JP2010183888A

JP2010183888A - Ｄｎａマイクロアレイプローブの選抜方法とそのプローブ

Info

Publication number: JP2010183888A
Application number: JP2009031292A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Togawa; 直之外川
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2009-02-13
Filing date: 2009-02-13
Publication date: 2010-08-26

Abstract

【課題】 DNAマイクロアレイで取得したデータの検証に際して，データ取得後にリアルタイムPCRを使用した検証の必要がないプローブの選抜方法及び当該プローブが搭載されたDNAマイクロアレイの提供。
【解決手段】以下の工程を含むDNAマイクロアレイに搭載するプローブの選抜方法。
１）１種以上の動物の少なくとも２種の培養細胞、組織または臓器から，totalRNAまたはmRNAを抽出する工程。
２）前記totalRNAまたはmRNAを用い、目的遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価する工程。
３）前記評価結果から，特定のコントロール遺伝子を基準として，発現量の比を算出する工程。
４）前期工程で得られた発現量の比と一致する結果を示すプローブを選抜する工程。
【選択図】なし

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドプローブの選抜方法、及び当該選抜されたプローブを備えたDNAマイクロアレイに関する。

近年、ヒト、マウス等のゲノム解析プロジェクトの進展により、種々の生物種の、ゲノムの全塩基配列が解読されている。得られた塩基配列情報は、遺伝子の発現パターンや遺伝子産物の機能を全ゲノムレベルで調査する研究に利用される。これらの研究を効率よく、飛躍的に進展させるためのツールとして、DNAマイクロアレイ（又はDNAチップ）が開発されており、全ゲノムが解読された生物種の遺伝子発現解析などに広く用いられている。
一般に、DNAマイクロアレイは、ガラススライドの上に、メッセンジャーRNA（mRNA）と相補的な配列を有する相補DNA（complementary DNA又はcDNA）をプローブとして固定化したものである（非特許文献１参照）。プローブの固定化方法としては、主にアレイ固相表面上のあらかじめ定められた領域で１本鎖DNAを合成する方法、又は予め化学合成された１本鎖DNAあるいはPCR反応等で調製した２本鎖DNAをアレイ固相上の予め定められた領域にスポッティングする方法が知られている。この際の固定化するプローブ配列は、DNAマイクロアレイの結果に大きな影響を与え、どのような配列をプローブとして用いるかということが非常に重要である。
プローブ配列の選択において考慮すべき点として、クロスハイブリダイゼーションが考えられる。クロスハイブリダイゼーション（「クロスハイブリ」と称する場合もある）とは、本来１対１に対応すべきサンプルのmRNAやcDNAと、基板に固定化されたDNAプローブとが、多対１対応（もしくは１対多対応）になる現象である。異なる遺伝子由来のmRNAでも、互いに類似した配列があるので（例えば同一スーパーファミリーに属する遺伝子同士は類似配列部位を多く有する）、この類似配列を包含するプローブは、例えば同一スーパーファミリーに属する多くの遺伝子由来のmRNAとハイブリダイズしてしまう。このため、仮に測定対象となる遺伝子の発現強度が同一であっても、類似配列を有する遺伝子の発現強度が異なれば、測定対象の遺伝子の発現強度は変化したと誤って観測され、ひいては測定再現性の低下を引き起こす。従って、DNAマイクロアレイ用プローブ配列を設計するには、まずGenBankなどの塩基配列データベース及びEST（Expressed Sequence Tag）配列データベース等の公共又は商用データベースから、ゲノムDNA又はmRNA配列を取得し、他の遺伝子配列とは類似していない特異的領域を特定することからはじめる。
次に、このような特異的領域の中から、プローブ候補配列を列挙する。例えば、あるmＲＮＡ配列中に200塩基長の特異的領域を見出した後、この配列中から、80塩基長のプローブを設計しようとした時、(200-80+1)個のプローブ候補配列をあげることができる。
さらに考慮しなければならないことは、プローブの融解温度（Tm, melting temperature）である。DNAマイクロアレイ上に固定化されたすべてのプローブDNAは、同一の温度、塩溶液中でハイブリダーゼーションが行われるため、すべてのプローブDNAのTmは、ほぼ同一にしておく必要がある。したがってすべての遺伝子のプローブ候補配列の中から、一定のTm値にあわせた配列を選抜する必要がある。
このように絞り込まれたプローブ候補の中から、二次構造を形成しにくいものをさらに選抜する。１本鎖DNAは溶液中において自らの水素結合による高次構造を形成しており、この高次構造のことを二次構造とよぶ。プローブDNAとターゲットRNA間のハイブリダイゼーションは、二次構造の形成と競合する過程である。すなわち、ターゲット濃度が同一の場合は、二次構造を形成しにくいほど、プローブ−ターゲット間のハイブリダイゼーション頻度が高くなるため、ハイブリダイゼーションの信号強度は大きくなる。
最後に、プローブの位置（3’末端からの距離）について考慮する必要がある。現在、DNAマイクロアレイのターゲットを調製する際には、mRNAの逆転写反応を一度行うことが一般的である。プローブの位置がmRNAのpolyA側（3’末端側）から遠い位置にあると、ターゲット核酸が生成されない位置となる場合がある。したがって、感度が高いプローブ配列とするためには、mRNAのpolyA側（3’末端）により近いプローブ配列を選抜する。
以上の記載のように設計したプローブ配列候補群をマイクロアレイに搭載させ、試験的にプローブを評価することも行われている。

特表2003-505038号公報特開2002-357606号公報特開2003-280号公報特開2003-52385号公報特開2008-136425号公報

Nature Biotechnology, vol.14, p.1675-1680(1996) Clinical Cancer Research ,vol. 10, 2368-2378 (2004) Blood, vol. 105 (2), 15 (2005)

近年の技術水準の進展に伴い、より精度の高い検出結果が得られる検出方法が強く望まれている。
しかし、上記のような概念をもとに、コンピューター上で、プローブ配列の選抜及び設計が行われ、ハイブリダイゼーションによるプローブ特異性評価が行われているが、期待される結果と現実の結果とに違いが見られることも多くある。

このような状況下、現在では、DNAマイクロアレイのデータを取得した後、そのデータの結果から、比較するサンプル間で差があると考えられた限られた数の遺伝子に関してリアルタイムPCRでデータを取得し、DNAマイクロアレイのデータの確認を行うことが日常的になされている。具体的には、数千〜数万のプローブDNAを搭載したDNAマイクロアレイに対して、total RNAから調製した比較するサンプルのaRNAをハイブリダイズし、数倍以上発現量に差がみられたものを選択後、再度この遺伝子についてTaqManプローブ等を用いたリアルタイムPCRを実施してデータの確認を行うというものである。この方法では限られた一部の遺伝子のみしか検証されたデータを得ることが出来なかった。本発明は上記課題を解決することを目的とする。

本発明者は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、比較するサンプルの各遺伝子について、リアルタイムPCRで発現量データを取得しておき、これと一致する結果を与えるプローブ配列を選択し、DNAマイクロアレイに搭載することにより課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 以下の工程を含むDNAマイクロアレイに搭載するプローブの選抜方法。
１）１種以上の動物の少なくとも２種の培養細胞、組織または臓器から，totalRNAまたはmRNAを抽出する工程。
２）前記totalRNAまたはmRNAを用い、目的遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価する工程。
３）前記評価結果から，特定のコントロール遺伝子を基準として，発現量の比を算出する工程。
４）前期工程で得られた発現量の比と一致する結果を示すプローブを選抜する工程。
[２] さらに発現量の比の，一致の尺度として最小二乗法による近似直線を算出した後、その直線から一定の距離内にあるかを判断するプローブの選抜方法。
[３] 上記[１]又は[２]で選抜されたプローブを搭載するDNAマイクロアレイ。
[４] リアルタイムPCRとの発現差の相関が決定係数R²で０．９５以上である上記[３]のマイクロアレイ。

本発明のプローブの選抜方法及び当該プローブが搭載されたDNAマイクロアレイにより，DNAマイクロアレイで取得したデータの検証に際して，データ取得後にリアルタイムPCRを使用した検証の必要がなく，限られた一部の遺伝子のみしか検証されたデータを得ることができない従来の課題が解決できる。

中空繊維束（中空繊維配列体）の製造用の配列固定治具を示す概略図である。比較対照として肝臓を使用し，x軸をLog2（シグナル強度の比率）、y軸をΔΔCt値として、比較データをグラフ上にプロットした図である。比較対照として骨格筋を使用し，x軸をLog2（シグナル強度の比率）、y軸をΔΔCt値として、比較データをグラフ上にプロットした図である。比較対照として小腸を使用し，x軸をLog2（シグナル強度の比率）、y軸をΔΔCt値として、比較データをグラフ上にプロットした図である。比較対照として睾丸を使用し，x軸をLog2（シグナル強度の比率）、y軸をΔΔCt値として、比較データをグラフ上にプロットした図である。比較対照として培養細胞（LPS刺激）を使用し，x軸をLog2（シグナル強度の比率）、y軸をΔΔCt値として、比較データをグラフ上にプロットした図である。選抜プローブのリアルタイムPCRとの比較した図である。

本発明は、以下の工程を含むDNAマイクロアレイに搭載するプローブの選抜方法である。
１）１種以上の動物の少なくとも２種の培養細胞、組織または臓器から，totalRNAまたはmRNAを抽出する工程。
２）前記totalRNAまたはmRNAを用い、目的遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価する工程。
３）前記評価結果から，特定のコントロール遺伝子を基準として，発現量の比を算出する工程。
４）前期工程で得られた発現量の比と一致する結果を示すプローブを選抜する工程。

第一の工程において，１種以上の動物の少なくとも２種の培養細胞、組織または臓器から，totalRNAまたはmRNAを抽出する。ここで１種以上の動物の少なくとも２種の培養細胞、組織または臓器とは，DNAマイクロアレイを使用して，発現量等のデータを取得する対象となる検体であり，検体は適宜選択される。TotalRNAまたはmRNAの抽出方法としては，一般的な手法を使用すればよい。市販のキットを使用すれば簡便に抽出・精製が可能である。例えば，グアニジンー塩化セシウム超遠心法，AGPC法（Acid guanidinium-Phenol-Chloroform法）等が挙げられる。

第二の工程において，totalRNAまたはmRNAを用い、目的遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価する。
リアルタイムPCRとは，PCRの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、繰り返し大量の遺伝子発現を測定するには不向きであるが、電気泳動が不要で迅速性と定量に優れている測定法である。評価方法としては，定量法が挙げられ，定量方には大きく分けて絶対定量と相対定量の２種類がある。本発明では相対定量をいう。相対定量とは、ターゲットサンプルのある遺伝子とリファレンスサンプルのある遺伝子の測定を行い、リファレンスサンプルに対するターゲットサンプルの発現相対量を求めてサンプル間で比較する方法である。

第三の工程において，「評価結果から，特定のコントロール遺伝子を基準として，発現量の比を算出する」とは，
未知サンプルの遺伝子の発現量が，コントロール遺伝子に対してどれだけ増減しているかを解析することである。相対定量実験では、発現量を求めたいターゲット遺伝子の他に、必ず内部コントロール遺伝子の測定も行う。内部コントロール遺伝子は、サンプル間の鋳型量の標準化を行うためのものであり、遺伝子発現解析の実験では通常、ハウスキーピング遺伝子が用いられる。解析時には、まず、内部コントロール遺伝子の定量値を用いてサンプル間の鋳型量の標準化を行い、次に、標準化された値をコントロールサンプルと比較して発現量の変動を調べる。上記の手法はΔΔCt 法と呼ばれ、検量線を用いずに定量できる方法である。

ただし、測定するすべての遺伝子についてPCR 増幅効率がほぼ一定であることが前提なので、好ましくは、実験により検証されたプライマー、プローブを用いる。この一例として、遺伝子ごとに設計されたTaqMan（登録商標：アプライドバイオシステムズ社）プローブを用いる方法が挙げられる。
内部コントロール遺伝子としては従来からハウスキーピング遺伝子がよく用いられている。この一例としてとGAPDH やβアクチンがあげられる。近年、これらの遺伝子も実験条件によっては変動するケースがあることが報告されている。したがって１種類のハウスキーピング遺伝子で補正を行うことも可能であるが、複数のハウスキーピング遺伝子を用いて変動が小さいと思われるものを選択して使用することも可能である。

プローブを選択する際の、DNAマイクロアレイのデータの補正には、リアルタイムPCRデータで補正したものと同じ内部コントロール遺伝子を用いる[A
nalysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8.）参照]。
第四の工程において，リアルタイムPCRで複数のサンプルについてデータ取得した後、DNAマイクロアレイのプローブを選抜する。DNAマイクロアレイに搭載するプローブ候補群としては、先にあげた手法で選抜したプローブを用いることができる。これらの複数のプローブを搭載したDNAマイクロアレイを作製した後、リアルタイムPCRでデータ取得を行ったサンプルと同一のサンプルを用いてDNAマイクロアレイのデータを取得する。データ取得後は、リアルタイムPCRで用いた内部コントロール遺伝子と同一の遺伝子を用いてサンプル間の補正を行う。

補正を行った後、リアルタイムPCRから得られた発現データとの比較を行う。この際、Y軸にリアルタイムPCRの発現量比、X軸にDNAマイクロアレイの発現量比をスキャッタープロットにしてグラフ化する。理想的には、Y=Xの直線上にすべてのプロットが配置されるが、実際はプローブによってリアルタイムPCRとのずれが生じているものがあるため、この段階でプローブの選抜を行う。
選抜方法としては、プローブ候補の中からもっともリアルタイムPCRのデータに近いものを用いる方法が考えられる。またはスキャッタープロットをもとに最小二乗法によって近似直線を求めこの直線にもっとも近いプロットとなるプローブを選抜する方法も考えられる。

DNAマイクロアレイで取得する比較データは特に制限されず、例えば、比較する２つの試料を用いた個別の発現解析データを比較したデータであっても、２蛍光染色法のように２つの試料を異なる色素で標識した後DNAマイクロアレイ上で競合ハイブリダイゼーションして得られた比較データであってもよい。存在量比は各サンプルから得られたハイブリダイゼーション強度から適切にバックグラウンドを引き、内部コントロール遺伝子で補正した後、これらの値の比率に対してLog２をとった値を用いる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実施例１＞
本実施例では、TaqMan（登録商標）プローブを用いたリアルタイムPCR、貫通孔型DNAマイクロアレイを用いた説明を行う。しかし、本発明はこれらに限定されず、例えば、サイバーグリーンを用いたリアルタイムPCR、平板型及びビーズ型などの各種基盤を使用したDNAマイクロアレイにも適用可能である。
１．リアルタイムPCRデータの取得
（１）リアルタイムPCR用プライマー、プローブの準備
表１及び表２に示すTaqMan probe（登録商標）をアプライドバイオシステムズジャパンから購入した。

（２）被験試料の準備
マウスの肝臓、脳、胸腺、心臓、肺、脾臓、睾丸、子宮、腎臓及び胎児（10〜12日）由来のtotal RNAがセットになっているAssorted total RNAをアプライドバイオシステムズ社から購入した（Assorted total RNA；製品番号：＃AM7800）。また骨格筋由来のtotal RNA（STRATAGENE社；製品番号：＃736513）、小腸由来のtotal RNA（BioChain社；製品番号：＃R1334226-50）、胎盤由来のtotal RNA（BioChain社；製品番号：＃R1334200-50）、脂肪組織由来のtotal RNA（BioChain社；製品番号：＃R1334003-50）を購入した。

さらに、マウス培養細胞（RAW246.7細胞）をLPS刺激下で6時間培養し、細胞を回収、RNeasy MinElute Kit（QIAGEN社製）を用いて抽出しtotal RNAを得た。

以上、合計15種類のtotal RNAを用意した。

この15種類のtotal RNAのうち、肝臓、腎臓、骨格筋、小腸、睾丸、培養細胞由来のものを使用し、リアルタイムPCRのテンプレートとするcDNAを調製した。
各々のtotal RNA 12μgを材料とし、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor（アプライドバイオサイエンス社；＃4374966）を使用して、キットの説明書のとおりｃDNA合成を行った。total RNA 1μgを12本のチューブを用いて反応させた。

まず、チューブ1本あたり表３の通り、試薬を混合した。

試薬混合後、25℃で10分間、37℃で120分間、及び85℃で5秒間、インキュベートした後、氷上に置いた。その後、同じ種類のtotalRNA由来のｃDNAをすべてプールして約240μlとしてこれをリアルタイムPCRのテンプレートに用いた。
（３）リアルタイムPCRの実施
Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステムを用いて、リアルタイムPCRを行った。反応試薬は、TaqMan（登録商標）Fast Universal PCR Master Mix（2×）（アプライドバイオサイエンス社；＃4352042）を用いた。

プールした上記のcDNAを1ウェルあたり1μlを使用してリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRはTaqMan法で行い、その際のTaqManプローブは表１のものを用いた。

次いで、1ウェルあたり表３のように試薬を混合した。

TaqManプローブ1種類あたり、2ウェルを使用し、2連で実験を行った。混合液を95℃で20秒インキュベートした後、「95℃,3秒→60℃,20秒」を1サイクルとして40サイクル＋延長10サイクル、計50サイクルのプログラムで、リアルタイムPCRを行った。

その後、Applied Biosystems 7500 FastリアルタイムPCRシステム付属のソフトでCt値を得た。内部コントロール遺伝子としてArbp（TaqMan_ID＝Mm99999223_gH）を用い、サンプル内の各遺伝子のCt値からArbpのCt値を差し引き、ΔCt値を算出したところ、表５〜７に示す結果となった。

続いてΔΔCt法により、各遺伝子の，サンプル間の発現量の比較データを得た。基準とするサンプルはどれを用いてもかまわないが、今回は腎臓を基準とした発現比としてΔΔCt値を算出した。結果を表８〜１０に示した。腎臓での発現量と比較し、より多く発現していればプラス、少なければマイナスの符号となる。またΔΔCt値の絶対値として「１」とは発現比として2倍差があることを示す。

２．DNAマイクロアレイの製造
貫通孔型のDNAマイクロアレイを、以下の手順で製造した。
（１）プローブの調製
DNAマイクロアレイに搭載するオリゴヌクレオチドプローブ（DNAプローブ）として、表４に示される塩基配列からなる5’末端ビニル化核酸分子を用いた。これら核酸分子の調製方法を以下に示す。

まず、末端アミノ化核酸（5’-O-アミノヘキシル-核酸）を合成するために、アミダイト試薬を用い、DNA自動合成装置により、表４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。その後、最終段階で、アミノリンクTM（PEバイオシステムズ社製）を各オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで、脱保護操作を行うことにより調製した。なお、他の手法で製造された末端アミノ化オリゴDNAを購入することも可能である。

続いて、調製した末端アミノ化核酸に対してビニル化剤とのビニル化反応を実施し（特許第04022149号公報参照）、その後精製することにより、効率良く末端ビニル化核酸とした。

各プローブの具体的な塩基配列は、表１１〜１６に示す通りである。特により詳細に検証したい遺伝子のプローブは複数プローブ搭載した。

（２）中空繊維束（中空繊維配列体）の製造
図1に示す配列固定器具を利用して中空繊維束（中空繊維配列体）を製造した。なお、図1中のｘ、ｙ、ｚは互いに直交する３次元軸であり、ｘ軸は上記中空繊維の長手方向と一致する。

まず、孔の中心間距離を0.42mmとして直径0.32mmの孔が縦12列横19行各で合計228個設けられた、厚さ0.1mmの多孔板２１を2枚準備した。これらの多孔板２１を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維３１（三菱エンジニアリングプラスチック社製、カーボンブラック1質量%含有）を１本ずつ通過させた。

ｘ軸方向に各中空繊維３１に0.1Nの張力をかけた状態で２枚の多孔板２１の位置を移動させて、中空繊維３１の一方の端部から20mmの位置と100mmの位置の2ヶ所に上記多孔板２１を固定した。即ち、2枚の多孔板２１の間隔を80mmとした。

次いで、上記多孔板間の空間の周囲３面を板状物４１で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。

得られた容器の上部から樹脂原料を流し込んだ。樹脂原料としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）製、ニッポラン4276，コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。樹脂原料を流し込んだ後、容器を25℃で1週間静置して樹脂を硬化させた。硬化後、容器から多孔板２１と板状物４１を取り除いて、中空繊維束を得た。得られた中空繊維束の繊維端のうち、一方は封止し、もう一方は開放状態にしておいた。
（３）ゲル充填中空繊維配列体の製造
次に、表１７に示す配合割合（プローブに関しては濃度）で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。当該溶液は、先に調製したプローブの種類ごとに調製した。
調製した各種ゲル前駆体重合性溶液を、384マイクロタイタープレートの所定のウェルに、80μLずつ分注した。

次に、上記分注後の384プレート及び中空繊維束をデシケーター内に配置し、デシケーター内を減圧状態にした後、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部を、384プレートに分注した溶液中に浸漬した。その後、デシケーター内に窒素ガスを封入して減圧状態を解き、中空繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入させた。次いで、容器内を70℃とし、3時間かけて重合反応を行った。

このようにして、プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束（ゲル充填中空繊維配列体）を得た。

（４）薄片化
上記(3)で得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向に厚さ0.25mmで200枚スライスし、得られた薄片シートをDNAマイクロアレイとした。
３．DNAマイクロアレイでの遺伝子発現の検出
（１）被験試料の準備
リアルタイムPCRで用いた試料と同一のtotalRNAを準備した。
（２）DNAマイクロアレイ用検体（aRNAの調製）
下記の通り、DNAマイクロアレイを用いた検出による発現量の測定を行った。

（１）で準備したtotal RNA 1μgを用いて、DNAチップにハイブリダイゼーションさせるビオチン標識aRNAを調製した。ビオチン標識aRNAの調製はMessage Amp II Biotin Kit (Ambion社製)を用い、キット付属の方法に従って実施した。取得したaRNAは、実験に用いるまで-80℃で保存しておいた。
（３）ハイブリダイゼーション
これらのaRNA 5μgをキット付属の断片化Bufferで断片化した。断片化は、94℃で７．５分間行った。断片化後、ハイブリダイゼーション溶液を混合し、チャンバー中、65℃で16時間、DNAマイクロアレイにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション溶液の終濃度は、0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20であった。

ハイブリダイゼーション溶液と断片化後aRNAとを表８のように混合した。

（４）洗浄
＜準備＞
洗浄液A：0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20溶液を滅菌済みの遠心管に10ml入れた。これをチップ1枚あたり、2本用意した。2本を65℃に保温した。

洗浄液B: 0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液を滅菌済みの遠心管にを10ml入れ、チップ１枚あたり、1本用意した。これを65℃に保温した。

ハイブリダイゼーション反応後、以下の手順(a)〜(c)でDNAマイクロアレイを洗浄した。
(a) 16時間のハイブリダイゼーションが終了するまでに、洗浄液A、Bを65℃に保温しておいた。ハイブリダイゼーションが終了した時点でチャンバーからDNAマイクロアレイを取り出し、洗浄液Aに浸漬し、65℃で20分間静置した。

(b) その後、65℃の洗浄液Aからもう1本の65℃の洗浄液AにDNAマイクロアレイを移し、65℃で20分間静置した。

(c) 20分後、65℃に保温した0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液にDNAマイクロアレイを移し、65℃で10分間静置した。
（５）
染色
ストレプトアビジン-Cy5（1 mg，GEヘルスケア，＃PA45001）に滅菌水1mlを加え、あわ立たないようにゆっくりと溶解した後、102μlずつ8本に分注した。そのうちの1本から100μlとり、50mlの0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液に混合した。この溶液中に、(c)の処理が終了したDNAマイクロアレイを取り出して浸漬した。30分間室温、暗所で静置し、染色反応を行った。
染色反応後の洗浄は以下の通り行った。まず、洗浄液Ｃ及び保存液を調製した。

洗浄液C：室温の0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20溶液、6mlを滅菌済みの遠心管に入れた。これを4本用意した。

保存液：0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液を滅菌済みの遠心管にを6ml入れ、チップ1枚あたり、1本用意した。
次に、染色後のチップを洗浄液Cに浸漬し、ローテーターを用いて、室温で、10rpmで回転させながら洗浄した。この後、新たな、洗浄液Cにチップを移しいれ、同様の洗浄をあと3回繰り返した。
最後に、保存液にチップを移し入れた。
（６）蛍光シグナルの検出
上記洗浄、染色、及び染色後の洗浄の後、三菱レイヨン社製の冷却CCD式蛍光検出装置（型番：0060304）を用い、下記検出条件で、各スポットの蛍光シグナルを検出した。
検出条件：
中心励起波長： 630nm
蛍光フィルター： Cy5フィルター
露光時間： 200 msec
プローブを搭載した各スポットの蛍光強度検出結果とブランクスポット（プローブを搭載していないスポット）の蛍光強度検出結果を得た。複数のブランクスポット蛍光強度の中央値をバックグラウンドとして、プローブを搭載した各スポットの蛍光強度から差し引きシグナル強度とした。その後、Arbpのプローブを内部コントロールとして、サンプル間でArbpのシグナル強度が最大のものを選択し、これに対する各サンプルのArbpの強度比率を算出し、サンプル間の補正係数とした。各遺伝子のシグナル強度に各サンプルの補正係数を乗算し、最終的な補正後のシグナル強度とした。この結果を下記表１９〜２６に示した。この方法によればArbpの補正後のシグナル強度はどのサンプルでも同一の値となっている。

また、ネガティブコントロールを大腸菌のOmpA遺伝子用プローブとし、このプローブが搭載されたスポットのシグナル強度より低いシグナル強度を示すものは検出できていないと判断した。

続いて検出できたプローブに関してサンプル間での比較を行った。

４．リアルタイムPCRとDNAマイクロアレイデータの発現比の比較
PCRの反応理論式は、式１で表される。
＜式１＞

[DNA]= [DNA]₀(1+e)^c
（ここで、[DNA]：PCR産物濃度、
[DNA]₀：標的テンプレートの初期濃度、
e ：平均PCR効率、
c ：サイクル数を意味する）
相対定量法では、平均PCR効率が分からないが、理想的な配列設計がなされている場合、e = 1 と仮定することができ、[DNA]= [DNA]₀ ×2^cとあらわすことが出来る。
リアルタイムPCRでは、totalRNAまたはｍRNAから逆転写したｃDNAをテンプレートに用いるが、
サンプルaの標的テンプレートの初期濃度を[DNA]_a0、サンプルbの標的テンプレートの初期濃度を[DNA]_b0とし、試料AでのCt値をCta、試料BでのCt値をCtbとすると、Ct値の定義より、
[DNA]= [DNA] _a0×2^Cta = [DNA] _b0 ×2^Ctbであり、
AとBにおける初期cDNA量の相対比は
[DNA]_b0/[DNA]_a0=2^(Cta-Ctb)である。

一方、DNAマイクロアレイでは、同一のプローブを用いた場合、ある遺伝子のサンプル間の存在量比は[サンプルAのシグナル強度]/[サンプルBのシグナル強度]であらわされる。 totalRNAまたはｍRNAからのaRNAの調製過程で、バイアスが生じなければ、これは上記の初期ｃDNA量の相対比と等しくなるため、2^(Cta-Ctb)＝[サンプルAのシグナル強度]/[サンプルBのシグナル強度]である。

この式の両辺に対して底が２のLogをとると、Log₂2^(Cta-Ctb)＝Log₂[サンプルAのシグナル強度]/[サンプルBのシグナル強度]であり、左辺はCta-Ctbとなる。これはΔΔCt値である。

以上のことから、リアルタイムPCRのΔΔCt値と、DNAマイクロアレイのサンプル間の、シグナル強度の比率に対して底が２のLog値をとった値は直接比較することできる。

DNAマイクロアレイの補正後の、各遺伝子のシグナル強度の比率を算出した後、底が２のLog値を算出した。これを表２７〜３４に示す。灰色で示した箇所は検出できなかったと判断したプローブである。検出できなかったと判断したプローブについては比較の際、対象外とした。
DNAマイクロアレイのサンプル間のシグナル強度の比率に対し、底が２のLog値をとった値（Log2（シグナル強度の比率）と表記）を算出した。リアルタイムPCRの結果と比較するため、腎臓のシグナル強度を基準として値を算出した。結果を表２７〜３４に示した。

DNAマイクロアレイでの発現差灰色箇所は、腎臓または比較対照のいずれかひとつ、もしくは両方が検出できなかったと判断されたため、値を算出しなかった。
続いてリアルタイムPCRのΔΔCt値と比較した。

x軸をLog2（シグナル強度の比率）、y軸をΔΔCt値として、比較データをグラフ上にプロットした。
プロットした後、最小2乗法により近似直線（y=ax+b）を求めたところ、以下に示す値を得た（表３５）。

次に、各比較対照について、ｙ＝ax＋b+１を上限、ｙ＝ax＋b-1を下限とし、プローブごとの上限値と下限値を算出した（表３６〜５９）。算出した値に基づいて上記のグラフ上にプロットした（図２〜６）。表３６〜４０の比較対照は肝臓である。表４１〜４５の比較対照は骨格筋である。表４６〜５１の比較対照は小腸である。表５２〜５７の比較対照は睾丸である。表５８〜６２の比較対照は培養細胞（LPS刺激）である。

最後に、プローブの選抜を行った。５種類の比較対照の，結果のグラフにおいて、上限と下限の直線に挟まれた領域内にプロットされたプローブについて選抜した。この際、検出限界による問題で判定できないものに関しては検出できたものの結果から判断して選抜した。これらを表６３〜６６に示した。

選抜したプローブのみでリアルタイムPCRとの結果を比較したところ、決定係数R²は0.9以上の値であった（図７、表６７）。

１１孔
２１多孔板
３１中空繊維
４１板状物

配列番号１〜１７０・・・合成DNA

Claims

以下の工程を含むDNAマイクロアレイに搭載するプローブの選抜方法。
１）１種以上の動物の少なくとも２種の培養細胞、組織または臓器から，totalRNAまたはmRNAを抽出する工程。
２）前記totalRNAまたはmRNAを用い、目的遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価する工程。
３）前記評価結果から，特定のコントロール遺伝子を基準として，発現量の比を算出する工程。
４）前期工程で得られた発現量の比と一致する結果を示すプローブを選抜する工程。
さらに発現量の比の，一致の尺度として最小二乗法による近似直線を算出した後、その直線から一定の距離内にあるかを判断する請求項１記載の選抜方法。
請求項１又は２記載の方法で選抜されたプローブを搭載するDNAマイクロアレイ。
リアルタイムPCRとの発現差の相関が決定係数R²で０．９５以上である請求項３記載のマイクロアレイ。