JP2010158217A - マイクロインジェクション装置および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 複数の細胞への導入物質の導入を同時に行うことのできる処理効率向上の可能なマイクロインジェクション装置を提供する。
【解決手段】 このマイクロインジェクション装置は、内部に導入物質の充填された微小な注入針１１を被導入体に挿入することにより、被導入体内に導入物質を導入するものである。容器位置調整手段１、撮像手段２、位置判定手段３、および複数の搬送手段４を備える。容器位置調整手段１は、被導入体の収容された容器１２の位置を調整する。撮像手段２は、容器位置調整手段１により位置調整された容器１２の内部の画像を、レンズ２ａを通して撮像する。位置判定手段３は、撮像手段２によって得られた画像から被導入体の位置を判定する。複数の搬送手段４は、位置判定手段３によって得られた位置情報に応じて複数の注入針１１を、各注入針１１ごとに個別に移動させる。
【選択図】 図１

Description

この発明は、細胞等の被導入体内に遺伝子制御因子等の導入物質を微小な注入針により導入するマイクロインジェクション装置および方法に関する。

細胞内へ遺伝子制御因子等の所望の物質を導入する代表的な方法として、電気的な方式であるエレクトロポレーション法、化学的な方式であるリポフェクション法、生物的な方式であるベクター法、機械的な方式であるマイクロインジェクション法、光学的な方式であるレーザインジェクション法などがある。

このうち、電気的方式であるエレクトロポレーション法は、大電流によって細胞膜を破るため細胞の損傷が大きい。また、化学的方式であるリポフェクション法の場合は、導入物質として導入できる遺伝子制御因子に制限があり、導入効率が低い。生物的方式であるベクター法の場合も導入できる遺伝子制御因子に制限があり、また安全性について問題がある。これに対して、機械的方式であるマイクロインジェクション法の場合は、インジェクション位置を高精度で制御することで、細胞内に導入物質を確実に導入できるという特長がある。このマイクロインジェクション法の一例として、キャピラリー（微小な注入針）を用いて細胞内に導入物質を導入する方法が提案されている（特許文献１）。

マイクロインジェクション法の処理効率を高くする手法として、多数の注入針を規則的に配列したマイクロキャピラリーアレイと、このアレイの各注入針に対応した位置に細胞を固定する複数のマイクロチャンバーを配列してなるマイクロチャンバーアレイとを対向させて、複数の細胞に遺伝子制御因子を一括注入する方法も提案されている（特許文献２）。

図１０に、マイクロインジェクション法を適用した装置の従来例を示す。このマイクロインジェクション装置では、被導入体である細胞を収容したシャーレ５０を容器載置台５１で把持し、シャーレ５０の内部の局部平面画像を撮像手段５２で撮像し、その平面画像を画像処理手段５３で処理することにより、細胞の位置情報を得る。この容器載置台５１を、ＸＹステージ装置からなる水平２軸方向の容器位置調整手段５４によって移動させることで、注入針５５の注入方向に細胞が位置するように細胞の位置決めを行う。次に、注入針５５を保持したマニピュレータを、Ｚステージ装置５６を有する注入針搬送手段５７によって注入針５５の注入方向に移動させる。このように、位置決めされた細胞に対して注入針５５を突き刺し、注入針５５の内部に充填された導入物質を細胞に導入する。これらの一連の動作は、制御装置５８の制御により自動的に行なわれる。注入針搬送手段５７には、超音波モータやボールねじが使用される。

特許第２６２４７１９号公報 特許第３０３５６０８号公報

細胞内にＤＮＡやタンパク質等の遺伝子制御因子を導入する方法として、上記した各方法が挙げられるが、確実性と効率性を両立させた技術は未だ確立されていない。これらの各方法の中でも、細胞の一つ一つに遺伝子制御因子を導入するマイクロインジェクション法は最も確実な方法であるが、その操作には熟練と時間を要し、そのため処理効率が低いという問題がある。

特許文献２に開示のマイクロキャピラリーアレイ方式のように複数の細胞に対する注入針の位置制御を一括して行う方法では、各細胞の形状、大きさ、弾力性が異なることから、多くの細胞に対して注入針が刺さらないか、或いは、多くの細胞を破壊するといった結果になっている。また、マイクロキャピラリーアレイ方式では、細胞をマイクロキャピラリーアレイの各注入針と同位置に配列する必要があるため、培養液内で移動可能な浮遊細胞に適用できるのみで、培地やシャーレの底に付着した細胞には適用することができない。

そこで、マイクロインジェクション法を適用する装置では、これまで、その処理効率向上のために、細胞へ導入物質を注入する注入速度の向上や、マニピュレータの位置決め速度の向上が図られている。現在のマイクロインジェクション装置では、１秒以下で１個の細胞の注入処理を実現したものがある。

しかし、医療用途の要求では、細胞への導入物質の種類を問わないこと、導入効率が高いこと、および物質導入細胞を大量に供給できることが要求され、特に重要な物質導入細胞を大量に供給できる要求は現状では満たすことができない。
また、複数の注入針を使用したくても、現状では注入針を装備したマニピュレータの寸法が大きいため、マニピュレータを複数配置できないといった問題がある。

また、例えば図１０と共に前述したような現在のマイクロインジェクション装置では、細胞を位置決めするために細胞を収容したシャーレ５０を支持する容器位置調整手段５４を移動させ、注入針５５を装備したマニピュレータを、細胞に注入針５５を刺入する方向にのみ移動させるため、複数の細胞を位置決めして各細胞に注入針を同時に刺入することができなかった。

この発明の目的は、細胞等の被導入体への導入物質の導入を、複数の注入針で効率良く確実に行うことができて、処理効率の向上が可能なマイクロインジェクション装置を提供することである。
この発明の他の目的は、複数の被導入体に対して複数の注入針の先端の位置決めを同時に行うことができ、より一層の処理効率の向上を可能とすることである。

この発明のマイクロインジェクション装置は、内部に導入物質の充填された微小な注入針を被導入体に挿入することにより、被導入体内に導入物質を導入するマイクロインジェクション装置であって、前記被導入体の収容された容器の位置を調整する容器位置調整手段と、この容器位置調整手段で位置調整された容器の内部の被導入体に対して複数の注入針をそれぞれ個別に移動可能に移動させる複数の搬送手段と、前記容器位置調整手段により位置調整された前記容器の内部の画像を拡大用のレンズを通して撮像する撮像手段と、この撮像手段によって得られた画像から被導入体の位置を判定する位置判定手段と、この位置判定手段によって得られた位置情報に応じて前記各搬送手段に注入針の移動を行わせる制御手段とを備えることを特徴とする。

この構成によると、被導入体を収容した容器の位置を容器位置調整手段で調整し、位置調整された容器の内部の平面視画像を撮像手段で撮像し、その画像から細胞位置を位置判定手段で判定することで各注入針の担当する細胞等の被導入体を決定する。このとき、拡大用のレンズにより前記容器を局部的に拡大し、細胞等の被導入体の位置を画像処理することで、被導入体の位置を精度良く認識できる。また、例えば、認識した細胞等の被導入体の画像内での位置関係から、各搬送装置で担当する被導入体を決定することができる。このように各注入針の担当する被導入体を決定した後、各注入針を個別の複数の搬送手段で移動させて各被導入体に注入針をそれぞれ挿入することにより、各被導入体に導入物質を導入する。このため、細胞等の複数の被導入体への導入物質の導入を同時に行うことができ、インジェクション処理の効率向上が可能となる。また、少なくとも2種類以上の種類の異なる注入物質を注入針毎に充填しておき、同じ被導入体に順次導入することにより、被導入体に複数種の導入物質のあらかた同時導入が可能となる。よって、注入針の注入物質の入れ替えなく複数種の導入物質の導入ができ、インジェクション処理の効率向上が可能となる。

この発明において、前記複数の搬送手段が、前記容器の周囲に放射状に配置されたものであっても良い。この発明のマイクロインジェクション装置は、各注入針の位置決めを個々の搬送手段によって行うようにしたため、上記のような複数の搬送手段の容器周囲への放射状の配置が可能になる。このように、注入針を位置決めする複数の搬送手段を放射状に配置した場合、容器の周囲の限られたスペースに多数の搬送手段を配置でき、それだけ多数の注入針を使用することができてインジェクション処理の、より一層の効率向上が可能となる。

この発明において、前記制御手段は、前記位置判定手段によって得られた位置情報により前記容器内の複数の被導入体の位置を認識し、前記複数の搬送手段を並行して動作させて、複数の注入針を各被導入体にそれぞれ挿入させる構成としても良い。
個々の注入針を動作させる複数の搬送手段を並行して動作させてインジェクション動作を行うことで、インジェクション処理の効率がより向上する。複数の搬送手段を並行動作させるが、複数の注入針を共通の搬送手段で位置決めするものと異なり、個々の搬送手段は独立して位置決め可能であるため、複数の細胞等の被導入体への適切な位置決めを可能として、確実な注入を可能としながら、インジェクション処理の効率の向上が可能となる。

この発明において、前記制御手段は、前記位置判定手段によって得られた位置情報により前記容器内の被導入体の位置を認識し、前記複数の搬送手段を順次動作させて、複数の注入針を同じ被導入体に順次挿入させる構成としても良い。
この構成の場合、複数種の導入物質を複数の注入針でそれぞれ注入するインジェクション処理につき、効率の向上が可能となる。

この発明において、前記搬送手段は、少なくとも２自由度の、各自由度ごとの移動機構を持つものとしても良い。搬送手段が少なくとも２自由度以上の移動機構を持つものとすれば、１つの搬送手段により注入針の先端の適切な位置決めが可能となる。各搬送手段が２自由度以上の移動機構を持つことで、各注入針の先端の位置決めが、前記搬送手段の単体で可能となる。

上記のように少なくとも２自由度の移動機構を持つ構成とした場合に、前記搬送手段の各自由度の移動機構のうち、少なくとも１つの自由度の移動機構の駆動源として圧電素子を用いても良い。駆動源として圧電素子を用いることで、搬送手段の小型化が可能となる。このように搬送手段が小型化されることで、細胞等の被導入体の入った容器の周辺の限られたスペースに複数の搬送装置を配置することが実現可能となる。また、圧電素子は、電気エネルギから機械エネルギに変換する変換効率が高く、印加する電圧を変えることにより、発生する変位を比較的簡単に可変することがき、制御性に優れた特長がある。そのため、注入針の挿入動作の制御性が優れたものとなる。

上記のように移動機構の駆動源に圧電素子を用いた場合は、その移動機構は、前記圧電素子の変位を拡大する拡大機構を有するものとしても良い。
注入針の先端が、撮像手段で撮像された容器内の画像における所定視野内の全域を移動可能にするためには、搬送手段による注入針の移動距離は、例えば１ｍｍ以上であることが望ましい。圧電素子の変位を拡大機構で拡大すれば、圧電素子を駆動源として用いても、注入針の移動距離を十分確保することができる。

この発明において、前記各搬送手段を、注入針の先端が被導入体の近接する注入準備位置と退避位置との間で進退させる搬送手段退避機構を設けても良い。
注入針の先端を常に被導入体に近接する注入準備位置に位置させておいても良いが、その場合、被導入体の収容された容器を交換するときに注入針が障害となり、容器の交換が困難となる。前記搬送手段退避機構を設けることで、容器の交換が容易に行える。また、各搬送手段の移動範囲を広げることで注入針を容器から退避させるものと異なり、搬送手段は撮像手段の視野内等の小さな範囲で移動可能なもので足り、搬送手段の小型化を図りながら、容器からの注入針の退避が行える。

この発明において、前記被導入体が細胞であり、前記導入物質が遺伝子制御因子であっても良い。遺伝子制御因子は例えばＤＮＡやタンパク質である。被導入体が細胞であり、導入物質が遺伝子制御因子である場合に、この発明における、複数の被導入体への導入物質の導入を同時に行うことができることなどによる処理効率向上するという効果が、より効果的に発揮される。

この発明のマイクロインジェクション方法は、内部に導入物質の充填された微小な注入針を被導入体に突き刺すことにより、被導入体内に導入物質を導入する方法であって、前記被導入体の収容された容器の位置を調整する容器位置調整過程と、この容器位置調整過程により位置調整された前記容器の内部の平面視画像をレンズを通して撮像する撮像過程と、この撮像過程によって得られた画像から被導入体の位置を判定する位置判定過程と、この位置判定過程によって得られた位置情報に応じて複数の注入針を、複数の搬送手段で各注入針ごとに個別に移動させる過程とを含むことを特徴とする。
この発明方法によると、この発明装置につき説明したと同様に、細胞等の複数の被導入体への導入物質の導入を同時に行うことや、同じ被導入体に複数の被導入体で順次導入を行うことができ、インジェクション処理の効率向上が可能となる。

この発明のマイクロインジェクション装置は、内部に導入物質の充填された微小な注入針を被導入体に挿入することにより、被導入体内に導入物質を導入する装置であって、前記被導入体の収容された容器の位置を調整する容器位置調整手段と、この容器位置調整手段で位置調整された容器の内部の被導入体に対して複数の注入針をそれぞれ個別に移動可能に移動させる複数の搬送手段と、前記容器位置調整手段により位置調整された前記容器の内部の画像を拡大用のレンズを通して撮像する撮像手段と、この撮像手段によって得られた画像から被導入体の位置を判定する位置判定手段と、この位置判定手段によって得られた位置情報に応じて前記各搬送手段に注入針の移動を行わせる制御手段とを備えるため、細胞等の被導入体への導入物質の導入を、複数の注入針で効率良く確実に行うことができる。
この発明のマイクロインジェクション方法は、内部に導入物質の充填された微小な注入針を被導入体に突き刺すことにより、被導入体内に導入物質を導入する方法であって、前記被導入体の収容された容器の位置を調整する容器位置調整過程と、この容器位置調整過程により位置調整された前記容器の内部の平面視画像をレンズを通して撮像する撮像過程と、この撮像過程によって得られた画像から被導入体の位置を判定する位置判定過程と、この位置判定過程によって得られた位置情報に応じて複数の注入針を、複数の搬送手段で各注入針ごとに個別に移動させる過程とを含む方法であるため、細胞等の被導入体への導入物質の導入を、複数の注入針で効率良く確実に行うことができる。

この発明の一実施形態にかかるマイクロインジェクション装置の概念図である。 同マイクロインジェクション装置における搬送手段の配置構成を示す平面図である。 同マイクロインジェクション装置における１つの搬送手段および搬送手段退避機構の組み合わせ体の斜視図である。 同搬送手段におけるＺ軸移動機構の縦断面図である。 同搬送手段におけるＹ軸移動機構の水平断面図である。 同搬送手段におけるＸ軸移動機構の水平断面図である。 マイクロインジェクション装置における容器載置台の斜視図である。 浮遊細胞の固定に用いられる細胞吸着基板ユニットの一例の断面図である。 容器位置調整調整手段におけるＸＹステージ装置の平面図である。 従来例の概念図である。

この発明の一実施形態を図１ないし図８と共に説明する。図１は、このマイクロインジェクション装置の概念図を示す。このマイクロインジェクション装置は、内部に導入物質の充填された微小な注入針１１を被導入体に挿入することにより、被導入体内に導入物質を導入する装置である。被導入体は、例えば細胞である。この細胞は、人体の細胞であっても、他の任意の動物や植物等の生物の細胞であっても良い。
このマイクロインジェクション装置は、容器位置調整手段１と、複数の注入針１１に対して個別に設けたマニピュレータである複数の搬送手段４と、この搬送手段４を注入準備位置と退避位置との間で進退させる搬送手段退避機構３３と、撮像手段２と、装置全体の動作を制御する制御装置５とを備える。制御装置５は、位置判定手段３と、担当被導入体決定部５１と、注入動作制御部５２とを有している。

容器位置調整手段１は、被導入体を収容するシャーレ等の容器１２が載置状態に保持された容器載置台１３を水平な直交２軸方向に移動させて容器１２の位置を調整する手段であり、ＸＹステージ装置６により構成される。ＸＹステージ装置６は、例えば図９に平面図で示すように、基台６１にガイド６２を介してＹ軸方向に移動自在に設置された下側可動台６３と、この下側可動台６３上のガイド６４を介してＸ軸方向に移動自在に設置された上側可動台６５と、上記下側可動台６３および上側可動台６５を可動方向に進退させる各軸の可動台駆動機構６６，６７とで構成される。可動台駆動機構６６，６７は、リニアモータであっても、モータとボールねじ等の回転・直線運動変換機構とでなるものであっても良い。上側可動台６５に、図１の上記容器載置台１３が設置され、または上側可動台６５自体が、上記容器載置台１３となる。
なお、この明細書でいうＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸は、マイクロインジェクション装置の全体における共通の座標系として定められる直角座標の各軸を表すものではなく、それぞれ個別の装置説明での各自由度に対する軸として表される。

撮像手段２（図１）は、容器載置台１３の上方の所定位置に、シャーレ等からなる容器１２を俯瞰するように１台だけ設置される。撮像手段２は、容器１２の内部を局部的に拡大した平面視画像等の画像を、拡大用のレンズ２ａを通して撮像するカメラなどであり、その画像は画像処理手段７によって処理される。

位置判定手段３は、前記撮像手段２によって得られた画像から被導入体の位置を判定する手段であり、例えば前記制御装置５の一部として含まれる。位置判定手段３は、画像処理手段７による画像処理結果を、適宜設定された設定基準と照合することなどで、被導入体の位置を判定する。例えば、位置判定手段３は、全体画像内での各被導入体の位置関係から、各被導入体の位置を判定する。

搬送手段４は、個々の注入針１１をそれぞれ移動させるＸＹＺステージ装置等からなる手段であり、複数設けられる。これら複数の搬送手段４は、図２に平面図で示すように、容器載置台１３の上方に位置して、容器１２を囲むように、容器１２の中心に対して略放射状に配置される。同図の例では、搬送手段４は、容器１２の左右にそれぞれ複数個（例えば３個）ずつが等角度間隔で配置され、左右の搬送手段４は、互いに放射中心に対して同一直線上に対向して位置している。

図３は、１つの搬送手段４と、その搬送手段４を支持する搬送手段退避機構３３とでなる退避機構付き搬送手段の全体構成の斜視図を示す。搬送手段４は３自由度を有する。そのうちの１自由度を担う移動機構は、容器載置台１３に対して水平方向の直交する２方向（Ｘ軸方向，Ｙ軸方向）のうち一方向（Ｘ軸方向）に注入針１１を移動させるＸ軸移動機構１４である。他の１つの自由度を担う移動機構は、水平方向の直交する２方向のうちの他の一方向（Ｙ軸方向）に注入針１１を移動させるＹ軸移動機構１５である。さらに他の１つの自由度を担う移動機構は、容器１２の内部に向けて傾斜する方向となる注入針中心軸方向に注入針１１を移動させるＺ軸移動機構１６である。

Ｚ軸移動機構１６は、図４に縦断面図で示すように、中空箱形の固定台１７と、この固定台１７の一端部において、その上面開口を通って、固定台１７内から上方に突出するように設けられた針支持部材１８と、固定台１７内に配置され駆動源となる圧電素子ユニット１９Ａとを備える。
針支持部材１８は、注入針１１を着脱自在に支持可能な構成であり、注入針１１の損傷や導入物質の交換等のために、注入針１１を簡単に交換することができる。針支持部材１８は、立片部１８ａおよび横片部１８ｂを有する概形が横向きＴ字状である。針支持部材１８は、その立片部１８ａの上端で注入針１１を着脱自在に支持し、横片部１８ｂが案内機構２１を介して固定台１７の上に注入針１１の突出方向に移動自在に支持される。針支持部材１８の立片部１８ａの下側部分は、固定台１７の一端部の内壁面に板ばね等からなるばね部材２０を介して支持されている。
圧電素子ユニット１９Ａは、複数の圧電素子１９Ａａを、それらの変位方向に重ねて棒状体としたものである。図では一部の圧電素子１９Ａａのみを図示している。圧電素子ユニット１９Ａは、その一端が針支持部材１８の立片部１８ａに連結され、他端が固定台１７の他端部に支持されている。前記ばね部材２０は、圧電素子ユニット１９Ａに予圧を与える部材である。これにより、圧電素子ユニット１９Ａの長手方向への変位で、針支持部材１８が注入針１１の突出方向に進退可能である。

このＺ軸移動機構１６には、固定台１７と針支持部材１８との相対変位を測定するための図示しないセンサが内蔵される。このセンサとしては、圧電素子ユニット１９Ａに予圧を与えるばね部材２０の歪みを検出する歪みセンサや、固定台１７と針支持部材１８とのギャップを測定する静電容量センサ、磁気センサ、光学式センサなどを用いることができる。

図３に示すように、Ｚ軸移動機構１６は、注入針１１の注入角度が下向きに傾斜した所定角度となるように、上側可動支持体２２の一端部の傾斜取付台部２２ａに固定されている。なお、Ｚ軸移動機構１６は、上側可動支持体２２に対して注入針１１の注入角度を自在に変更する角度可変機構（図示せず）を有するものとしても良い。上側可動支持体２２は、一辺が開放された矩形枠状とされている。上側可動支持体２２は、平板状の下側可動支持体２３上に、左右一対の案内機構２４を介して水平方向の一方向（Ｙ軸方向）に移動自在に支持されている。下側可動支持体２３の上には、前記Ｙ軸移動機構１５が設置されている。下側可動支持体２３は、その下に配置された平板状の搬送手段基台２８の上に、案内機構２９を介してＸ軸方向に移動自在に支持されている。この搬送手段基台２８の下側に前記Ｘ軸移動機構１４が設置されている。

Ｙ軸移動機構１５を、図５に水平断面図で示す。Ｙ軸移動機構１５は、固定台２５と、可動片２６と、駆動源となる圧電素子ユニット１９Ｂとを備える。固定台２５は、Ｘ軸方向に延びる主枠部２５ａと、この主枠部２５ａの両端から幅方向（Ｙ軸方向）に延びる一対の側枠部２５ｂ，２５ｃとを有し、水平断面がＵ字状とされている。可動片２６は、固定台２５と一体に形成され、固定台２５の一端の側枠部２５ｂから他端の側枠部２５ｃ側へ延びている。可動片２６は、圧電素子ユニット１９Ｂの変位を拡大する拡大機構となるものであって、固定台２５と共に、金属や合成樹脂等の弾性材で形成されている。可動片２６は、固定台２５の一端の側枠部２５ｂから主枠部２５ａと略平行に延びる主枠平行片部２６ａと、この主枠平行片部２６ａの他端から固定台２５の他端の側枠部２５ｃの内側に位置する側枠平行片部２６ｂとでなる。側枠平行片部２６ｂは、側枠部２５ｃと平行に延びる。固定台２５の側枠部２５ｂと可動片２６の主枠平行片部２６ａとの接続部、および可動片２６の主枠平行片部２６ａと側枠平行片部２６ｂとの接続部は薄肉部２６ｃとされている。また、可動片２６の主枠平行片部２６ａの長手方向中間部も薄肉部２６ｄとされている。これにより、可動片２６の側枠平行片部２６ｂは、その基端の薄肉部２６ｃを揺動中心に揺動可能とされる。また、可動片２６の主枠平行片部２６ａは、その長手方向中間部の薄肉部２６ｄで折れ曲がっていて、その折れ曲がり角度の増減により、長手方向と直交する方向（Ｙ軸方向）に、中間部が進退可能とされる。

固定台２５の他端の側枠部２５ｃと、可動片２６の側枠平行片部２６ｂとの間には、圧電素子ユニット１９Ｂに予圧を与える板ばね等のばね部材２７が介在している。圧電素子ユニット１９Ｂは、上記圧電素子ユニット１９Ａと同様な積層構造の棒状とされている。圧電素子ユニット１９Ｂは、その一端が可動片２６の側枠平行片部２６ｂに連結され、他端が固定台２５の側枠部２５ｂに支持されている。これにより、圧電素子ユニット１９Ｂの長手方向への変位で、可動片２６の側枠平行片部２６ｂが屈曲動作し、その屈曲変位が拡大されて主枠平行片部２６ａのＹ軸方向への変位となる。この変位は、Ｚ軸移動機構１６を支持する支持体２２（図３）に伝達され、これにより注入針１１がＹ軸方向に移動可能である。

Ｙ軸移動機構１５の場合も、固定台２５と可動片２６との相対変位を測定するための図示しないセンサが内蔵される。このセンサとしては、前記圧電素子ユニット１９Ｂに予圧を与えるばね部材２７の歪みを検出する歪みセンサや、固定台２５と可動片２６とのギャップを測定する静電容量センサ、磁気センサ、光学式センサ等を用いることができる。

図６にＸ軸移動機構１４を水平断面図で示す。Ｘ軸移動機構１４は、固定台２９と、可動片３０と、駆動源となる圧電素子ユニット１９Ｃとを備える。固定台２９は、Ｘ軸方向に延びる主枠部２９ａと、この主枠部２９ａの両端から幅方向に延びる一対の側枠部２９ｂ，２９ｃとを有し、水平断面がＵ字状とされている。可動片３０は、固定台２９と一体に形成されていて、固定台２９の一端の側枠部２９ｂから他端の側枠部２９ｃ側に向けて延びている。可動片３０は、圧電素子ユニット１９Ｃの変位を拡大する第１の拡大機構となるものであって、固定台２９と共に、金属や合成樹脂等の弾性材で形成されている。可動片３０は、固定台２９の一端の側枠部２９ｂから主枠部２９ａと略平行に延びる主枠平行片部３０ａと、この主枠平行片部３０ａの他端から固定台２９の他端の側枠平行片部３０ｂとでなり、水平断面がＬ字状とされている。側枠平行片部３０ｂは、側枠部２９ｃの内側に位置して側枠部２９ｃと平行に延びる。固定台２９の側枠部２９ｃと可動片３０の側枠平行片部３０ｂとの間には、圧電素子ユニット１９Ｃに予圧を与える板ばね等のばね部材３１が介在している。固定台２９の側枠部２９ｂと可動片３０の主枠平行片部３０ａとの接続部、および可動片３０の主枠平行片部３０ａと側枠平行片部３０ｂとの接続部は、いずれも薄肉部３０ｃとされている。また、可動片３０の主枠平行片部３０ａの長手方向中間部も薄肉部３０ｄとされている。これにより、可動片３０の側枠平行片部３０ｂは、その基端の薄肉部３０ｃを揺動中心に、屈曲して揺動可能とされる。また、可動片３０の主枠平行片部３０ａは、両端の薄肉部３０ｃを中心に屈曲揺動可能であると共に、その長手方向の中間部の薄肉部３０ｄで折れ曲がっていて、この薄肉部３０ｄで屈曲揺動が可能である。

また、可動片３０の主枠平行片部３０ａの長手方向中間部の薄肉部３０ｄよりも側枠平行片部３０ｂ寄りの略半部となる部分には、固定台２９の側枠部２９ｃ側に延びて側枠部２９ｃの基端近傍に連結される水平断面が逆Ｌ字状の可動枠部３２が一体形成されている。この可動枠部３２は圧電素子ユニット１９Ｃの変位を拡大する第２の拡大機構となるものであって、可動片３０の主枠平行片部３０ａと略平行な厚肉枠部３２ａと、この厚肉枠部３２ａから固定台２９の側枠部２９ｃの外側を側枠部２９ｃと平行に延びる薄肉枠部３２ｂとでなる。可動枠部３２の厚肉枠部３２ａと薄肉枠部３２ｂとの接続部、および薄肉枠部３２ｂと固定台２９の側枠部２９ｃの基端近傍との接続部は薄肉枠部３２ｂよりもさらに薄い薄肉部３２ｃとされている。また、薄肉枠部３２ｂの長手方向中間部も、さらに薄い薄肉部３２ｄとされている。これにより、可動枠部３２の薄枠肉部３０ｂは、その長手方向中間部の薄肉部３２ｄおよび両端の薄肉部３２ｃで折れ曲がって、中間部が長手方向と直交する方向（Ｘ軸方向）に進退可能とされている。

圧電素子ユニット１９Ｃは、前記圧電素子ユニット１９Ａと同様な棒状とされ、その一端が前記可動片３０の側枠平行片部３０ｂに連結され、他端が固定台２９の側枠部２９ｂに支持されている。これにより、圧電素子ユニット１９Ｃの長手方向への変位で、可動片３０の側枠平行片部３０ｂが揺動し、その揺動変位が拡大されて主枠平行片部３０ａのＹ軸方向への変位となる。この変位はさらに拡大されて可動枠部３２における薄枠肉部３２ｂのＸ軸方向への変位となる。このＸ軸方向への変位は、図３における下側可動支持体２３に伝達され、これにより注入針１１がＸ軸方向に移動可能である。

Ｘ軸移動機構１４の場合も、固定台２９と可動枠部３２との相対変位を測定するための図示しないセンサが内蔵される。このセンサとしては、前記圧電素子ユニット１９Ｃに予圧を与えるばね部材３１の歪みを検出する歪みセンサや、固定台２９と可動枠部３２とのギャップを測定する静電容量センサ、磁気センサ、光学式センサなどを用いることができる。

上記した各搬送手段４のＸ軸移動機構１４、Ｙ軸移動機構１５、およびＺ軸移動機構１６における駆動源としては、圧電素子ユニット１９Ａ，１９Ｂ，１９Ｃのほかに、モータおよびボールねじ、超音波モータ、リニアモータ、油圧アクチュエータ、空圧アクチュエータを用いても良い。また、注入針１１の先端が前記画像における所定視野内の全域を移動可能にするために、搬送手段４による注入針１１の移動距離は１ｍｍ以上であることが望ましい。前記所定視野の範囲は、任意に設定される。

図３において、搬送手段退避機構３３につき説明する。この搬送手段退避機構３３は、搬送手段４の搬送手段基台２８を支持する機構であり、基台３４と、断面Ｌ字状の水平移動台３６と、垂直移動台３８とでなる。水平移動台３６は、基台３４上に案内機構３５を介して水平方向の一方向（例えばＸ軸方向）に移動自在である。垂直移動台３８は、水平移動台３６の立板部３６ａに案内機構３７を介して垂直方向に移動自在に設けられており、この垂直移動台３８に前記搬送手段基台２８が支持されている。水平移動台３６および垂直移動台３８は、図示しない駆動源、例えば回転型のモータとボールねじとの組み合わせ、またはリニアモータ、流体圧アクチュエータ等により駆動される。これにより、図１における容器載置台１３上へ容器１２を着脱する際に、前記搬送手段退避機構３３の水平移動台３６および垂直移動台３７を駆動することで、注入針１１の各搬送手段４をインジェクション位置から退避させて、着脱の作業スペースを確保することができる。

図１において、制御装置５につき説明する。制御装置５は、このマイクロインジェクション装置の全体を制御する手段であって、マイクロコンピュータ，パーソナルコンピュータ等のコンピュータと、これに実行されるプログラムと、電子回路等によって構成される。制御装置５は、前記位置判定手段３の他に、搬送手段４の制御手段となる担当被導入体決定部５１と、注入動作制御部５２とを有している。

担当被導入体決定部５１は、位置判定手段３による各被導入体の位置の判定結果、例えば全体画像内での各被導入体の位置関係から、設定規則等に基づき、各注入針１１にどの被導入体への注入を行わせるかの担当の決定、およびその決定された被導入体のどの位置へ注入針１１を挿入するかの注入目標位置を決定する手段である。被導入体の担当については、特に「担当」として定めていなくても良く、各注入針１１の先端が移動する目標位置が決定されて、その結果として被導入体の担当が定まるようにしても良い。また、同じ被導入体に複数の注入針１１による注入を行わせるように上記目標位置を決定しても良い。

注入動作制御部５２は、担当被導入体決定部５１で決定された目標位置に注入針１１の先端が移動するように、各搬送手段４を制御する手段である。注入動作制御部５２は、各搬送手段４毎に、各軸の移動機構１４〜１６の駆動制御を行う搬送手段個別制御部５２ａを有している。注入動作制御部５２は、注入針１１に導入物質を吐出させる注入駆動手段（図示せず）を有している場合は、上記制御の他に、その注入駆動手段の制御手段（図示せず）が設けられる。また、注入動作制御部５２には、各搬送手段退避機構３３の制御を行う退避機構制御手段５３、および容器位置調整手段１の各軸の制御を行う容器位置調整制御手段５４を有している。

次に、上記構成のマイクロインジェクション装置によるインジェクション動作を説明する。
はじめに、容器位置調整手段１の駆動により、容器載置台１３が水平移動し、容器載置台１３上の容器１２が撮像手段２の下方の所定位置に位置決めされる。次に、撮像手段２が容器１２内の一部の局部的に拡大した平面視画像を、レンズ２ａを通して撮像する。その画像は画像処理手段７によって処理され、制御装置５の位置判定手段３が前記画像から容器１２内の被導入体である細胞の位置を判定する。

次に、位置判定手段３によって得られた各細胞の位置情報に応じて、担当被導入体決定部５１により、各注入針１１が注入を担当する細胞、およびその注入針１１の先端を細胞に挿入する目標位置が決定される。この決定に伴い、注入針１１を支持する各搬送手段４が、注入動作制御部５２の各搬送手段個別制御部５２ａにより制御される。この場合、注入動作制御部５２は、各搬送手段４の各注入針１１が干渉しないように動作させる。
これにより、例えば、各注入針１１による以下のインジェクション動作が並列して行なわれる。すなわち、インジェクション動作として、各注入針１１の水平方向および注入方向の位置決めが行なわれ、注入方向への注入針１１の移動で決定された細胞に注入針１１が挿入され、注入針１１の内部に充填された導入物質が細胞に導入される。この導入は、注入針１１から駆動によって導入物質を吐出させるようにしても良く、また浸透圧等によって浸透することで導入されるようにしても良い。これらの注入針１１による一連のインジェクション動作の全体は、制御装置５によって制御される。注入方向への注入針１１の移動では、細胞への円滑な挿入を可能にするため、往復移動として振動させることができる。また、細胞の種類に応じて、あるいは細胞膜への突き刺しや核膜への突き刺しに応じて、前記振動の周波数を変えることもできる。導入物質は例えばＤＮＡやタンパク質等の遺伝子制御因子である。

画像内の細胞へのインジェクション処理が終了した後、容器位置調整手段１の作動で容器載置台１３が所定量だけ水平移動することで、容器１２内の先の画像撮像位置に近接した別の位置での細胞位置が、撮像手段２による画像から位置判定手段３によって認識され、上記したインジェクション動作が繰り返される。

このように、上記構成のマイクロインジェクション装置によると、被導入体として例えば細胞を収容した容器である容器１２の位置を容器位置調整手段１で調整し、位置調整された容器１２の内部の平面視画像を撮像手段２で撮像し、その画像から細胞位置を位置判定手段３で判定することで各注入針１１の担当する細胞を決定し、各注入針１１を個別の複数の搬送手段４で移動させて各細胞に注入針１１をそれぞれ挿入することにより、各細胞に導入物質として例えば遺伝子制御因子を導入する。そのため、一度に複数の細胞へのインジェクション動作を並行して行うことができ、インジェクション処理の大幅な効率向上が可能となる。

また、このマイクロインジェクション装置は、図１０に示す従来例において、複数の注入針１１に対応した複数の搬送手段４を追加するだけで、インジェクション処理効率の高い構成とすることができる。

また、この実施形態では、各注入針１１を個別に移動させる複数の搬送手段４を、被導入体を収容する容器である容器１２の周囲に放射状に配置しているので、容器１２の周囲の限られたスペースに多数の搬送手段４を配置でき、それだけ多数の注入針１１を使用することができてインジェクション処理の、より一層の効率向上が可能となる。なお、搬送手段４のこのような配置は、個々の搬送手段４がそれぞれ単独で注入針１１の搬送動作を行なえることから可能となっている。

また、この実施形態では、注入針１１の搬送手段４として３自由度の移動機構、つまりＸ軸移動機構１４、Ｙ軸移動機構１５およびＺ軸移動機構１６を持つものとしているが、少なくとも２自由度の移動機構を持つものとすれば、１つの搬送手段により注入針１１の先端の位置決めが可能となる。

また、この実施形態では、搬送手段４のＸ軸移動機構１４、Ｙ軸移動機構１５およびＺ軸移動機構１６の駆動源として圧電素子ユニット１９Ａ，１９Ｂ，１９Ｃを用いているので、搬送手段４の小型化が可能であり、これによりインジェクション処理のさらなる効率向上が可能となる。圧電素子ユニット１９Ａ，１９Ｂ，１９Ｃは、電気エネルギから機械エネルギに変換する変換効率が高く、印加する電圧を変えることにより、発生する変位を比較的簡単に可変することがき、制御性に優れる特長がある。

ところで、前記被導入体となる細胞には、培地などに付着した付着細胞と培養液内を浮遊する浮遊細胞がある。付着細胞の場合は、上記した手順でインジェクション動作を行うことができる。図７および図８は、被導入体が浮遊細胞である場合に用いる細胞吸着基板ユニットの一構成例を示す。この細胞吸着基板ユニット４０は、上面が開放された箱体４１の開口を、複数の微細孔４３を有する細胞吸着基板４２で蓋閉めしてなり、箱体４１の一部には、箱体４１内から培養液を吸引するための吸引口４４が設けられている。細胞吸着基板４２は、インジェクションを行う細胞の大きさによって、その微細孔４３の孔径の異なるものを用意する。図１に示すマイクロインジェクション装置では、この細胞吸着基板ユニット４０を使用する場合のポンプ４５を装備した例を示している。このポンプ４５で細胞吸着基板ユニット４０の前記吸引口４２から培養液を吸引することで、浮遊細胞４６を細胞吸着基板４２の各微細孔４３に固定させることができる。ポンプ４５を制御する手段（図示せず）も、制御装置５に設けられている。

また、被導入体が浮遊細胞である場合において上述の前記細胞吸着基板ユニット４０を用いないインジェクション方法について示す。注入針１１の搬送手段４と同様の搬送手段を少なくとも２つ以上を組み合わせて、一方に注入針１１を支持させ、他方に細胞固定用のチューブを把持させ、浮遊細胞を前記チューブからの吸引で固定し、注入針１１でインジェクション動作を行う。この場合、細胞固定用のチューブ側の操作によって、細胞を容器である容器１２内の任意の位置に移動させることができる。つまり、細胞固定用のチューブを把持した搬送手段４の操作によって細胞を分別することが可能となる。

このマイクロインジェクション装置によると、複数の注入針１１の内部に充填された導入物質が全ての注入針１１で同じ物質である場合、インジェクション動作の速度を、従来と比較して注入針１１の本数倍に向上させることができる。
また、複数の注入針１１の内部に充填された導入物質が、注入針１１ごとに異なる物質である場合、同じ細胞に対して、複数の注入針１１が順次挿入されて注入する動作を行うように各搬送手段４を制御することで、１つの細胞に複数種類の導入物質を注入することが可能となる。注入動作制御部５２は、このように複数の搬送手段４を順次動作させるように制御するものとしても良い。

１…容器位置調整手段
２…撮像手段
３…位置判定手段
４…搬送手段
５…制御装置
１１…注入針
１２…容器
１４…Ｘ軸移動機構
１５…Ｙ軸移動機構
１６…Ｚ軸移動機構
１９Ａ〜１９Ｃ…圧電素子ユニット
２６…可動片（拡大機構）
３０…可動片（拡大機構）
３２…可動枠部（拡大機構）
３３…搬送手段退避機構
５０…制御手段
５１…担当被導入体決定部

Claims (10)

1. 内部に導入物質の充填された微小な注入針を被導入体に挿入することにより、被導入体内に導入物質を導入するマイクロインジェクション装置であって、
   前記被導入体の収容された容器の位置を調整する容器位置調整手段と、この容器位置調整手段で位置調整された容器の内部の被導入体に対して複数の注入針をそれぞれ個別に移動可能に移動させる複数の搬送手段と、前記容器位置調整手段により位置調整された前記容器の内部の画像を拡大用のレンズを通して撮像する撮像手段と、この撮像手段によって得られた画像から被導入体の位置を判定する位置判定手段と、この位置判定手段によって得られた位置情報に応じて前記各搬送手段に注入針の移動を行わせる制御手段とを備えることを特徴とするマイクロインジェクション装置。
2. 請求項１において、前記複数の搬送手段が、前記容器の周囲に放射状に配置されたマイクロインジェクション装置。
3. 請求項１または請求項２において、前記制御手段は、前記位置判定手段によって得られた位置情報により前記容器内の複数の被導入体の位置を認識し、前記複数の搬送手段を並行して動作させて、複数の注入針を各被導入体にそれぞれ挿入させるマイクロインジェクション装置。
4. 請求項１または請求項２において、前記制御手段は、前記位置判定手段によって得られた位置情報により前記容器内の被導入体の位置を認識し、前記複数の搬送手段を順次動作させて、複数の注入針を同じ被導入体に順次挿入させるマイクロインジェクション装置。
5. 請求項１ないし請求項４のいずれか１項において、前記搬送手段は、少なくとも２自由度の、各自由度ごとの移動機構を持つマイクロインジェクション装置。
6. 請求項５において、前記搬送手段の各自由度の移動機構のうち、少なくとも１つの自由度の移動機構の駆動源として圧電素子を用いたマイクロインジェクション装置。
7. 請求項６において、前記移動機構は、前記圧電素子の変位を拡大する拡大機構を有するマイクロインジェクション装置。
8. 請求項１ないし請求項７のいずれか１項において、前記各搬送手段を、注入針の先端が被導入体の近接する注入準備位置と退避位置との間で進退させる搬送手段退避機構を設けたマイクロインジェクション装置。
9. 請求項１ないし請求項８のいずれか１項において、前記被導入体が細胞であり、前記導入物質が遺伝子制御因子であるマイクロインジェクション装置。
10. 内部に導入物質の充填された微小な注入針を被導入体に突き刺すことにより、被導入体内に導入物質を導入するマイクロインジェクション方法であって、
    前記被導入体の収容された容器の位置を調整する容器位置調整過程と、この容器位置調整過程により位置調整された前記容器の内部の平面視画像をレンズを通して撮像する撮像過程と、この撮像過程によって得られた画像から被導入体の位置を判定する位置判定過程と、この位置判定過程によって得られた位置情報に応じて複数の注入針を、複数の搬送手段で各注入針ごとに個別に移動させる過程とを含む、
    ことを特徴とするマイクロインジェクション方法。

Images