JP4517081B2 - Immunosensor device - Google Patents
Immunosensor device Download PDFInfo
- Publication number
- JP4517081B2 JP4517081B2 JP2005371003A JP2005371003A JP4517081B2 JP 4517081 B2 JP4517081 B2 JP 4517081B2 JP 2005371003 A JP2005371003 A JP 2005371003A JP 2005371003 A JP2005371003 A JP 2005371003A JP 4517081 B2 JP4517081 B2 JP 4517081B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immunosensor
- polymer
- target molecule
- thin film
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
本発明は、生体試料溶液中に存在するペプチド、タンパク等を測定する免疫センサの検出部に使用する免疫センサ用デバイスに関する。 The present invention relates to an immunosensor device used in a detection unit of an immunosensor that measures peptides, proteins and the like present in a biological sample solution.
従来、生体中のタンパク質やペプチド類を測定する方法として、これら標的分子に対する抗体等の分子認識能力を利用した免疫測定法が盛んに行われている。しかしながら、生体試料の測定においては、測定に使用するセンサの検出部表面に試料溶液中の標的としないタンパク等の非特異的な吸着が起こるために定量的な結果を得ることが困難であるという問題点があった。
したがって、標的としない分子の非特異的吸着を抑制し精度良く検出するためには、（１）標的としないタンパク等の非特異的な吸着を抑制する膜をセンサの検出部分にコーティングする、或いは、（２）前処理として、試料溶液中の血液成分を分離精製を行う、等の煩雑な操作が必要である。
Conventionally, as a method for measuring proteins and peptides in a living body, an immunoassay method using molecular recognition ability such as an antibody against these target molecules has been actively performed. However, in the measurement of biological samples, it is difficult to obtain quantitative results because non-specific adsorption of untargeted proteins etc. in the sample solution occurs on the detection part surface of the sensor used for the measurement. There was a problem.
Therefore, in order to suppress non-specific adsorption of non-target molecules and detect them with high accuracy, (1) coating the detection portion of the sensor with a film that suppresses non-specific adsorption of non-target proteins or the like, or (2) As pretreatment, complicated operations such as separation and purification of blood components in the sample solution are required.
従来、タンパク等の非特異的吸着を抑制する膜に関しては、生体成分が材料表面に付着しないように疎水性の高い高分子、例えばポリテトラフルオロエチレンやポリジメチルシロキサン、ポリウレタンなどが用いられてきた（非特許文献１）。
これとは反対に、材料表面を親水性の高い高分子、例えばポリ（２-ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリアクリルアミドなどを用いて界面自由エネルギーの低い表面を形成し、生体成分の付着を抑制する試みも行われてきた（非特許文献２）。
生体成分を測定する免疫センサの検出部に用いられるデバイスには、疎水性膜によるコーティングでは測定対象分子の拡散が阻害され測定が困難になる場合があるため、主に親水性の膜を検出部分に固定化し、用いられてきた（非特許文献３）。近年、ポリエチレングリコールやメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、デキストランなど、非特異吸着を抑制可能なポリマーの分析デバイスへの応用が試みられている。
しかしながら、これら従来の技術では、高分子膜形成の際に有機溶媒を用いる場合や紫外線を照射し架橋等を行う必要があるものも多く、煩雑な操作を必要とする等の問題があった。近年、タンパク吸着を高効率に抑制可能な膜が開発されているものの、抗原抗体反応を利用した免疫分析デバイスへ応用する際には、上記膜に抗体を固定化する必要があり、抗体を固定化するために必要な官能基が不足していたり、抗体を膜に固定化することにより本来の抗体の活性が低下してしまうという問題点があった。 However, in these conventional techniques, there are many cases in which an organic solvent is used for forming a polymer film, and there are many cases where it is necessary to perform crosslinking or the like by irradiating ultraviolet rays, which requires complicated operations. In recent years, membranes that can suppress protein adsorption with high efficiency have been developed, but when applied to immunoassay devices that utilize antigen-antibody reactions, it is necessary to immobilize antibodies on the membrane, and the antibodies are immobilized. There is a problem that the functional group necessary for the formation of the antibody is insufficient, or that the activity of the original antibody is reduced by immobilizing the antibody on the membrane.
したがって、本発明はこれら従来技術の問題点を解消して、免疫センサの検出部への非特異的なタンパク吸着を抑制することができるとともに、検出部に結合された抗体等の活性を低下させることなく、安定かつ高感度で標的分子を検出することのできる免疫センサの検出部に使用する免疫センサ用デバイスを提供することを目的とする。 Therefore, the present invention solves these problems of the prior art, can suppress nonspecific protein adsorption to the detection part of the immunosensor, and reduces the activity of the antibody or the like bound to the detection part. An object of the present invention is to provide a device for an immunosensor that is used in a detection part of an immunosensor that can detect a target molecule stably and with high sensitivity.
本発明では、上記課題を解決するために、次のような構成１〜８を採用する。
１．標的分子の検出部を、ポリカチオン性高分子の側鎖のカチオン性基とポリアニオン性高分子の側鎖のアニオン性基のモル比が３．５：６．５〜４．５：５．５となるように混合したポリカチオン性高分子とポリアニオン性高分子の混合高分子膜により被覆し、該混合高分子膜の側鎖に標的分子に対する免疫反応性結合基を結合したことを特徴とする免疫センサ用デバイス。
２．免疫反応性結合基が標的分子に対する抗体又は抗体の抗原結合性断片であることを特徴とする１に記載の免疫センサ用デバイス。
３．ポリカチオン性高分子が側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸であることを特徴とする１又は２に記載の免疫センサ用デバイス。
４．ポリアニオン性高分子が側鎖にスルホン酸基を有するスチレン系重合体であることを特徴とする１〜３のいずれかに記載の免疫センサ用デバイス。
５．標的分子の検出部を絶縁性基板の上に金属薄膜を形成し、該金属薄膜の表面を前記混合高分子膜により被覆することにより構成したことを特徴とする１〜４のいずれかに記載の免疫センサ用デバイス。
６．金属薄膜を金、銀、銅、アルミニウムから選択された金属により構成したことを特徴とする５に記載の免疫センサ用デバイス。
７．標的分子の検出部に標的分子を含有する試料の流路を形成し、該流路の表面を混合高分子膜により被覆したことを特徴とする１〜６のいずれかに記載の免疫センサ用デバイス。
８．溝状の流路を形成したプラスチック基板を、該流路が絶縁性基板上に形成した金属薄膜の表面に被覆した混合高分子膜に接するようにして積層したことを特徴とする７に記載の免疫センサ用デバイス。
In the present invention, the following configurations 1 to 8 are employed in order to solve the above problems.
1. The detection part of the target molecule has a molar ratio of the cationic group of the side chain of the polycationic polymer to the anionic group of the side chain of the polyanionic polymer of 3.5: 6.5 to 4.5: 5.5. It is characterized in that it is coated with a mixed polymer membrane of a polycationic polymer and a polyanionic polymer mixed so that an immunoreactive binding group for a target molecule is bound to the side chain of the mixed polymer membrane. Device for immunosensor.
2. 2. The immunosensor device according to 1, wherein the immunoreactive binding group is an antibody against the target molecule or an antigen-binding fragment of the antibody.
3. 3. The immunosensor device according to 1 or 2, wherein the polycationic polymer is a polyamino acid having an amino group in a side chain.
4). 4. The immunosensor device according to any one of 1 to 3, wherein the polyanionic polymer is a styrene polymer having a sulfonic acid group in the side chain.
5). 5. The target molecule detection portion is formed by forming a metal thin film on an insulating substrate, and covering the surface of the metal thin film with the mixed polymer film. Device for immunosensor.
6). 6. The immunosensor device according to 5, wherein the metal thin film is made of a metal selected from gold, silver, copper, and aluminum.
7). 7. The immunosensor device according to any one of 1 to 6, wherein a flow path for a sample containing a target molecule is formed in a target molecule detection portion, and the surface of the flow path is covered with a mixed polymer film. .
8). 8. The plastic substrate having a groove-like channel formed thereon is laminated so that the channel is in contact with a mixed polymer film coated on the surface of a metal thin film formed on an insulating substrate. Device for immunosensor.
本発明によれば、試料溶液中に含まれる標的分子以外のタンパク等が免疫センサの検出部へ非特異的に吸着するのを抑制することができ、免疫センサの検出部に結合された抗体等の活性を低下させることなく、安定かつ高感度で標的分子を検出することのできる免疫センサの検出部に使用する免疫センサ用デバイスを得ることができる。 According to the present invention, it is possible to suppress non-specific adsorption of proteins other than the target molecule contained in the sample solution to the detection part of the immunosensor, and antibodies and the like bound to the detection part of the immunosensor It is possible to obtain an immunosensor device for use in a detection part of an immunosensor that can detect a target molecule stably and with high sensitivity without reducing the activity of the sensor.
本発明では、免疫センサの検出部に使用する免疫センサ用デバイスの標的分子の検出部を、ポリカチオン性高分子の側鎖のカチオン性基とポリアニオン性高分子の側鎖のアニオン性基のモル比が３．５：６．５〜４．５：５．５となるように混合したポリカチオン性高分子とポリアニオン性高分子の混合高分子膜により被覆し、該混合高分子膜の側鎖に標的分子に対する免疫反応性結合基を結合することにより免疫センサ用デバイスを構成する。 In the present invention, the detection part of the target molecule of the immunosensor device used in the detection part of the immunosensor is a molar group of the cationic group of the side chain of the polycationic polymer and the anionic group of the side chain of the polyanionic polymer. Coated with a mixed polymer membrane of polycationic polymer and polyanionic polymer mixed so that the ratio is 3.5: 6.5 to 4.5: 5.5, and the side chain of the mixed polymer membrane A device for an immunosensor is constructed by binding an immunoreactive binding group for a target molecule to a target molecule.
本発明において混合高分子膜を形成する高分子材料としては、液中で各々カチオン性、或いはアニオン性を示す高分子であれば特に制限はない。
例えば、ポリカチオン性高分子としては、ポリリジン、ポリヒスチジン等のポリアミノ酸；ポリジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルアクリレート、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリジエチルアクリルアミド、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリジプロピルアミノエチルメタクリレート、ポリジエチルアクリルアミド等のアクリル系重合体；ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、ポリ（Ｎ−アルキル−４−ビニルピリジニウムクロリド）、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、が挙げられる。好ましいポリカチオン性高分子としては、ポリリジン、ポリヒスチジン等のポリアミノ酸、特にポリリジンが挙げられる。
In the present invention, the polymer material for forming the mixed polymer film is not particularly limited as long as it is a polymer that is cationic or anionic in the liquid.
For example, polycationic polymers include polyamino acids such as polylysine and polyhistidine; polydiethylaminoethyl methacrylate, polydimethylaminoethyl acrylate, polydimethylaminopropyl acrylamide, polydimethylacrylamide, polydiethylacrylamide, polydimethylaminoethyl methacrylate, Acrylic polymers such as polydiethylaminoethyl methacrylate, polydipropylaminoethyl methacrylate, polydiethylacrylamide; polyallylamine, polyvinylamine, polyethyleneimine, poly (N-alkyl-4-vinylpyridinium chloride), polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride, Can be mentioned. Preferred polycationic polymers include polyamino acids such as polylysine and polyhistidine, especially polylysine.
また、ポリアニオン性高分子としては、ポリスチレンスルホン酸等のスルホン酸基を有するスチレン系重合体、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンリン酸およびポリリン酸等があげられる。好ましいポリアニオン性高分子としては、ポリスチレンスルホン酸の単独重合体或いは共重合体等のスルホン酸基を有するスチレン系重合体が挙げられる。
これらの混合高分子膜を構成する高分子材料としては、市販されているものを使用することができる。
Examples of polyanionic polymers include styrene polymers having a sulfonic acid group such as polystyrene sulfonic acid, polyglutamic acid, polyaspartic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinyl sulfonic acid, polystyrene phosphoric acid, and polyphosphoric acid. Can be given. Preferable polyanionic polymers include styrene-based polymers having a sulfonic acid group such as a homopolymer or copolymer of polystyrene sulfonic acid.
As the polymer material constituting these mixed polymer films, commercially available materials can be used.
本発明の免疫センサ用デバイスは、例えば免疫センサの検出部を構成する絶縁性基板の上に、金属薄膜を形成し、該金属薄膜の表面を上記の混合高分子膜で被覆し、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等をもちいて混合高分子膜の側鎖に標的分子に対する免疫反応性結合基を結合することによって構成することができる。
免疫反応性結合基としては、通常は標的分子に対する抗体又は抗体の抗原結合性断片が使用されるが、抗原を使用することもできる。
The immunosensor device of the present invention comprises, for example, a metal thin film formed on an insulating substrate that constitutes a detection part of an immunosensor, and the surface of the metal thin film is covered with the above mixed polymer film. It can be constructed by binding an immunoreactive binding group for the target molecule to the side chain of the mixed polymer membrane using aldehyde or the like.
As the immunoreactive binding group, an antibody against a target molecule or an antigen-binding fragment of an antibody is usually used, but an antigen can also be used.
本発明の免疫センサ用デバイスを使用して測定される測定対象分子は、抗原性を有するものであれば特に限定されない。具体的な測定対象分子としては、例えばサイトカインなどのタンパク、ペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド等が挙げられ、中でもサイトカイン類、特にＴＮＦ−αが好ましい。サイトカインの一つであるＴＮＦ−αは、健常人の血液中においては数ｐｇ／ｍＬ以下であるが、ガン等においてその濃度が上昇し、医療分野における重要なマーカー分子である。 The molecule to be measured that is measured using the immunosensor device of the present invention is not particularly limited as long as it has antigenicity. Specific molecules to be measured include, for example, proteins such as cytokines, peptides, polysaccharides, polynucleotides, etc. Among them, cytokines, particularly TNF-α is preferable. TNF-α, which is one of cytokines, is several pg / mL or less in the blood of healthy people, but its concentration increases in cancer and the like and is an important marker molecule in the medical field.
本発明の免疫センサ用デバイスに使用する絶縁基板、及び該基板上に形成される金属薄膜としては、免疫センサで使用する分析手法に適した材料が選択される。
例えば、表面プラズモン共鳴法による分析センサでは、絶縁性基板としてガラスやポリカーボネート、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン、エポキシ樹脂、ポリオレフィン等が使用され、金属薄膜としては、金、銀、アルミニウム、銅等の導電性を有する金属が適している。また、水晶子マイクロバランス法による分析センサでは、絶縁性基板には結晶性の良いガラスが適しており、金属薄膜には金、銀、アルミニウムが適している。そして、表面弾性波素子を用いた分析センサでは、絶縁性基板にはシリコンもしくはガラスが適しており、金属薄膜には金、銀、銅が適している。
金属薄膜の表面は、上記した混合高分子膜により、部分的に或いは全面的に被覆される。
As the insulating substrate used in the immunosensor device of the present invention and the metal thin film formed on the substrate, a material suitable for the analytical technique used in the immunosensor is selected.
For example, in an analytical sensor using the surface plasmon resonance method, glass, polycarbonate, polymethyl acrylate, polystyrene, epoxy resin, polyolefin, or the like is used as an insulating substrate, and conductive metal such as gold, silver, aluminum, or copper is used as a metal thin film. A metal having is suitable. In the analysis sensor based on the quartz crystal microbalance method, glass with good crystallinity is suitable for the insulating substrate, and gold, silver, and aluminum are suitable for the metal thin film. In the analysis sensor using the surface acoustic wave element, silicon or glass is suitable for the insulating substrate, and gold, silver, or copper is suitable for the metal thin film.
The surface of the metal thin film is partially or entirely covered with the above-described mixed polymer film.
以下、混合高分子膜を構成するポリカチオン性高分子としてポリリジン、ポリアニオン性高分子としてポリスチレンスルホン酸を使用する場合を例にとり、本発明の免疫センサ用デバイスを構成する手順について説明する。
（１） ポリリジンとポリスチレンスルホン酸の水溶液をおのおの準備する。これらの高分子はバッファ等に溶かしてもよいが、純水の方が溶解し易いため好ましい。
（２） つぎに、表面に金属薄膜を形成した絶縁基板を準備する。金属薄膜の厚さは、後に抗原抗体反応が形成された状態を計測するために適切な膜厚にする必要があり、例えば表面プラズモン共鳴法による免疫センサに使用するデバイスでは、５０ナノメートル程度が望ましい。
（３） 上記薄膜金属上にポリリジン溶液をキャストし、直ちにポリスチレンスルホン酸を加え、そのまま基板上で乾燥させる。この時に、ポリリジンとポリスチレンスルホン酸は各々のイオン電荷により互いに結合し、不溶化され、そのまま金属薄膜上に高分子混合膜が形成される。ポリリジンとポリスチレンスルホン酸の濃度比は、例えばモノマー濃度比で４：６で混合する。ポリスチレンスルホン酸をやや過剰に混合するのは、形成される高分子混合膜をアニオン性にし、中性付近でアニオンであるタンパク質の非特異的な吸着を抑制するためである。ポリリジン及びポリスチレンスルホン酸は、単一モノマーあたり１つのカチオン性側鎖もしくは１つのアニオン性側鎖を有しているため、上記混合比がそのまま側鎖のカチオン性官能基とアニオン性官能基のモル比となるが、側鎖に複数のアニオン性もしくはカチオン性側鎖を有する場合には、側鎖の数を考慮し、カチオン性官能基とアニオン性官能基のモル比が４：６になるように混合する。
Hereinafter, the procedure for constructing the device for an immunosensor of the present invention will be described by taking as an example the case of using polylysine as the polycationic polymer constituting the mixed polymer membrane and polystyrene sulfonic acid as the polyanionic polymer.
(1) Prepare an aqueous solution of polylysine and polystyrene sulfonic acid. These polymers may be dissolved in a buffer or the like, but pure water is preferred because it is easier to dissolve.
(2) Next, an insulating substrate having a metal thin film formed on the surface is prepared. The thickness of the metal thin film needs to be an appropriate film thickness to measure the state in which the antigen-antibody reaction is formed later. For example, in a device used for an immunosensor by the surface plasmon resonance method, the thickness is about 50 nanometers. desirable.
(3) A polylysine solution is cast on the thin film metal, polystyrene sulfonic acid is immediately added, and the substrate is dried as it is. At this time, polylysine and polystyrene sulfonic acid are bonded to each other by their ionic charges and insolubilized, and a polymer mixed film is formed on the metal thin film as it is. The concentration ratio of polylysine and polystyrene sulfonic acid is mixed at a monomer concentration ratio of 4: 6, for example. The reason why the polystyrene sulfonic acid is mixed slightly excessively is to make the formed polymer mixed film anionic and to suppress nonspecific adsorption of proteins that are anions near neutrality. Since polylysine and polystyrene sulfonic acid have one cationic side chain or one anionic side chain per single monomer, the above mixing ratio remains as it is as the molar ratio between the cationic functional group and the anionic functional group of the side chain. In the case of having a plurality of anionic or cationic side chains in the side chain, the molar ratio of the cationic functional group to the anionic functional group is 4: 6 in consideration of the number of side chains. To mix.
（４） ついで、以下のようにして、標的分子（例えばＴＮＦ−α）に対する抗体（例えば抗ＴＮＦ−α抗体）を混合高分子膜に結合させる。
先ず、水溶性カルボジイミド及びエチルジメチルアミノプロピルを含む溶液を混合高分子膜上に加え、１５分程度放置しアミノ基を活性化させた後、測定対象試料量に対して過剰或いは大過剰の抗体を上記溶液に加えて、室温で２時間程度放置し、抗体を固定化する。その後、リン酸バッファで洗浄することにより、未反応の水溶性カルボジイミド、エチルジメチルアミノプロピル及び抗体を除去する。なお、この際に、混合高分子膜に抗体の抗原結合性断片を使用することや、抗体に代えて抗原を固定化することにより、その抗体を検出するようにすることも可能である。
(4) Next, an antibody (eg, anti-TNF-α antibody) against the target molecule (eg, TNF-α) is bound to the mixed polymer membrane as follows.
First, a solution containing water-soluble carbodiimide and ethyldimethylaminopropyl is added to the mixed polymer membrane, and left for about 15 minutes to activate the amino group. In addition to the above solution, the antibody is immobilized by allowing it to stand at room temperature for about 2 hours. Thereafter, the unreacted water-soluble carbodiimide, ethyldimethylaminopropyl and the antibody are removed by washing with a phosphate buffer. At this time, it is possible to detect the antibody by using an antigen-binding fragment of the antibody in the mixed polymer membrane or by immobilizing the antigen instead of the antibody.
本発明の免疫センサ用デバイスでは、必要に応じて標的分子の検出部に標的分子を含有する試料の流路を形成し、該流路の表面を上記混合高分子膜により被覆することによって、センサを構成するようにしてもよい。
このような流路は、例えば、溝状の流路を形成したプラスチック基板を、該流路が絶縁性基板上に形成した金属薄膜の表面に被覆した混合高分子膜に接するようにして、積層することによって構成することができる。
In the device for an immunosensor of the present invention, a sample channel containing a target molecule is formed in the target molecule detection part as necessary, and the surface of the channel is covered with the mixed polymer film, thereby You may make it comprise.
For example, such a channel is formed by laminating a plastic substrate on which a groove-like channel is formed so that the channel is in contact with a mixed polymer film coated on the surface of a metal thin film formed on an insulating substrate. Can be configured.
このようにして得られた、本発明の混合高分子膜を有する免疫センサ用デバイスは、様々な分析装置に適用可能であるが、例えば表面プラズモン共鳴測定に使用する際には、以下のようにして標的分子を計測する。
上述した抗体結合済み混合高分子膜で覆われた金属薄膜を有するガラス基板からなる免疫センサ用デバイスを、表面プラズモン共鳴測定装置の検出部に取り付け、基板表面にバッファを導入し、バッファに対するベースラインを得る。
その後、上記バッファに、測定試料溶液を加える。この時、バッファ中に含まれる標的分子は混合高分子膜上に固定化された抗体と特異的に結合し、金属表面の屈折率が変化する。この屈折率変化を測定することにより、試料中に含まれる標的分子濃度を見積もることが可能である。
The thus obtained device for an immunosensor having the mixed polymer membrane of the present invention can be applied to various analyzers. For example, when used for surface plasmon resonance measurement, the device is as follows. To measure the target molecule.
A device for an immunosensor composed of a glass substrate having a metal thin film covered with a mixed polymer film to which an antibody is bound as described above is attached to a detection portion of a surface plasmon resonance measuring apparatus, a buffer is introduced on the substrate surface, and a baseline for the buffer Get.
Thereafter, the measurement sample solution is added to the buffer. At this time, the target molecule contained in the buffer specifically binds to the antibody immobilized on the mixed polymer film, and the refractive index of the metal surface changes. By measuring this change in refractive index, it is possible to estimate the concentration of the target molecule contained in the sample.
一般に、血液や尿などの生体試料中にはタンパク（アルブミン等）が含まれている。該タンパクは非特異的に検出部表面に吸着することが知られており、通常の表面プラズモン共鳴法では、屈折率変化が特異的な反応によるものか非特異的な吸着によるものかを判断することは出来ない。しかしながら、本発明の混合高分子膜で被覆した免疫センサ用デバイスを検出部に使用した場合には、非特異的なタンパク吸着を大幅に抑制することが可能であるため、屈折率変化が特異的な反応によるものだけに由来すると考えられ、正確に標的分子を定量することが可能となる。 In general, biological samples such as blood and urine contain proteins (such as albumin). The protein is known to adsorb non-specifically on the surface of the detection part, and the normal surface plasmon resonance method determines whether the refractive index change is due to a specific reaction or non-specific adsorption. I can't do that. However, when the device for immunosensors coated with the mixed polymer film of the present invention is used for the detection part, non-specific protein adsorption can be greatly suppressed, so that the refractive index change is specific. The target molecule can be accurately quantified because it is thought that it is derived only from the reaction.
また、本発明の免疫センサ用デバイスを使用して水晶振動子マイクロバランス法及び弾性表面波素子により測定する際には、上述した抗体（もしくは抗原）結合済み混合高分子膜で覆われた金属薄膜を有する絶縁性基板からなる免疫センサ用デバイスを用いて同様にベースラインを得た後、測定試料溶液を加える。この時、標的分子は混合高分子膜上に固定化された抗体（もしくは抗原）と特異的に結合し金属表面の重量が変化するため、標的分子の測定を行うことが可能である。その他、免疫センサ用デバイスに蛍光標識或いは酵素標識された２次抗体を導入し、標的分子と結合したこれらの標識量を定量する免疫センサに本発明の免疫センサ用デバイスを用いることも可能であり、様々な測定手法に応用可能である。 In addition, when the immunosensor device of the present invention is used for measurement by the quartz crystal microbalance method and the surface acoustic wave device, the metal thin film covered with the above-described mixed polymer film to which the antibody (or antigen) is bound. After obtaining a baseline in the same manner using an immunosensor device comprising an insulating substrate having a measurement sample, a measurement sample solution is added. At this time, since the target molecule specifically binds to the antibody (or antigen) immobilized on the mixed polymer membrane and the weight of the metal surface changes, the target molecule can be measured. In addition, it is also possible to use the immunosensor device of the present invention for an immunosensor that introduces a fluorescently labeled or enzyme-labeled secondary antibody into the immunosensor device and quantifies the amount of these labels bound to the target molecule. It can be applied to various measurement methods.
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
（実施例１）
図１は、本発明の免疫センサ用デバイスの１例を示す図であり、（Ａ）はデバイスを作製する工程を示す斜視図、また（Ｂ）はデバイスの断面模式図である。
このデバイスＤ１は、ガラス基板２上に形成した金属薄膜１の表面を部分的に混合高分子膜３で被覆し、この高分子膜の側鎖に標的分子に対する免疫反応性結合基として抗体を結合したものである。金属薄膜１の上には、混合高分子膜３に接するように溝状の微小流路４を設けたポリマー基板７が、金属薄膜１全体を覆うように積層されている。そして、微小流路４の両端には孔５，６を設け、試料の導入及び排出のためのキャピラリー（図示せず）を接続するよう構成されている。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated based on an Example, a following example does not limit this invention.
Example 1
1A and 1B are diagrams showing an example of an immunosensor device according to the present invention, in which FIG. 1A is a perspective view showing a process for producing the device, and FIG. 1B is a schematic sectional view of the device.
In this device D1, the surface of a metal thin film 1 formed on a glass substrate 2 is partially covered with a mixed polymer film 3, and an antibody is bound to the side chain of this polymer film as an immunoreactive binding group for a target molecule. It is a thing. On the metal thin film 1, a polymer substrate 7 provided with a groove-like microchannel 4 so as to be in contact with the mixed polymer film 3 is laminated so as to cover the entire metal thin film 1. Then, holes 5 and 6 are provided at both ends of the microchannel 4 to connect capillaries (not shown) for introducing and discharging the sample.
以下、このデバイスＤ１を作製する手順について説明する。
ガラス基板２（16mm x16mm、厚さ0.15ｍｍ、松浪硝子社製）上にマグネトロンスパッタ装置（日本シード社製）を用いてチタンを３ｎｍ堆積させた後、さらに金薄膜を５０ｎｍ堆積させることにより金薄膜１を形成した。該金薄膜１上に直径３ミリメートルの穴を開けたシールを貼り、直径３ミリメートルの金薄膜１のみを露出させた。上記露出された金薄膜１上に、モノマー濃度換算で２．５μＭのポリリジン水溶液（平均分子量８万）を４μＬ滴下後、直ちにモノマー濃度換算で２．５μＭのポリスチレンスルホン酸水溶液（平均分子量７万）を６μＬ滴下した。これによりポリリジンとポリスチレンスルホン酸は、モル比で４：６で混合されたことになり、合計１０μＬ滴下している(1.4 μL/mm2)。ポリリジン及びポリスチレンスルホン酸は、単一モノマーあたり１つのカチオン性側鎖もしくは１つのアニオン性側鎖を有しているため、上記混合比がそのまま側鎖のカチオン性官能基とアニオン性官能基のモル比となる。そのまま、室温で１２時間乾燥させ、金薄膜１上に混合高分子膜３を形成した。図２に上記条件で作製した混合高分子膜のＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像を示す。混合高分子膜３は厚さ４．５ナノメートル程度と極めて薄く、平坦な丘状構造を示した。
Hereinafter, a procedure for manufacturing the device D1 will be described.
After depositing 3 nm of titanium on a glass substrate 2 (16 mm x 16 mm, thickness 0.15 mm, manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.) using a magnetron sputtering apparatus (manufactured by Nippon Seed Co., Ltd.), a gold thin film is further deposited by depositing 50 nm of gold. 1 was formed. A seal with a hole having a diameter of 3 mm was attached on the gold thin film 1 to expose only the gold thin film 1 having a diameter of 3 mm. After 4 μL of 2.5 μM polylysine aqueous solution (average molecular weight 80,000) was dropped onto the exposed gold thin film 1 in terms of monomer concentration, 2.5 μM polystyrenesulfonic acid aqueous solution (average molecular weight 70,000) immediately in terms of monomer concentration was immediately added. 6 μL was added dropwise. As a result, polylysine and polystyrenesulfonic acid were mixed at a molar ratio of 4: 6, and a total of 10 μL was dropped (1.4 μL / mm 2). Since polylysine and polystyrene sulfonic acid have one cationic side chain or one anionic side chain per single monomer, the above mixing ratio remains as it is as the molar ratio between the cationic functional group and the anionic functional group of the side chain. It becomes a ratio. The mixture was dried at room temperature for 12 hours to form a mixed polymer film 3 on the gold thin film 1. FIG. 2 shows an AFM (atomic force microscope) image of the mixed polymer film produced under the above conditions. The mixed polymer film 3 was extremely thin with a thickness of about 4.5 nanometers, and showed a flat hill-like structure.
つぎに、混合高分子膜３を有する薄膜上に、0.4 mg/mL 水溶性カルボジイミド（N-ethyl-N'-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride、Pierce社製）と 1.1 mg/mL Ｎ−ハイドロキシスクシンイミド（Pierce社製）を含む１０ｍＭリン酸バッファを９μＬ滴下し、室温で１５分間放置した。これにより金薄膜１上の混合高分子膜３のアミノ基を活性化した。さらに終濃度が0.1 mg/mLになるように抗ＴＮＦ−α抗体（マウスモノクローナル抗体、Sigma社製）を含む１０ｍＭリン酸バッファを加え、室温で２時間放置し、反応させた。上記反応により、活性化したポリリジンのアミノ基と抗ＴＮＦ−α抗体のカルボキシル基を結合させ、抗体を混合高分子膜３に固定化した。その後、１０ｍＭリン酸バッファで洗浄し、未反応の水溶性カルボジイミド、Ｎ−ハイドロキシスクシンイミド並びに抗ＴＮＦ−α抗体を金薄膜１上から除去した。 Next, 0.4 mg / mL water-soluble carbodiimide (N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, manufactured by Pierce) and 1.1 mg / mL N-hydroxyl are formed on the thin film having the mixed polymer film 3. 9 μL of 10 mM phosphate buffer containing succinimide (Pierce) was dropped and left at room temperature for 15 minutes. Thereby, the amino group of the mixed polymer film 3 on the gold thin film 1 was activated. Furthermore, 10 mM phosphate buffer containing anti-TNF-α antibody (mouse monoclonal antibody, manufactured by Sigma) was added so that the final concentration was 0.1 mg / mL, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours to be reacted. By the above reaction, the amino group of activated polylysine and the carboxyl group of the anti-TNF-α antibody were combined, and the antibody was immobilized on the mixed polymer membrane 3. Thereafter, the plate was washed with 10 mM phosphate buffer, and unreacted water-soluble carbodiimide, N-hydroxysuccinimide and anti-TNF-α antibody were removed from the gold thin film 1.
このようにして得られた抗体を固定化した混合高分子膜３を有する金薄膜１からシールをはがし、微小流路４を有するポリマー基板７に取り付けた。ポリマー基板７は、ステンレス基板にサンドブラスト加工法により形成した凸構造を有するネガパターンを鋳型としてポリジメチルシロキサン及び硬化剤を流し込み、６０℃で２時間放置することにより硬化させ、その後、ポリマー基板を剥がし取ることにより作製した。微小流路４は幅１ミリメートル、深さ２０マイクロメートルであった。その後ドリルにより、２カ所の穴５，６を開け試料の導入及び排出のためのキャピラリを接続可能とした。〔図１（Ｂ）参照〕 The seal was peeled off from the gold thin film 1 having the mixed polymer film 3 on which the antibody thus obtained was immobilized, and attached to a polymer substrate 7 having a microchannel 4. The polymer substrate 7 is cured by pouring polydimethylsiloxane and a curing agent using a negative pattern having a convex structure formed by a sandblasting method on a stainless steel substrate as a mold, and leaving it at 60 ° C. for 2 hours, and then peeling the polymer substrate. Made by taking. The microchannel 4 had a width of 1 millimeter and a depth of 20 micrometers. After that, two holes 5 and 6 were opened by a drill so that capillaries for introducing and discharging the sample could be connected. [See Fig. 1 (B)]
つぎに、このデバイスＤ１を使用して、表面プラズモン共鳴法により測定を行う手順について説明する。
上記で得られた混合高分子膜３を有するガラス基板２とポリマー基板７を貼り合わせたデバイスＤ１を、Ｈａｎｄｙ−ＳＰＲ装置（ＮＴＴアドバンステクノロジ社製）の検出部に屈折率マッチングオイル（n=1.510, Cargille Laboratories社製）を介して取り付けた。該ＳＰＲ装置を用いて混合高分子膜３を有する金薄膜１へ全反射条件で測定光８を導入し、該装置内に組み込まれたＣＣＤカメラで反射光９の強度を測定し、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）角の測定を行った。
Next, a procedure for performing measurement by the surface plasmon resonance method using the device D1 will be described.
The device D1 obtained by bonding the glass substrate 2 having the mixed polymer film 3 and the polymer substrate 7 obtained as described above to the detection unit of the Handy-SPR apparatus (manufactured by NTT Advanced Technology) is used as a refractive index matching oil (n = 1.510). , Cargille Laboratories). Using the SPR device, the measurement light 8 is introduced into the gold thin film 1 having the mixed polymer film 3 under total reflection conditions, the intensity of the reflected light 9 is measured with a CCD camera incorporated in the device, and surface plasmon resonance (Surface Plasmon resonance: SPR) angle was measured.
また、本発明にかかるタンパクへの非特異的吸着の影響評価は、以下の手順で行った。
まず、０．１Ｍリン酸バッファ溶液（ｐＨ７）をデバイスＤ１に取り付けられた試料導入用のキャピラリを通して混合高分子膜３上に導入し、ベースラインを得た。バッファの導入にはシリンジポンプ（ＣＭＡ社製）を用いて、流速２μL/minで送液した。その後、1mg/mLの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍリン酸バッファ水溶液（ｐＨ７）を同様にシリンジポンプを用いて同流速でデバイスに導入しつつ、微小流路４内に配置された混合高分子膜３を有する金薄膜表面のＳＰＲ角度変化をＳＰＲ装置により読み取った。
Moreover, the influence evaluation of the nonspecific adsorption | suction to the protein concerning this invention was performed in the following procedures.
First, a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7) was introduced onto the mixed polymer membrane 3 through a sample introduction capillary attached to the device D1, thereby obtaining a baseline. For introducing the buffer, a syringe pump (manufactured by CMA) was used, and the solution was fed at a flow rate of 2 μL / min. Thereafter, a 0.1 M phosphate buffer aqueous solution (pH 7) containing 1 mg / mL bovine serum albumin (BSA) was similarly introduced into the device at the same flow rate using a syringe pump, and placed in the microchannel 4. The SPR angle change on the surface of the gold thin film having the mixed polymer film 3 was read with an SPR device.
図３は、1mg/mLのＢＳＡ溶液を５分間混合高分子膜３を有する金薄膜１上に導入した際の、ＳＰＲ角変化を示す図である。図３において、（ｃ）は上記実施例１のポリリジンとポリスチレンスルホン酸がモル比で４：６で混合された混合高分子膜３を有するデバイスを使用した結果であり、（ｂ）は上記実施例１のポリリジンとポリスチレンスルホン酸のモル比を５：５に変えて混合した混合高分子膜３を有するデバイスを使用した結果である。また（ａ）は、比較のために混合高分子膜を有しない金薄膜にＢＳＡ溶液を直接導入した際の、ＳＰＲ角の変化の様子を示している。
ＢＳＡ溶液を混合高分子膜が固定化されてない金薄膜上に導入した際には、（ａ）にみられるように、ＳＰＲ角は急激に上昇し一定値を示した。この金薄膜に、再度ＢＳＡを含まないリン酸バッファを導入すると、若干ＳＰＲ角は低下した。これは、弱い力により吸着している一部のＢＳＡがはがれたためである。２度目のリン酸バッファ導入後のＳＰＲ角の変化量は１１４ミリ度であり、これは1.14 ng/mm2 のＢＳＡ溶液吸着に相当することが知られている。
FIG. 3 is a diagram showing the SPR angle change when a 1 mg / mL BSA solution is introduced onto the gold thin film 1 having the mixed polymer film 3 for 5 minutes. In FIG. 3, (c) is the result of using a device having a mixed polymer membrane 3 in which polylysine and polystyrene sulfonic acid of Example 1 were mixed at a molar ratio of 4: 6, and (b) is the result of the above implementation. It is the result of using the device which has the mixed polymer membrane 3 which changed the molar ratio of the polylysine of Example 1 and polystyrenesulfonic acid into 5: 5, and was mixed. For comparison, (a) shows a change in the SPR angle when a BSA solution is directly introduced into a gold thin film not having a mixed polymer film.
When the BSA solution was introduced onto the gold thin film on which the mixed polymer film was not immobilized, the SPR angle increased rapidly and showed a constant value as seen in (a). When a phosphate buffer not containing BSA was introduced again into this gold thin film, the SPR angle slightly decreased. This is because some of the BSA adsorbed by the weak force peeled off. The amount of change in the SPR angle after the second introduction of the phosphate buffer is 114 mm, which is known to correspond to 1.14 ng / mm @ 2 of BSA solution adsorption.
一方、混合高分子膜が固定化された金薄膜上にＢＳＡ溶液を導入した際には、より緩やかで小さなＳＰＲ角度の変化が観測された。（ｂ）にみられるように、混合高分子膜を構成するポリリジンとポリスチレンスルホン酸が５：５で混合された膜へのＢＳＡの吸着に伴うＳＰＲ角変化は５２ミリ度であり、混合高分子膜を構成するポリリジンとポリスチレンスルホン酸が４：６で混合された膜への吸着に伴うＳＰＲ角変化は４ミリ度であった〔（ｃ）参照〕。
図４は、実施例１において、混合高分子膜を構成するポリリジンとポリスチレンスルホン酸の混合比を変化させた際の、1mg/mLのＢＳＡ溶液に対するＳＰＲ角変化を示したものである。ポリリジンとポリスチレンスルホン酸が４．５：５．５乃至３．５：６．５に混合された混合高分子膜において、ＢＳＡの吸着は特に顕著に抑制された。
On the other hand, when the BSA solution was introduced onto the gold thin film on which the mixed polymer film was immobilized, a more gradual and small change in the SPR angle was observed. As seen in (b), the SPR angle change accompanying the adsorption of BSA to the membrane in which polylysine and polystyrene sulfonic acid constituting the mixed polymer membrane are mixed at 5: 5 is 52 mm, and the mixed polymer The change in SPR angle due to adsorption to the membrane in which polylysine and polystyrene sulfonic acid constituting the membrane were mixed at 4: 6 was 4 mm [see (c)].
FIG. 4 shows changes in SPR angle with respect to a 1 mg / mL BSA solution when the mixing ratio of polylysine and polystyrene sulfonic acid constituting the mixed polymer membrane was changed in Example 1. In the mixed polymer membrane in which polylysine and polystyrene sulfonic acid were mixed at 4.5: 5.5 to 3.5: 6.5, BSA adsorption was particularly remarkably suppressed.
一方、混合比が著しく異なる混合高分子膜においては、ＢＳＡ溶液吸着量は、修飾しない場合とほぼ同程度であり、非特異タンパクであるＢＳＡの吸着抑制能に乏しいといえる。ポリカチオン性高分子の側鎖のカチオン性基とポリアニオン性高分子の側鎖のアニオン性基のモル比が４：６程度で混合されることにより、混合高分子膜がアニオン性に帯電し、ＢＳＡのように中性付近でアニオンに帯電するタンパクでは、静電的な反発により非特異的な吸着が抑制されていると考えられる。本発明の混合高分子膜の形成は、２種類の水溶性ポリマーを混合後、室温で乾燥させるだけで形成することが可能であり、有機溶媒や紫外線など危険物を必要とせず、安全・簡便に形成可能であるという、従来の技術に見られない特徴を有する。 On the other hand, in mixed polymer membranes with significantly different mixing ratios, the amount of BSA solution adsorbed is almost the same as that without modification, and it can be said that the ability to suppress adsorption of BSA, which is a nonspecific protein, is poor. When the molar ratio of the cationic group of the side chain of the polycationic polymer and the anionic group of the side chain of the polyanionic polymer is mixed at about 4: 6, the mixed polymer film is anionicly charged, It is considered that non-specific adsorption is suppressed by electrostatic repulsion in a protein charged with an anion near neutrality such as BSA. The mixed polymer film of the present invention can be formed by mixing two kinds of water-soluble polymers and then drying them at room temperature, and does not require any dangerous substances such as organic solvents or ultraviolet rays. It has a feature that cannot be seen in the prior art.
次に、ＴＮＦ−α溶液を該デバイスに導入し、ＴＮＦ−αと抗ＴＮＦ−α抗体の抗原抗体反応を上記混合高分子膜上で行い、免疫センサとしての性能評価を行った。
図５は、Ｈａｎｄｙ−ＳＰＲ装置に取り付けた本発明の免疫センサ用デバイス上へ、試料溶液として0.1Ｍのリン酸バッファに溶解した１μＭ、５μＭ、１０μＭのＴＮＦ−αを導入した際の、ＳＰＲ角変化を示す図である。ＴＮＦ−α濃度の上昇に伴い、ＳＰＲ角変化量が大きくなっている。このことから、濃度未知のＴＮＦ−αを本発明の免疫センサ用デバイスに導入することによって、ＳＰＲ角変化量から試料溶液中に含まれるＴＮＦ−αの濃度を見積もることが可能である。
Next, a TNF-α solution was introduced into the device, and an antigen-antibody reaction between TNF-α and anti-TNF-α antibody was performed on the mixed polymer film, and performance evaluation as an immunosensor was performed.
FIG. 5 shows the SPR angle when 1 μM, 5 μM, and 10 μM TNF-α dissolved in 0.1 M phosphate buffer is introduced as a sample solution onto the immunosensor device of the present invention attached to the Handy-SPR device. It is a figure which shows a change. As the TNF-α concentration increases, the SPR angle change amount increases. From this, it is possible to estimate the concentration of TNF-α contained in the sample solution from the SPR angle change amount by introducing TNF-α whose concentration is unknown to the immunosensor device of the present invention.
一般に、固定化された抗体は溶液中に存在する場合に比べ、活性が低下することがよく知られており、免疫測定センサにおいて、抗体の活性を低下させることなく固定化することは重要である。
今回は、表面プラズモン共鳴現象測定において反応速度定数を求める際に最も一般的なKarlssonらの報告（非特許文献３）に基づき、評価を行った。
Langumuirの１：１結合モデルにおいて、測定対象試料濃度を[A]、混合高分子膜に固定化された抗体濃度を[B]、抗原抗体反応により結合した分子濃度を[AB]、結合速度定数をKa、解離速度定数をKdとすると、
d[AB]/dt = Ka[A][B] - Kd[AB] ・・・・（式２）
と示すことが出来る。
表面プラズモン共鳴現象測定では[AB]がＳＰＲ角度変化量(θSPR)になるので、
dθSPR/dt =Constant - (Ka[A] + Kd) θSPR ・・・・（式３）
となる。
In general, it is well known that the activity of an immobilized antibody is lower than when it is present in a solution, and in an immunoassay sensor, it is important to immobilize the antibody without reducing the activity of the antibody. .
This time, evaluation was performed based on the most general report of Karlsson et al. (Non-patent Document 3) when determining the reaction rate constant in the surface plasmon resonance phenomenon measurement.
In Langumuir's 1: 1 binding model, the concentration of the sample to be measured is [A], the concentration of the antibody immobilized on the mixed polymer membrane is [B], the concentration of the molecule bound by the antigen-antibody reaction is [AB], and the binding rate constant. Is Ka and the dissociation rate constant is Kd.
d [AB] / dt = Ka [A] [B]-Kd [AB] (Equation 2)
Can be shown.
In the surface plasmon resonance measurement, [AB] is the SPR angle change (θSPR).
dθSPR / dt = Constant-(Ka [A] + Kd) θSPR (3)
It becomes.
先ず、図６（ａ）に示すように1 μM ~ 10 μM のTNF-α溶液を、実施例１で得られた混合高分子膜を有するデバイスに導入しＳＰＲ角度変化に対する結合速度を求めた。図６（ａ）において、横軸はＳＰＲ角度変化量を、縦軸はＳＰＲ角度変化量を時間で除した値である。
つぎに、図６（ａ）のおのおのの直線の傾きをTNF-α濃度に対してプロットすることにより、図６（ｂ）を求めた。図６（ｂ）の傾きから、結合速度定数は3.7 x 104 (M-1 sec-1)であった。解離速度定数は、ＴＮＦ−αを導入した後、バッファを導入した解離曲線から求め、2.5 x 10-4 (sec-1)であった。これらの速度定数より求めた結合定数は、1.5 x 108であった。これらの値は一般的な溶液中のモノクローナル抗体と同等の値を示しており、本発明による混合高分子膜上に固定化した抗体は、その結合活性を失わないことがわかった。
このように本発明にかかる混合高分子膜を有する免疫センサ用デバイスでは、測定の際に妨害物質となる生体中に存在するタンパクの非特異的吸着を大幅に抑制可能であるだけでなく、デバイスに固定化された抗体の活性を損なうことがなく、標的分子を安定かつ高感度に測定可能であり、免疫センサの検出部に使用するデバイスとして極めて有用であることが判明した。
First, as shown in FIG. 6A, a 1 μM to 10 μM TNF-α solution was introduced into the device having the mixed polymer film obtained in Example 1, and the binding rate with respect to the SPR angle change was determined. In FIG. 6A, the horizontal axis represents the SPR angle change amount, and the vertical axis represents the value obtained by dividing the SPR angle change amount by time.
Next, FIG. 6B was obtained by plotting the slope of each straight line in FIG. 6A against the TNF-α concentration. From the slope of FIG. 6B, the coupling rate constant was 3.7 × 10 4 (M −1 sec −1 ). The dissociation rate constant was determined from a dissociation curve in which TNF-α was introduced and then a buffer was introduced, and was 2.5 × 10 −4 (sec −1 ). The coupling constant determined from these rate constants was 1.5 × 10 8 . These values are equivalent to those of a monoclonal antibody in a general solution, and it was found that the antibody immobilized on the mixed polymer membrane according to the present invention does not lose its binding activity.
Thus, in the device for an immunosensor having the mixed polymer membrane according to the present invention, not only the nonspecific adsorption of the protein existing in the living body which becomes an interfering substance at the time of measurement can be significantly suppressed, It was found that the target molecule can be measured stably and with high sensitivity without impairing the activity of the antibody immobilized on the antibody, and is extremely useful as a device used in the detection part of the immunosensor.
（実施例２）
実施例１と同様ににして、金薄膜上にポリリジンとポリスチレンスルホン酸がモル比で４：６で混合された混合高分子膜を形成した後、水溶性カルボジイミドとＮ−ハイドロキシスクシンイミドを用いて混合高分子膜のアミノ基を活性化した。ついで、終濃度が0.1 mg/mLになるように脳性ナトリウム利尿ペプチド (BNP)（Phoenix Pharmaceuticals社製）を含む１０ｍＭリン酸バッファを加え、室温で２時間放置し、反応させた。上記反応により、活性化したポリリジンのアミノ基とBNPが結合し、混合高分子膜に固定化されている。その後、１０ｍＭリン酸バッファで洗浄し、未反応の水溶性カルボジイミド、Ｎ−ハイドロキシスクシンイミド並びにBNPを金薄膜を設けた基板上から除去した。
(Example 2)
In the same manner as in Example 1, after forming a mixed polymer film in which polylysine and polystyrenesulfonic acid were mixed at a molar ratio of 4: 6 on a gold thin film, mixing was performed using water-soluble carbodiimide and N-hydroxysuccinimide. The amino group of the polymer membrane was activated. Subsequently, 10 mM phosphate buffer containing brain natriuretic peptide (BNP) (manufactured by Phoenix Pharmaceuticals) was added to a final concentration of 0.1 mg / mL, and the reaction was allowed to stand at room temperature for 2 hours. By the above reaction, the amino group of activated polylysine and BNP are bonded and immobilized on the mixed polymer membrane. Thereafter, it was washed with 10 mM phosphate buffer, and unreacted water-soluble carbodiimide, N-hydroxysuccinimide and BNP were removed from the substrate provided with the gold thin film.
つぎに、実施例１と同様にして基板を微小流路を有するポリマー基板に取り付け、免疫センサ用デバイスを作製した。そして、得られたデバイスを実施例１と同様にしてＨａｎｄｙ−ＳＰＲ装置に取り付け、表面プラズモン共鳴角の測定を行った。
図７は、上記デバイスに抗脳性ナトリウム利尿ペプチド抗体（抗ＢＮＰ抗体）を、１０μｇ／ｍＬから１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において導入した際のＳＰＲ角変化を示す図である。抗ＢＮＰ抗体の濃度上昇に伴い、ＳＰＲ角変化が大きくなっている。図８は、本発明により作製した抗ＢＮＰ抗体センサ用デバイスの検量線を示すもので、横軸に抗体濃度を、縦軸にはデバイスに導入してから５分後のＳＰＲ角度を図７から読み取り、プロットすることにより作成したものである。該検量線より、抗ＢＮＰ抗体濃度を見積もることが可能である。
このように、本発明にかかる免疫センサ用デバイスは、検出部を被覆した混合高分子膜に標的分子に対する抗原を固定化することにより、その抗体を検出することも可能である。すなわち、測定対象となる標的分子としては、抗原性を有するものであれば様々な分子を測定可能であり、各種分子検出への応用が可能である。
Next, the substrate was attached to a polymer substrate having a microchannel in the same manner as in Example 1 to produce an immunosensor device. And the obtained device was attached to the Handy-SPR device in the same manner as in Example 1, and the surface plasmon resonance angle was measured.
FIG. 7 is a view showing a change in SPR angle when an anti-brain natriuretic peptide antibody (anti-BNP antibody) is introduced into the device in a concentration range of 10 μg / mL to 1000 μg / mL. As the concentration of the anti-BNP antibody increases, the SPR angle change increases. FIG. 8 shows a calibration curve of an anti-BNP antibody sensor device prepared according to the present invention. The horizontal axis represents the antibody concentration, and the vertical axis represents the SPR angle 5 minutes after introduction into the device. It was created by reading and plotting. From the calibration curve, the anti-BNP antibody concentration can be estimated.
As described above, the immunosensor device according to the present invention can detect the antibody by immobilizing the antigen against the target molecule on the mixed polymer film covering the detection part. That is, as a target molecule to be measured, various molecules can be measured as long as they have antigenicity, and can be applied to detection of various molecules.
また、図９は本発明の免疫センサ用デバイスを用いて、固定化したＢＮＰへの親和性を見積もるために従来から広く用いられているスキャッチャードプロットを作成した際の図である。横軸には変化したＳＰＲ角変化量を、縦軸にはＳＰＲ角変化量を抗体濃度で割った商を示している。図９の傾きの逆数が結合定数であるため、本発明にかかるデバイス膜上の抗原抗体結合定数は１．５ｘ１０６であり、ポリクローナル抗体として十分な結合定数を示しており、抗原や抗体を問わず、安定して本発明の混合高分子膜上に固定化可能であることを示している。 FIG. 9 is a diagram when a Scatchard plot that has been widely used in the past to create an affinity for the immobilized BNP is created using the immunosensor device of the present invention. The abscissa indicates the changed SPR angle change, and the ordinate indicates the quotient obtained by dividing the SPR angle change by the antibody concentration. Since the reciprocal of the slope of FIG. 9 is a binding constant, the antigen-antibody binding constant on the device membrane according to the present invention is 1.5 × 10 6 , indicating a binding constant sufficient as a polyclonal antibody. In other words, it can be stably immobilized on the mixed polymer membrane of the present invention.
１ 金属薄膜
２ ガラス基板
３ 混合高分子膜
４ 微小流路
５ 試料導入キャピラリ接続口
６ 試料排出キャピラリ接続口
７ ポリマー基板
８ 測定用光
９ 反射光
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Metal thin film 2 Glass substrate 3 Mixed polymer film 4 Microchannel 5 Sample introduction capillary connection port 6 Sample discharge capillary connection port 7 Polymer substrate 8 Measurement light 9 Reflected light
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005371003A JP4517081B2 (en) | 2005-12-22 | 2005-12-22 | Immunosensor device |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005371003A JP4517081B2 (en) | 2005-12-22 | 2005-12-22 | Immunosensor device |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007171054A JP2007171054A (en) | 2007-07-05 |
| JP4517081B2 true JP4517081B2 (en) | 2010-08-04 |
Family
ID=38297800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005371003A Expired - Fee Related JP4517081B2 (en) | 2005-12-22 | 2005-12-22 | Immunosensor device |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4517081B2 (en) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5423965B2 (en) * | 2007-05-30 | 2014-02-19 | Ｊｓｒ株式会社 | Non-specific adsorption inhibitor |
| JP5248394B2 (en) * | 2009-03-30 | 2013-07-31 | シャープ株式会社 | Method of immobilizing analyte substance and microanalyzer |
| JP2012251863A (en) * | 2011-06-02 | 2012-12-20 | Konica Minolta Holdings Inc | Surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring device and sensor structure to be used for the same |
| EP3418295B1 (en) * | 2011-07-18 | 2020-09-02 | IBA GmbH | Method of reversibly staining a target cell |
| JP5615306B2 (en) * | 2012-02-03 | 2014-10-29 | シャープ株式会社 | Target recognition molecule and method for immobilizing the target recognition molecule |
| WO2013146249A1 (en) * | 2012-03-27 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | Method for measuring isoelectric point, and sensor chip, measurement device, measurement system and program therefor |
| WO2018199168A1 (en) * | 2017-04-25 | 2018-11-01 | デンカ株式会社 | Membrane carrier, method for producing same, and liquid sample test kit |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005062074A (en) * | 2003-08-19 | 2005-03-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Dna chip and detection method of target dna |
-
2005
- 2005-12-22 JP JP2005371003A patent/JP4517081B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005062074A (en) * | 2003-08-19 | 2005-03-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Dna chip and detection method of target dna |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007171054A (en) | 2007-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Masson | Surface plasmon resonance clinical biosensors for medical diagnostics | |
| Vaisocherová et al. | Functionalizable low-fouling coatings for label-free biosensing in complex biological media: advances and applications | |
| FI118061B (en) | Procedure and bio donor for analysis | |
| US5436161A (en) | Matrix coating for sensing surfaces capable of selective biomolecular interactions, to be used in biosensor systems | |
| Zhao et al. | Interfacial immobilization of monoclonal antibody and detection of human prostate-specific antigen | |
| JP4517081B2 (en) | Immunosensor device | |
| US8093005B2 (en) | Preparation and use of a reactive solid support surface | |
| EP0226470A2 (en) | Materials and methods for microchemical testing | |
| Gobi et al. | Novel surface plasmon resonance (SPR) immunosensor based on monomolecular layer of physically-adsorbed ovalbumin conjugate for detection of 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid and atomic force microscopy study | |
| US7563624B2 (en) | Measurement method using biosensor | |
| JP4768417B2 (en) | Biosensor | |
| US20070048796A1 (en) | Biosensor | |
| US8158342B2 (en) | Method for the identification of human immunodeficiency virus related antibodies in blood | |
| JPS5916669B2 (en) | Antigen or antibody detection method | |
| EP2948772B1 (en) | A hydrogel, for use in a biosensor with optics based detection of analytes | |
| JPH05506314A (en) | Method of manufacturing test surfaces for optical detection of biological binding | |
| US8158440B2 (en) | Method for quantitative measurement of thyroid related antibodies or antigens in a serum sample | |
| Wang et al. | Aspects of recent development of immunosensors | |
| WO2005036171A1 (en) | Method and system for detection of a target analyte | |
| US20100047815A1 (en) | Method to detect tumor markers and diagnosis of undifferentiated tumors | |
| CASA et al. | Immunosensor using surface plasmon resonance for C-reactive protein detection | |
| JP2005164348A (en) | Method for observing interaction of biomolecules | |
| WO2008066994A2 (en) | Application of surface plasmon resonance technology to maternal serum screening for congenital birth defects | |
| WO2006041392A1 (en) | Preparation and use of a reactive solid support surface | |
| Ramadan et al. | Non-fouling hyaluronic acid coatings for improved sandwich ELISA measurements in plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080327 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20091217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100105 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100304 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100406 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100407 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130528 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4517081 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130528 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130528 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130528 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140528 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |