JP2010175251A

JP2010175251A - 表面増強ラマン分光測定方法及び本方法を用いた表面増強ラマン分光装置

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Publication number: JP2010175251A
Application number: JP2009014947A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Shioi; 正彦塩井; Tatsuro Kawamura; 達朗河村; Masaru Minamiguchi; 勝南口
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2009-01-27
Filing date: 2009-01-27
Publication date: 2010-08-12

Abstract

【課題】金ナノロッド等の形状異方性を有する金属微粒子が同一方向で固定化されていなくとも、高精度に被検物質の濃度が測定することができる表面増強ラマン分光方法および装置を提供する。
【解決手段】被検物質を、形状異方性を持つ金属微粒子１０５ａが形成されたセル１０５に供給し、前記セル１０５に光を照射し、前記光の偏光状態を偏光制御器１０２により変化させながら、前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を検出し、検出された光の光量から、最適な偏光状態を決定する。得られた偏光状態になるよう偏光素子を制御し、最適な偏光状態で前記セルに光を照射し、表面増強ラマン散乱を発生させ、発生した表面増強ラマン散乱光を検出する。検出された表面増強ラマン散乱光を分析することにより、被検成分濃度を高精度に算出する。
【選択図】図１

Description

本発明はラマン分光法にかかり、特に、形状異方性をもつ金属微粒子に光を照射した際に発生する局在化表面プラズモン共鳴による電場増強効果により励起される表面増強ラマン分光法を利用した特定物質の濃度を計測する技術に関するものである。

従来より、ラマン分光法は様々な応用に用いられており、例えば、ラマン分光法を用いて生体成分の濃度を測定する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。ラマン分光法を用いることにより、生体成分中の特性成分の濃度を消耗品である試薬、試験紙片及び酵素などを不要にし、さらにはそれらの消耗品の使用前の保存安全性や使用後の廃棄の問題、誤差を生じる原因となる煩雑な操作や他の成分による干渉作用などの問題をなくし、さらに多成分を同時に定量測定することができる。この従来の技術を第１の従来技術と呼ぶ。

表面増強ラマン分光測定方法としては、金ナノロッドのような形状が非対称な金属ナノ粒子を表面増強ラマン分光に応用する技術が開示されている。金ナノロッドとは、形状が均一な「ロッド状（棒状）」の金ナノ粒子（金ナノロッド）であり、可視から近赤外の領域に表面プラズモンに由来する強い二本の吸収バンドを持つ。一つは金ナノロッドの短軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長であり、可視域（５２０ｎｍ付近）に吸収ピークが存在する。もう一つは長軸方向の局在化表面プラズモン波長であり、赤色から近赤外域（６００〜１３００ｎｍ）に吸収ピークを持つ。金ナノロッドの形状制御によって二つの吸収ピーク位置を変えることができることが知られており、球状の金ナノ粒子よりも増強度が高いとされている。この従来の技術を第２の従来技術と呼ぶ。
特開平９−０７９９８２号公報特開２００５-２３３６３７号公報

しかしながら、前記第１の従来技術では、典型的には、試料物質に入射するフォトンの１０^-7しかラマン散乱されない。従って、ラマン散乱されたフォトンを検出するために、ラマン分光器においては一般に、高出力レーザ及び高感度検出器が採用されている。絶対的な意味において散乱断面積が小さいのみならず、散乱されたフォトンが入射フォトンと同じエネルギーを有するレイリー散乱に比較しても小さい。これはつまり、小さなラマン信号を大きなレイリー信号及び入射信号から分離することに関して問題がある場合が多いということであり、特に、ラマン信号のエネルギーが入射信号のエネルギーに近い場合に問題となる。高出力レーザはかさばり高価であるだけでなく、非常に高い出力においては、その光放射の強度により試料物質が破壊される可能性がある。従って、光放射源の強度には上限が課される。同様に、高感度検出器もかさばり高価であることが多く、例えば液体窒素により冷却される必要がある。それに加えて、許容可能な信号対雑音比を有するラマンスペクトル信号を得るために長い積分時間が必要とされるので、検出は時間がかかるプロセスであることが多いという課題を有していた。

また、金ナノロッドのような形状異方性を持つ金属微粒子を用いて、表面増強ラマン散乱を励起するためには、局在化表面プラズモン共鳴における共鳴波長と表面増強ラマン励起波長を一致させる必要がある。また、タンパク質等を含む血清、尿などの生体由来材料を、表面増強ラマン分光法を利用して解析する際、蛍光を抑えるという観点から、近赤外域の波長で表面増強ラマン散乱を励起することが好ましい。例えば、金ナノロッドでは、長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴における共鳴波長が近赤外領域の波長となるため、長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長を利用して表面増強ラマン散乱を励起することが好ましい。

ところが、長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長により表面増強ラマン散乱を励起するためには、金ナノロッドの長軸方向に電場成分を持つ偏光状態の光で励起する必要がある。一般的に金ナノロッドは同一方向に配向しセル等に固定化することは困難である。また、近赤外領域に発振波長を持つ半導体レーザは、その構造上の特性により、一方向に偏光した光が放射される。したがって、半導体レーザを利用して、金ナノロッドの局在化表面プラズモン共鳴波長の光を入射することにより、表面増強ラマン散乱を励起し、表面増強ラマン分光法による分析を行うには、セル等に金ナノロッドが同一方向に配向していない状態で固定化されているため、固定化状態により、所望の長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長により、表面増強ラマン散乱が励起される確率が低くなり、最悪、長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長では、表面増強ラマン散乱が励起されない可能性があるという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、金ナノロッド等の形状異方性を有する金属微粒子が同一方向で固定化されていなくとも、表面増強ラマン散乱を励起するための光源の偏光状態を制御することにより、測定感度が低下することを防止することで、高精度に被検物質の濃度が測定できる表面増強ラマン分光方法、および、表面増強ラマン分光装置を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の表面増強ラマン分光方法は、
ａ）被検物質を、形状異方性を持つ金属微粒子が形成されたセルに供給する工程、
ｂ）前記セルに光を照射する工程、
ｃ）前記光の偏光状態を変化させながら、前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を検出する工程、
ｄ）工程ｃ）により検出された光の光量から、最適な偏光状態を決定する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた偏光状態になるよう偏光素子を制御する工程、
ｆ）工程e）の偏光状態で前記セルに光を照射し、表面増強ラマン散乱を発生させる工程、
ｇ）工程ｆ）により発生した表面増強ラマン散乱光を分光し、検出する工程、
ｈ）工程ｇ）により検出された表面増強ラマン散乱光から被検物質濃度を算出する工程
を含む。

また、本発明の表面増強ラマン分光装置は、前記方法を利用した、表面増強ラマン散乱を励起するための光を放射する光源と、形状異方性を持つ金属微粒子が形成されたセルと、前記セルを透過、反射、または、散乱した光を検出、または、分光し、分光された光を検出する分光手段と、表面増強ラマン散乱を前記光源からの光を減衰させる光学フィルターと、前記光源から放射された光の偏光状態を変更・制御する偏光制御手段とを備え、前記分光手段により検出された光量に基づいて前記偏光制御手段の制御値を決定し、前記偏光制御手段を制御する演算部とを備える。

本構成によって、金ナノロッド等の形状異方性を有する金属微粒子が同一方向で固定化されていなくとも、表面増強ラマン散乱を励起するための光源の偏光状態を制御することにより、測定感度が低下することを防止することで、高精度に被検物質の濃度が測定できる。

本発明の表面増強ラマン分光方法および本方法を用いた表面増強ラマン分光装置によれば、金ナノロッド等の形状異方性を有する金属微粒子が同一方向で固定化されていなくとも、表面増強ラマン散乱を励起するための光源の偏光状態を制御することにより、測定感度が低下することを防止することで、高精度に被検物質の濃度が測定できる。

以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
本発明の第１の実施の形態について図１〜６を用いて説明する。

図１は、本発明の実施の形態１における表面増強ラマン分光装置１００の構成を示す図である。図１において、局在化表面プラズモン共鳴波長を含む光を放射する半導体レーザ１０１、半導体レーザから放射された光の偏光状態を制御する偏光制御器１０２、半導体レーザ１０１から放射された光を整形するレンズ系１０４、被検物質を保持し、金ナノロッド１０５ａが設けられているセル１０５、半導体レーザ１０１が放射する波長に対応したノッチフィルターが装着されたスロットと、局在化表面プラズモン共鳴波長を測定する際に利用するノッチフィルターが装着されていないスロットを備える光学フィルターホイール１０６、グレーティング分光を行う際に光を略点光源状に整形するスリット１０７、スリット１０７を透過した光を波長に応じて分散させながら反射するグレーティング素子１０８、分散した光を検出する複数の受光領域を持つ光検出器１０９、偏光制御器１０２を制御し、また、偏光制御器１０２の制御状態と光検出器１０９が受光した光の強度から最適な偏光状態を算出し、算出した最適な偏光状態に基づき偏光制御器１０２を制御し、また、半導体レーザ１０１から放射された光により発生した表面増強ラマン分光スペクトルを分析することにより被検物質の濃度を算出するマイクロコンピュータ１１０である。

ここで、半導体レーザ１０１、偏光制御器１０２、光学フィルターホイール１０６、マイクロコンピュータ１１０はそれぞれ、本発明における光源、偏光制御手段、光学フィルター、演算部に相当する。また、スリット１０７、グレーティング素子１０８、光検出器１０９は本発明における分光手段に相当する。本実施の形態において分光手段として、グレーティング素子１０８と複数の受光領域を持つ光検出器１０９を用いたが、所定の波長を分光できる公知技術であれば、特に限定することなく利用できる。例えば、干渉フィルター等の分光フィルターや、音響光学素子と単一の受光領域を持つ光検出器等を利用することができる。

また、本発明の表面増強ラマン分光装置は、メモリ１１１を備えていてもよい。メモリ１１１には、複数の受光領域を持つ光検出器１０９の各セルに対応する波長のデータや、被検物質の濃度を算出するための表面増強ラマン散乱光の各波数における強度と被検物質の濃度の相関関係に関するデータを保持している。

図２は、本発明の第１の実施の形態におけるセル１０５の断面を示す図である。セル１０５は、基板１０５ｃに固定化された金ナノロッド１０５ａ（短軸サイズ＝数ｎｍ〜２５ｎｍ程度、長軸＝５０〜５００ｎｍ程度）、スペーサー１０５ｂ、基板１０５ｃ、カバーガラス１０５ｅ、スペーサー１０５ｂとカバーガラス１０５ｅで形成される被検溶液保持空間１０５ｄ、被検溶液の供給口、排出口（図示せず）から構成される。ここで、基板１０５ｃに固定化された金ナノロッド１０５ａは、本発明における金属微粒子に相当する。ここで、ロッド状に形成された金微粒子１４２ａの製法としては、公知の技術を特に限定なく利用することができる。例えば、電解法、化学還元法、光還元法等が利用できる。ロッド状に形成された金微粒子１４２ａを基板に固定化する技術としては、例えば、静電相互作用を利用する方法を利用することができる。

基板１０５ｃとしては、半導体レーザ１０１、および、表面増強ラマン散乱光の波長の光が透過するものであれば、公知技術を特に限定することなく利用することができる。例えば、ＳｉＯ２は、前記光の波長に対して透明であるため好ましい。

図３には、金ナノロッド１０５ａが基板１０５ｃに固定化されている例を上面から見た図を示す。図３に示すように金ナノロッド１０５ａは、一定の方向に配向することなく基板１０５ｃに固定化されている。しかし、図３に示した例のようにある方向（図３中の矢印１２０）に配向した金ナノロッド１０５ａが多く含まれる。このような状態では、矢印１２０の方向に電場が振動する偏光の光を入射すると、金ナノロッド１０５ａの長軸方向の局在化表面プラズモンが共鳴し、長軸方向の電場が増強された金ナノロッド１０５ａの個数が多くなる。この配向方向は、セル１０５ごとに異なるため、一定方向の偏光を入射して測定すると、セル１０５ごとに局在化表面プラズモンの共鳴状態が変化し、信号対雑音比が変動する要因になる。したがって、信号対雑音比を各測定で極大化するために、本発明のように偏光を変化させながら測定し、長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴が極大になる偏光状態で測定することが好ましい。

例えば、短軸長が約１０ｎｍ、長軸長が約３０ｎｍ、直径が約１０ｎｍのロッド状に形成された金微粒子において、空気中では、局在化表面プラズモン共鳴波長は約７００ｎｍとなり、屈折率が１変化した場合の局在化表面プラズモン共鳴波長変化量は、約３００ｎｍとなる。ここで、被検溶液の屈折率を１．３５とした場合、空気の屈折率の差から被検溶液がロッド状に形成された金微粒子１０５ａの周囲に満たされている場合、長軸方向に共鳴した局在化表面プラズモン共鳴波長は約８０５ｎｍとなる。

ここで、本発明の光源として、約８０５ｎｍの光を放射する半導体レーザを利用することができる。また、被検溶液の屈折率に応じて、異なる波長を放射する半導体レーザを利用しても良く、金ナノロッド１０５ａの大きさによって局在化表面プラズモン共鳴波長が変化するため、金ナノロッド１０５ａの大きさに応じて半導体レーザ１０１が放射する波長を変更してもよい。

本実施の形態では、光源として、半導体レーザを利用したが、当該波長を放射できるレーザ光源であれば特に限定なく利用することができる。例えば、波長可変が可能なチタンサファイアレーザ、固体レーザ等を利用することができる。

光学フィルターホイール１０６は、図４に示すように、半導体レーザ１０１の光を減衰させる第１のノッチフィルター１０６ａがリング１０６ｈにはめ込まれており、リング１０６ｈに穴を開けることにより空隙１０６ｇが形成されている。図３に示す例では、ともに半円状である第１のノッチフィルター１０６ａと空隙１０６ｇがリング１０６ｈにはめ込まれることにより円盤状の部材が構成されており、その円盤状の部材の中央部にリング１０６ｉが設けられている。このリング１０６ｉを図４の矢印のように回転させることにより、第１のノッチフィルター１０６ａと空隙１０６ｇとの間で切り替えることができる。リング１０６ｉの回転は、マイクロコンピュータ１１０からの制御信号により制御される。光学フィルターホイール１０６は、本発明における光学フィルターに相当する。本実施の形態において、光学フィルターとして光学フィルターホイールを利用したが、表面増強ラマン分光測定を行う際に半導体レーザ１０１の光の波長を減衰させ、また、最適な偏光状態を算出するときに、半導体レーザ１０１が放射する波長を実質的に減衰させず、測定状態に応じて光学フィルターを切り替えることができれば、特に公知技術を限定なく利用することができる。

次に本実施の形態における表面増強ラマン分光方法および本方法を利用した表面増強ラマン分光装置の動作について、図面を参照しながら説明する。図５には、偏光制御器の最適制御値を測定する際の動作を説明する図を示す。まず、セル１０５に被検溶液を供給する。セル１０５に被検溶液が満たされたあと、半導体レーザ１０１の電源を入れる。この時、光学フィルターホイール１０６は、空隙１０６ｇが光路中に挿入されている。半導体レーザ１０１から放射された光は、セル１０５中の金ナノロッド１０５ａを透過する際、被検溶液の屈折率に応じた局在化表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が最大となる。金ナノロッド１０５ａを透過した光がスリット１０７を透過し、グレーティング素子１０８により分散される。しかし、半導体レーザ１０１は実質的に単一波長の光を放射するため、光検出器１０９における各受光領域のうち、半導体レーザ１０１の波長に対応した受光領域のみが検出した光の量に基づいてマイクロコンピュータ１１０に電気信号を出力する。

この時、被検溶液が満たされたかどうかを判定するためのセンサを備えていることが好ましい。例えば、カバーガラス１０５ｅと基板１０５ｃに電極を設けておき、電極に弱い電圧をかけておく。被検溶液が例えば血液である場合、血液には電解質が含まれることから、被検溶液が満たされると電極間に電流が流れ、被検溶液がセル１０５内に満たされたどうかが判定できる。さらに前記センサの出力を利用して半導体レーザ１０１の電源を自動的にＯＮにすることが、測定を自動化できるため好ましい。

次に、偏光制御器１０２を駆動しながら、セル１０５を透過した半導体レーザ１０１の光量を測定する。

ここで、偏光制御器１０２としては、公知の技術を特に限定することなく利用できる。例えば、λ／２波長板を回転させて偏光状態を制御するもの、液晶に電圧を印加して偏光状態を制御するものや、ファラデーローテーター等の偏光ローテーターを利用することができる。また、半導体レーザ１０１そのものを回転することにより、セル１０５に照射される光の偏光を制御してもよいし、半導体レーザ１０１を固定し、セル１０５ｃを回転することによりセル１０５ｃに照射される光の変更を制御してもよい。このとき、光軸の中心を回転中心として回転させることが好ましい。

また、本発明の実施の形態において、半導体レーザ１０１が照射する光の偏光状態に合わせてさらに偏光子を備えていてもよい。半導体レーザ１０１は、その構造上ある方向に偏光した光を照射するが、多少偏光の広がりが存在する。この状態で半導体レーザ１０１の偏光状態に合わせて偏光子を利用することにより、さらに半導体レーザ１０１の偏光状態を急峻にできるため好ましい。

金ナノロッド１０５ｃは、形状が均一な「ロッド状（棒状）」の金ナノ粒子（金ナノロッド）であり、可視から近赤外の領域に表面プラズモンに由来する強い二本の吸収バンドを持つ。一つは金ナノロッドの短軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長であり、可視域（５２０ｎｍ付近）に吸収ピークが存在する。もう一つは長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長であり、赤色から近赤外域（６００〜１３００ｎｍ）に吸収ピークを持つ。例えば、長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長である近赤外域の光を用いて表面増強ラマン分光を実施する場合、金ナノロッド１０５ｃの長軸方向に電場成分を持つように偏光した光を利用することにより長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴による電場増強効果を引き起こすことができる。以下、本実施の形態において、近赤外域の局在化表面プラズモン共鳴波長を利用して表面増強ラマン散乱を励起する場合について説明する。

偏光制御器１０２の最適な制御量は、次のように決定することができる。まず、ある偏光状態に設定された偏光制御器１０２を介してセル１０５に対して半導体レーザ１０１から光を照射する。この状態で半導体レーザ１０１の光量を光検出器１０９で検出し、対応する電気出力をマイクロコンピュータ１１０で処理する。次に、偏光制御器１０２を駆動し、セル１０５に照射される光の偏光状態を変化させる。この状態で、半導体レーザ１０１の光量を光検出器１０９で検出し、対応する電気出力をマイクロコンピュータ１１０で処理する。この後、さらに偏光制御器１０２を駆動し、セル１０５に照射される光の偏光状態を変化させ、この状態で、半導体レーザ１０１の光量を光検出器１０９で検出し、対応する電気出力をマイクロコンピュータ１１０で処理することを繰り返し、偏光制御器１０２により偏光が１８０度変化するまで繰り返す。この時、半導体レーザ１０１が放射する波長は、本実施の形態において被検試料をセル１０５内に導入した後の局在化表面プラズモン共鳴波長と等しくなるように設定されているため、偏光状態を変化させると、金ナノロッド１０５ａの配向状態に応じてある偏光状態で光検出器１０９が検出する光量が極小になる位置が存在する。光検出器１０９が検出する光量が極小になっている場合、局在化表面プラズモン共鳴の発生が極大となり、最適な偏光状態となっていることを意味する。したがって、偏光制御器１０２を光検出器１０９が検出する光量が極小になった状態に制御することにより、表面増強ラマン散乱をより強く発生させることができる。

最適な偏光状態を算出した後、マイクロコンピュータ１１０は、最適な偏光状態の算出結果に基づき、偏光制御器１０２を駆動すると共に、リング１０６ｉを回転させ、第１のノッチフィルター１０６ａを光路中に挿入する。図６には、ノッチフィルター１０３ｃが光路中に挿入されている例を示している。

半導体レーザ１０１の光をセル１０５に入射すると、金ナノロッド１０５ａにおいて局在化表面プラズモンが励起され、近傍に電場増強領域が発生する。この電場増強領域において、表面増強ラマン散乱光が発生する。発生した表面増強ラマン散乱光は、入射した半導体レーザ１０１の光とは、波長が異なる。この時、表面増強ラマン散乱光として、ストークス光とアンチストークス光の２種類の表面増強ラマン散乱光が発生する。一般的にストークス光の方が、アンチストークス光に比較して光量が大きい。本実施の形態において、ストークス光、アンチストークス光のどちらを測定してもかまわない。

また、半導体レーザ１０１をセル１０５に入射した際、表面増強ラマン散乱光とともに、波長が変化しないレイリー散乱光が発生する。発生した表面増強ラマン散乱光とレイリー散乱光は、共に第１のノッチフィルター１０６ａに入射するが、レイリー散乱光は、第１のノッチフィルター１０６ａにより減衰され、スリット１０７、グレーティング素子１０８にはほとんど放射されない。第１のノッチフィルター１０６ａを透過した表面増強ラマン散乱光は、グレーティング素子１０８により分散させられ、各波長に応じて複数の受光領域を持つ光検出器１０９に入射される。

ここで、複数の受光領域を持つ光検出器１０９としては、公知技術を特に限定することなく利用することができる。例えば、ＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ、１次元フォトディテクターアレイ等を利用することができる。また、受光領域の数としては、例えば４０９６個の受光領域を持つ１次元ＣＣＤ素子を利用することができる。

光検出器１０９に入射した光は、マイクロコンピュータ１１０により表面増強ラマン散乱光強度とラマンシフト波数が算出される。この時、光検出器１０９における各受光領域の出力と波数に関するデータはメモリ１１１を参照する。

表面増強ラマン散乱光強度とラマンシフト波数が算出されると、マイクロコンピュータ１１０は、さらにメモリ１１１に格納されている表面増強ラマン散乱光の各波数における強度と被検物質の濃度の相関関係を参照し、被検物質の濃度を算出する。算出された被検物質の濃度は、例えば、スピーカー（図示せず）を通じて音声での通知や、ディスプレイ等（図示せず）に表示させることにより、ユーザに通知される。

メモリ１１２に格納されている、表面増強ラマン散乱光の強度と波長の関係と被検溶液中の被検物質の濃度との相関を示す相関データは、例えば、以下の手順によって取得することができる。

まず、既知の被検成分濃度（例えば、血糖値）を有する患者について、表面増強ラマン散乱光の波長と光強度の関係を測定する。この測定を、異なる被検成分濃度を有する複数の患者について行うことにより、表面増強ラマン散乱光の波長と光強度の関係と、それらに対応する被検物質濃度とからなるデータの組を得ることができる。

次に、このようにして取得したデータの組を解析して相関データを求める。例えば、表面増強ラマン散乱光の波長と光強度の関係と、それらに対応する被検物質濃度とについて、ＰＬＳ（ＰａｒｔｉａｌＬｅａｓｔＳｑｕａｒｅｓＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）法などの重回帰分析法やニューラルネットワーク法などを用いて多変量解析を行うことにより、表面増強ラマン散乱光の波長と光強度の関係と、それらに対応する被検物質濃度との相関を示す関数を求めることができる。

本実施の形態によれば、金ナノロッド等の形状異方性を有する金属微粒子が同一方向で固定化されていなくとも、表面増強ラマン散乱を励起するための光源の偏光状態を制御することにより、測定感度が低下することを防止することで、高精度に被検物質の濃度が測定できる。

（実施の形態２）
本発明の別の実施の形態について図７を用いて説明する。図７において、図１〜図６と同じ構成要素については、同じ符号を用い、説明を省略する。

図７は、本発明の実施の形態２に係る表面増強ラマン分光装置の構成を示す図である。図７において、実施の形態１と異なる構成は、光学フィルターとして第１のノッチフィルター１０６ａのみを備えている点である。その他の構成は実施の形態１と同じであるため説明を省略する。

本発明の実施の形態２では、偏光制御器１０２の最適な制御量を決定する際、実施の形態１とは異なり、直接表面増強ラマン散乱光の光量を測定することにより決定する。このようにすることにより、光学フィルターの制御が不必要となり、システムがより簡易になるため好ましい。

次に本実施の形態における表面増強ラマン分光方法および本方法を利用した表面増強ラマン分光装置の動作について、図７を用いて説明する。まず、セル１０５に被検溶液を供給する。セル１０５に被検溶液が満たされたあと、半導体レーザ１０１の電源を入れる。

次に、偏光制御器１０２を駆動しながら、セル１０５に照射された半導体レーザ１０１により発生された表面増強ラマン散乱光の光量を測定する。ここで、測定する表面増強ラマン散乱光の光量は、ある特定のラマンシフトに対応する波数の光量を測定すればよい。例えば、最も大きなラマン散乱強度の波数の光量を測定することが好ましい。

偏光制御器１０２の最適な制御量は、次のように決定することができる。まず、ある偏光状態に設定された偏光制御器１０２を介してセル１０５に対して半導体レーザ１０１から光を照射する。この状態で半導体レーザ１０１をセル１０５に照射することにより発生した表面増強ラマン散乱光の光量を光検出器１０９で検出し、対応する電気出力をマイクロコンピュータ１１０で処理する。次に、偏光制御器１０２を駆動し、セル１０５に照射される光の偏光状態を変化させる。この状態で半導体レーザ１０１をセル１０５に照射することにより発生した表面増強ラマン散乱光の光量を光検出器１０９で検出し、対応する電気出力をマイクロコンピュータ１１０で処理する。この後、さらに偏光制御器１０２を駆動し、セル１０５に照射される光の偏光状態を変化させ、この状態で半導体レーザ１０１をセル１０５に照射することにより発生した表面増強ラマン散乱光の光量を光検出器１０９で検出し、対応する電気出力をマイクロコンピュータ１１０で処理することを繰り返し、偏光制御器１０２により偏光が１８０度変化するまで繰り返す。この時、半導体レーザ１０１が放射する波長は、本実施の形態において被検試料をセル１０５内に導入した後の局在化表面プラズモン共鳴波長と等しくなるように設定されているため、偏光状態を変化させると、金ナノロッド１０５ａの配向状態に応じてある偏光状態で光検出器１０９が検出する表面増強ラマン散乱光量が極大になる位置が存在する。光検出器１０９が検出する表面増強ラマン散乱光量が極大になっている場合、偏光状態が最適であることを意味する。したがって、偏光制御器１０２を光検出器１０９が検出する光量が極大になった状態に制御することにより、表面増強ラマン散乱をより強く発生させることができる。

最適な偏光状態を算出した後、マイクロコンピュータ１１０は、最適な偏光状態の算出結果に基づき、偏光制御器１０２を駆動する。

（実施の形態３）
本発明の別の実施の形態について、図８〜図１０を用いて説明する。図８〜図１０において、図１〜図７と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。

図８は、本発明の実施の形態３に係る表面増強ラマン分光装置の構成を示す図である。図８において、実施の形態１と異なる構成は、光源として、局在化表面プラズモン共鳴波長を測定するために利用するハロゲン光源１２１、半導体レーザ１０１ａ〜１０１ｆを備えている点である。ここで、本発明の実施の形態では、局在化表面プラズモン共鳴波長を測定するための光源として、ハロゲン光源１２１を利用したが、測定する局在化表面プラズモン共鳴波長を含む光源であれば、公知の技術を特に限定することなく利用することができる。例えば、近赤外領域の光を放射する赤外ＬＥＤ等を利用することができる。また、半導体レーザ１０１ａ〜１０１ｆは、被検溶液の屈折率が変化した際に局在化表面プラズモン共鳴波長が変化するが、この現象を補償するために利用する。半導体レーザ１０１ａ〜１０１ｆが放射する波長は、被検溶液をセル１０５内に導入した後の長軸方向の局在化表面プラズモン共鳴波長の光を含むものであれば、公知の技術を特に限定なく利用することができる。例えば、短軸長が約１０ｎｍ、長軸長が約３０ｎｍ、直径が約１０ｎｍのロッド状に形成された金微粒子において、空気中では、局在化表面プラズモン共鳴波長は約７００ｎｍとなり、屈折率が１変化した場合の局在化表面プラズモン共鳴波長変化量は、約３００ｎｍとなる。ここで、被検溶液の屈折率を１．３５とした場合、空気の屈折率の差から被検溶液がロッド状に形成された金微粒子１０５ａの周囲に満たされている場合、長軸方向に共鳴した局在化表面プラズモン共鳴波長は約８０５ｎｍとなる。半導体レーザ１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃ、１０１ｄ、１０１ｅ、１０１ｆとして、放射する波長が、それぞれ７９０ｎｍ、７９４ｎｍ、７９８ｎｍ、８０２ｎｍ、８０６ｎｍ、８１０ｎｍであるものを利用することができる。

次に本実施の形態における表面増強ラマン分光方法および本方法を利用した表面増強ラマン分光装置の動作について、図面を参照しながら説明する。図９には、局在化表面プラズモン共鳴波長を測定する際の動作を説明する図を示す。まず、セル１０５に被検溶液を供給する。セル１０５に被検溶液が満たされたあと、ハロゲン光源１０１の電源を入れる。この時、光学フィルターホイール１０６は、空隙１０６ｇが光路中に挿入されている。ハロゲン光源１０１から放射された光は、セル１０５中の三角錘状の銀微粒子１０５ａを透過する際、被検溶液の屈折率に応じた局在化表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が最大となる。金ナノロッド１０５ａを透過した光がスリット１０７を透過し、グレーティング素子１０８により分散され、光検出器１０９における各受光領域に到達した光の量からマイクロコンピュータ１１０が、光検出器１０９の各受光領域が検出した光の量に基づいて局在化表面プラズモン共鳴波長を決定する。この時、実施の形態１と同じく偏光制御器１０２を駆動しながら測定を実施する。ここで、ハロゲン光源１２１を利用して局在化表面プラズモン共鳴波長を測定する際の偏光制御器１０２は、ハロゲン光源１２１が放射する光はランダムに偏光していることから、特定方向に偏光した光を透過させる偏光子を利用し、偏光制御は、偏光子を回転させることにより行う。ハロゲン光源１２１が放射する光を、偏光制御器１０２を制御しながら測定する。ハロゲン光源１２１から放射された光は、セル１０５中の金ナノロッド１０５ａを透過する際、被検溶液の屈折率に応じて局在化表面プラズモン共鳴波長において光の消衰が最大となり、さらに、偏光制御器１０２の状態に応じて、さらに光の減衰が大きくなる。金ナノロッド１０５ａを透過した光がスリット１０７を透過し、グレーティング素子１０８により分散され、光検出器１０９における各受光領域に到達した光の量からマイクロコンピュータ１１０が、光検出器１０９の各受光領域が検出した光の量に基づいて局在化表面プラズモン共鳴波長と偏光制御器１０２の最適状態を決定する。

この時、実施の形態１と同様に、被検溶液が満たされたかどうかを判定するためのセンサを備えていることが好ましい。例えば、カバーガラス１０５ｅと基板１０５ｃに電極を設けておき、電極に弱い電圧をかけておく。被検溶液が例えば血液である場合、血液には電解質が含まれることから、被検溶液が満たされると電極間に電流が流れ、被検溶液がセル１０５内に満たされたどうかが判定できる。さらに前記センサの出力を利用して半導体レーザ１０１の電源を自動的にＯＮにすることが、測定を自動化できるため好ましい。

局在化表面プラズモン共鳴波長と、最適な偏光制御値を算出した後、マイクロコンピュータ１１０は、局在化表面プラズモン共鳴波長の算出結果に基づき、半導体レーザ１０１ａ〜１０１ｆのうち、どの半導体レーザ１０１を放射するかを決定し、決定した半導体レーザ１０１を放射するように設定すると共に、半導体レーザ１０１からセル１０５の光路中に存在する偏光制御器１０２を最適な偏光制御値になるように設定し、さらに、リング１０６ｉを回転させ、選定した半導体レーザ１０１が放射する波長に対応するノッチフィルターを光路中に挿入する。

ここで、本実施の形態で利用する、光学フィルターホイール１０６を図１０に示す。光学フィルターホイール１０６は、図１０に示すように、第１のノッチフィルター１０６ａ、第２のノッチフィルター１０６ｂ、第３のノッチフィルター１０６ｃ、第４のノッチフィルター１０６ｄ、第５のノッチフィルター１０６ｅ、及び、第６のノッチフィルター１０６ｆがリング１０６ｈにはめ込まれており、リング１０６ｈに穴を開けることにより空隙１０６ｇが形成されている。ここで、第１〜第６のノッチフィルター１０６ａ〜１０６ｆは、それぞれ半導体レーザ１０２ａ〜１０２ｆが放射する波長の光を減衰させるノッチフィルターに対応する。図９に示す例では、ともに円状である第１〜第６のノッチフィルター１０６ａ〜１０６ｆと空隙１０６ｇがリング１０６ｈにはめ込まれることにより円盤状の部材が構成されており、その円盤状の部材の中央部にシャフト１０６ｉが設けられている。このシャフト１０６ｉを図１０の矢印のように回転させることにより、第１〜第６のノッチフィルター１０６ａ〜１０６ｆと空隙１０６ｇとの間で切り替えることができる。シャフト１０６ｉの回転は、マイクロコンピュータ１１０からの制御信号により制御される。光学フィルターホイール１０６は、本発明における光学フィルターに相当する。

図９には、半導体レーザ１０１が局在化表面プラズモン共鳴波長とほぼ等しくなるよう、半導体レーザ１０１ｃが放射するように設定され、ノッチフィルター１０３ｃが光路中に挿入され、さらに、半導体レーザ１０１からセル１０５の光路中に存在する偏光制御器１０２を最適な偏光制御値になるように設定されている例を示している。例えば、局在化表面プラズモン共鳴波長が８０５ｎｍであるとき、８０６ｎｍの光を放射するように半導体レーザ１０１ｃを駆動し、これと同時に半導体レーザ１０１ｃが放射する波長に対応する第３のノッチフィルター１０６ｃを光路中に挿入する。ここで、半導体レーザ１０１からセル１０５の光路中に存在する偏光制御器１０２は、実施の形態１と同様のものを利用することができる。

半導体レーザ１０１ｃの光をセル１０５に入射すると、金ナノロッド１０５ａにおいて局在化表面プラズモンが励起され、近傍に電場増強領域が発生する。この電場増強領域において、表面増強ラマン散乱光が発生する。発生した表面増強ラマン散乱光は、入射した半導体レーザ１０１ｃの波長の光とは、波長が異なる。この時、表面増強ラマン散乱光として、ストークス光とアンチストークス光の２種類の表面増強ラマン散乱光が発生する。一般的にストークス光の方が、アンチストークス光に比較して光量が大きい。本実施の形態において、ストークス光、アンチストークス光のどちらを測定してもかまわない。

また、半導体レーザ１０１ｃが放射した光をセル１０５に入射した際、表面増強ラマン散乱光とともに、波長が変化しないレイリー散乱光が発生する。発生した表面増強ラマン散乱光とレイリー散乱光は、共にノッチフィルター１０６ｃに入射するが、レイリー散乱光は、ノッチフィルター１０６ｃにより吸収され、スリット１０７、グレーティング素子１０８にはほとんど放射されない。ノッチフィルター１０６ｃを透過した表面増強ラマン散乱光は、グレーティング素子１０８により分散させられ、各波長に応じて複数の受光領域を持つ光検出器１０９に入射される。

本発明にかかる表面増強ラマン分光測定方法及び本方法を用いた表面増強ラマン分光装置は、本実施の形態によれば、金ナノロッド等の形状異方性を有する金属微粒子が同一方向で固定化されていなくとも、表面増強ラマン散乱を励起するための光源の偏光状態を制御することにより、測定感度が低下することを防止することで、高精度に被検物質の濃度が測定する際に有用である。

本発明の一実施の形態における表面増強ラマン分光装置の構成を示す図本発明の一実施の形態におけるセル１０５の断面を示す図本発明の一実施の形態における金ナノロッド１０５ｃの固体化状態を示す模式図本発明の一実施の形態における光学フィルターホイール１０６の斜視図本発明の一実施の形態における偏光制御器の最適制御値を測定する際の動作を説明する図本発明の一実施の形態における表面増強ラマン散乱光を測定する際の動作を説明する図本発明の他の実施の形態における表面増強ラマン分光装置の構成を示す図本発明の他の実施の形態における偏光制御器の最適制御値を測定する際の動作を説明する図本発明の他の実施の形態における表面増強ラマン散乱光を測定する際の動作を説明する図本発明の他の実施の形態における光学フィルターホイール１０６の斜視図

１００表面増強ラマン分光装置
１０１半導体レーザ
１０１ａ半導体レーザ
１０１ｂ半導体レーザ
１０１ｃ半導体レーザ
１０１ｄ半導体レーザ
１０１ｅ半導体レーザ
１０１ｆ半導体レーザ
１０２偏光制御器
１０３ミラー
１０４レンズ
１０５セル
１０５ａ金ナノロッド
１０５ｂスペーサー
１０５ｃ基板
１０５ｄ被検溶液保持空間
１０６光学フィルターホイール
１０６ａ第１のノッチフィルター
１０６ｂ第２のノッチフィルター
１０６ｃ第３のノッチフィルター
１０６ｄ第４のノッチフィルター
１０６ｅ第５のノッチフィルター
１０６ｆ第６のノッチフィルター
１０６ｇ空隙
１０６ｈリング
１０６ｉシャフト
１０７スリット
１０８グレーティング素子
１０９複数の受光領域を持つ光検出器
１１０マイクロコンピュータ
１１１メモリ
１２０金ナノロッドの配向方向のうち最も多く含まれる方向を示す矢印
１２１ハロゲン光源

Claims

被検物質の濃度を表面増強ラマン分光法により測定する方法であって、
ａ）被検物質を、形状異方性を持つ金属微粒子が形成されたセルに供給する工程、
ｂ）前記セルに光を照射する工程、
ｃ）前記光の偏光状態を変化させながら、前記セルを透過、または、散乱、または、反射した光を検出する工程、
ｄ）工程ｃ）により検出された光の光量から、最適な偏光状態を決定する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた偏光状態になるよう偏光素子を制御する工程、
ｆ）工程e）の偏光状態で前記セルに光を照射し、表面増強ラマン散乱を発生させる工程、
ｇ）工程ｆ）により発生した表面増強ラマン散乱光を分光し、検出する工程、
ｈ）工程ｇ）により検出された表面増強ラマン散乱光から被検物質濃度を算出する工程
を含む表面増強ラマン分光測定方法
前記工程ｃ）において、検出する光量は、工程ｂ）において入射した波長の光である請求項１記載の表面増強ラマン分光方法。
前記工程ｃ）において、検出する光量は、前記工程ｂ）において入射した光により発生した表面増強ラマン散乱光の光量である請求項１記載の表面増強ラマン分光方法。
被検物質は、生体に含まれる成分である請求項１から３いずれかに記載の表面増強ラマン分光方法。
表面増強ラマン散乱を励起するための光を放射する光源と、形状異方性を持つ金属微粒子が形成されたセルと、前記セルを透過、反射、または、散乱した光を検出、または、分光し、分光された光を検出する分光手段と、表面増強ラマン散乱を前記光源からの光を減衰させる光学フィルターと、前記光源から放射された光の偏光状態を変更・制御する偏光制御手段とを備え、前記分光手段により検出された光量に基づいて前記偏光制御手段の制御値を決定し、前記偏光制御手段を制御する演算部とを備える請求項１から４記載のいずれかの方法を利用する表面増強ラマン分光装置。
前記光源は、半導体レーザである請求項５の表面増強ラマン分光装置。
前記光源と前記偏光制御手段との間に、前記光源の偏光状態と一致するように設けられた偏光素子をさらに備える請求項５、６いずれかに記載の表面増強ラマン分光装置。
前記光学フィルターは、前記光源の光を減衰させる表面増強ラマン分光用光学フィルターと前記光源の光に作用しない光学フィルター、または、空隙で構成されている請求項２、５、６、７のいずれかに記載の表面増強ラマン分光装置。