JP2010164537A - Fractionation method of rubber particle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、天然ゴムラテックス中のゴム粒子を、大きさに基づいて分取する方法に関する。 The present invention relates to a method for sorting rubber particles in natural rubber latex based on size.
天然ゴムは、弾性を有する高分子であり、主にゴムノキの乳管（ｌａｔｉｃｉｆｅｒ）と呼ばれる細胞内で造られているラテックスという乳液を収集し、これに所望の加工をすることにより製造される（例えば、特許文献１参照。）。乳管は、ゴムノキの樹皮内の形成層の外側に年に数層発達する。ラテックスの収集は、一般的に、ゴムノキの幹にナイフ等を用いて溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管から流出するラテックスを回収することにより行われている。 Natural rubber is a polymer having elasticity, and is produced by collecting latex called latex, which is mainly produced in cells called a latex tube of rubber tree, and processing it into a desired form ( For example, see Patent Document 1.) The ducts develop several layers a year outside the formation layer in the bark of the rubber tree. The latex is generally collected by scratching (tapping) a rubber tree trunk into a groove shape using a knife or the like and collecting the latex flowing out from the cut milk duct.
天然ゴムは、ゴム製品の主原料として、様々な用途において幅広くかつ大量に用いられている。このため、より高収率でラテックスを得る方法の開発が求められている。より大量のラテックスを採取する方法としては、例えば、ゴムノキの幹に対してエチレンやＥｔｈｅｐｈｏｎ（２−クロロエチルホスホン酸）による刺激を加える方法がある。エチレン等を樹皮に塗布することにより、乳管から流出してくるラテックスが傷口で凝固することが抑制されるため、より多くのラテックスを採取することができる。 Natural rubber is used widely and in large quantities in various applications as the main raw material for rubber products. For this reason, development of the method of obtaining latex with higher yield is calculated | required. As a method for collecting a larger amount of latex, for example, there is a method in which stimulation of ethylene or ether (2-chloroethylphosphonic acid) is applied to a rubber tree trunk. By applying ethylene or the like to the bark, the latex flowing out from the milk duct is prevented from coagulating at the wound, so that more latex can be collected.
天然ゴムのゴムラテックス（天然ゴムラテックス）中のゴム粒子の粒径分布には、ピークが複数存在しており、天然ゴムラテックス中には様々な大きさのゴム粒子が存在していることが分かっている。また、各ゴム粒子のゴム生合成能が、ゴム粒子の大きさによって異なり、粒子径の小さいゴム粒子のほうが、粒子径の大きいゴム粒子よりもゴム生合成能が高いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。 There are multiple peaks in the particle size distribution of rubber particles in natural rubber rubber latex (natural rubber latex), and it is understood that rubber particles of various sizes exist in natural rubber latex. ing. In addition, the rubber biosynthetic capacity of each rubber particle varies depending on the size of the rubber particle, and it is reported that the rubber particle having a smaller particle diameter has higher rubber biosynthetic capacity than the rubber particle having a larger particle diameter ( For example, refer nonpatent literature 1.).
このように、ゴム粒子の特性は粒子径の大きさにより異なるため、天然ゴムラテックスに含まれるゴム粒子の大きさは、天然ゴムラテックスの物性に影響を与えると考えられる。このため、好ましいゴム特性を有する天然ゴムラテックスを調製するためには、天然ゴムラテックスから、粒子径に応じてゴム粒子を分取し、所望の大きさのゴム粒子の含有量が高い天然ゴムラテックスを調製することが理想である。 Thus, since the characteristics of the rubber particles vary depending on the size of the particle diameter, the size of the rubber particles contained in the natural rubber latex is considered to affect the physical properties of the natural rubber latex. For this reason, in order to prepare a natural rubber latex having preferable rubber characteristics, the rubber particles are separated from the natural rubber latex according to the particle diameter, and the content of the rubber particles having a desired size is high. It is ideal to prepare.
しかしながら、従来は、天然ゴムラテックス中のゴム粒子を、粒子径に応じて精度よく分取することは困難であった。例えば、ゴム粒子は非常に凝集しやすく、このため、タンパク質等を大きさにより分取する際に通常用いられているゲル濾過クロマトグラフィー等の手法を用いた場合には、単独のゴム粒子と凝集体とを分取することは容易であるが、凝集体が混在している状態で、一粒子の粒子径の大きさに基づいてゴム粒子を精度よく分取することが非常に困難である。 However, conventionally, it has been difficult to accurately classify rubber particles in natural rubber latex according to the particle diameter. For example, rubber particles are very likely to agglomerate. For this reason, when a method such as gel filtration chromatography, which is usually used when fractionating proteins and the like, is used, the particles are aggregated with individual rubber particles. Although it is easy to sort the aggregates, it is very difficult to accurately classify the rubber particles based on the particle size of one particle in a state where aggregates are mixed.
本発明は、天然ゴムラテックス中のゴム粒子を、大きさに基づいて分取する有効な方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the effective method of fractionating the rubber particle in natural rubber latex based on a magnitude | size.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、天然ゴムラテックス中のゴム粒子においては、粒子径の大きさに依存して、ゴム粒子の表面に存在しているタンパク質の種類が異なること、及び、ゴム粒子の表面に存在するタンパク質に対する抗体を用いた免疫学的手法を利用することにより、粒子径が特定の範囲である所望の粒子径のゴム粒子を、精度よく分取し得ることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has different types of proteins present on the surface of rubber particles depending on the particle size in the rubber particles in natural rubber latex. In addition, by utilizing an immunological technique using an antibody against a protein present on the surface of rubber particles, rubber particles having a desired particle diameter within a specific range can be accurately sorted. As a result, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、
（１） 天然ゴムラテックス中のゴム粒子を、大きさに基づいて分取する方法であって、天然ゴムラテックスに、ゴム粒子の表面タンパク質と特異的に結合する検出用抗体を添加し、当該検出用抗体とゴム粒子とが結合した複合体を形成した後、当該複合体を分取することを特徴とする、ゴム粒子の分取方法、
（２） 前記検出用抗体が、標識物質を結合させた抗体であることを特徴とする前記（１）記載のゴム粒子の分取方法、
（３） 前記複合体を、前記検出用抗体と特異的に結合する二次抗体であって、標識物質を結合させた抗体を用いて識別し、分取することを特徴とする前記（１）記載のゴム粒子の分取方法、
（４） 前記表面タンパク質が、ＳＲＰＰ（Ｓｍａｌｌ ｒｕｂｂｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のゴム粒子の分取方法、
（５） 前記表面タンパク質が、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ) であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のゴム粒子の分取方法、
（６） 前記標識物質が磁性体微粒子であり、前記複合体を、磁場を用いて回収することを特徴とする前記（２）〜（５）のいずれか記載のゴム粒子の分取方法、
（７） 前記標識物質が蛍光色素であり、前記複合体を、前記標識物質が発する蛍光に基づき識別して分取することを特徴とする前記（２）〜（５）のいずれか記載のゴム粒子の分取方法、
を提供することを目的とする。
That is, the present invention
(1) A method for separating rubber particles in natural rubber latex based on size, and adding a detection antibody that specifically binds to the surface protein of the rubber particles to natural rubber latex and detecting the same. Forming a complex in which the antibody for use and rubber particles are bound, and then fractionating the complex,
(2) The method for sorting rubber particles according to (1), wherein the detection antibody is an antibody to which a labeling substance is bound.
(3) The complex is a secondary antibody that specifically binds to the detection antibody, wherein the complex is identified and sorted using an antibody bound with a labeling substance (1) A method for separating rubber particles according to the description;
(4) The method for fractionating rubber particles according to any one of (1) to (3), wherein the surface protein is SRPP (Small rubber particle protein),
(5) The method for separating rubber particles according to any one of (1) to (3), wherein the surface protein is REF (rubber elongation factor),
(6) The method for separating rubber particles according to any one of (2) to (5), wherein the labeling substance is magnetic fine particles, and the complex is recovered using a magnetic field,
(7) The rubber according to any one of (2) to (5), wherein the labeling substance is a fluorescent dye, and the complex is identified and sorted based on fluorescence emitted from the labeling substance. Particle sorting method,
The purpose is to provide.
本発明のゴム粒子の分取方法により、天然ゴムラテックスから、所望の粒子径のゴム粒子を、精度よく分取することができる。 According to the method for fractionating rubber particles of the present invention, rubber particles having a desired particle diameter can be accurately separated from natural rubber latex.
本発明のゴム粒子の分取方法に供される天然ゴムラテックスは、ラテックス産生植物から回収されたラテックス（主にポリイソプレン）であれば、特に限定されるものではなく、ラテックス産生植物から回収された直後のものであってもよく、回収後一定期間保存されたものであってもよい。なお、ラテックス産生植物からの天然ゴムラテックスの回収は、常法により行うことができる。 The natural rubber latex used in the method for separating rubber particles of the present invention is not particularly limited as long as it is a latex (mainly polyisoprene) recovered from a latex-producing plant, and is recovered from a latex-producing plant. It may be immediately after it has been stored, or it may have been stored for a certain period of time after collection. In addition, collection | recovery of natural rubber latex from a latex production plant can be performed by a conventional method.
本発明のゴム粒子の分取方法に供される天然ゴムラテックスを産生するラテックス産生植物は、ラテックス（主にポリイソプレン）を産生する植物であれば、特に限定されるものではなく、乳管を有しており、乳管中にラテックスが含まれている植物であってもよく、乳管細胞内ではなく細胞間隙中にラテックスが含まれている植物であってもよい。このようなラテックス産生植物として、例えば、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈａｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、セアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ラゴスゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｌｕｔｅａ Ｖａｈｌ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ ｚａｐｏｔａ）、ガガイモ科のオオバナアサガオ（Ｃｒｙｐｔｏｓｔｅｇｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、トチュウ科のトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。中でも、パラゴムノキ、セアラゴムノキ、ゴムタンポポ等であることが好ましく、工業用天然ゴム原料として汎用されているパラゴムノキであることがより好ましい。 The latex-producing plant that produces the natural rubber latex used in the method for separating rubber particles of the present invention is not particularly limited as long as it is a plant that produces latex (mainly polyisoprene). It may be a plant containing latex in the milk duct, or may be a plant containing latex in the cell space instead of in the duct cells. Examples of such latex-producing plants include, for example, Havea brasiliensis, Meliahot glazovii, Mulberry family, Ficus elasticus, Pana rubber, and Castilla elasticus. Leguminous arabic (Acaccia sengal), Tragant rubber cypress (Astragalus gummifer), Oleander family stag beetle (Dyera costulata), Zanzibar turkey um (Landolphia kirsiel) ca), guayule rubber tree (Parthenium argentatum), rubber dandelion (Taraxacum kok-saghyz), scallops of the categorae family (Palaguium gatata), Mimusops galata Asagao (Cryptostegia grandiflora), Eucommia ulmoides and the like. Among these, para rubber tree, sea rubber tree, rubber dandelion and the like are preferable, and para rubber tree which is widely used as an industrial natural rubber raw material is more preferable.
後述する図１に示すように、天然ゴムラテックス中には、様々な粒子径のゴム粒子が混在している。そこで、本発明者は、各ゴム粒子の特性を調べるべく、ゴム生合成への関与が示唆されている２つのタンパク質、ＳＲＰＰとＲＥＦの局在を、各タンパク質と特異的に結合する抗体を用いた免疫学的手法により調べたところ、図２及び図３に示すように、ＳＲＰＰは、比較的粒子径の小さいゴム粒子の表面に多く局在しており、ＲＥＦは比較的粒子径の大きいゴム粒子の表面に多く局在していることが分かった。このように、ゴム粒子表面に存在するタンパク質の種類が、ゴム粒子の粒子径に依存して異なること、及び、ゴム粒子表面に存在するタンパク質を指標とすることにより、粒子径が特定の範囲であるゴム粒子を、他の大きさのゴム粒子から識別し得ることは、本発明者により初めて見出された知見である。 As shown in FIG. 1 described later, rubber particles having various particle diameters are mixed in the natural rubber latex. Therefore, in order to investigate the characteristics of each rubber particle, the present inventor uses antibodies that specifically bind the localization of two proteins, SRPP and REF, which are suggested to be involved in rubber biosynthesis. As shown in FIG. 2 and FIG. 3, SRPP is localized in a large amount on the surface of rubber particles having a relatively small particle size, and REF is a rubber having a relatively large particle size. It was found that many particles were localized on the surface of the particles. In this way, the type of protein present on the rubber particle surface varies depending on the particle size of the rubber particle, and the protein present on the rubber particle surface is used as an index, so that the particle size is within a specific range. It is a finding for the first time by the present inventors that a certain rubber particle can be distinguished from rubber particles of other sizes.
なお、ＳＲＰＰとＲＥＦのいずれも、複数のアイソタイプを有するタンパク質であるが、本発明においては、パラゴムノキ由来のタンパク質であることが好ましい。特に、ＳＲＰＰとしては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることが、ＲＥＦとしては配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることが、それぞれ好ましい。 Although both SRPP and REF are proteins having a plurality of isotypes, in the present invention, a protein derived from Para rubber tree is preferable. In particular, SRPP is preferably a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and REF is preferably a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
本発明のゴム粒子の分取方法は、該知見に基づいた方法であり、天然ゴムラテックス中のゴム粒子を、大きさに基づいて分取する方法であって、天然ゴムラテックスに、ゴム粒子の表面タンパク質（ゴム粒子表面に存在しているタンパク質）と特異的に結合する検出用抗体を添加し、当該検出用抗体とゴム粒子とが結合した複合体を形成した後、当該複合体を分取することを特徴とする。すなわち、他の大きさのゴム粒子の表面よりも、粒子径が特定の範囲であるゴム粒子の表面により選択的に発現しているタンパク質を指標とし、当該タンパク質を抗原とする抗体（検出用抗体）を、ゴム粒子表面の当該タンパク質と結合させて当該検出用抗体とゴム粒子とが結合した複合体（検出用抗体−ゴム粒子複合体）を形成した後、当該検出用抗体−ゴム粒子複合体を分取することにより、当該検出用抗体が結合した特定のタンパク質が表面に存在しているゴム粒子を分取することができる。 The method for fractionating rubber particles of the present invention is a method based on the above knowledge, and is a method for fractionating rubber particles in natural rubber latex based on the size. A detection antibody that specifically binds to a surface protein (protein present on the rubber particle surface) is added to form a complex in which the detection antibody and the rubber particle are bound, and then the complex is separated. It is characterized by doing. That is, an antibody (detection antibody) that uses a protein that is selectively expressed on the surface of a rubber particle having a particle diameter in a specific range as an index rather than the surface of another size of rubber particle, and uses the protein as an antigen. ) Is bound to the protein on the rubber particle surface to form a complex in which the detection antibody and the rubber particle are bound (detection antibody-rubber particle complex), and then the detection antibody-rubber particle complex. The rubber particles on the surface of which the specific protein to which the detection antibody is bound can be separated.
例えば、検出用抗体として、ＳＲＰＰと特異的に結合する抗ＳＲＰＰ抗体を用いることにより、天然ゴムラテックスから、粒子径が比較的小さいゴム粒子、より具体的には、粒子径が１０〜２５０ｎｍのゴム粒子を分取することができる。一方、検出用抗体として、ＲＥＦと特異的に結合する抗ＲＥＦ抗体を用いることにより、天然ゴムラテックスから、粒子径が比較的大きいゴム粒子、より具体的には、粒子径が２５０〜２０００ｎｍのゴム粒子を分取することができる。 For example, by using an anti-SRPP antibody that specifically binds to SRPP as a detection antibody, rubber particles having a relatively small particle size, more specifically rubber having a particle size of 10 to 250 nm, can be obtained from natural rubber latex. Particles can be sorted out. On the other hand, by using an anti-REF antibody that specifically binds to REF as an antibody for detection, rubber particles having a relatively large particle size, more specifically rubber having a particle size of 250 to 2000 nm, can be obtained from natural rubber latex. Particles can be sorted out.
検出用抗体−ゴム粒子複合体の形成は、抗原抗体反応において一般的に行われている条件や手法で行うことができる。例えば、天然ゴムラテックスに、検出用抗体を添加し、３０分間〜２時間インキュベーションすることにより、検出用抗体が、ゴム粒子表面の抗原（タンパク質）に結合し、検出用抗体−ゴム粒子複合体が形成される。なお、検出用抗体が添加される天然ゴムラテックスは、適当なバッファー等で希釈したものであることが好ましい。該バッファーとして、例えば、リン酸バッファー、トリスバッファー等が挙げられる。 Formation of the detection antibody-rubber particle complex can be carried out under conditions and techniques generally used in antigen-antibody reactions. For example, by adding a detection antibody to natural rubber latex and incubating for 30 minutes to 2 hours, the detection antibody binds to an antigen (protein) on the rubber particle surface, and the detection antibody-rubber particle complex becomes It is formed. The natural rubber latex to which the detection antibody is added is preferably diluted with an appropriate buffer or the like. Examples of the buffer include a phosphate buffer and a Tris buffer.
本発明において用いられる検出用抗体は、ゴム粒子表面に発現している目的の表面タンパク質を抗原とする抗体であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているいずれの種類の抗体であってもよい。例えば、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよい。また、市販されている抗体であってもよく、抗原とするタンパク質又はその部分タンパク質を抗原として動物に免疫し、常法により作製された抗体であってもよい。例えば、ＳＲＰＰの検出用抗体としては、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として作製された抗ＳＲＰＰ抗体等を用いることができる。また、ＲＥＦの検出用抗体としては、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として作製された抗ＲＥＦ抗体等を用いることができる。 The detection antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody having the target surface protein expressed on the rubber particle surface as an antigen, and is generally used in the art. Any type of antibody may be used. For example, it may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a chimeric antibody. Further, it may be a commercially available antibody, or an antibody produced by immunizing an animal using a protein as an antigen or a partial protein thereof as an antigen and using a conventional method. For example, as an antibody for detecting SRPP, an anti-SRPP antibody produced using a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an antigen can be used. In addition, as an antibody for detecting REF, an anti-REF antibody produced using a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as an antigen can be used.
また、本発明において用いられる検出用抗体は、標識物質を結合させた抗体（標識抗体）であることが好ましい。検出用抗体が標識抗体である場合には、当該標識を利用して簡便に検出用抗体−ゴム粒子複合体を分取することができるためである。標識物質としては、当該技術分野において、抗体の標識に一般的に用いられる標識物質であれば特に限定されるものではない。該標識物質として、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光色素、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ、磁性体微粒子、シリカビーズ等の固相担体等が挙げられる。 In addition, the detection antibody used in the present invention is preferably an antibody (labeled antibody) to which a labeling substance is bound. This is because when the detection antibody is a labeled antibody, the detection antibody-rubber particle complex can be easily separated using the label. The labeling substance is not particularly limited as long as it is a labeling substance generally used for labeling antibodies in the technical field. Examples of the labeling substance include fluorescent dyes such as fluorescein, FITC, and rhodamine, solid phase carriers such as Quantum Dot, magnetic fine particles, and silica beads.
蛍光色素やＱｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔを結合させた検出用抗体を用いた場合には、例えば、蛍光シグナルを検出し、目的の蛍光シグナルを発する粒子を分取することが可能なセルソーター等を用いることにより、検出用抗体−ゴム粒子複合体を分取することができる。 When using a detection antibody to which a fluorescent dye or Quantum Dot is bound, for example, detection can be performed by using a cell sorter or the like that can detect a fluorescent signal and sort out particles that emit the target fluorescent signal. The antibody-rubber particle complex can be fractionated.
また、磁性体微粒子を結合させた検出用抗体を用いた場合には、例えば、磁石等を用いて磁性体のみを回収することにより、検出用抗体−ゴム粒子複合体を分取することができる。なお、本発明において、磁性体微粒子とは、磁性を帯びた微粒子を意味し、鉄等の磁性体からなる微粒子であってもよく、樹脂ビーズ等に鉄等の磁性体を埋め込んだ微粒子であってもよい。 Further, when a detection antibody to which magnetic fine particles are bound is used, for example, the detection antibody-rubber particle complex can be separated by collecting only the magnetic material using a magnet or the like. . In the present invention, the magnetic fine particles mean magnetic fine particles, which may be fine particles made of a magnetic material such as iron, or fine particles in which a magnetic material such as iron is embedded in resin beads or the like. May be.
また、シリカビーズ等の固相担体を結合させた検出用抗体を用いた場合には、例えば、当該固相担体が通過できない多孔質膜を用いたフィルトレーション法により、当該多孔質膜上に固相担体を回収することにより、検出用抗体−ゴム粒子複合体を分取することができる。なお、検出用抗体を結合させる固相担体としては、アフィニティカラム等において一般的に用いられる固相担体を用いることができる。 In addition, when a detection antibody to which a solid phase carrier such as silica beads is bound is used, for example, a filtration method using a porous membrane through which the solid phase carrier cannot pass is applied on the porous membrane. By recovering the solid support, the detection antibody-rubber particle complex can be separated. In addition, as a solid phase carrier to which the detection antibody is bound, a solid phase carrier generally used in an affinity column or the like can be used.
その他、検出用抗体−ゴム粒子複合体は、当該検出用抗体と特異的に結合する二次抗体であって、標識物質を結合させた抗体を用いて識別し、分取することができる。すなわち、当該二次抗体と検出用抗体を結合させることにより、二次抗体−検出用抗体−ゴム粒子三者複合体を形成することができる。二次抗体を、標識物質と結合させた標識抗体とすることにより、形成された三者複合体を、当該標識を利用して簡便に分取することができる。なお、二次抗体に結合させる標識物質は、検出用抗体の標識に用いられる標識物質と同様のものを用いることができ、また、三者複合体の分取方法は、検出用抗体が標識抗体である場合の検出用抗体−ゴム粒子複合体の分取方法と同様に行うことができる。 In addition, the detection antibody-rubber particle complex is a secondary antibody that specifically binds to the detection antibody, and can be identified and sorted using an antibody to which a labeling substance is bound. That is, by combining the secondary antibody and the detection antibody, a secondary antibody-detection antibody-rubber particle ternary complex can be formed. By using a labeled antibody in which the secondary antibody is bound to a labeling substance, the formed ternary complex can be easily separated using the label. The labeling substance to be bound to the secondary antibody can be the same as the labeling substance used for labeling the detection antibody, and the method for sorting the ternary complex is that the detection antibody is labeled antibody. In the same manner as the fractionating method of the detection antibody-rubber particle complex.
本発明のゴム粒子の分取方法は、このように、ゴム粒子の表面に特定のタンパク質が存在しているゴム粒子を、当該タンパク質を抗原とする抗体を用いた免疫学的手法により分取する方法である。 In this way, the rubber particle sorting method of the present invention sorts rubber particles in which a specific protein is present on the surface of the rubber particles by an immunological technique using an antibody using the protein as an antigen. Is the method.
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。 Next, although an experiment example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to the following experiment examples.
［参考例］ 天然ゴムラテックス中のゴム粒子の粒度分布の測定
パラゴムノキから回収された天然ゴムラテックスを、リン酸バッファーで希釈し、この希釈溶液中の各ゴム粒子の粒子径を、粒度分布測定装置ＬＳ １３３２０（ベックマン・コールター社製）を用いて測定した。測定の結果得られたゴム粒子の粒度分布を図１に示す。
この粒度分布から、測定に供された天然ゴムラテックス中のゴム粒子の粒度分布には、少なくとも２つのピークがあり、天然ゴムラテックス中には様々な大きさのゴム粒子が存在していることが確認された。
[Reference Example] Measurement of particle size distribution of rubber particles in natural rubber latex Natural rubber latex recovered from para rubber tree is diluted with a phosphate buffer, and the particle size of each rubber particle in this diluted solution is measured by a particle size distribution measuring device. Measurement was performed using LS 13320 (manufactured by Beckman Coulter). The particle size distribution of the rubber particles obtained as a result of the measurement is shown in FIG.
From this particle size distribution, there are at least two peaks in the particle size distribution of the rubber particles in the natural rubber latex subjected to the measurement, and rubber particles of various sizes are present in the natural rubber latex. confirmed.
［実験例１］
参考例で用いた天然ゴムラテックスの希釈溶液に、抗ＳＲＰＰ抗体を添加し、室温で１時間インキュベーションした後、金粒子を結合させた金粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、さらに室温で１時間インキュベーションすることにより、金粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体−抗ＳＲＰＰ抗体−ゴム粒子複合体を形成した。なお、抗ＳＲＰＰ抗体は、大腸菌発現系で発現させた配列番号３のアミノ酸配列を有する組み換えタンパク質を、エピトープとしてマウスに免疫して作製されたポリクローナル抗体（免疫はタカラバイオ社に外注。）を、金粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体は、British biocell international社のgoat anti-mouse IgG(H and L)（Code No; EM.GMHL20）を用いた。インキュベーション後の溶液中のゴム粒子を、電子顕微鏡を用いて観察した。図２の（ａ）及び（ｂ）は、金粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体−抗ＳＲＰＰ抗体−ゴム粒子複合体の電子顕微鏡像である。この結果、抗ＳＲＰＰ抗体は、比較的粒子径の小さいゴム粒子に多く結合していることが確認された。
一方、抗ＳＲＰＰ抗体に換えて、抗ＲＥＦ抗体を用いた以外は、同様にして、金粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体−抗ＲＥＦ抗体−ゴム粒子複合体を形成した。なお、抗ＲＥＦ抗体は、大腸菌発現系で発現させた配列番号４のアミノ酸配列を有する組み換えタンパク質を、エピトープとしてマウスに免疫して作製されたポリクローナル抗体（免疫はタカラバイオ社に外注。）を用いた。インキュベーション後の溶液中のゴム粒子を、電子顕微鏡を用いて観察した。図２の（ｃ）及び（ｄ）は、金粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体−抗ＲＥＦ抗体−ゴム粒子複合体の電子顕微鏡像である。この結果、抗ＳＲＰＰ抗体とは逆に、抗ＲＥＦ抗体は、比較的粒子径の大きいゴム粒子に多く結合していることが確認された。
図３は、取得された電子顕微鏡像を画像解析処理により二値化し、結合している金粒子の数と、ゴム粒子の粒子径の大きさとの関係を示した図である。これらの結果からも、抗ＳＲＰＰ抗体は、比較的粒子径の小さいゴム粒子に多く結合しており、抗ＲＥＦ抗体は、比較的粒子径の大きいゴム粒子に多く結合していることが明らかである。
[Experimental Example 1]
Anti-SRPP antibody is added to the diluted natural rubber latex solution used in the reference example, and incubated at room temperature for 1 hour, followed by addition of gold particle-labeled anti-mouse IgG antibody to which gold particles are bound, and further at room temperature for 1 hour. By incubation, a gold particle-labeled anti-mouse IgG antibody-anti-SRPP antibody-rubber particle complex was formed. The anti-SRPP antibody is a polyclonal antibody prepared by immunizing a mouse with a recombinant protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 expressed in an E. coli expression system (immunization is outsourced to Takara Bio Inc.). As the gold particle-labeled anti-mouse IgG antibody, goat anti-mouse IgG (H and L) (Code No; EM.GMHL20) manufactured by British biocell international was used. The rubber particles in the solution after the incubation were observed using an electron microscope. 2A and 2B are electron microscopic images of a gold particle-labeled anti-mouse IgG antibody-anti-SRPP antibody-rubber particle complex. As a result, it was confirmed that many anti-SRPP antibodies were bound to rubber particles having a relatively small particle size.
On the other hand, a gold particle-labeled anti-mouse IgG antibody-anti-REF antibody-rubber particle complex was formed in the same manner except that an anti-REF antibody was used instead of the anti-SRPP antibody. As the anti-REF antibody, a polyclonal antibody prepared by immunizing a mouse with a recombinant protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 expressed in an E. coli expression system as an epitope (externally immunized by Takara Bio Inc.) is used. It was. The rubber particles in the solution after the incubation were observed using an electron microscope. (C) and (d) of FIG. 2 are electron microscopic images of a gold particle-labeled anti-mouse IgG antibody-anti-REF antibody-rubber particle complex. As a result, contrary to the anti-SRPP antibody, it was confirmed that the anti-REF antibody was bound to a large amount of rubber particles having a relatively large particle size.
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the number of gold particles bonded and the size of the particle diameter of rubber particles by binarizing the acquired electron microscope image by image analysis processing. From these results, it is clear that the anti-SRPP antibody is bound to a large amount of rubber particles having a relatively small particle size, and the anti-REF antibody is bound to a large amount of rubber particles having a relatively large particle size. .
これらの結果から、天然ゴムラテックス中のゴム粒子においては、粒子径の大きさに依存して、ゴム粒子の表面に存在しているタンパク質の種類が異なること、特に、ＳＲＰＰは、比較的粒子径の小さいゴム粒子に多くしており、一方、ＲＥＦは、比較的粒子径の大きいゴム粒子に多く存在していることが明らかになった。
また、粒子の大きさにより、粒子表面に局在するタンパク質が異なるということから、天然ゴムラテックス中のゴム粒子においては、小さいゴム粒子が生長して大きなゴム粒子となるのではなく、小さいゴム粒子と大きなゴム粒子とでは、生成起源が異なり、異なる合成経路により生成されていることが示唆される。
From these results, in rubber particles in natural rubber latex, depending on the size of the particle diameter, the types of proteins present on the surface of the rubber particles are different. In particular, SRPP has a relatively small particle diameter. On the other hand, it was clarified that REF is present in a large amount in rubber particles having a relatively large particle diameter.
In addition, because the protein localized on the particle surface varies depending on the size of the particle, in rubber particles in natural rubber latex, small rubber particles do not grow into large rubber particles, but small rubber particles. It is suggested that the origin of production is different between large rubber particles and large rubber particles, and they are produced by different synthetic routes.
本発明のゴム粒子の分取方法を用いることにより、天然ゴムラテックスから、粒子径に応じてゴム粒子を分取し、所望の大きさのゴム粒子の含有量が高い天然ゴムラテックスを調製することができるため、天然ゴムの生産及び製造の分野で特に有用である。 By using the method for separating rubber particles of the present invention, the rubber particles are separated from the natural rubber latex according to the particle diameter to prepare a natural rubber latex having a high content of rubber particles of a desired size. And is particularly useful in the field of natural rubber production and manufacture.
Claims (7)
天然ゴムラテックスに、ゴム粒子の表面タンパク質と特異的に結合する検出用抗体を添加し、当該検出用抗体とゴム粒子とが結合した複合体を形成した後、当該複合体を分取することを特徴とする、ゴム粒子の分取方法。 A method of separating rubber particles in natural rubber latex based on size,
After adding a detection antibody that specifically binds to the surface protein of rubber particles to natural rubber latex, forming a complex in which the detection antibody and rubber particles are bound, separating the complex A method for separating rubber particles.
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