000 μm, and the width is preferably about 0.1 to 1000 μm.
マイクロチャネル2の断面形状は、矩形または台形形状とすることができる。また、流路の底は円の一部のように丸くなっていてもよい。 The cross-sectional shape of the microchannel 2 can be rectangular or trapezoidal. Moreover, the bottom of the flow path may be round like a part of a circle.
注入孔1および排出孔7は、直径が10μm以上である。また、注入孔1および排出孔7は、液体を注入および排出するため、基板100および蓋基板のいずれか一方に貫通孔として形成されている。 The injection hole 1 and the discharge hole 7 have a diameter of 10 μm or more. Further, the injection hole 1 and the discharge hole 7 are formed as through holes in either the substrate 100 or the lid substrate in order to inject and discharge the liquid.
基板100の凹凸を形成する方法は、例えば、直接加工する方法として機械加工による方法、レーザー加工による方法、金型を用いた射出成型、プレス成型、および鋳造による方法などが挙げられる。その中で、金型を用いる方法は、量産性が良く、且つ形状の再現性が高いため好ましい。 Examples of the method for forming the unevenness of the substrate 100 include a method by machining, a method by laser processing, an injection molding using a mold, a press molding, a method by casting, and the like as a direct processing method. Among them, a method using a mold is preferable because mass productivity is good and shape reproducibility is high.
また、基板100の材料がシリコンまたはガラス等である場合、基板100上のマイクロチャネル2のパターンは、従来一般的に提案されているフォトリソグラフィ法またはエッチング法により形成することができる。 When the material of the substrate 100 is silicon, glass, or the like, the pattern of the microchannel 2 on the substrate 100 can be formed by a conventionally proposed photolithography method or etching method.
<固定化用電極、対向電極および参照電極>
図1に示すように、マイクロチャネル2内には、複数のリガンドを固定化するための複数の固定化用電極3、4、5が配置されている。固定化用電極3、4、5は、直線状のマイクロチャネル2に沿って、直線状に配置されている。
<Immobilization electrode, counter electrode and reference electrode>
As shown in FIG. 1, a plurality of immobilization electrodes 3, 4, 5 for immobilizing a plurality of ligands are arranged in the microchannel 2. The immobilization electrodes 3, 4, and 5 are linearly arranged along the linear microchannel 2.
上述したように、リガンド(被検体物質)とは、検体とする物質に対して特異的に親和性を持つ化学物質を意味する。 As described above, the ligand (analyte substance) means a chemical substance having specific affinity for the substance to be analyzed.
固定化用電極3、4、5の上流側における注入孔1の近傍には、その対向電極6が配置されている。ここで、上流側または下流側とは、注入孔1から排出孔7までの流れに準じたものである。 In the vicinity of the injection hole 1 on the upstream side of the fixing electrodes 3, 4, 5, the counter electrode 6 is arranged. Here, the upstream side or the downstream side corresponds to the flow from the injection hole 1 to the discharge hole 7.
マイクロチャネル2には、さらに参照電極を設け、固定化用電極、対向電極および参照電極の3極からなる構成としてもよい。 The microchannel 2 may be further provided with a reference electrode, and may be composed of three electrodes, an immobilization electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
各電極は、従来のフォトリソグラフィ技術を利用した微細加工技術によって形成することができる。電極の導電性材料としては、例えば金、白金、銀、クロム、チタン、イリジウム、銅またはカーボンなどを用いることができる。 Each electrode can be formed by a microfabrication technique using a conventional photolithography technique. As the conductive material of the electrode, for example, gold, platinum, silver, chromium, titanium, iridium, copper, or carbon can be used.
固定化用電極3、4、5およびその対向電極6の幅は、1μmから3000μmの範囲であり、チャネル幅と等しく設定されることがより好ましい。また、各電極の形状は、図1に示すような矩形を含む多角形であってもよいし、円状であってもよい。 The widths of the fixing electrodes 3, 4, 5 and the counter electrode 6 are in the range of 1 μm to 3000 μm, and more preferably set equal to the channel width. The shape of each electrode may be a polygon including a rectangle as shown in FIG. 1 or may be a circle.
固定化用電極3、4、5のチャネル内の配置場所は、対向電極6と固定化用電極3との間隔距離が、固定化用電極3と4との間隔距離および固定化用電極4と固定化用電極5との間隔距離の10倍以上になるように配置されることが好ましい。対向電極6は、図1に示すように注入孔1の付近に配置されていてもよいし、排出孔7の付近に配置されていてもよい。 The fixing electrodes 3, 4, and 5 are arranged in the channel such that the distance between the counter electrode 6 and the fixing electrode 3 is the same as the distance between the fixing electrodes 3 and 4 and the fixing electrode 4. It is preferable that the distance between the electrode 5 and the immobilization electrode 5 is 10 times or more. The counter electrode 6 may be disposed near the injection hole 1 as shown in FIG. 1 or may be disposed near the discharge hole 7.
対向電極6と固定化用電極3との間隔距離を、固定化用電極3と固定化用電極4との間隔距離および固定化用電極4と固定化用電極5との間隔距離の10倍以上にする構成により、以下の効果が得られる。すなわち、被検体物質を含む液体をマイクロチャンネル2に入れて、固定化用電極3、4、5のそれぞれと対向電極6との間に電圧を印加した際、電圧を印加した電極間のリガンドが泳動して電極上に濃縮されることになる。しかし、固定化用電極3、4、5の互いの間隔に比べ、固定化用電極3、4、5のいずれかと対向電極6との間の間隔が十分に大きいため、固定化用電極3、4、5に濃縮されて固定される被検体物質の量は、各固定化用電極3、4、5においての不均一が少なくなる。換言すれば、複数の被検体物質を固定化する際、固定化される被検体物質の量の不均一を少なくすることができる。 The distance between the counter electrode 6 and the immobilizing electrode 3 is at least 10 times the distance between the immobilizing electrode 3 and the immobilizing electrode 4 and the distance between the immobilizing electrode 4 and the immobilizing electrode 5. According to the configuration, the following effects can be obtained. That is, when a liquid containing an analyte is put into the microchannel 2 and a voltage is applied between each of the immobilizing electrodes 3, 4, and 5 and the counter electrode 6, the ligand between the electrodes to which the voltage is applied is It migrates and is concentrated on the electrode. However, since the interval between any of the fixing electrodes 3, 4, 5 and the counter electrode 6 is sufficiently larger than the interval between the fixing electrodes 3, 4, 5, the fixing electrode 3, The amount of the analyte substance that is concentrated and fixed to 4, 5 is less uneven in each of the immobilizing electrodes 3, 4, 5. In other words, when immobilizing a plurality of analyte substances, non-uniformity in the amount of analyte substances to be immobilized can be reduced.
<非特異吸着防止処理剤>
本発明の被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置において、被検体物質を含む液体をマイクロチャンネル2に流す前に、マイクロチャンネル2に非特異吸着防止処理剤を接触させて、マイクロチャンネル2に非特異吸着防止処理剤層12(図2を参照)を設ける。ここで、「非特異吸着防止処理剤」とは、非特異的に吸着することを防止するものをいう。
<Non-specific adsorption prevention treatment agent>
In the analyte immobilization method and the microanalyzer according to the present invention, before flowing the liquid containing the analyte into the microchannel 2, the microchannel 2 is contacted with a non-specific adsorption preventing treatment agent, and the microchannel 2 is brought into contact with the microchannel 2. A non-specific adsorption preventing treatment agent layer 12 (see FIG. 2) is provided. Here, the “non-specific adsorption preventing treatment agent” refers to an agent that prevents non-specific adsorption.
該非特異吸着防止処理剤として、タンパク質、合成高分子、または合成高分子とタンパク質との混合物質が挙げられる。 Examples of the non-specific adsorption preventing treatment agent include proteins, synthetic polymers, and mixed substances of synthetic polymers and proteins.
タンパク質の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質が非常に容易に入手することができ、且つ非特異吸着防止能が高いため、コストを減少し、非特異吸着防止をより確実に行うことができる。また、合成高分子の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質と比較して保存による劣化が非常に少ないという効果がある。合成高分子とタンパク質との混合物質を用いる場合、両方の効果を共に奏することができる。 When using a non-specific adsorption inhibitor for proteins, the protein can be obtained very easily and the non-specific adsorption prevention capability is high, thereby reducing costs and ensuring non-specific adsorption prevention more reliably. it can. In addition, when a non-specific adsorption preventing treatment agent for a synthetic polymer is used, there is an effect that deterioration due to storage is very small compared to protein. When using a mixed material of a synthetic polymer and protein, both effects can be achieved.
前記タンパク質として、例えばウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、ゼラチン等を用いることができる。 Examples of the protein include bovine serum albumin (BSA), casein, and gelatin.
前記合成高分子として、電気的に中性なポリマーやホスホリルコリン基を有するポリマーなど市販品の非特異吸着防止処理剤を用いることができる。 As the synthetic polymer, a commercially available non-specific adsorption preventing treatment agent such as an electrically neutral polymer or a polymer having a phosphorylcholine group can be used.
<リガンド(被検体物質)>
リガンド溶液中のリガンドとして抗体や人工抗体が好ましい。これは、抗体または人工抗体は非常に検体との特異性が高く、耐久性にも優れているためである。また、人工抗体は合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーを用いることができる。合成ペプチド作製、アプタマー作製、分子インプリンティング作製技術は周知の技術にて作製することが容易である。
<Ligand (analyte substance)>
As the ligand in the ligand solution, an antibody or an artificial antibody is preferable. This is because an antibody or an artificial antibody has very high specificity with a specimen and is excellent in durability. Artificial antibodies can be synthetic peptides, aptamers, or molecular imprinting polymers. Synthetic peptide production, aptamer production, and molecular imprinting production techniques can be easily produced by known techniques.
リガンド溶液は、pKaや等電点からリガンドが正負いずれかに帯電するようなpHに調製される。ここで、リガンド溶液のpHは、酸性の場合3〜6、アルカリ性の場合8〜11に調整されることが好ましい。また、pH調整後のリガンド溶液の最終濃度は好ましくは0.01μg/ml以上、10μg/ml以下に調製される。これは、0.01μg/ml未満の場合、本特許による固定化法で固定化を行っても、固定化電極に十分量を固定化することができなくなり、10μg/mlを超える場合、非特異的吸着防止剤に対してもリガンドが非特異的に吸着する恐れがあるため、好ましくない。 The ligand solution is adjusted to a pH at which the ligand is charged either positively or negatively from the pKa or isoelectric point. Here, the pH of the ligand solution is preferably adjusted to 3 to 6 when acidic and 8 to 11 when alkaline. The final concentration of the ligand solution after pH adjustment is preferably adjusted to 0.01 μg / ml or more and 10 μg / ml or less. This is because when it is less than 0.01 μg / ml, a sufficient amount cannot be immobilized on the immobilized electrode even when immobilization is performed by the immobilization method according to this patent. This is also not preferable because the ligand may be adsorbed nonspecifically to the chemical adsorption inhibitor.
<架橋剤>
架橋剤としては、前記特許文献4に記載された光架橋剤が好ましい。本実施の形態1では、光架橋剤を使用している。光架橋剤としては、光反応性置換基を2つ以上有する物質、または光反応性置換基と活性物質置換基とを有する物質を用いることができる。
<Crosslinking agent>
As a crosslinking agent, the photocrosslinking agent described in the said patent document 4 is preferable. In the first embodiment, a photocrosslinking agent is used. As the photocrosslinking agent, a substance having two or more photoreactive substituents or a substance having a photoreactive substituent and an active substance substituent can be used.
光架橋剤は、その光反応性置換基がマイクロチャネルの表面に吸着された非特異吸着防止処理剤と反応し、かつ光反応性置換基または活性物質置換基がリガンドと反応することにより、活性物質と非特異吸着防止処理剤との間で橋架け結合を形成する役割を果たすものである。 The photo-crosslinking agent is activated by reacting the photoreactive substituent with the non-specific adsorption preventing agent adsorbed on the surface of the microchannel, and reacting the photoreactive substituent or active substance substituent with the ligand. It plays a role of forming a bridging bond between the substance and the non-specific adsorption preventing treatment agent.
光反応性置換基は、光反応により非特異吸着防止処理剤と反応して結合するものであればよく、例えば、アジド基、ベンゾフェノン基等が挙げられ、特にアジド基が好ましい。活性物質置換基は、リガンドと反応して結合を形成するものであればよい。例えば、リガンドがタンパク質や酵素である場合には、それらが有するアミノ基、カルボキシ基、チオール基等に対して反応性を有する置換基であることが好ましい。このような置換基としては、アミノ基、カルボキシ基、カルボン酸の活性化エステル、イソチオシアナート基、チオール基、スルフォニルクロリド等が挙げられる。このような光架橋剤としては、例えば、アジド基およびカルボン酸の活性エステルを有する化合物、アジド基およびカルボキシ基を有する化合物、アジド基およびアジド基を有する化合物等が挙げられる。具体的には、例えば、4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロ安息香酸、4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル(以下、「ATFB−SE」という。)、Bis−(4−Azidosalicylamido)ethyl]disulfide等が好ましく、特にATFB−SEが反応性、および入手容易性の観点から好ましい。 The photoreactive substituent is not particularly limited as long as it reacts with and binds to the non-specific adsorption preventing agent by photoreaction, and examples thereof include an azide group and a benzophenone group, and an azide group is particularly preferable. The active substance substituent may be any substance that reacts with a ligand to form a bond. For example, when the ligand is a protein or an enzyme, it is preferably a substituent having reactivity with an amino group, a carboxy group, a thiol group, or the like that they have. Examples of such a substituent include an amino group, a carboxy group, an activated ester of a carboxylic acid, an isothiocyanate group, a thiol group, and a sulfonyl chloride. Examples of such a photocrosslinking agent include a compound having an azide group and an active ester of a carboxylic acid, a compound having an azide group and a carboxy group, a compound having an azide group and an azide group, and the like. Specifically, for example, 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid, 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid succinimide ester (hereinafter referred to as “ATFB-”). SE ”), Bis- (4-Azidosalylamido) ethyl] disulphide and the like are preferable, and ATFB-SE is particularly preferable from the viewpoints of reactivity and availability.
また、架橋剤としては、熱架橋剤などのほかの架橋剤を用いることができる。架橋剤が有する官能基としても、上記の光反応性置換基または活性物質置換基に限られず、非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基およびリガンド(被検体物質)と反応可能な官能基を有し、熱などの活性化エネルギーの付与により、リガンドと非特異吸着防止処理剤とを架橋剤により架橋することができるものであればよい。 Moreover, as a crosslinking agent, other crosslinking agents, such as a thermal crosslinking agent, can be used. The functional group possessed by the crosslinking agent is not limited to the above-mentioned photoreactive substituent or active substance substituent, but a functional group capable of reacting with a non-specific adsorption preventing treatment agent and a ligand (analyte substance). It is sufficient that the ligand and the non-specific adsorption preventing treatment agent can be crosslinked with a crosslinking agent by applying activation energy such as heat.
<固定化方法>
以下、実施の形態1おけるリガンドの固定化方法について説明する。
<Immobilization method>
Hereinafter, the ligand immobilization method in Embodiment 1 will be described.
図1のマイクロチャンネル2に非特異吸着防止処理剤を接触させて、マイクロチャンネル2に非特異吸着防止処理剤層12(図2を参照)を形成した後、pH調整後のリガンド溶液と光架橋剤との混合液を、注入孔1からマイクロチャネル2内が十分満たされる程度の量を接触させる。 A non-specific adsorption preventing treatment agent is brought into contact with the microchannel 2 of FIG. 1 to form a non-specific adsorption preventing treatment agent layer 12 (see FIG. 2) on the microchannel 2, and then the pH-adjusted ligand solution and photocrosslinking The liquid mixture with the agent is brought into contact with an amount sufficient to fill the microchannel 2 through the injection hole 1.
次に、固定化したい固定化用電極(ここでは固定化用電極5とする)と対向電極6との間に電圧を印加する。この際、一定の電流が流れるように可変電圧を印加する。上記一定の電流の値は、絶対値で100μA以下とする。好ましくは、1μA以上、100μA以下の範囲であり、より好ましくは、1μA以上、10μA以下の範囲で設定される。 Next, a voltage is applied between the fixing electrode to be fixed (here, the fixing electrode 5) and the counter electrode 6. At this time, a variable voltage is applied so that a constant current flows. The value of the constant current is 100 μA or less in absolute value. The range is preferably 1 μA or more and 100 μA or less, and more preferably 1 μA or more and 10 μA or less.
ここで、固定化用電極5に印加する電圧は、帯電されたリガンドの極性とは反対の電位を与える必要がある。固定化用電極5にこのような電圧を印加することで、帯電したリガンドが固定化用電極5へ誘引され、濃縮される。 Here, the voltage applied to the immobilizing electrode 5 needs to be given a potential opposite to the polarity of the charged ligand. By applying such a voltage to the immobilization electrode 5, the charged ligand is attracted to the immobilization electrode 5 and concentrated.
また、電圧の印加と同時に、固定化用電極5上に光エネルギーを与える。これにより、混合液の中の光架橋剤が活性化され、固定化用電極5上に誘引濃縮されたリガンドは非特異吸着防止処理剤と光架橋剤とにより架橋される(熱架橋剤を使用する場合は、熱エネルギーを与えることになる)。光エネルギーが与えられていない部分については、光架橋剤が活性化されないため、非特異吸着防止処理剤と架橋することはない。固定化後、緩衝溶液などの洗浄溶液でマイクロチャネル内を洗浄する。これにより、固定化用電極5上の光エネルギーを与えた(固定化用電極5上の)任意の部位のみにリガンドが固定化された状態になる。 At the same time as the voltage is applied, light energy is applied to the fixing electrode 5. As a result, the photocrosslinking agent in the mixed solution is activated, and the ligand attracted and concentrated on the immobilizing electrode 5 is cross-linked by the non-specific adsorption preventing treatment agent and the photocrosslinking agent (using a thermal cross-linking agent). If you do, you will give thermal energy). Since the photocrosslinking agent is not activated in the portion to which no light energy is applied, it is not crosslinked with the non-specific adsorption preventing treatment agent. After immobilization, the inside of the microchannel is washed with a washing solution such as a buffer solution. As a result, the ligand is immobilized only at an arbitrary site (on the immobilization electrode 5) to which light energy is applied on the immobilization electrode 5.
上述した固定化方法によれば、予めマイクロチャネルに非特異吸着防止処理を行っているため、固定化用電極5の光エネルギーを与えていない部位以外のマイクロチャネル2内にはリガンドが固定化されない。 According to the above-described immobilization method, since non-specific adsorption prevention treatment is performed in advance on the microchannel, the ligand is not immobilized in the microchannel 2 other than the portion where the light energy of the immobilization electrode 5 is not applied. .
固定化用電極4および固定化用電極3に対して固定化用電極5と同様な操作を繰り返すことで、それぞれのリガンドを混入や、規定の部位以外のマイクロチャネル内での非特異吸着なく、固定化用電極4および固定化用電極3上に固定化することが可能となる。図2は、このような固定化後のマイクロ分析装置の固定化用電極を示す断面図である。図2に示すように、固定化用電極13上に、非特異吸着防止処理剤が塗布されて非特異吸着防止処理剤層12が形成されており、光架橋剤11でリガンド10と非特異吸着防止処理剤層12の間が架橋されて、リガンド10が固定化された構造になっている。 By repeating the same operation as the immobilization electrode 5 on the immobilization electrode 4 and the immobilization electrode 3, each ligand is not mixed, and there is no nonspecific adsorption in the microchannel other than the prescribed site. It is possible to immobilize on the immobilizing electrode 4 and the immobilizing electrode 3. FIG. 2 is a cross-sectional view showing the immobilization electrode of the microanalyzer after such immobilization. As shown in FIG. 2, a non-specific adsorption preventing treatment agent is applied on the immobilizing electrode 13 to form a non-specific adsorption preventing treatment agent layer 12, and the photocrosslinking agent 11 and the ligand 10 are non-specifically adsorbed. The prevention treatment agent layer 12 is cross-linked and has a structure in which the ligand 10 is immobilized.
以下、本実施の形態1におけるリガンドの固定化方法の他の構成について説明する。 Hereinafter, another configuration of the ligand immobilization method according to the first embodiment will be described.
本発明の実施の形態1におけるマイクロ分析装置において、図3に示したように、非特異吸着防止処理剤を塗布する前に、固定化用電極上29に合成高分子をコーティング(被覆)して、マイクロチャネルに、合成高分子層28を固定化用電極29の少なくとも一部を被覆するように配置することができる。 In the microanalyzer according to Embodiment 1 of the present invention, as shown in FIG. 3, before applying the nonspecific adsorption preventing treatment agent, a synthetic polymer is coated (coated) on the immobilizing electrode 29. In the microchannel, the synthetic polymer layer 28 can be disposed so as to cover at least a part of the immobilizing electrode 29.
このような処理を施すことで、固定化用電極29上に固定化できる領域を立体的に構築することが可能となる。同じ面積の固定化用電極上にリガンドを固定化する際、高分子をコーティングした方が、コーティングしない場合と比較して、2倍以上の固定化量を確保することができる。このように、高密度にリガンドを固定化したマイクロチャネルチップを用いた場合、検体の検出感度を向上させることができる。 By performing such a process, it is possible to construct a three-dimensional region that can be immobilized on the immobilizing electrode 29. When immobilizing the ligand on the immobilizing electrode having the same area, the amount of immobilization can be ensured twice or more when the polymer is coated as compared to the case where the polymer is not coated. Thus, when a microchannel chip having a ligand immobilized at a high density is used, the detection sensitivity of the specimen can be improved.
さらに、この合成高分子は非特異吸着防止処理剤の機能を有していてもよい。この場合、非特異吸着をより一層防止することができる。また、合成高分子層と非特異吸着防止処理剤層とを1つの層として形成することもでき、構造がより簡略化できる。 Furthermore, this synthetic polymer may have a function of a non-specific adsorption preventing treatment agent. In this case, non-specific adsorption can be further prevented. Further, the synthetic polymer layer and the non-specific adsorption preventing treatment agent layer can be formed as one layer, and the structure can be further simplified.
<検出物質と検体>
本発明のマイクロ分析装置の分析対象としては、検出物質中の検体である。検出物質として、例えば血液または血液を含む溶液が挙げられる。
<Detection substance and sample>
An analysis target of the microanalyzer of the present invention is a specimen in a detection substance. Examples of the detection substance include blood or a solution containing blood.
検体としては、血液内成分が挙げられる。該血液内成分として、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびTNF(Tumor Necrosis Factor)−αの中のいずれかを含むことができる。すなわち、検出物質が血液である場合、本発明のマイクロ分析装置を用いて、血液の1つのサンプルで、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびTNF−αの中のいずれか1つまたは複数を検出することができる。 Examples of the specimen include blood components. The blood component can include any of adiponectin, leptin, resistin, and TNF (Tumor Necrosis Factor) -α. That is, when the detection substance is blood, any one or more of adiponectin, leptin, resistin, and TNF-α can be detected in one sample of blood using the microanalyzer of the present invention. it can.
〔実施の形態2〕
図4は、本発明の実施の形態2にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図4に示すように、実施の形態2にかかるマイクロ分析装置(マイクロチャネルチップ)は、基板100および該基板100を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板100と蓋基板とは接着されている構造である。基板100には、注入孔30、排出孔36、および注入孔30と排出孔36接続するマイクロチャネル31が形成されている。また、実施の形態1(図1を参照)と同様に、マイクロチャネル31内に3つの固定化用電極32、33、34が配置されている。また、注入孔30の付近に、対向電極35が配置されていることも実施の形態1と同様である。
[Embodiment 2]
FIG. 4 shows the structure of the microanalyzer according to the second embodiment of the present invention. As shown in FIG. 4, the microanalyzer (microchannel chip) according to the second embodiment includes a substrate 100 and a lid substrate (not shown) that adheres and seals the substrate 100. The substrate 100 and the lid substrate are bonded to each other. The substrate 100 is formed with an injection hole 30, a discharge hole 36, and a microchannel 31 that connects the injection hole 30 and the discharge hole 36. Further, as in the first embodiment (see FIG. 1), three fixing electrodes 32, 33, and 34 are arranged in the microchannel 31. Further, the counter electrode 35 is arranged in the vicinity of the injection hole 30 as in the first embodiment.
また、実施の形態1と同様に、マイクロチャンネル31に非特異吸着防止処理剤を接触させた後、pH調整後のリガンド溶液と光架橋剤との混合液を、注入孔30からマイクロチャネル31内に接触させる。 Similarly to the first embodiment, after the non-specific adsorption preventing treatment agent is brought into contact with the microchannel 31, the mixed solution of the ligand solution and the photocrosslinking agent after pH adjustment is transferred from the injection hole 30 into the microchannel 31. Contact.
本実施の形態2における実施の形態1との異なる点は、排出孔36の付近にも対向電極37が配置されていることである。 The difference between the second embodiment and the first embodiment is that a counter electrode 37 is also disposed in the vicinity of the discharge hole 36.
実施の形態1の場合、マイクロチャネル31内の固定化用電極と対向電極の間に電圧を印加すると、電極間に存在するリガンドが固定化用電極に誘引され、濃縮される。したがって、実施の形態1における図1の構成では、マイクロチャネル2内のすべてのリガンドを固定化用電極3、4、5に誘引することは難しい。また、固定化用電極3と対向電極6との間、固定化用電極4と対向電極6との間、および固定化用電極5と対向電極6との間の距離がそれぞれ異なるため、誘引されたリガンド量がどうしても異なってしまう。 In the first embodiment, when a voltage is applied between the immobilization electrode and the counter electrode in the microchannel 31, the ligand existing between the electrodes is attracted to the immobilization electrode and concentrated. Therefore, in the configuration of FIG. 1 in the first embodiment, it is difficult to attract all the ligands in the microchannel 2 to the immobilization electrodes 3, 4, and 5. Further, the distance between the immobilizing electrode 3 and the counter electrode 6, the distance between the immobilizing electrode 4 and the counter electrode 6, and the distance between the immobilizing electrode 5 and the counter electrode 6 are different, so that they are attracted. The amount of ligands is inevitably different.
これに対し、本実施の形態2では、排出孔36の付近にも対向電極37が配置されているため、対向電極35および対向電極37と、固定化したい固定化用電極(ここでは、固定化用電極33とする)との間で同時に電圧を印加することができる。これにより、マイクロチャネル31内に存在するリガンドを、対向電極35および対向電極37から同時に両側から固定化用電極33に誘引することが可能となる。 On the other hand, in the second embodiment, since the counter electrode 37 is also arranged in the vicinity of the discharge hole 36, the counter electrode 35 and the counter electrode 37 and the fixing electrode (here, the fixing electrode) to be fixed. The voltage can be simultaneously applied to the electrode 33 for use. As a result, the ligand present in the microchannel 31 can be simultaneously attracted from both the opposing electrode 35 and the opposing electrode 37 to the immobilizing electrode 33 from both sides.
そのため、マイクロチャネル31内に存在するリガンドをより多く固定化用電極33に誘引することができ、かつ、リガンドを固定化用電極33の両側から誘引するため、誘引されたリガンドの量を均一にすることが可能となる。 Therefore, a larger amount of the ligand present in the microchannel 31 can be attracted to the immobilizing electrode 33, and the ligand is attracted from both sides of the immobilizing electrode 33, so that the amount of the attracted ligand is made uniform. It becomes possible to do.
なお、本実施の形態2において、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤を含む電気誘引固定化法は実施の形態1と同様である。 In the second embodiment, the method for adjusting the ligand solution, the electro-attractive immobilization method including the photocrosslinking agent and the non-specific adsorption preventing treatment agent are the same as those in the first embodiment.
〔実施の形態3〕
図5は、本発明の実施の形態3にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図5に示すように、実施の形態3にかかるマイクロ分析装置は、基板100および該基板100を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板100と蓋基板は接着されている構造である。基板100には、注入孔40、排出孔44、排出孔47、排出孔50、および注入孔40と排出孔44、47、50とを接続するマイクロチャネル41が形成されている。
[Embodiment 3]
FIG. 5 shows the structure of the microanalyzer according to the third embodiment of the present invention. As shown in FIG. 5, the microanalyzer according to the third embodiment includes a substrate 100 and a lid substrate (not shown) that adheres and seals the substrate 100. The substrate 100 and the lid substrate are bonded together. In the substrate 100, the injection hole 40, the discharge hole 44, the discharge hole 47, the discharge hole 50, and the microchannel 41 that connects the injection hole 40 and the discharge holes 44, 47, 50 are formed.
マイクロチャネル41は、注入孔40からのマイクロチャンネルの経路が固定化用電極の数だけ複数個(図5では3つである)に分岐した構造であり、図5のように1つの分岐点から分岐した構造であってもよいし、それぞれ違う点から分岐した構造であってもよい。 The microchannel 41 has a structure in which the path of the microchannel from the injection hole 40 is branched into a plurality (three in FIG. 5) as many as the number of fixing electrodes, and from one branch point as shown in FIG. A branched structure may be used, or a structure branched from different points.
排出孔44、47、50のそれぞれに対応して分岐されたマイクロチャネル41内の3つの分岐路に、固定化用電極42と検出用電極部43、固定化用電極45と検出用電極部46、および固定化用電極48と検出用電極部49がそれぞれ配置され、それらの対向電極51は注入孔40付近に配置されている。 The immobilization electrode 42 and the detection electrode portion 43, the immobilization electrode 45 and the detection electrode portion 46 are provided at three branch paths in the microchannel 41 branched corresponding to the discharge holes 44, 47 and 50. , And an immobilization electrode 48 and a detection electrode portion 49 are disposed, and the counter electrode 51 is disposed in the vicinity of the injection hole 40.
検出用電極部43、46、49は、それぞれ電気化学的に活性な物質を検出する作用電極とその対向電極との2極から構成されてもよいし、対向電極と作用電極と参照電極との3極から構成されてもよい。ここで、電気化学的に活性な物質としては、例えば、フェロセン、パラアミノフェノール(PAP)、フェリシアン化カリウム等が挙げられる。 Each of the detection electrode portions 43, 46, 49 may be composed of two electrodes, that is, a working electrode for detecting an electrochemically active substance and a counter electrode thereof, or a counter electrode, a working electrode, and a reference electrode. You may comprise from 3 poles. Here, examples of the electrochemically active substance include ferrocene, paraaminophenol (PAP), and potassium ferricyanide.
なお、本実施の形態3において、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤を含む電気誘引固定化法は実施の形態1と同様である。 In the third embodiment, the method for adjusting the ligand solution, the electro-attractive immobilization method including the photocrosslinking agent and the non-specific adsorption preventing treatment agent are the same as those in the first embodiment.
本発明の実施の形態3による分岐構造は、電気化学的に検体を検出する際に非常に有効である。電気化学的に検体を検出する場合、検体がリガンドに捕捉された信号を電気化学的な信号に変換し、検出用電極部で検出するといったプロセスとなる。 The branched structure according to the third embodiment of the present invention is very effective when an analyte is detected electrochemically. When the specimen is detected electrochemically, the process is such that the signal captured by the ligand in the specimen is converted into an electrochemical signal and detected by the detection electrode section.
例えば、酵素基質反応により基質が変化する反応を検出する場合、検体を捕捉した後、2次抗体による反応で酵素標識し、次いで酵素基質反応により電気化学的に活性のある物質を生成させ、検出用電極部でその濃度を検出する。 For example, when detecting a reaction in which a substrate changes due to an enzyme substrate reaction, after capturing the sample, the enzyme is labeled with a secondary antibody reaction, and then an electrochemically active substance is generated by the enzyme substrate reaction to detect it. The concentration is detected by the electrode section for use.
これに対し、図1,4のように直線状のマイクロチャネル内に固定化用電極並びに検出用電極部を配置したとすると、上流側で反応し、生成した電気化学的活性のある物質が下流側の他の検出用電極部で誤認識してしまう問題が生じる。しかしながら、図5のように、固定化用電極と検出用電極部とを一式ずつ分岐後のマイクロチャネル内に配置することで、それぞれ独立して検出用電極部にて検出することができる。 On the other hand, when the immobilization electrode and the detection electrode section are arranged in the linear microchannel as shown in FIGS. 1 and 4, the substance having electrochemical activity generated by the reaction on the upstream side is downstream. This causes a problem of misrecognition by other detection electrode portions on the side. However, as shown in FIG. 5, by arranging the immobilization electrode and the detection electrode part one by one in the microchannel after branching, detection can be performed independently by the detection electrode part.
〔実施の形態4〕
図6は、本発明の実施の形態4にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図6に示すように、実施の形態4にかかるマイクロ分析装置は、基板100および該基板100を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板100と蓋基板は接着されている構造である。基板100には、注入孔60、排出孔64、排出孔68、排出孔72、および注入孔60と排出孔64、68、72とを接続する1本のマイクロチャネル61が形成されている。
[Embodiment 4]
FIG. 6 shows the structure of the microanalyzer according to the fourth embodiment of the present invention. As shown in FIG. 6, the microanalyzer according to the fourth embodiment includes a substrate 100 and a lid substrate (not shown) that adheres and seals the substrate 100. The substrate 100 and the lid substrate are bonded together. The substrate 100 is formed with the injection hole 60, the discharge hole 64, the discharge hole 68, the discharge hole 72, and one microchannel 61 that connects the injection hole 60 and the discharge holes 64, 68, 72.
マイクロチャネル61は、注入孔60からのマイクロチャンネルの経路が固定化用電極の数だけ複数個(図6では3つである)に分岐した構造であり、図6のように1つの分岐点から分岐した構造であってもよいし、それぞれ違う点から分岐した構造であってもよい。 The microchannel 61 has a structure in which the path of the microchannel from the injection hole 60 is branched into a plurality (three in FIG. 6) of the number of electrodes for immobilization, and from one branch point as shown in FIG. A branched structure may be used, or a structure branched from different points.
排出孔64、68、72のそれぞれに対応して分岐されたマイクロチャネル61内の3つの分岐路に、固定化用電極62と検出用電極部63、固定化用電極66と検出用電極部67、および固定化用電極70と検出用電極部71がそれぞれ配置され、それらの対向電極74は注入孔60付近に配置されている。これらの構造は、図5に示す実施の形態3の構造と同様である。 Immobilization electrode 62 and detection electrode portion 63, immobilization electrode 66 and detection electrode portion 67 are arranged in three branch paths in microchannel 61 branched corresponding to each of discharge holes 64, 68 and 72. , And the immobilization electrode 70 and the detection electrode portion 71 are disposed, and the counter electrode 74 is disposed in the vicinity of the injection hole 60. These structures are the same as those of the third embodiment shown in FIG.
本実施の形態4における実施の形態3との異なる点は、排出孔64付近に対向電極65が、排出孔68付近に対向電極69が、排出孔72付近に対向電極73がそれぞれ配置されていることである。 The fourth embodiment differs from the third embodiment in that a counter electrode 65 is disposed near the discharge hole 64, a counter electrode 69 is disposed near the discharge hole 68, and a counter electrode 73 is disposed near the discharge hole 72. That is.
該構造によると、固定化する際に1つの固定化用電極に対し4つの対向電極とすることで、より多くのリガンドを固定化用電極に誘引し固定化することが可能となる。 According to this structure, it is possible to attract more ligands to the immobilization electrode and immobilize them by using four counter electrodes for one immobilization electrode when immobilizing.
なお、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤を含む電気誘引固定化法は実施の形態1と同様である。 The method for preparing the ligand solution and the method for electrically attracting and immobilizing the photocrosslinking agent and the non-specific adsorption preventing treatment agent are the same as in the first embodiment.
〔実施の形態5〕
図7は、本発明の実施の形態5にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図7に示すように、実施の形態5にかかるマイクロ分析装置は、基板100および該基板100を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板100と蓋基板は接着されている構造である。基板100には、注入孔80、排出孔84、および注入孔80と排出孔84を接続する1本のマイクロチャネル82が形成されている。
[Embodiment 5]
FIG. 7 shows the structure of the microanalyzer according to the fifth embodiment of the present invention. As shown in FIG. 7, the microanalyzer according to the fifth embodiment includes a substrate 100 and a lid substrate (not shown) that adheres and seals the substrate 100. The substrate 100 and the lid substrate are bonded together. The substrate 100 is formed with an injection hole 80, a discharge hole 84, and one microchannel 82 that connects the injection hole 80 and the discharge hole 84.
排出孔84の付近にリガンド誘引用電極85が配置され、注入孔80の付近に対向電極81が配置されている。ここで、逆に、排出孔84の付近に対向電極81が配置され、注入孔80の付近にリガンド誘引用電極85が配置されていてもよい。 A ligand reference electrode 85 is disposed in the vicinity of the discharge hole 84, and a counter electrode 81 is disposed in the vicinity of the injection hole 80. Here, conversely, the counter electrode 81 may be disposed near the discharge hole 84, and the ligand reference electrode 85 may be disposed near the injection hole 80.
実施の形態5では、前記注入孔80と排出孔84との間のマイクロチャネルに、該マイクロチャネル82に沿う長い(長尺状)固定化可能領域83が設けられている。該構造により、実施の形態5による方法では、一対の電極のみを利用し複数のリガンドを固定化することができる。 In the fifth embodiment, a long (long) immobilizable region 83 along the microchannel 82 is provided in the microchannel between the injection hole 80 and the discharge hole 84. With this structure, in the method according to Embodiment 5, a plurality of ligands can be immobilized using only a pair of electrodes.
すなわち、リガンドと光架橋剤の混合液からリガンドを電気で誘引させる際、実施の形態1ないし4では、固定化用電極まで誘引させた後に光固定化を行うが、実施の形態5では、該マイクロチャネル82に沿う固定化可能領域83を有するため、電気的に誘引している途中の固定化可能領域83で、フォトマスクを使用し固定化可能領域83内の任意の点のみに光を照射する。 That is, when the ligand is electrically attracted from the mixed solution of the ligand and the photocrosslinking agent, in Embodiments 1 to 4, photoimmobilization is performed after attracting the immobilization electrode. Since the immobilizable region 83 along the microchannel 82 is provided, light is irradiated only to an arbitrary point in the immobilizable region 83 using a photomask in the immobilizable region 83 that is being electrically attracted. To do.
これにより、光が照射した時点で光架橋剤は活性化され、その場でリガンドと非特異吸着防止処理剤とが架橋される。これを繰り返すことで、一対の電極のみで複数のリガンドをマイクロチャネル82の任意の場所に固定化することが可能となる。 As a result, the photocrosslinking agent is activated when light is irradiated, and the ligand and the non-specific adsorption preventing treatment agent are cross-linked on the spot. By repeating this, a plurality of ligands can be immobilized at an arbitrary location of the microchannel 82 with only a pair of electrodes.
なお、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤などは実施の形態1と同様である。 The ligand solution adjustment method, photocrosslinking agent, non-specific adsorption preventing treatment agent and the like are the same as those in the first embodiment.
〔実施の形態6〕
図8は、本発明の実施の形態6にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図8に示すように、実施の形態6にかかるマイクロ分析装置は、マイクロ分析装置93のマイクロチャネル92に接続するようにポンプ90を設置する構造とする。ポンプ90は、例えば、注入孔または排出孔に接続することができるが、本実施の形態では注入孔に接続する。
[Embodiment 6]
FIG. 8 shows the structure of the microanalyzer according to the sixth embodiment of the present invention. As shown in FIG. 8, the microanalyzer according to the sixth embodiment has a structure in which a pump 90 is installed so as to be connected to a microchannel 92 of the microanalyzer 93. The pump 90 can be connected to, for example, an injection hole or a discharge hole. In the present embodiment, the pump 90 is connected to the injection hole.
ポンプ90と注入孔は、チューブ91で連接される。チューブ91は実質的には必要ないが、接続するために必要であれば設置する。 The pump 90 and the injection hole are connected by a tube 91. The tube 91 is substantially unnecessary, but is installed if necessary for connection.
マイクロ分析装置93としては、実施の形態1ないし5のマイクロ分析装置を用いることができる。ポンプで送液しながら固定化を行えば、リガンドは電気だけの誘引力だけではなく、ポンプによる拡散速度も速くなるため、より効果的に固定化することが可能となる。 As the microanalyzer 93, the microanalyzer of Embodiments 1 to 5 can be used. If immobilization is carried out while pumping the solution, the ligand can be immobilized more effectively because not only the attractive force of electricity alone but also the diffusion speed of the pump is increased.
なお、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤などは実施の形態1と同様である。 The ligand solution adjustment method, photocrosslinking agent, non-specific adsorption preventing treatment agent and the like are the same as those in the first embodiment.
次に、実施例1および比較例1、2により本発明の構造による効果を説明する。 Next, effects of the structure of the present invention will be described with reference to Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
実施例1および比較例1、2では、図9に示すマイクロチャネルチップを作製した。実施例1および比較例1、2におけるマイクロ分析装置のマイクロチャネルの構造は、PDMS(Polydimethylsiloxane、東レダウコーニング社製)を用いて作製した。固定化用電極203、204と対向電極205とをともに石英基板にフォトリソグラフィ法によりレジストパターンを形成し、チタン次いで金をスパッタリングし金電極を作製した。 In Example 1 and Comparative Examples 1 and 2, the microchannel chip shown in FIG. 9 was produced. The structure of the microchannel of the microanalyzer in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 was prepared using PDMS (Polydimethylsiloxane, manufactured by Toray Dow Corning). Both the fixing electrodes 203 and 204 and the counter electrode 205 were formed on a quartz substrate by a photolithographic method, and titanium and then gold were sputtered to produce a gold electrode.
マイクロチャネル202の幅は500μm、高さは50μmで作製した。固定化用電極203、204は200μm×500μm、対向電極205は600μm×500μmとした。PDMSチャネル基板と電極基板を貼りあわせて、マイクロチャネル構造を作製した。マイクロチャネル内はBSAとホスホリルコリン基を含むMPC(Methacryloyloxyethylphosphorylcholine)ポリマー(第一器業社製)で非特異吸着防止処理を施した。 The microchannel 202 was manufactured with a width of 500 μm and a height of 50 μm. The fixing electrodes 203 and 204 were 200 μm × 500 μm, and the counter electrode 205 was 600 μm × 500 μm. A PDMS channel substrate and an electrode substrate were bonded together to produce a microchannel structure. The inside of the microchannel was subjected to non-specific adsorption prevention treatment with MPC (Methacryloyloxyethylphosphorylcholine) polymer (Daiichi Kikai Co., Ltd.) containing BSA and phosphorylcholine groups.
(実施例1)
Hilyte555(同仁化学社製)で修飾したアディポネクチン抗体(R&Dシステム社製)とFITC(Fluoresceinisothiocyanate、同仁化学社製)で修飾したレジスチン抗体をそれぞれpH3.5に調製し、最終濃度を1μg/mlに調製した。それぞれの抗体溶液には光架橋剤ATFB−SE(Thermo Fisher Scientific社製)を、抗体に対する光架橋剤のモル比が500になるよう混合した。注入孔201からFITC修飾レジスチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極203に光を照射しながら電流が−4μAになるよう電圧を印加し電気誘引光固定化を行った。次に、ツイーン20(キシダ化学社製)入りのPBS(phosphate buffer saline、和光純薬工業社製)で十分洗浄した。さらに、注入孔201からHilyte555修飾アディポネクチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極204に光を照射しながら電流が−4μAになるよう電圧を印加して電気誘引光固定化を行った。最後に、ツイーン20入りのPBSで十分洗浄した。
Example 1
Adiponectin antibody (manufactured by R & D System) modified with Hilyte 555 (manufactured by Dojindo) and resistin antibody modified with FITC (Fluoresceinisothiocyanate, manufactured by Dojindo) are each adjusted to pH 3.5, and the final concentration is adjusted to 1 μg / ml. did. Each antibody solution was mixed with a photocrosslinking agent ATFB-SE (manufactured by Thermo Fisher Scientific) so that the molar ratio of the photocrosslinking agent to the antibody was 500. The FITC-modified resistin antibody mixed solution was brought into contact through the injection hole 201, and a voltage was applied so that the current became −4 μA while irradiating light to the immobilizing electrode 203, thereby performing electro-induced light immobilization. Next, it was sufficiently washed with PBS (phosphate buffer saline, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing Tween 20 (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.). Further, the Hilite 555-modified adiponectin antibody mixed solution was brought into contact through the injection hole 201, and voltage was applied so that the current became −4 μA while irradiating the immobilizing electrode 204 with light, thereby carrying out electric induced light immobilization. Finally, the plate was thoroughly washed with PBS containing Tween 20.
(比較例1)
Hilyte555修飾アディポネクチン抗体とFITC修飾レジスチン抗体をそれぞれpH3.5に調製し、最終濃度を1μg/mlに調製した。それぞれの抗体溶液には光架橋剤ATFB−SEを混合しなかった。注入孔201からFITC修飾レジスチン抗体溶液を接触させ、固定化用電極203に光を照射しながら電流が−4μAになるよう電圧を印加して電気誘引光固定化を行った。次に、ツイーン20入りのPBSで十分洗浄した。さらに注入孔201からHilyte555修飾アディポネクチン抗体溶液を接触させ、固定化用電極204に光を照射しながら電流が−4μAになるよう電圧を印加して電気誘引光固定化を行った。最後に、ツイーン20入りのPBSで十分洗浄した。
(Comparative Example 1)
The Hyte 555 modified adiponectin antibody and the FITC modified resistin antibody were each adjusted to pH 3.5, and the final concentration was adjusted to 1 μg / ml. The photocrosslinking agent ATFB-SE was not mixed in each antibody solution. The FITC-modified resistin antibody solution was brought into contact from the injection hole 201, and a voltage was applied so that the current became −4 μA while irradiating the immobilizing electrode 203 with light, thereby performing electro-induced light immobilization. Next, the plate was thoroughly washed with PBS containing Tween 20. Furthermore, a Hilyte 555-modified adiponectin antibody solution was brought into contact with the injection hole 201, and a voltage was applied so that the current became −4 μA while irradiating the immobilization electrode 204 with light, thereby performing electro-induced light immobilization. Finally, the plate was thoroughly washed with PBS containing Tween 20.
(比較例2)
Hilyte555修飾アディポネクチン抗体とFITC修飾レジスチン抗体をそれぞれpH3.5に調製し、最終濃度を1μg/mlに調製した。それぞれの抗体溶液には光架橋剤ATFB−SEを、抗体に対する光架橋剤のモル比が500になるよう混合した。注入孔201からFITC修飾レジスチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極203に光を照射しながら電圧を印加せずに電気誘引光固定化を行った。次に、ツイーン20入りのPBSで十分洗浄した。さらに注入孔201からHilyte555修飾アディポネクチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極204に光を照射しながら電圧を印加せずに電気誘引光固定化を行った。最後に、ツイーン20入りのPBSで十分洗浄した。
(Comparative Example 2)
The Hyte 555 modified adiponectin antibody and the FITC modified resistin antibody were each adjusted to pH 3.5, and the final concentration was adjusted to 1 μg / ml. Each antibody solution was mixed with the photocrosslinking agent ATFB-SE so that the molar ratio of the photocrosslinking agent to the antibody was 500. The FITC-modified resistin antibody mixed solution was brought into contact through the injection hole 201, and the electric attraction light immobilization was performed without applying a voltage while irradiating the immobilization electrode 203 with light. Next, the plate was thoroughly washed with PBS containing Tween 20. Furthermore, a Hilyte 555-modified adiponectin antibody mixed solution was brought into contact with the injection hole 201, and the electric attraction light immobilization was performed without applying voltage while irradiating the immobilization electrode 204 with light. Finally, the plate was thoroughly washed with PBS containing Tween 20.
(実施例1と比較例1、2との比較)
それぞれの固定化用電極204を蛍光観察した。抗体に蛍光を修飾しているため、蛍光が観察された場合、マイクロチャネル内に抗体が固定化されていることを示す。
(Comparison between Example 1 and Comparative Examples 1 and 2)
Each immobilization electrode 204 was observed with fluorescence. Since fluorescence is modified in the antibody, if fluorescence is observed, it indicates that the antibody is immobilized in the microchannel.
実施例1の場合、固定化用電極上の光を当てた部位のみきれいに蛍光が観察された(図10)。光架橋剤を入れなかった比較例1の場合には、蛍光がほぼ観察されなかった(図11)。電圧を印加しなかった比較例2の場合にも、蛍光がほぼ観察されなかった(図12)。 In the case of Example 1, the fluorescence was clearly observed only at the site irradiated with light on the immobilizing electrode (FIG. 10). In the case of Comparative Example 1 in which no photocrosslinking agent was added, almost no fluorescence was observed (FIG. 11). In the case of Comparative Example 2 where no voltage was applied, almost no fluorescence was observed (FIG. 12).
これにより、本発明のマイクロ分析装置の構造で、光架橋剤を入れ且つ電圧を印加することにより、リガンドが固定化用電極に確実に固定化されることができることがわかる。 Thus, it can be seen that the ligand can be reliably immobilized on the immobilization electrode by inserting a photocrosslinking agent and applying a voltage in the structure of the microanalyzer of the present invention.
本発明は上述した各実施形態、実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the technical means disclosed in different embodiments can be appropriately combined. Such embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられる。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。 The embodiments and examples disclosed this time are examples in all respects and are not considered to be restrictive. The scope of the present invention is defined by the terms of the claims, rather than the description above, and is intended to include any modifications within the scope and meaning equivalent to the terms of the claims.
尚、以上説明した本発明は、以下のように言い換えることもできる。即ち、
(1)多項目を同時に検出するマイクロ分析装置の被検体物質の固定化方法であって、被検体物質は帯電性を有するpHに調製し、該溶液には光反応性置換基をもつ光架橋剤を混合し、被検体物質を固定化する前に非特異吸着防止処理を施したマイクロチャネル内に、前記溶液を注入し、マイクロチャネル内に設置された固定化用電極およびその対向電極との間に一定の電流が流れるように可変電圧を印加させ、さらに該固定化用電極に活性化エネルギーを与える光を照射することによる光反応によって、前記被検体物質を固定化することを特徴とする被検体物質の固定化方法。
The present invention described above can be paraphrased as follows. That is,
(1) A method for immobilizing an analyte substance of a microanalyzer that detects multiple items simultaneously, wherein the analyte substance is adjusted to a pH having a charging property, and the solution has a photocrosslinking group having a photoreactive substituent. The solution is injected into a microchannel that has been subjected to non-specific adsorption prevention treatment before immobilizing the analyte and immobilizing the analyte, and the immobilization electrode installed in the microchannel and its counter electrode A variable voltage is applied so that a constant current flows between them, and the analyte substance is immobilized by a photoreaction by irradiating the immobilizing electrode with light that gives activation energy. A method for immobilizing an analyte.
(2)上記(1)に記載の被検体物質の固定化方法において、前記マイクロ分析装置のマイクロチャネルにおいて、非特異吸着防止処理を施す前に、高分子により前記固定化用電極の少なくとも一部を被覆する被検体物質の固定化方法。 (2) In the method for immobilizing an analyte substance described in (1) above, at least a part of the immobilization electrode is made of a polymer before performing nonspecific adsorption prevention treatment in the microchannel of the microanalyzer. Method for immobilizing an analyte material that coats the substrate.
(3)上記(1)または(2)に記載の被検体物質の固定化方法において、マイクロチャネル内に設置された固定化用電極およびその対向電極との間に印加する電圧は1V以上とする被検体物質の固定化方法。 (3) In the method for immobilizing a specimen substance described in (1) or (2) above, the voltage applied between the immobilization electrode installed in the microchannel and the counter electrode is 1 V or more. A method for immobilizing an analyte.
(4)上記(1)または(2)に記載の被検体物質の固定化方法において、被検体物質の最終濃度は10μg/ml以下とする被検体物質の固定化方法。 (4) The method for immobilizing an analyte substance according to (1) or (2) above, wherein the final concentration of the analyte substance is 10 μg / ml or less.
(5)多項目を同時に検出するマイクロ分析装置であって、固定化用電極上に非特異吸着防止処理剤が被覆され、さらに被検体物質が光反応性置換基をもつ光架橋剤により非特異吸着防止処理との間を架橋した構造を特徴とするマイクロ分析装置。 (5) A microanalyzer that detects multiple items simultaneously, in which a non-specific adsorption preventing treatment agent is coated on an immobilizing electrode, and the analyte is non-specific by a photocrosslinking agent having a photoreactive substituent. A microanalyzer characterized by a cross-linked structure between the adsorption prevention treatment.
(6)上記(5)に記載のマイクロ分析装置において、固定化用電極上の少なくとも一部を高分子で被覆され、その上に非特異吸着防止処理剤が被覆され、さらに被検体物質が光反応性置換基をもつ光架橋剤により非特異吸着防止処理との間を架橋した構造を特徴とするマイクロ分析装置。 (6) In the microanalyzer described in (5) above, at least a part of the immobilization electrode is coated with a polymer, a non-specific adsorption preventing treatment agent is further coated thereon, and the analyte is further irradiated with light. A microanalyzer characterized by a structure in which a non-specific adsorption preventing treatment is crosslinked by a photocrosslinking agent having a reactive substituent.
(7)上記(5)または(6)に記載のマイクロ分析装置において、マイクロチャネル内に2つ以上の固定化用電極を設け、その下流または上流側に(1つの)対向電極を設けるマイクロ分析装置。 (7) The microanalysis apparatus according to (5) or (6), wherein two or more immobilization electrodes are provided in the microchannel, and (one) counter electrode is provided downstream or upstream thereof. apparatus.
(8)上記(7)に記載のマイクロ分析装置において、前記マイクロチャネルが、溶液を注入する注入孔1つと溶液を排出する排出孔1つを接続する1本のマイクロチャネルで構成された構造を特徴とするマイクロ分析装置。 (8) In the microanalyzer described in (7) above, the microchannel has a structure composed of one microchannel connecting one injection hole for injecting a solution and one discharge hole for discharging the solution. Features a micro-analyzer.
(9)上記(7)に記載のマイクロ分析装置において、前記マイクロチャネルが、溶液を注入する注入孔1つと溶液を排出する2つ以上の排出孔に接続するため途中で分岐した構造であり、分岐点より下流側のマイクロチャネル内に固定化用電極を分岐したチャネル分設け、分岐点より上流側のマイクロチャネル内に対向電極1つ設けるマイクロ分析装置。 (9) In the microanalyzer described in (7) above, the microchannel has a structure branched in the middle to connect to one injection hole for injecting the solution and two or more discharge holes for discharging the solution, A microanalyzer in which an immobilization electrode is branched in a microchannel downstream from a branch point, and one counter electrode is provided in a microchannel upstream from the branch point.
(10)上記(9)に記載のマイクロ分析装置において、固定化用電極の下流側に電気化学的に活性な物質を検出する検出用電極を設けるマイクロ分析装置。 (10) The microanalyzer according to the above (9), wherein a detection electrode for detecting an electrochemically active substance is provided downstream of the immobilization electrode.
(11)上記(5)〜(10)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤がタンパク質であるマイクロ分析装置。 (11) The microanalyzer according to any one of (5) to (10) above, wherein the non-specific adsorption preventing treatment agent is a protein.
(12)上記(5)〜(10)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤が合成高分子であるマイクロ分析装置。 (12) The microanalyzer according to any one of (5) to (10) above, wherein the non-specific adsorption preventing treatment agent is a synthetic polymer.
(13)上記(5)〜(10)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤が合成高分子とタンパク質の混合物質であるマイクロ分析装置。 (13) The microanalyzer according to any one of (5) to (10), wherein the non-specific adsorption preventing treatment agent is a mixed substance of a synthetic polymer and a protein.
(14)上記(11)または(13)に記載のマイクロ分析装置において、上記タンパク質は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、且つまたはゼラチンであるマイクロ分析装置。 (14) The microanalyzer according to (11) or (13) above, wherein the protein is bovine serum albumin, casein, and / or gelatin.
(15)上記(12)または(13)に記載のマイクロ分析装置において、前記合成高分子が電気的に中性であるマイクロ分析装置。 (15) The microanalyzer according to the above (12) or (13), wherein the synthetic polymer is electrically neutral.
(16)上記(15)に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤がホスホリルコリン基を有する合成高分子であるマイクロ分析装置。 (16) The microanalyzer according to (15), wherein the non-specific adsorption preventing treatment agent is a synthetic polymer having a phosphorylcholine group.
(17)上記(5)〜(16)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、前記光反応性基を有する光架橋剤が、4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル、Bis−(4−Azidosalicylamido)ethyl]disulfideであるマイクロ分析装置。 (17) In the microanalyzer according to any one of (5) to (16) above, the photocrosslinking agent having a photoreactive group is 4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro. Microanalyzer, which is benzoic acid succinimide ester, Bis- (4-Azidosalylamido) ethyl] disulphide.
(18)上記(5)〜(17)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、前記被検体物質が、抗体または人工抗体であるマイクロ分析装置。 (18) The microanalyzer according to any one of (5) to (17) above, wherein the analyte is an antibody or an artificial antibody.
(19)上記(18)に記載のマイクロ分析装置において、前記人工抗体は合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーであるマイクロ分析装置。 (19) The microanalyzer according to the above (18), wherein the artificial antibody is a synthetic peptide, aptamer, or molecular imprinting polymer.
(20)上記(5)〜(19)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、検出物質が、血液内成分であるマイクロ分析装置。 (20) The microanalyzer according to any one of (5) to (19) above, wherein the detection substance is a blood component.
(21)上記(20)に記載のマイクロ分析装置において、前記血液成分が、アディポネクチン、レプチン、レジスチン、TNF−αのいずれかを含むマイクロ分析装置。 (21) The microanalyzer according to (20), wherein the blood component includes any one of adiponectin, leptin, resistin, and TNF-α.
(22)上記(5)〜(21)の何れか1項に記載のマイクロ分析装置において、注入孔にポンプを接続するマイクロ分析装置。 (22) The microanalyzer according to any one of (5) to (21), wherein a pump is connected to the injection hole.
本発明の被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置によると、微量なサンプル量で、迅速かつ高感度な測定を複数同時に行うことができる。これにより、本発明は、微小な化学物質等を検出するために用いるマイクロチャネルチップ、マイクロリアクター等の化学マイクロデバイスやアレルゲンセンサーをはじめとするバイオセンサーなど、μ−TAS技術を用いたマイクロチャネルチップを利用する分野に適用することができる。 According to the analyte substance immobilization method and the microanalyzer of the present invention, a plurality of rapid and highly sensitive measurements can be simultaneously performed with a small amount of sample. Accordingly, the present invention provides a microchannel chip using μ-TAS technology, such as a microchannel chip used to detect a minute chemical substance, a chemical microdevice such as a microreactor, and a biosensor such as an allergen sensor. It can be applied to fields that use.
1、30、40、60、80、102、201 注入孔
2、31、41、61、82、92、101、202 マイクロチャネル
3、4、5、13、29、32、33、34、42、45、48、62、66、70、203、204 固定化用電極
6、35、37、51、65、69、73、74、81、205 対向電極
7、36、44、47、50、64、68、72、84、104、206 排出孔
10、25 リガンド(被検体物質)
11、26 光架橋剤(架橋剤)
12、27 非特異吸着防止処理剤層
28 合成高分子層
43、46、49、63、67、71 検出用電極部
83 固定化可能領域
85 リガンド誘引電極
90 ポンプ
91 チューブ
93 マイクロ分析装置
100 基板
103 液だめ部
105 リガンド固定部
120 被検体物質
121 標識物質
122、125 抗体
123 標識抗体
124 免疫複合体
126 複合体
1, 30, 40, 60, 80, 102, 201 Injection hole 2, 31, 41, 61, 82, 92, 101, 202 Microchannel 3, 4, 5, 13, 29, 32, 33, 34, 42, 45, 48, 62, 66, 70, 203, 204 Immobilization electrode 6, 35, 37, 51, 65, 69, 73, 74, 81, 205 Counter electrode 7, 36, 44, 47, 50, 64, 68, 72, 84, 104, 206 Discharge hole 10, 25 Ligand (analyte substance)
11, 26 Photocrosslinking agent (crosslinking agent)
12, 27 Non-specific adsorption preventing treatment agent layer 28 Synthetic polymer layer 43, 46, 49, 63, 67, 71 Detection electrode part 83 Immobilizable region 85 Ligand attracting electrode 90 Pump 91 Tube 93 Microanalyzer 100 Substrate 103 Pool part 105 Ligand fixing part 120 Sample substance 121 Labeled substance 122, 125 Antibody 123 Labeled antibody 124 Immune complex 126 Complex
Claims (26)
前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、
前記マイクロチャネルに非特異吸着防止処理剤を接触させ、前記マイクロチャネルの中および固定化用電極に対して非特異吸着防止処理を行う非特異吸着防止工程、
前記被検体物質を含む溶液のpHを調整して前記被検体物質を帯電させ、pH調整後の溶液に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤を混合して、混合液を作製する混合液作製工程、並びに、
前記混合液を前記マイクロチャネルに接触させ、前記マイクロチャネルの中に設けられた前記固定化用電極と前記対向電極との間に電流を流し且つ前記固定化用電極に前記被検体物質が帯電した電位と極性が反対の電位を供給するような可変電圧を印加し、さらに前記固定化用電極に活性化エネルギーを付与して、前記被検体物質を、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と架橋させて固定化する固定化工程
を含むことを特徴とする被検体物質の固定化方法。 A method of immobilizing an analyte substance that immobilizes an analyte substance that can bind to an analyte in a microchannel in a microanalyzer,
The microchannel is provided with an immobilization electrode and a counter electrode,
A non-specific adsorption preventing step of bringing a non-specific adsorption preventing treatment agent into contact with the micro channel and performing non-specific adsorption preventing treatment on the microchannel and the immobilization electrode;
The pH of the solution containing the analyte is adjusted to charge the analyte, and the pH-adjusted solution can react with the functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent and the analyte A mixed liquid preparation step of mixing a crosslinking agent having a functional group to prepare a mixed liquid, and
The mixed solution is brought into contact with the microchannel, a current is passed between the immobilization electrode and the counter electrode provided in the microchannel, and the analyte substance is charged on the immobilization electrode. Applying a variable voltage that supplies a potential opposite in polarity to the potential, further applying activation energy to the immobilization electrode, and immobilizing the analyte substance on the non-specific adsorption prevention treatment A method for immobilizing an analyte, comprising an immobilization step of immobilizing the immobilization electrode by crosslinking with the non-specific adsorption preventing treatment agent.
前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、
前記マイクロチャネルの固定化用電極は非特異吸着防止処理剤で被覆されており、
前記被検体物質は、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤により、前記非特異吸着防止処理剤と架橋して固定化されていることを特徴とするマイクロ分析装置。 A microanalyzer comprising a microchannel and an analyte substance that can bind to a specimen immobilized on the microchannel,
The microchannel is provided with an immobilization electrode and a counter electrode,
The electrode for immobilizing the microchannel is coated with a non-specific adsorption preventing treatment agent,
The analyte substance has a functional group capable of reacting with the non-specific adsorption preventing treatment agent and a functional group capable of reacting with the analyte substance on the immobilizing electrode that has been subjected to non-specific adsorption preventing treatment. The microanalyzer is characterized by being cross-linked and immobilized with the non-specific adsorption preventing treatment agent.
前記合成高分子の層は、前記非特異吸着防止処理剤で被覆されていることを特徴とする請求項6または7に記載のマイクロ分析装置。 At least a part of the immobilizing electrode is covered with a synthetic polymer layer,
8. The microanalyzer according to claim 6, wherein the synthetic polymer layer is coated with the non-specific adsorption preventing treatment agent.
前記2つ以上の固定化用電極の下流側または上流側には、対向電極が設けられていることを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載のマイクロ分析装置。 The microchannel is provided with two or more immobilization electrodes,
The microanalyzer according to any one of claims 6 to 8, wherein a counter electrode is provided on the downstream side or the upstream side of the two or more immobilization electrodes.
前記注入孔と前記排出孔とは、1本の前記マイクロチャネルにより接続されていることを特徴とする請求項6〜9のいずれか1項に記載のマイクロ分析装置。 And further comprising one injection hole for bringing the liquid into contact with the microchannel and one discharge hole for discharging the liquid,
The microanalyzer according to any one of claims 6 to 9, wherein the injection hole and the discharge hole are connected by one microchannel.
前記1つの注入孔と前記2つ以上の排出孔とを接続する前記マイクロチャネルは、前記1つの注入孔からの経路が分岐点で分岐した構造を有し、
前記分岐点より下流側の前記マイクロチャネルの中には、分岐されたマイクロチャネルの分岐路ごとに前記固定化用電極が設けられており、
前記分岐点より上流側の前記マイクロチャネルの中には、前記対向電極が設けられていることを特徴とする請求項6〜9のいずれか1項に記載のマイクロ分析装置。 And further comprising one injection hole for bringing the liquid into contact with the microchannel and two or more discharge holes for discharging the liquid,
The microchannel connecting the one injection hole and the two or more discharge holes has a structure in which a path from the one injection hole branches at a branch point;
In the microchannel downstream from the branch point, the immobilization electrode is provided for each branch path of the branched microchannel,
The microanalyzer according to any one of claims 6 to 9, wherein the counter electrode is provided in the microchannel upstream of the branch point.
前記マイクロチャネルに、該マイクロチャネルに沿う長尺状の固定化可能領域が設けられ、前記マイクロチャネルの両端には、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための1つの注入孔および液体を排出するための1つの排出孔がそれぞれ設けられており、
前記注入孔の付近に誘引用電極が設けられかつ前記排出孔の付近に対向電極が設けられているか、もしくは、前記排出孔の付近に誘引用電極が設けられかつ前記注入孔の付近に対向電極が設けられており、
前記被検体物質を前記マイクロチャネルに固定化する場合、非特異吸着防止処理剤により非特異吸着防止処理が施された前記固定化可能領域において、前記被検体物質と光架橋剤とを含む液体を前記注入孔から注入して前記排出孔に電気的に誘引する途中で、フォトマスクを使用して前記固定化可能領域の複数の位置に光を照射して、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する前記光架橋剤が活性化されることにより、前記被検体物質が前記非特異吸着防止処理剤と架橋して前記固定化可能領域の複数の位置に固定化されることを特徴とするマイクロ分析装置。 A microanalyzer comprising a microchannel and an analyte substance that can bind to a specimen immobilized on the microchannel,
The microchannel is provided with an elongate immobilizable region along the microchannel, and at both ends of the microchannel, one injection hole for bringing the liquid into contact with the microchannel and the liquid are discharged. Each has one discharge hole,
A reference electrode is provided in the vicinity of the injection hole and a counter electrode is provided in the vicinity of the discharge hole, or a reference electrode is provided in the vicinity of the discharge hole and the counter electrode is in the vicinity of the injection hole Is provided,
When immobilizing the analyte substance on the microchannel, a liquid containing the analyte substance and a photocrosslinking agent is provided in the immobilizable region that has been subjected to the nonspecific adsorption prevention treatment with the nonspecific adsorption prevention treatment agent. While injecting from the injection hole and electrically attracting to the discharge hole, a photomask is used to irradiate light to a plurality of positions of the immobilizable region to react with the non-specific adsorption preventing treatment agent. The immobilizable region is formed by crosslinking the analyte substance with the non-specific adsorption preventing treatment agent by activating the photocrosslinking agent having a functional group capable of reacting with the analyte substance. A microanalyzer fixed at a plurality of positions.
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