JP2010180217A - Hiv膜融合のインヒビター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも4個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列WXWL〔式中、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXは任意の残基(moiety)を表す〕を含んでなり、可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合するD−ペプチドであって、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドは、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルの部分とを含み、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドが、疎水性ポケットが空であり、リガンドによる結合が可能となるように疎水性ポケットを提示する、D−ペプチド。
【選択図】なし
Description
本出願は、1997年4月17日に提出された、HIVエンベロープ糖タンパク質由来のgp41のコア構造と題するデービッド シー.チャン(David C.Chan)、デボラ ファス(Deborah Fass)、ミン ルー(Min Lu)、ジェイムス エム.バーガー(James M.Berger)およびペーター エス.キム(Peter S.Kim)による米国仮出願第60/043,280号および1998年4月17日に提出された、HIVエンベロープ糖タンパク質由来のgp41のコア構造と題するデービッド シー.チャン、デボラ ファス、ミン ルー、ジェイムス エム.バーガーおよびペーター エス.キムによる米国出願第09/062,241号に関する。本出願は、1998年7月30日に提出された、HIV膜融合のインヒビターと題するデービッド シー.チャン、デブラ エム.アーゴット(Debra M.Ehrgott)およびペーター エス.キムによる米国仮出願第60/094,676号;1998年9月14日に提出された、HIV膜融合のインヒビターと題するデービッド シー.チャン、デブラ エム.アーゴットおよびペーター エス.キムによる米国仮出願第60/100,265号および1998年9月18日に提出された、HIV膜融合のインヒビターと題するデービッド シー.チャン、デブラ エム.アーゴットおよびペーター エス.キムによる米国仮出願第60/101,058号;ならびに1999年5月3日に提出された、デブラ エム.アーゴット、デービッド シー.チャン、ブラジミール マラシュケヴィッチ(Vladimir Malashkevich)およびペーター エス.キムによる米国仮出願第60/132,295号の利益を主張するものである。これらの参照された出願の全ての教示は、参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は、国立衛生研究所交付番号P01 GM56552により、全部または一部支援された。米国政府は、本発明において、一定の権利を有する。
ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV−1)由来のタンパク質の構造研究は、抗レトロウイルス薬物の開発に必須であった。構造に基づく創薬は、臨床用途におけるHIV−1薬物の2つのクラスである逆転写酵素インヒビターとプロテアーゼインヒビターに関して、最も熱心であった。HIV侵入に対して、構造に基づく創薬を行ないうることも有用であろう。
〔1〕少なくとも4個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列WXWL〔式中、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXは任意の残基(moiety)を表す〕を含んでなり、可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合するD−ペプチドであって、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドは、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルの部分とを含み、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドが、疎水性ポケットが空であり、リガンドによる結合が可能となるように疎水性ポケットを提示する、D−ペプチド、
〔2〕XがD−アミノ酸残基または修飾D−アミノ酸残基である〔1〕記載のD−ペプチド、
〔3〕4〜21個のアミノ酸残基を含んでなる〔1〕または〔2〕記載のD−ペプチド、
〔4〕EWXWL(式中、EはD−グルタミン酸を表し、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXはアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基を表す)である少なくとも5個のアミノ酸残基を含んでなり、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合する〔1〕記載のD−ペプチド、
〔5〕
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる〔1〕または〔4〕記載のD−ペプチド、
〔6〕粘膜細胞へのHIVの侵入の妨害方法に使用される医薬の製造のための、〔1〕〜〔5〕いずれか1つに記載のD−ペプチドおよび担体または基剤を含んでなる薬物の使用、
〔7〕担体または基剤が、フォーム、ゲル、薬物を保持するのに充分に粘性のその他の物質、水および緩衝液からなる群より選ばれるものである〔6〕記載の使用、
〔8〕担体または基剤が膣坐剤または直腸坐剤である〔6〕または〔7〕記載の使用、
〔9〕ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された直後または投与もしくは適用された後すぐに、該ペプチドが担体または基剤から放出される、〔6〕〜〔8〕いずれか1つに記載の使用、
〔10〕ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された後に徐々に、または投与もしくは適用された後の所定の期間の後に、該ペプチドが担体または基剤から放出される、〔6〕〜〔8〕いずれか1つに記載の使用、
〔11〕薬物を、使用の条件下に該薬物の放出が可能となるような様式で避妊具の表面上に存在させるか、または避妊具内に組み込む、〔6〕記載の使用、
〔12〕薬物がgp41の立体配座変化を防ぎまたは減少させ、それにより、粘膜表面の細胞へのHIVの侵入を妨げる、〔6〕〜〔11〕いずれか1つに記載の使用
に関する。
本明細書に記載のように、HIVエンベロープタンパク質gp41サブユニット(例えば、HIV−1エンベロープタンパク質gp41−サブユニット)のN−ヘリックスコイルドコイルの表面のくぼみ(cavity)は、該コイルドコイル表面、とりわけ、くぼみを結合することにより、細胞へのHIV侵入を阻害する薬物または他の薬剤の標的である。これは、HIV(例えば、HIV−1、HIV−2など)の細胞への侵入を阻害する薬物または薬剤を同定およびデザインするための基礎として有用である。
を有するD−ペプチドも本発明の主題である。
である。
(a)C34ぺプチド;
(b)DP178;
(c)T649;
(d)T1249;
(e)(a)〜(d)の誘導体;
(f)HIV gp41の疎水性ポケットに結合するD−ぺプチド;
(g)(f)の誘導体;
(h)(a)〜(g)の2種以上の組み合わせ;および
(i)N−ヘリックス超らせんへの結合によるHIV感染力を阻害する分子
からなる群より選ばれる少なくとも1種の成分を含有する。該組成物は、かかある成分の1種または2種以上の成分を含有することができる。
HIV−1エンベロープタンパク質のgp41サブユニットは、ウイルス膜と細胞膜との融合を媒介する。gp41のエクトドメインコア結晶構造は、逆平行のC−ヘリックスと対形成するN−ヘリックスからそれぞれがなる3つのらせん状ヘアピンから構成される6回らせんの束である〔D.C.Chan、D.Fass、J.M.Berger、P.S.Kim、Cell、89:263(1997)、W.Weissenhorn、A.Dessen、S.C.Harrison、J.J.Skehel、D.C.Wiley、Nature、387:426(1997);K.Tan、J.Liu、J.Wang、S.Shen、M.Lu、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94:12303(1997)〕。3つのN−ヘリックスにより、内部に位置する三量体の超らせんが形成され、そして3つのC−ヘリックスにより、保存された疎水性の溝に沿ったこのN−ヘリックス超らせんの外側が包まれている。この構造は、(D.C.Chan、D.Fass、J.M.Berger、P.S.Kim、Cell、89:263(1997)ならびにD.C.ChanおよびPeter S.Kim、Cell、93:681(1998)において議論されている)gp41の融合活性状態のコアに対応していることが考えられ、下記のウイルスに由来するエンベロープ融合タンパク質の提案された融合誘導(fusogenic)構造との類似性を示している:インフルエンザ(P.A.Bullough、F.M.Hughson、J.J.Skehel、D.C.Wiley、Nature、371:37(1994))、モロニーマウス白血病ウイルス(D.Fass、S.C.Harrison、P.S.Kim、Nat.Struct.Biol.、3:465(1996))、およびサル免疫不全症ウイルス(SIV)(V.N.Malashkevich、D.C.Chan、C.T.Chutkowski、P.S.Kim、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95:9134(1998)、M.Caffrey他、EMBO J.、17:4572(1998))、ならびにエボラウイルス(W.Weissenhorn他、Mol.Cell、2:605(1998)、V.N.Malashkevich他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96:2662(1992))。
式中、A、B、DおよびEはそれぞれ独立して1つのD−アミノ酸残基、1つのL−アミノ酸残基、または1つのN−置換グリシル残基である。天然アミノ酸残基または非天然アミノ酸残基を使用できる。K、L、MおよびNはそれぞれ独立して1つのアミノ酸残基、または同一でも異なってもよい2〜約6アミノ酸残基のポリペプチド基であり、n、p、qおよびrはそれぞれ独立して0または1である。Fは直接結合または二官能性連結基であり、sは0または1である。
式中、RA1とRA2の一方は、置換されたまたは非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合へテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル、ベンゾ縮合へテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり、他方は水素である。Wは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン(例えばフッ素、塩素、臭素またはヨウ素)である。
式中、RB1とRB2の一方は、置換されたまたは非置換の直鎖状、分枝鎖状または環状アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基であり、他方は水素である。Xは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン(フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など)である。
式中、RD1とRD2の一方は、置換されたまたは非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合へテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル、ベンゾ縮合へテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり、他方は水素である。Yは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン(フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など)である。
式中、RE1とRE2の一方は、置換されたまたは非置換の直鎖状、分枝鎖状または環状アルキル、アリールまたはアリールアルキル基であり、他方は水素である。Zは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン(フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など)である。
[式中、JはO、SまたはNRであり、RはHまたは直鎖状、分枝鎖状もしくは環状のC1 −C6 アルキル、好ましくはメチルである。R1、R2 、R3 、R4 およびR5 は、水素、ハロゲンおよびアルキル、好ましくは直鎖状、分枝鎖状、または環状のC1 −C4 アルキル(メチルなど)からなる群より独立して選択される]の基である。好適なフェニル、ナフチル、ナフチルメチルおよびベンジル置換基としては、アルキル、好ましくは直鎖状、分枝鎖状または環状のC1 −C4 アルキル(メチルなど)およびハロゲン(フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など)が挙げられる。より好ましくは、RA1とRD1は共に水素であり、RA2とRD2はそれぞれ独立して上述した基の一つである。
固相FMOCペプチド化学によって突然変異型ペプチドを合成した。これらの突然変異型ペプチドはアセチル化されたアミノ末端とアミド化されたカルボキシ末端を持つ。樹脂から切り離した後、ペプチドをセファデックスG−25カラム(ファルマシア社)で脱塩し、次に直線的水−アセトニトリル勾配および0.1%トリフルオロ酢酸を用いるVydac C18分取用カラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー(ウォーターズ社)によって精製した。ペプチドの確認はMALDI質量分析(Voyager Elite、パーセプティブ・バイオシステムズ社)で行なった。ペプチド濃度は6M GuHCl中でのトリプトファンおよびチロシン吸収によって測定した[H.Edelhoch,Biochemistry,6:1948(1967)]。
HIVエンベロープ糖タンパク質gp41のN−ヘリックスコイルドコイルの表面にあるくぼみに結合するD−ペプチドを同定するのに役立つ方法がある。以下に詳述するように、HIV−1エンベロープ糖タンパク質gp41のN−ヘリックスコイルドコイルの表面にあるくぼみに結合するD−ペプチドを、鏡像ファージディスプレイ法(mirror−image phage display)によって同定した。この方法では、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、D−アミノ酸からなるリガンドを同定する。D−アミノ酸含有リガンドは、基質とインヒビターに対して、天然に存在するL−アミノ酸リガンドとは反対のキラル特異性を有する。ファージディスプレイライブラリーを使って、標的または所望のL−アミノ酸ペプチドを結合するD−アミノ酸ペプチドリガンドが同定されている(Schumacherら,Science,271:1854−1857(1996))。
NeutrAvidin(ピアス社、100μLの100mM NaHCO3 中10μg)を96ウェル高吸着スチレン製プレート(コースター社)の各ウェルに入れ、振盪台上4℃で一晩インキュベートした。NeutrAvidinを除去し、ウェルをTBS/Tween溶液で4回洗浄した。ビオチン化D−IQN17(100mM NaHCO3 中の10μLペプチド溶液100μL)を各ウェルに加え、25℃で1時間インキュベートした。ビオチン化標的を除去し、ブロッキング溶液(100mM NaHCO3 中の30mg/ml脱脂粉乳)を各ウェルに加え、振とうしながら4℃で2時間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを再び上述のようにビオチン化標的でコーティングした。標的を除去し、5mMビオチンを含むブロッキング溶液を添加することにより、リガンドと結合していないNeutrAvidinをブロックした。ビオチンを除去した後、各ウェルをTBS/Tween溶液で6回洗浄した。次に、ファージストックを各ウェルに加えた(50μLのファージストック+50μLのファージ結合緩衝液:TBS、0.1%Tween−20、1mg/mlミルク、0.05%アジ化ナトリウム)。ウェルでのファージストックのインキュベーション時間は、選択ラウンド数が増すにつれて短くした。インキュベーション後に、ファージ溶液を除去し、結合していないファージを除去するために、ウェルをTBS/Tweenで12回洗浄した。奇数回目の洗浄はインキュベーション時間なしですばやく行ない、偶数回目の洗浄は、ファージ選択のラウンド数が増えるごとに時間を増やしてインキュベートした。100μLのファージ結合緩衝液および2.5mM CaCl2 中のトリプシン2μgを添加し、37℃で1時間インキュベートすることにより、ファージを溶出させた。回収率を決定するために、溶出したファージの希釈液を使って、K91 kan細胞を感染させた。1時間のインキュベーション後に、細胞100μLを取り出し、LBで1:10、1:100および1:100に希釈した液をLB/テトラサイクリンプレートに播種した。ファージ回収率は、回収された形質導入単位(溶出したファージの力価)の、投入した形質導入単位数(そのラウンドで使用したファージストックの力価)に対する割合として決定した。形質導入単位はLB/テトラサイクリンプレート上のテトラサイクリン耐性コロニーの数を数えることによって決定した。非特異的ファージ回収が一般に10-8〜10-9の桁の比率を持つのに対して、特異的に増幅されたファージは10-7以上の比率を持つ。個々のクローンを増幅し、配列決定した。それらを結合測定法で測定して、結合特異性を決定した。
IQN17と各D10ペプチドは、FMOCペプチド化学によって合成した。それらはアセチル化されたN−末端とC−末端アミドを持つ。IQN17はGCN4−pIQ Iに由来する29残基をN−末端に含有し、N36のC−末端に由来する17残基をC−末端に含有する。GCN4−pIQ IとN36領域には1残基の重複があるので、45残基長のペプチドになる。溶解度を改善するために、元のGCN4−pIQ I配列と比較して3つのアミノ酸置換を、IQN17のGCN4−pIQ I領域に施した(Eckert,D.M.ら,J.Mol.Biol.,284:859−865,1998)。それらの置換はL13E、Y17KおよびH18Kである。したがってIQN7の配列は、
ac−RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKLLQLTVWGIKQLQARlL−am
(ac−はN−末端アセチル基を表し、−amはC−末端アミドを表す)
であり、下線部はHIV部分である。鏡像ファージディスプレイのために、D−アミノ酸を使ってIQN17を合成した(IleやThrなどの2つ目のキラル中心を含むアミノ酸残基については、天然に存在するアミノ酸残基の正確な鏡像を使ってD型の標的を作成する)。また、ペプチドのN−末端をNHS−LC−ビオチンII(ピアス社、カタログ番号21336)を使ってビオチン化した。ビオチンとIQN17配列の間にはGKGの3アミノ酸リンカーがあり、そのリジンは天然に存在するL−型である。このリジンはトリプシン認識部位として挿入した。
を含む。
ウイルス感染を阻害することにおけるC34ペプチドの効力およびD−ペプチドのHIV−1感染阻害活性を、組換えルシフェラーゼ発現HIV−1(Chen,B.K.ら、J.Virol.、68:654(1994));Malashkevich、V.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,95:9134(1998))。ウイルスを、293T細胞へのエンベロープ欠損HIVゲノムNL43LucR−E−(Chen,B.Kら、J.Virol.、68:654(1994)およびHXB2 gp160発現ベクターpCMVHXB2gp160(Chan,D.C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、95:11513(1998))の同時トランスフェクトによって産生した。低速度遠心分離を用いて細胞細片のウイルス上清を清澄化した。上清を、0〜500μMの範囲の範囲の濃度のD−ペプチドの存在下でHOS−CD4/融合細胞(N,Landau、NIH AIDS Reagent Program)を感染させるために使用した。細胞を、感染の48時間後に回収し、ルシフェラーゼ活性をWallac AutoLumat LB953 ルミノメーター(Gaithersburg、MD)でモニターした。IC50は、ペプチドを欠失した対照試料と比較して50%の活性の減少を生じるペプチド濃度である。IC50を、ラングミュア式[y=k/(1+([ペプチド]/IC50)+x](式中、y=ルシフェラーゼ活性、kおよびxは換算定数(scaling constant)である)にデータを当てはめることにより計算した。
細胞/細胞融合(すなわち、シンシチウム形成)の阻害を、HXB2エンベロープを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(K.Kozarskyら、J.Acquir.Immune.Defic.Syndr.、2:163(1989))およびHeLa−CD4−LTR−β−gal細胞(M.Emerman,NIH AIDS Reagent program)を、異なる濃度のペプチドの存在下で共培養することによってアッセイした。混合した場合、これらの細胞はシンシチウム、または多核細胞を形成するか、β−ガラクトシダーゼを発現する。細胞を共培養した約20時間後、シンシチウムを視覚化するために単層を5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシドで染色した。シンシチウムを顕微鏡で視覚化し、手作業で計数する(シンシチウムを、3またはそれ以上の核を含有する融合細胞として得点づけた)。IC50を、ラングミュア式[y=k/(1+[ペプチド]/IC50)+x](式中、y=シンシチウムの数、kおよびxは換算定数(scaling constant)である)にデータを当てはめることにより計算した。
ペプチド精製、結晶化
ペプチドIQN17およびD10pep1を、上記のようにFMOCペプチド化学によって合成した。
最初のデータを、R軸IVエリア検出器に据え付けたRigaku RU300回転陽極X線発生装置(Molecular Structure Corporation)で収集した。IQN17の回折データをQuantum−4CCD検出器を用いて100Kで、そしてAdvanced Light Source(Berkeley、USA)で5.0.2ビームライン(beamline)で収集した。IQN17/D10pep1に関する最終の天然の、および多波長変則回折(multiwavelength anomalous diffraction;MAD)データを、Raxis−IV detectorを用いてHoward Hughes Medical Institute Beamline X4Aで収集した。MADデータに関して、オスミウムL−III吸収端付近の4つの波長を、Os誘導体結晶の蛍光スペクトルに基づいて選択した(表2)。4つの波長は:1.1398オングストローム、1.1403オングストローム、1.1393オングストローム、1.1197オングストロームであった。データセット間の結晶崩壊を最小化するために、データセットを、20°バッチで収集し、次のバッチに移る前に各波長で同じバッチを収集することを可能にした。反射を、プログラムDENZOおよびSCALEPACKで積分し、計測した(Otwinowski,Z.、(1993)、Data Collection and Processing、Sawer,L.、Isaacs,N.およびBailey,S.編(SERC,Daresbury Laboratory,Warrington,England)、pp.55−62)。
最初に、IQN17/D10pep1結晶に関する位相決定を、ポリセリン鎖に切断された側鎖を有する公開されたGCN4−pIQIおよびHIV gp41構造に由来する理論モデルのIQN17構造(build)(Eckert,D.Mら、(1998)J.Mol.Biol.284:859−865;Chan,D.C.ら、(1997)Cell 89,263−273)を用いて分子置換技術で試みた。得られた分子置換溶液は、あいまいであり、電子密度図は、D10pep1ペプチドのコンホメーションを示さなかった。しかし、分子置換位相は、差異および多義的なフーリエマップを用いて対応する誘導体中の単一のOs原子の座標を決定するのに充分に良好だった。重原子は、結晶学的3倍軸(cryallographic three−fold axis)(0.222、0.667、0.047)に結合する。次いで、MAD位相を、プログラムMLPHARE(表2)で産生し、プログラムDMでより高い分解能に拡大した。1.5オングストロームでのMAD電子密度図の質は、例外的であり、明快さを伴ってIQN17およびD10pep1ペプチドの構造的詳細を示した。電子密度図解釈およびモデル構築をプログラムO(Jones,T.A.ら、(1991)Acta Crystallogr.D47,110−119)で行った。IQN17−D10pep1複合体の構造を、プログラムCNS(Breunger,A.T.ら、Acta Crystallogr.D54,905−921(1998))を用いて精密化した。構造の正確さを、シミュレートしたアニーリング省略マップおよびプログラムWHAT CHECK(Hoff,R.WW.ら、Nature 381:272(1996))でチェックした。IQN17およびD10pep1ペプチド(その鏡像に変換されていない場合)の全ての残基は、ラマチャンドランプロットの最も好ましい領域を占める。IQN17の2つの最もN末端の残基ならびにD10pep1ペプチドのArg−6およびArg−8の側鎖以外については、残基の大部分のコンホメーションは充分に規定されている。
A.IQN17疎水性ポケットとD−ペプチドとの特異的結合アッセイ
IQN17への各D−ペプチドの結合をアッセイするためにNMR実験を使用した。IQN17の単一のトリプトファン残基(Trp−571で示される)は、gp41の疎水性ポケットへの特異的結合の最良のプローブを提供する。酸化重水素(重水素水)緩衝液において、IQN17の単純な均一核一次元1 H NMRスペクトル(図9A、中段)は、この分子の他の全てのシグナルから特に充分に分離した、Trp−571インドール由来の5つのシグナルを示す。gp41ポケットへの結合に関して化合物を試験するために、2つの一次元1 H NMR測定を重水素化緩衝液中の試料で行った。最初に、IQN17の参照(対照)スペクトルを採取し、非結合形態のTrp571化学シフトを同定した。第2のスペクトルを、IQN17および目的の化合物を含有する試料で得た。選択任意の第3のD−ペプチド(もしくは他の低分子、または分子の混合物)もまた採取した。1 H NMR実験をBruker AMX500スペクトロメーターにおいて行った。データを、Silicon GraphicsコンピュータにおいてのFelix 98.0(MSI)で処理し、全てのスペクトルをDSSに対して照会した。全ての実験を、100mM NaCl、50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)において25℃で行った。使用した全ての緩衝液は、交換可能な骨格および側鎖のプロトンに由来する重複する共鳴を除去するために>99.7%D2 Oであった。溶質濃度は、個々のペプチドに関して0.3〜1.0mMの範囲であり、IQN17と各Dペプチドとの1:1複合体に関しては0.8〜1.0mMの範囲であった。
上記(A)に記載される結合アッセイは、化学ライブラリー中に存在する多数の化合物をスクリーニングするのに使用されうる。単純な一次元の同核1 H NMR実験は、アイソトープ標識を必要とすることなく結合を評価するのに充分である。同核または異核(15Nおよび/または13Cアイソトープ標識による)二次元NMR実験もまた使用されうる。単一化合物を、本プロセスの時にスクリーニングし得る。しかし、多数の化合物もまた、IQN17(またはgp41 N−ヘリックスコイルドコイルの任意の代表)と同一のアッセイで組み合わされ、同時にスクリーニングされうる。上記混合物の任意の成分によるポケットへの結合は、Trp−571化学シフトにおける変化によって示される。多数の化合物からのNMRシグナルは、共にTrp−571からのシグナルを不明瞭にする可能性を有する;非結合分子に由来するこれらのシグナルは、当該技術分野で充分知られているパルスフィールドグラジエント技術を用いて排除されうる。これらの技術および市販されているNMRチューブサンプルチェンジャーの使用により、多数の化合物の自動スクリーニングが容易になる。
上記(B)に記載されるスクリーニングプロセスは、組み合わせ有機合成法を利用することを意図しうる。かかる方法は、多数の化学的に関連する化合物を含む各ファミリーに関して、化合物の全ファミリーを作製するために使用されている。上記のシンプルなアッセイにより、全体の組み合わせ合成の産物が、同時にスクリーニングされうる。結合が示されない場合、その化合物のファミリーのいかなるメンバーにおいてもさらに注意を払う必要はない。単純な一次元の同核1 H NMR実験は、アイソトープ標識を必要とすることなく結合を評価するのに充分である。同核または異核(15Nおよび/または13Cアイソトープ標識による)の二次元NMR実験もまた使用されうる。
[1]可溶性の三量体型のコイルドコイルと、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチド領域の部分とを含んでなるペプチド。
[2]D−ペプチドである[1]記載のペプチド。
[3]コイルドコイルが:
(a)GCN4−pIQ Iのコイルドコイル;
(b)GCN4−pIIのコイルドコイル;
(c)モロニーマウス白血病ウイルスのコイルドコイル;および
(d)ABCヘテロ三量体のコイルドコイル、
からなる群より選ばれるものである[2]記載のD−ペプチド。
[4]コイルドコイルのアミノ酸配列が:
RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK(配列番号:25)
である[3]記載のD−ペプチド。
[5]HIV gp41のNペプチド領域の充分な部分が、配列:LLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号:20)
を含んでなるものである[2]記載のD−ペプチド。
[6]IQN17(配列番号:2)である[5]記載のD−ペプチド。
[7]配列番号:25および17個のアミノ酸残基を含んでなる配列を含んでなり、該17個のアミノ酸残基が、配列:LLXLTVWGXKXLQXRXX(配列番号:42)(式中、L、T、V、W、G、K、QおよびRは一文字アミノ酸コードにより表わされたアミノ酸残基であり、XはいずれかのD−アミノ酸残基である)を含んでなるものである、HIV gp41疎水性ポケットの可溶性の三量体ペプチドモデルであるD−ペプチド。
[8]17個のアミノ酸残基を含んでなる配列が、配列番号:20;配列番号:26;配列番号:27および配列番号:42からなる群より選ばれるものである[7]記載のD−ペプチド。
[9]
(y’) HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する(a)〜(x’)の配列の変異体、
(式中、C−末端のac−およびN−末端の−amは任意である)
からなる群より選ばれるD−ペプチド。
[10]L−ペプチドである[1]記載のペプチド。
[11]可溶性の三量体のコイルドコイルが:
(a)GCN4−pIQ Iのコイルドコイル;
(b)GCN4−pIIのコイルドコイル;
(c)モロニーマウス白血病ウイルスのコイルドコイル;および
(d)ABCヘテロ三量体のコイルドコイル、
からなる群より選ばれるものである[10]記載のL−ペプチド。
[12]HIV gp41のNペプチド領域の充分な部分が、配列:LLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号:20)
を含んでなるものである[10]記載のL−ペプチド。
[13]IQN17(配列番号:2)である[12]記載のL−ペプチド。
[14]配列番号:25および17個のアミノ酸残基を含んでなる配列を含んでなり、該17個のアミノ酸残基が、配列:LLXLTVWGXKXLQXRXX(式中、L、T、V、W、G、K、QおよびRは一文字アミノ酸コードにより表わされたアミノ酸残基であり、XはいずれかのD−アミノ酸残基である)を含んでなるものである、HIV gp1疎水性ポケットの可溶性の三量体モデルであるL−ペプチド。
[15]17個のアミノ酸残基を含んでなる配列が、配列番号:20;配列番号:26;および配列番号:27からなる群より選ばれるものである[14]記載のL−ペプチド。
[16](a)C34ペプチドとN36ペプチドとの間での複合体の形成に適する条件下に、C34ペプチドおよびN36ペプチドと、C34ペプチドとN36ペプチドとの間での複合体の形成を妨げるその能力についての評価対象の候補薬物とを合わせ、それにより被検試料を形成する工程;ならびに
(b)C34ペプチドとN36ペプチドとの間での複合体の形成が阻害されるか否かを決定する工程、
を含み、複合体の形成が阻害される場合、候補薬物は複合体の形成を妨げる薬物であり、それにより、複合体の形成を妨げる薬物が同定される、C34ペプチドとN36ペプチドとの間での複合体の形成を妨げる薬物の同定方法。
[17](a)において被検試料が形成される条件下と同じ条件下に、C34ペプチドとN36ペプチドとを合せることにより対照試料を形成し;C34ペプチドとN36ペプチドとの間での複合体の形成を測定し、かつ被検試料において複合体が形成される程度を対照試料において複合体が形成される程度と比較し、複合体が対照試料におけるよりも被検試料においてより低い程度で形成される場合、候補薬物は複合体の形成を妨げる薬物であり、それにより、複合体の形成を妨げる薬物を同定する、[16]記載の方法。
[18]C34ペプチドとN36ペプチドを各々1組のドナー−アクセプター分子のメンバーにより標識し、かつC34とN36との間での複合体の形成が生ずる程度を、アクセプター分子から生ずる発光の程度を測定することにより評価し、発光が候補薬物の非存在下よりも候補薬物の存在下においてより低い程度で生ずる場合、候補薬物はC34ペプチドとN36ペプチドとの間での複合体の形成を妨げる薬物である、[16]記載の方法。
[19]C34ペプチドとN36ペプチドを各々1組またはドナー−アクセプター分子のメンバーにより標識し、かつ発光が生ずる程度を被検試料においておよび対照試料において評価し、発光が対照試料におけるよりも被検試料においてより少ない場合、候補薬物はC34プルプチド(prptide)とN36ペプチドとの間での複合体の形成を阻害する薬物である、[17]記載の方法。
[20]複合体の形成を妨げる薬物が細胞へのHIV侵入のインヒビターであるか否かを、細胞/細胞融合または細胞のHIV感染に対する薬物の影響が薬物の非存在下におけるよりも薬物の存在下においてより低いことを評価することにより評価する工程をさらに含み、該薬物は細胞へのHIV侵入のインヒビターである、[16]記載の方法。
[21]タンパク質の、三量体型のコイルドコイル領域と、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルの一部または全部を形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチド領域の部分とを含んでなるペプチドを個体に導入する工程を含み、かつ該ペプチドは製薬学的に許容され得る担体中に存在するものである、個体における免疫応答の顕現方法。
[22]筋内、腹腔内、経口、経鼻および経皮からなる群より選択される投与経路により個体にペプチドを導入する[21]記載の方法。
[23]コイルドコイルが、GCN4−pIQ I;GCN4−pII;モロニーマウス白血病ウイルスおよびABCヘテロ三量体からなる群より選ばれるものである[21]記載の方法。
[24]ペプチドがIQN17である[21]記載の方法。
[25](1)HIVエンベロープタンパク質gp41サブユニットを結合し、かつ粘膜表面の細胞へのHIVの侵入を妨げる薬物、および(2)担体または基剤を含んでなる組成物を粘膜表面に投与または適用する工程を含む、粘膜細胞へのHIVの侵入の妨害方法。
[26]薬物がHIVエンベロープタンパク質gp41サブユニットのN−ヘリックスコイルドコイルの表面上のくぼみを結合する、[25]記載の方法。
[27]薬物がgp41の立体配座変化を防ぎまたは減少させ、それにより、粘膜表面の細胞へのHIVの侵入を妨げる、[26]記載の方法。
[28]組成物が:
(a)C34ペプチド;
(b)DP178;
(c)DP649;
(d)T1249;
(e)(a)〜(d)の誘導体;
(f)HIV gp41の疎水性ポケットに結合するD−ペプチド;
(g)(f)の誘導体;
(h)(a)〜(g)の2つまたはそれ以上の組み合わせ;および
(i)N−ヘリックスコイルドコイルに結合することによりHIV感染力を阻害する分子、
からなる群より選ばれる成分を含んでなるものである、[25]記載の方法。
[29]担体または基剤が、フォーム、ゲル、薬物を保持するのに充分に粘性のその他の物質、水および緩衝液からなる群より選ばれるものである[28]記載の方法。
[30]担体または基剤が膣座剤または直腸座剤である[28]記載の方法。
[31]薬物が膣、口または直腸に投与もしくは適用された直後または投与もしくは適用された後すぐに、該薬物が担体または基剤から放出される、[28]記載の方法。
[32]薬物が膣、口または直腸に投与もしくは適用された後に徐々に、または投与もしくは適用された後、特定の期間の後に、該薬物が担体または基剤から放出される、[28]記載の方法。
[33]薬物を、使用の条件下に該薬物の放出が可能となるような様式で避妊具の表面上に存在させるか、または避妊具内に組み込む、[28]記載の方法。
[34](e)のD−ペプチドが:
(y’) HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する(a)〜(x’)の配列の変異体、
(式中、C−末端のac−およびN−末端の−amは任意である)
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるものである、[28]記載の方法。
[35]評価対象の化合物または分子を候補インヒビターといい、
(a)N−ヘリックスコイルドコイルくぼみへのD−ペプチドの結合に適する条件下に、N−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するD−ペプチド、N−ヘリックスコイルドコイルくぼみを提示する可溶性モデルである融合タンパク質および候補インヒビターを合わせ、それにより、被検試料を作製する工程;
(b)被検試料におけるN−ヘリックスコイルドコイルくぼみへのD−ペプチドの結合の程度を測定する工程;ならびに
(c)対照試料におけるN−ヘリックスコイルドコイルくぼみに対する場合と測定した結合の程度を比較する工程、ここで、対照試料は候補インヒビターを含んでいないことを除いて被検試料と同じであり、かつ該対照試料は、N−ヘリックスコイルドコイルくぼみへのD−ペプチドの結合に適する被検試料と同じ条件下に維持される、
を含み、被検試料における結合の程度が対照試料における結合の程度より低い場合、候補インヒビターはHIV−1 gp41エンベロープタンパク質のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子である、HIV−1 gp41エンベロープタンパク質のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子の同定方法。
[36]融合タンパク質がIQN17である[35]記載の方法。
[37]D−ペプチドを蛍光性レポーターで標識し、かつ融合タンパク質を、蛍光性レポーターに充分に近接した場合に該レポーターからのシグナルを消去する消光物質で標識し、かつ蛍光性レポーターからのシグナルの検出が、候補インヒビターがHIV−1 gp41エンベロープタンパク質のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する化合物または分子であることを示す、[35]記載の方法。
[38]GCN4の、三量体型のコイルドコイル領域と、HIV−1 gp41のN−ペプチド領域の部分とを含んでなり、gp41のN−ペプチド領域の部分がHIV−1 gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットの一部または全部を含んでなるか、または含まないものである融合タンパク質。
[39]HIV gp41のN−ペプチド領域の部分が、HIVの以下の24個のアミノ酸残基:SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTを含んでなるものである、[38]記載の融合タンパク質。
[40]可溶性の三量体型のコイルドコイルと、HIV−1 gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV−1 gp41のN−ペプチド領域の部分とを含んでなる融合タンパク質を個体に導入する工程を含み、該融合タンパク質が製薬学的に許容され得る担体中に存在するものである、個体における免疫応答の顕現方法。
[41]少なくとも4個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列WXWL(式中、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXはいずれかの残基(moiety)を表わす)を含んでなるD−ペプチド。
[42]XがD−アミノ酸残基または修飾D−アミノ酸残基である[41]記載のD−ペプチド。
[43]2〜21個のアミノ酸残基を含んでなる[41]記載のD−ペプチド。
[44]EWXWL(式中、EはD−グルタミン酸を表し、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXはアミノ酸残基、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸残基以外の残基を表わす)である少なくとも5個のアミノ酸残基を含んでなるD−ペプチド。
[45]
(y’) HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する、(a)〜(x’)の配列の変異体、
(式中、C−末端のac−およびN−末端の−amは任意である)
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるD−ペプチド。
[46](a)(1)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と;(2)タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、HIV gp41くぼみを含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質とを、薬物による結合についてHIV gp41くぼみの提示に適する条件下に合せる工程;ならびに
(b)候補薬物がHIV gp41くぼみを結合するか否かを決定する工程、ここで、結合が生ずる場合、候補薬物はHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物である、
を含む、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物の同定方法。
[47](a)において、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するペプチドを候補薬物および融合タンパク質と合わせ、かつ(b)において、候補薬物がHIV gp41くぼみを結合するか否かをHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するペプチドの存在下に測定する、[46]記載の方法。
[48]HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するペプチドが、
(y’) HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する、(a)〜(x’)の配列の変異体、
(式中、C−末端のac−およびN−末端の−amは任意である)
からなる群より選ばれるものである、[42]記載の方法。
[49]候補薬物を検出可能に標識し、かつHIV gp41くぼみへの候補薬物の結合をHIV gp41くぼみ上の検出可能な標識の存在を検出することにより測定する、[46]記載の方法。
[50]融合タンパク質が、GCN4の可溶性の三量体状のコイルドコイル領域と、HIV gp41くぼみを含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチドの部分とを含んでなるものである、[46]記載の方法。
[51]融合タンパク質がIQN17またはその変異体であり、IQN17のアミノ酸配列が配列番号:2である[50]記載の方法。
[52](a)(1)薬物による結合が可能であるような様式でHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを提示する可溶性モデルと(2)N−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物とを合せる工程;ならびに
(b)候補薬物が可溶性モデルのN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するか否かを測定する工程、
を含み、結合が生ずる場合、候補薬物はHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物である、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物の同定方法。
[53](a)(1)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのHIV侵入を阻害するその能力についての評価対象の候補薬物と、(2)タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、HIV gp41くぼみを含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質とを、薬物による結合についてHIV gp41くぼみの提示に適する条件下に合わせる工程;
(b)候補薬物がHIV gp41くぼみを結合するか否かを測定する工程、ここで、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみへの候補薬物の結合が生ずる場合、該候補薬物はHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物であり、それにより、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を製造する;ならびに
(c)(b)において製造された薬物の細胞へのHIV侵入を阻害する能力を評価する工程、ここで、薬物が細胞へのHIV侵入を阻害する場合、該薬物は、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのHIV侵入を阻害する薬物である、
を含む、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのHIV侵入を阻害する薬物の製造方法。
[54](a)(2)の融合タンパク質が、GCN4の、可溶性の三量体型のコイルドコイル領域と、HIV gp41くぼみを含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチドの部分とを含んでなり、かつ(b)において製造された薬物の細胞へのHIV侵入を阻害する能力をシンシチウムアッセイ、感染アッセイまたは両方で評価する、[53]記載の方法。
[55](c)において同定された薬物を、適切な動物モデルにおけるインビボ評価により細胞へのHIV侵入を阻害するその能力についてさらに評価する、[54]記載の方法。
[56]融合タンパク質がIQN17またはその変異体であり、IQN17のアミノ酸配列が配列番号:2である、[54]記載の方法。
[57](a)可溶性の三量体型のコイルドコイルと(b)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチド領域の部分とを含んでなる融合タンパク質を製造する工程を含む、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルの製造方法。
[58](a)のタンパク質が、GCN4−pIQ I、GCN4−pII、モロニーマウス白血病ウイルスまたはABCヘテロ三量体であり、かつ(b)の充分な部分が、配列番号:20を含んでなる部分;配列番号:26を含んでなる部分;配列番号:27を含んでなる部分および配列番号:42を含んでなる部分からなる群より選ばれるものである、[57]記載の方法。
[59]融合タンパク質がIQN17またはその変異体であり、IQN17のアミノ酸配列が配列番号:2である、[57]記載の方法。
[60](a)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルを製造または得る工程;
(b)(1)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と(2)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルとを合わせる工程;ならびに
(c)候補薬物がHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するか否かを決定する工程、
を含み、候補薬物がHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する場合、候補薬物はHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物であり、それにより、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を製造する、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物の製造方法。
[61]可溶性モデルが、タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、HIV gp41くぼみを含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質である、[60]記載の方法。
[62]融合タンパク質がIQN17またはその変異体であり、IQN17のアミノ酸配列が配列番号:2である、[61]記載の方法。
[63](a)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルを製造または得る工程;
(b)(1)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するその能力についての評価対象の候補薬物と(2)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみの可溶性モデルとを合わせる工程;
(c)候補薬物がHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するか否かを決定する工程、ここで、候補薬物がHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する場合、該候補薬物はHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物であり、それにより、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合する薬物を製造する、ならびに;
(d)(c)において製造した薬物の細胞へのHIV侵入を阻害する能力を評価する工程、
を含み、薬物が細胞へのHIV侵入を阻害する場合、薬物はHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのHIV侵入を阻害する薬物である、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合し、かつ細胞へのHIV侵入を阻害する薬物の製造方法。
[64]可溶性モデルが、タンパク質の、三量体状のコイルドコイル領域と、HIV gp41くぼみを含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチドの部分とを含んでなる融合タンパク質である、[63]記載の方法。
[65]融合タンパク質がIQN17またはその変異体であり、IQN17のアミノ酸配列が配列番号;2である、[64]記載の方法。
[66][60]記載の方法により製造された薬物。
[67][61]記載の方法により製造された薬物。
[68][62]記載の方法により製造された薬物。
[69][63]記載の方法により製造された薬物。
[70][64]記載の方法により製造された薬物。
[71][65]記載の方法により製造された薬物。
[72](a)D−掌体(handedness)のIQN17をL−アミノ酸ペプチドのファージディスプレイライブラリーと、D−掌体のIQN17への該ライブラリーのメンバーの結合に適する条件下に合わせる工程;ならびに
(b)D−掌体のIQN17とファージディスプレイライブラリーの1つまたは複数のメンバーとの間で結合が生ずるか否かを決定する工程、ここで、結合が生ずる場合、D−掌体のHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合するペプチドが同定される、
を含む、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合するペプチドの同定方法。
[73]D−掌体のIQN17に結合するファージディスプレイライブラリーの1つまたは複数のメンバーのアミノ酸配列を決定する工程、ならびに決定されたアミノ酸配列を含んでなるD型のペプチドを製造する工程をさらに含み、D型のペプチドが天然のL−掌体のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみを結合するものである、[72]記載の方法。
[74]式I
〔式中、AはD−アミノ酸残基または式
(式中、RA1とRA2の一方は、置換もしくは非置換の、アリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合ヘテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル、ベンゾ縮合ヘテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり;かつ他方は水素であり;およびWは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはハロゲン、たとえば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である)
のN−置換グリシル残基である;
Bはグリシル残基または式
(式中、RB1とRB2の一方は、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状の、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロアリール基またはヘテロアリールアルキル基であり;かつ他方は水素であり;およびXは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等のハロゲンである)
のD−アミノ酸もしくはN−置換グリシル残基である;
Dは式
(式中、RD1とRD2の一方は、置換もしくは非置換の、アリール、ヘテロアリール、アリールメチル、ヘテロアリールメチル、ベンゾ縮合アリール、ベンゾ縮合ヘテロアリール、ベンゾ縮合アリールメチル;ベンゾ縮合ヘテロアリールメチル、シクロアルキルまたはビシクロアルキルであり;かつ他方は水素であり;およびYは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等のハロゲンである)
のD−アミノ酸残基またはN−置換グリシル残基である;
Eは式
(式中、RE1とRE2の一方は、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状の、アルキル基、アリール基またはアリールアルキル基であり;かつ他方は水素であり;およびZは水素、メチル、トリフルオロメチルまたはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素等のハロゲンである)
のD−アミノ酸残基またはN−置換グリシル残基である;
K、L、MおよびNは各々独立して、アミノ酸残基または2〜約8個のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチド基である;
Fは直接結合または二官能性連結基である;ならびに
n、p、q、rおよびsは各々独立して、0または1である〕
の化合物。
[75]RA1とRA2の一方およびRD1とRD2の一方が独立して、フェニル基、置換フェニル基、ナフチル基、置換ナフチル基、ナフチルメチル基、置換ナフチルメチル基、ベンジル基もしくは置換ベンジル基、または式
(式中、JはO、SまたはNRであり、RはHまたは直鎖、分岐もしくは環状のC1 〜C6 −アルキルであり;ならびに
R1 、R2 、R3 、R4 およびR5 は独立して、水素、ハロゲンおよびアルキルからなる群より選ばれるものである)
の基である、[74]記載の化合物。
[76]RA1とRD1が両方とも水素である[75]記載の化合物。
[77]RB1とRB2の一方が、水素、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状のC1 〜C4 −アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチルまたはナフチルメチルである、[74]記載の化合物。
[78]RB1が水素である[77]記載の化合物。
[79]RE1とRE2の一方が、置換もしくは非置換の、直鎖、分岐もしくは環状のC1 〜C6 −アルキル基または置換もしくは非置換のフェニル基もしくはナフチル基であり、かつ他方が水素である、[74]記載の化合物。
[80]RE1が水素である[79]記載の化合物。
[81]AおよびDが各々D−トリプトファン残基であり、かつEがD−ロイシン残基である[74]記載の化合物。
[82]KがD−アミノ酸残基またはアミノ−、カルボキシル−もしくはスルフヒドリル置換側鎖を含んでなるN−置換グリシル残基であり、かつLが2もしくは3個のD−アミノ酸残基またはN−置換グリシン残基を含んでなるポリペプチドである[74]記載の化合物。
[83]Mが2〜約8個のD−アミノ酸残基を含んでなり、該アミノ酸残基の少なくとも1つがアミノ−、カルボキシ−もしくはスルフヒドリル置換側鎖を含んでなるポリペプチド基であり、かつNが1〜約6個のアミノ酸残基を含んでなり、該アミノ酸残基の少なくとも1つがリジン残基であるポリペプチド基である[74]記載の化合物。
[84]Fが約2〜約40原子の長さを有する二価の連結基である[74]記載の化合物。
[85]Fが式−Pn −(式中、nは1〜約12の整数であり、かつ各Pは独立して、L−もしくはD−アミノ酸もしくはN−置換グリシル残基、グリシル残基またはN−置換グリシル残基である)のポリペプチド連結基である[84]記載の化合物。
[86]Fは置換もしくは非置換のC4 〜C40−アルキレン基または1もしくはそれ以上の箇所においてヘテロ原子、フェニレン基もしくはヘテロアリーレン基により介在されているC4 〜C40−アルキレン基である[84]記載の化合物。
[87]Fが1〜約10個のグリコシド基を含んでなる多糖類基である[84]記載の化合物。
[88](a)HIV gp41疎水性ポケットの可溶性の三量体ペプチドモデルの結晶を得る工程;
(b)(a)において得られた結晶を用いてX線回折研究によりペプチドモデルの原子座標を得る工程;
(c)(b)において得られた原子座標を用いてHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットを明確化する工程;
(d)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する分子または化合物を同定する工程;
(e)(d)において同定された分子または化合物を得る工程;ならびに
(f)(e)において得られた分子または化合物をHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットと接触させて、分子または化合物のHIV gp41のポケットに適合する能力を評価する工程、
を含み、分子または化合物がHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する場合、該分子または化合物は該ポケットに適合する薬物であり、それにより、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する薬物を製造する、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する薬物の製造方法。
[89]可溶性の三量体ペプチド分子が、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ペプチド領域の部分とを含んでなるものである、[88]記載の方法。
[90](f)において、分子または化合物をIQN17、HIV gp41のN−ヘリックスまたはHIVポケットを含んでなるポリペプチドと接触させることにより、該分子または化合物をHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットと接触させる、[89]記載の方法。
[91]可溶性モデルがIQN17である[89]記載の方法。
[92](a)において得られた結晶が空間群C222のIQN17の結晶である[88]記載の方法。
[93](a)IQN17の原子座標を得る工程;
(b)(a)において得られた原子座標を用いてHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットを明確化する工程;
(c)HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する分子または化合物を同定する工程;
(d)(c)において同定された分子または化合物を得る工程;ならびに
(e)(d)において得られた分子または化合物をHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットと接触させて、分子または化合物のHIV gp41のポケットに適合する能力を評価する工程、
を含み、分子または化合物がHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する場合、該分子または化合物は該ポケットに適合する薬物であり、それにより、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットに適合する薬物を製造する、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合する薬物の製造方法。
[94]原子座標が図11A〜11Vに表わされるPDBファイルにおける原子座標である[93]記載の方法。
[95](a)D−掌体のIQN17をリガンドの生物学的にコードされたライブラリーと、D−掌体のIQN17への該ライブラリーのメンバーの結合に適する条件下に合わせる工程;ならびに
(b)D−掌体のIQN17と生物学的にコードされたライブラリーの1つまたは複数のメンバーとの間で結合が生ずるか否かを測定する工程、ここで、結合が生ずる場合、D−掌体のHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合するリガンドが同定される、
を含む、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルくぼみに結合する分子の同定方法。
[96]D−掌体のIQN17に結合する生物学的にコードされたライブラリーの1つまたは複数のメンバーの配列を決定する工程、ならびに決定された配列を含んでなる、生物学的にコードされたリガンドの鏡像掌体のリガンドを製造する工程をさらに含む[95]記載の方法。
[97]生物学的にコードされたライブラリーがファージディスプレイライブラリー、DNAライブラリー、RNAライブラリーおよび生物学的にコードされたペプチドライブラリーからなる群より選ばれるものである[95]記載の方法。
Claims (12)
- 少なくとも4個のアミノ酸残基を含んでなり、かつコンセンサス配列WXWL〔式中、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXは任意の残基(moiety)を表す〕を含んでなり、可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合するD−ペプチドであって、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドは、可溶性の三量体型のコイルドコイルと、HIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルのポケットを形成するアミノ酸残基を含むのに充分なHIV gp41のN−ヘリックスコイルドコイルの部分とを含み、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドが、疎水性ポケットが空であり、リガンドによる結合が可能となるように疎水性ポケットを提示する、D−ペプチド。
- XがD−アミノ酸残基または修飾D−アミノ酸残基である請求項1記載のD−ペプチド。
- 4〜21個のアミノ酸残基を含んでなる請求項1または2記載のD−ペプチド。
- EWXWL(式中、EはD−グルタミン酸を表し、WはD−トリプトファンを表し、LはD−ロイシンを表し、ならびにXはアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基を表す)である少なくとも5個のアミノ酸残基を含んでなり、該可溶性の非凝集性三量体ペプチドのポケットに結合する請求項1記載のD−ペプチド。
-
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる請求項1または請求項4記載のD−ペプチド。 - 粘膜細胞へのHIVの侵入の妨害方法に使用される医薬の製造のための、請求項1〜5いずれか1つに記載のD−ペプチドおよび担体または基剤を含んでなる薬物の使用。
- 担体または基剤が、フォーム、ゲル、薬物を保持するのに充分に粘性のその他の物質、水および緩衝液からなる群より選ばれるものである請求項6記載の使用。
- 担体または基剤が膣坐剤または直腸坐剤である請求項6または請求項7記載の使用。
- ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された直後または投与もしくは適用された後すぐに、該ペプチドが担体または基剤から放出される、請求項6〜8いずれか1つに記載の使用。
- ペプチドが膣、口または直腸に投与もしくは適用された後に徐々に、または投与もしくは適用された後の所定の期間の後に、該ペプチドが担体または基剤から放出される、請求項6〜8いずれか1つに記載の使用。
- 薬物を、使用の条件下に該薬物の放出が可能となるような様式で避妊具の表面上に存在させるか、または避妊具内に組み込む、請求項6記載の使用。
- 薬物がgp41の立体配座変化を防ぎまたは減少させ、それにより、粘膜表面の細胞へのHIVの侵入を妨げる、請求項6〜11いずれか1つに記載の使用。
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