JP2010216985A - セルソータおよびサンプル分別方法 - Google Patents

Abstract

【課題】大きなダメージを与えることなく目標サンプルを選択的に分別することができるセルソータおよびサンプル分別方法を提供する。
【解決手段】測定サンプルＳがレーザ光照射域Ｒ１を通過する際に光学ユニット１４および分析部２２により得られた光情報に基づき、測定サンプルＳが目標サンプルであるか否かが制御部２８により判定され、目標サンプルであると判定された測定サンプルＳが所定位置Ｒ２に至るタイミングで液体噴射部２６が駆動され、液体噴射部２６から噴射された液体Ｌが溶液中の測定サンプルＳに衝突して、測定サンプルＳはその流れを偏向させ、回収容器３２に収容される。
【選択図】図１

Description

この発明は、セルソータおよびサンプル分別方法に係り、特に、細胞等の多数の測定サンプルから目標サンプルを選択的に分別するセルソータおよび方法に関する。

医療分野において、複数種の細胞を含む溶液から特定の細胞を分別することは、医療効果を高めるための非常に重要な処理である。近年、このような分別の手段として、細胞等の多数のサンプルが分散された溶液の流れを形成し、各サンプルにレーザ光を照射してサンプルから発せられる蛍光、散乱光等を分析することによりサンプルの種別を同定して目標となるサンプルを分別するフローサイトメータが用いられるようになった。このフローサイトメータは、短時間に多数のサンプルについての分析を可能とするので、特に、再生医療の分野における幹細胞の選別収集への利用が注目されている。

幹細胞とは、細胞分裂を経ても、再び自らと同じ細胞を複製する能力を維持すると共に、他の種類の細胞に分化する能力を有する細胞のことであり、この能力により組織や臓器を構成する細胞を作り出すことができる。幹細胞は、多くの組織において存在するものであるが、その数は少なく、通常、採取した大量の細胞サンプルの中から極微量しか見つけることができない。このため、幹細胞を高精度に選別収集することが要求されている。

多数のサンプルから目標となるサンプルを分別する方法としては、例えば、特許文献１に、多数のサンプルが分散された溶液の流れから液滴を順次形成して落下させると共に、目標サンプルを含む液滴のみを選択的に帯電した上で、落下途中において各液滴に所定の電界中を通過させる方法が開示されている。電界中を通過する際に、帯電されている液滴のみが電界から静電気力を受けてその落下方向を曲げるので、その液滴に含まれる目標サンプルを他のサンプルから分別することができる。

特開昭６２−２５５８６８号公報

しかしながら、目標サンプルを分別するために目標サンプルを含む液滴を帯電すると、付与された電荷により細胞等からなる目標サンプルが大きなダメージを受けるおそれがある。特に、幹細胞を目標サンプルとする場合には、ダメージによって正常に分化することができなくなる、あるいは、癌細胞等の不良細胞が発現する、等の不具合を来すおそれがある。

この発明は、このような従来の問題点を解消するためになされたもので、大きなダメージを与えることなく目標サンプルを選択的に分別することができるセルソータおよびサンプル分別方法を提供することを目的とする。

この発明に係るセルソータは、溶液中に分散され間隔をあけながら１列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの測定サンプルの光情報に基づいて目標サンプルを選択的に分別するセルソータであって、光ビームの照射域よりも下流側を流れる溶液中の測定サンプルに向けて側方から液体を噴射するための液体噴射手段と、測定サンプルの光情報に基づいて液体噴射手段を選択的に駆動することにより、溶液中の目標サンプルに液体噴射手段から噴射された液体を衝突させて目標サンプルの流れを偏向させ、目標サンプルを他のサンプルから分別する制御部とを備えたものである。

好ましくは、液体噴射手段は、圧電素子の駆動により液体を噴射する。
また、液体噴射手段が、溶液中の測定サンプルに向けて互いに異なる方向から液体を噴射する複数の液体噴射部を有し、制御部は、測定サンプルの光情報に基づいて複数の液体噴射部のうちの１つを選択的に駆動することにより、目標サンプルの流れを、駆動された液体噴射部に対応した方向に偏向させるように構成することもできる。

この発明に係るサンプル分別方法は、溶液中に分散され間隔をあけながら１列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの測定サンプルの光情報に基づいて目標サンプルを選択的に分別する方法であって、測定サンプルの光情報に基づいて光ビームの照射域よりも下流側を流れる溶液中の目標サンプルに側方から噴射された液体を衝突させて目標サンプルの流れを偏向させることにより目標サンプルを他のサンプルから分別する方法である。

なお、測定サンプルの光情報に基づいて溶液中の目標サンプルに互いに異なる方向から選択的に液体を噴射することにより、目標サンプルの流れを、複数の方向のうちのいずれかに偏向させるようにしてもよい。

この発明によれば、溶液中の目標サンプルに側方から噴射された液体を衝突させて、これにより目標サンプルの流れを偏向させるので、大きなダメージを与えることなく目標サンプルを選択的に分別することが可能となる。

この発明の実施の形態１に係るセルソータを備えたフローサイトメータの構成を示す図である。 実施の形態１で用いられた液体噴射部の構成を示す断面図である。 液体噴射時における図２の液体噴射部の要部を示す断面図である。 実施の形態２に係るセルソータの概略構成を示す図である。

以下、図面に示す好適な実施の形態に基づいて、この発明を詳細に説明する。
実施の形態１
図１に、この発明の実施の形態１に係るセルソータを備えたフローサイトメータの構成を示す。フローサイトメータは、ほぼ鉛直方向に配置された円筒形状のフローセル１０を有している。フローセル１０は、測定サンプルＳが分散された溶液を流通させるためのものである。フローセル１０内では、シース液の流れの中に測定サンプルＳを含むサンプル液を吐出することにより、流体力学的絞り込み効果に起因して極めて細いサンプル液流が形成され、測定サンプルＳが１列となって適宜間隔をあけながら所定の速度Ｖで流れるように構成されている。

このようなフローセル１０の外周部を囲むように光学ユニット１４が配置されている。光学ユニット１４は、フローセル１０内に所定波長を有するレーザ光の照射域Ｒ１を形成するための光源部１６と、レーザ光が照射された測定サンプルＳから発生する前方散乱光を検出する受光部１８と、同じくレーザ光が照射された測定サンプルＳから発生する側方散乱光および蛍光を検出する受光部２０とを有している。一方の受光部１８は、フローセル１０を挟んで光源部１６に対向する位置に配置され、他方の受光部２０は、光源部１６からのレーザ光の照射方向に対して直角方向に配置されている。前方散乱光を検出する受光部１８としては、例えばフォトダイオード、フォトトランジスタ等を使用することができ、側方散乱光および蛍光を検出する受光部２０としては、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用することができる。

これら受光部１８および２０に分析部２２が接続されている。分析部２２は、受光部１８および２０で得られた検出信号に基づいて、前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、蛍光の強度、蛍光寿命等の光情報を算出する。

レーザ光の照射域Ｒ１よりも下流側の所定位置Ｒ２において、フローセル１０の壁部にノズル孔２４が形成され、その外側に液体噴射部２６が配置されている。液体噴射部２６は、所定位置Ｒ２を下方へと流れる溶液中の測定サンプルＳに向けて側方から液体Ｌを噴射するためのものである。液体Ｌの噴射を受けない測定サンプルＳは、溶液の流れに沿って鉛直下方へと落下するが、液体噴射部２６から噴射された液体Ｌが衝突した測定サンプルＳは、所定位置Ｒ２でその流れを偏向し、他の測定サンプルＳから分離して側方へずれることとなる。
なお、液体噴射部２６から噴射される液体Ｌとしては、測定サンプルＳの特性に影響を及ぼさないものであれば、特に限定されないが、例えば、フローセル１０に流通されたシース液およびサンプル液と同じ液体を用いることができる。

液体噴射部２６の駆動を制御するための制御部２８が、分析部２２と液体噴射部２６とに接続されている。制御部２８には、予めオペレータにより入力されていた目標サンプルに固有の光情報が記憶されている。制御部２８は、分析部２２で算出された光情報を予め記憶されていた目標サンプルに固有の光情報と比較することにより、フローセル１０内のレーザ光照射域Ｒ１を通過した測定サンプルＳが目標サンプルか否かを判定し、目標サンプルであると判定された測定サンプルＳが所定位置Ｒ２を通過する際に液体噴射部２６を駆動して、その液滴Ｄに液体Ｌを衝突させる。
また、制御部２８は、光学ユニット１４の光源部１６にも接続されている。

フローセル１０は、液体噴射部２６が配置された所定位置Ｒ２で、鉛直下方へ向けられた鉛直管部３４と、ノズル孔２４が形成された壁部とは反対方向で且つ斜め下方へ向けられた分岐管部３６とに分岐している。
さらに、鉛直管部３４の下方に、液体Ｌの噴射を受けなかった測定サンプルＳを溶液と共に貯留するための廃液容器３０が配置され、分岐管部３６の下方に、液体Ｌに衝突されて流れを偏向した測定サンプルＳを貯留するための回収容器３２が配置されている。
上述した液体噴射部２６、制御部２８、鉛直管部３４、分岐管部３６、廃液容器３０および回収容器３２により、実施の形態１に係るセルソータが構成されている。

図２に液体噴射部２６の構成を示す。この液体噴射部２６は、圧電素子の伸縮動作を利用した、いわゆるインクジェット方式の噴射部である。ブラケット４０により支持されたヘッド部４２に圧力室４４と、それぞれ圧力室４４に連通する液体流路４６およびノズル４８とが形成されている。圧力室４４の背部には、振動膜５０を介して圧電素子からなるアクチュエータ５２が配置され、ノズル４８をフローセル１０の壁部に形成されたノズル孔２４に位置合わせした状態で、ヘッド部４２の表面がフローセル１０の外周面に当接されている。

ヘッド部４２は、例えばエポキシ樹脂製の複合材料から形成され、特にヘッド部４２の一部から形成され且つ圧力室４４とアクチュエータ５２との間に介在する振動膜５０は、所定の弾力性および可撓性を有している。また、アクチュエータ５２には、外部から電圧を印加するための図示しない電極が形成されると共に、アクチュエータ５２を構成する圧電素子は、電圧を印加されることにより圧力室４４の方向へ伸長するように分極されている。
このため、液体流路４６を介して圧力室４４に液体Ｌが供給された状態で、アクチュエータ５２にパルス状の電圧を印加すると、図３に示されるように、振動膜５０を押圧変形させながらアクチュエータ５２が圧力室４４の方向へ伸長し、これにより圧力室４４内の圧力が上昇してノズル孔２４から液体Ｌが噴射される。

次に、図１に示したフローサイトメータの動作について説明する。
まず、制御部２８により光学ユニット１４の光源部１６が駆動され、フローセル１０内に所定波長を有するレーザ光の照射域Ｒ１が形成される。この状態で、フローセル１０内にシース液が供給されると共に測定サンプルＳを含むサンプル液がシース液の流れの中に吐出され、これにより測定サンプルＳが１列となって適宜間隔を隔てながら所定の速度Ｖで流される。
なお、制御部２８では、測定サンプルＳの所定の速度Ｖおよびレーザ光照射域Ｒ１と所定位置Ｒ２との間の距離に基づき、測定サンプルＳがレーザ光照射域Ｒ１を通過してから所定位置Ｒ２に至るまでの所要時間Ｔが算出され記憶されているものとする。

フローセル１０内を流れる測定サンプルＳがレーザ光照射域Ｒ１に入り、ここで所定波長のレーザ光の照射を受けると、測定サンプルＳに含まれる蛍光色素が励起されて蛍光が発生すると共に測定サンプルＳによる前方散乱光および側方散乱光が発生する。測定サンプルＳから発生された前方散乱光は受光部１８で検出され、受光部１８から分析部２２へ検出信号が伝送される。一方、測定サンプルＳから発生された蛍光および側方散乱光は受光部２０で検出され、受光部２０から分析部２２へ検出信号が伝送される。これらの検出信号に基づいて、分析部２２により、前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、蛍光の強度、蛍光寿命等の光情報が算出され、制御部２８へ出力される。

制御部２８では、予めオペレータにより入力され記憶されていた目標サンプルに固有の光情報と分析部２２で算出された光情報との比較が行われる。なお、ここで比較される光情報としては、上述した前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、蛍光の強度および蛍光寿命に関する情報のうちのいずれか１つを用いてもよく、あるいは複数の情報をそれぞれ比較するようにしてもよい。

そして、分析部２２で算出された光情報が制御部２８に記憶されていた光情報に合致した場合に、制御部２８は、フローセル１０内のレーザ光照射域Ｒ１を通過した測定サンプルＳが目標サンプルであると判定する。一方、分析部２２で算出された光情報が制御部２８に記憶されていた光情報に合致しない場合には、制御部２８は、フローセル１０内のレーザ光照射域Ｒ１を通過した測定サンプルＳが目標サンプルではないと判定する。

レーザ光照射域Ｒ１を通過した測定サンプルＳは、サンプル液およびシース液からなる溶液と共にフローセル１０内を所定の速度Ｖで下方へと流れ、ノズル孔２４が形成されている所定位置Ｒ２を通る。
そこで、制御部２８は、分析部２２から入力された光情報に基づいて目標サンプルであると判定した測定サンプルＳが所定位置Ｒ２に至るタイミングで液体噴射部２６を駆動する。具体的には、この測定サンプルＳがレーザ光照射域Ｒ１を通過してから予め算出して記憶していた所要時間Ｔが経過した時点で、制御部２８は、液体噴射部２６のアクチュエータ５２にパルス状の電圧を印加し、これによりアクチュエータ５２が伸長して圧力室４４が圧縮され、ノズル孔２４から液体Ｌが噴射される。

このようにして、液体と共に流れてきた目標サンプルは、所定位置Ｒ２で液体噴射部２６から噴射された液体Ｌに衝突され、その流れを偏向させる。すなわち、所定位置Ｒ２まではフローセル１０内を鉛直下方に向かって流れてきた目標サンプルが、液体Ｌの衝突により、所定位置Ｒ２からはノズル孔２４が形成された壁部とは反対方向へと進行方向を変えて分岐管部３６内へ入る。このため、目標サンプルは、分岐管部３６に案内されて回収容器３２に収容されることとなる。

一方、制御部２８は、分析部２２から入力された光情報に基づいて目標サンプルではないと判定した測定サンプルＳに対しては、所定位置Ｒ２に至っても液体噴射部２６による液体Ｌの噴射を行わない。すなわち、目標サンプル以外の測定サンプルＳは、所定位置Ｒ２を通過してもそのまま鉛直下方へと流れて鉛直管部３４に入り、鉛直管部３４に案内されて廃液容器３０に収容される。

以上のようにして、溶液と共に流れる測定サンプルＳに選択的に液体噴射部２６から液体Ｌを噴射することにより、目標サンプルのみを回収容器３２に収容すると共に目標サンプル以外の測定サンプルＳを廃液容器３０に収容することができる。従来技術で用いられていたような液滴への電荷の付与を行わずに、液体Ｌの噴射のみで測定サンプルＳを選別するので、大きなダメージを与えることなく細胞等からなる目標サンプルを分別することが可能となる。
また、液滴を形成することなく、溶液と共に流れる目標サンプルに側方から噴射された液体を衝突させて目標サンプルの流れを偏向させるので、液滴を形成する際に目標サンプルがせん断力を受けてダメージを被るおそれもない。
なお、インクジェット方式の液体噴射部２６を用いているので、１秒間に数万個の液体Ｌを噴射することができ、多数の測定サンプルＳを短時間で分別することが可能となる。

実施の形態２
図４に実施の形態２に係るセルソータの概略構成を示す。このセルソータは、図１に示した実施の形態１のセルソータにおいて、所定位置Ｒ２に対応して配置されたノズル孔２４および液体噴射部２６に加え、所定位置Ｒ２より下方の他の所定位置Ｒ３に対応してノズル孔６０および液体噴射部６２を配置すると共に、この所定位置Ｒ３から、ノズル孔６０が形成された壁部とは反対方向で且つ斜め下方へ向けられた分岐管部６４を分岐させ、分岐管部６４の下方に回収容器６６を配置したものである。さらに、実施の形態１の制御部２８の代わりに液体噴射部２６および６２に制御部６８を接続し、制御部６８に、実施の形態１で説明した光学ユニット１４の光源部１６および分析部２２が接続されている。

液体噴射部６２は、実施の形態１で説明した液体噴射部２６と同様の構成を有し、所定位置Ｒ３を流れる測定サンプルＳに向けて側方から液体Ｌを噴射するが、液体噴射部２６とは異なる方向から液体Ｌを噴射するように配置されている。そして、液体噴射部６２から液体Ｌの噴射を受けない測定サンプルＳは、所定位置Ｒ３を鉛直下方へと落下するが、液体噴射部６２から噴射された液体Ｌが衝突した測定サンプルＳは、所定位置Ｒ３でその流れを偏向させて分岐管部６４内へ入り、回収容器６６に収容される。

制御部６８には、予めオペレータにより入力されていた第１の目標サンプルに固有の光情報および第２の目標サンプルに固有の光情報がそれぞれ記憶されており、制御部６８は、分析部２２で算出された光情報を予め記憶されていたこれらの光情報と比較することにより、フローセル１０内のレーザ光照射域Ｒ１を通過した測定サンプルＳが第１の目標サンプルか第２の目標サンプルかあるいはその他の目標サンプルかを判定する。

そして、第１の目標サンプルであると判定すると、制御部６８は、その測定サンプルＳが所定位置Ｒ２を通過するタイミングで液体噴射部２６を駆動して、測定サンプルＳに液体Ｌを衝突させ、その流れを偏向させて測定サンプルＳを回収容器３２に収容させる。一方、レーザ光照射域Ｒ１を通過した測定サンプルＳが第２の目標サンプルであると判定すると、制御部６８は、その測定サンプルＳが所定位置Ｒ３を通過するタイミングで液体噴射部６２を駆動して、測定サンプルＳに液体Ｌを衝突させ、その流れを偏向させて測定サンプルＳを回収容器６６に収容させる。また、第１の目標サンプルでも第２の目標サンプルでもないと判定した場合には、液体噴射部２６および６２はいずれも駆動されず、測定サンプルＳは、所定位置Ｒ２およびＲ３を通過してもそのまま鉛直下方へと落下して廃液容器３０に収容される。

このようにして、第１および第２の目標サンプルをそれぞれ分別して回収容器３２および６６に収容させることができる。
なお、１つの所定位置に対応して２つの液体噴射部２６および６２を互いに異なる方向に向けて配置することができれば、液体噴射部２６および６２の配置高さを互いに異ならせることはなく、例えば共通の所定位置Ｒ２に対応してこれら液体噴射部２６および６２を並設してもよい。この場合には、分岐管部３６および６４は共に所定位置Ｒ２から互いに異なる方向に分岐するように構成される。
また、液体噴射部２６および６２の配置高さが互いに異なれば、これら液体噴射部２６および６２を互いに同じ方向に向けて配置してもよい。この場合には、分岐管部３６および６４も互いに同じ方向に向けて配置される。
同様にして、３組以上の液体噴射部と分岐管部と回収容器を配置することにより、３種類以上の目標サンプルをそれぞれ分別することが可能となる。

上記の実施の形態１および２では、液体噴射部として圧電素子の伸縮動作を利用したインクジェット方式の噴射部を用いたが、これに限るものではなく、例えばソレノイドコイルを使用し、電磁力を利用して圧力室を押圧することにより液体Ｌを噴射するように構成することもできる。

１０ フローセル、１４ 光学ユニット、１６ 光源部、１８，２０ 受光部、２２ 分析部、２４，６０ ノズル孔、２６，６２ 液体噴射部、２８，６８ 制御部、３０ 廃液容器、３２，６６ 回収容器、３４ 鉛直管部、３６，６４ 分岐管部、４０ ブラケット、４２ ヘッド部、４４ 圧力室、４６ 液体流路、４８ ノズル、５０ 振動膜、５２ アクチュエータ、Ｓ 測定サンプル、Ｌ 液体、Ｒ１ レーザ光照射域、Ｒ２，Ｒ３ 所定位置。

Claims (5)

1. 溶液中に分散され間隔をあけながら１列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの前記測定サンプルの光情報に基づいて前記目標サンプルを選択的に分別するセルソータであって、
   前記光ビームの照射域よりも下流側を流れる溶液中の前記測定サンプルに向けて側方から液体を噴射するための液体噴射手段と、
   前記測定サンプルの光情報に基づいて前記液体噴射手段を選択的に駆動することにより、溶液中の前記目標サンプルに前記液体噴射手段から噴射された液体を衝突させて前記目標サンプルの流れを偏向させ、前記目標サンプルを他のサンプルから分別する制御部と
   を備えたことを特徴とするセルソータ。
2. 前記液体噴射手段は、圧電素子の駆動により液体を噴射する請求項１に記載のセルソータ。
3. 前記液体噴射手段は、溶液中の前記測定サンプルに向けて互いに異なる方向から液体を噴射する複数の液体噴射部を有し、
   前記制御部は、前記測定サンプルの光情報に基づいて前記複数の液体噴射部のうちの１つを選択的に駆動することにより、前記目標サンプルの流れを、駆動された前記液体噴射部に対応した方向に偏向させる請求項１または２に記載のセルソータ。
4. 溶液中に分散され間隔をあけながら１列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの前記測定サンプルの光情報に基づいて前記目標サンプルを選択的に分別する方法であって、
   前記測定サンプルの光情報に基づいて前記光ビームの照射域よりも下流側を流れる溶液中の前記目標サンプルに側方から噴射された液体を衝突させて前記目標サンプルの流れを偏向させることにより前記目標サンプルを他のサンプルから分別する
   ことを特徴とするサンプル分別方法。
5. 前記測定サンプルの光情報に基づいて溶液中の前記目標サンプルに互いに異なる方向から選択的に液体を噴射することにより、前記目標サンプルの流れを、複数の方向のうちのいずれかに偏向させる請求項４に記載のサンプル分別方法。

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