JP2010156576A - Chromatography vehicle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体に関する。より詳細には、本発明は、被検出物質と特異的に結合する第一試薬が固定化された判定部位に、第四級アンモニウム塩が存在することを特徴とする、クロマトグラフ媒体及びクロマトグラフ媒体の製造方法に関する。さらに、本発明は、クロマトグラフ媒体を含有する測定キット及びクロマトグラフ媒体を用いた測定方法に関する。 The present invention relates to a chromatographic medium for immunochromatographic methods. More specifically, the present invention relates to a chromatographic medium and a chromatograph characterized in that a quaternary ammonium salt is present at a determination site where a first reagent that specifically binds to a substance to be detected is immobilized. The present invention relates to a method for manufacturing a medium. Furthermore, the present invention relates to a measurement kit containing a chromatographic medium and a measurement method using the chromatographic medium.
抗原とこれに対する抗体による特異的な結合反応を利用した、特定の抗原又は抗体からなる被検出物質を検出する免疫測定法が知られている。標識物質により標識化した抗体又は抗原を試料中の被検出物質に結合させ、被検出物質と複合体を形成した標識物質からのシグナルを測定することで高い感度が得られるため、免疫測定法は広く臨床検査の領域で利用されている。
このような免疫測定法の１つに、イムノクロマトグラフ法がある。免疫測定法では、一般に、被検出物質を、標識物質により標識化した抗体等と反応させた後、被検出物質と複合体を形成した標識物質を、被検出物質と結合していない標識物質から分離する工程が必要となる。イムノクロマトグラフ法は、この工程を、クロマトグラフィーの原理を応用して、固定相とそれに接して連続的に流れる移動相からなる系で行う点に特徴がある。
There is known an immunoassay method for detecting a substance to be detected comprising a specific antigen or antibody using a specific binding reaction between an antigen and an antibody thereto. Since the antibody or antigen labeled with a labeling substance is bound to the substance to be detected in the sample and the signal from the labeling substance that has formed a complex with the substance to be detected is measured, high sensitivity is obtained. Widely used in the field of clinical testing.
One such immunoassay method is an immunochromatographic method. In an immunoassay method, generally, after a substance to be detected is reacted with an antibody or the like labeled with a labeling substance, a labeling substance that forms a complex with the substance to be detected is removed from a labeling substance that is not bound to the substance to be detected. A separation step is required. The immunochromatography method is characterized in that this process is performed in a system composed of a stationary phase and a mobile phase that continuously flows in contact with the application of the principle of chromatography.
例えば、イムノクロマトグラフ法により、試料中の抗原からなる被検出物質を検出する場合には、以下のような操作が行われる。
（１）被検出物質である抗原に特異的に結合する抗体を第一試薬とし、この第一試薬をクロマトグラフ媒体の所定の部位に所定の形で塗布すること等により、クロマトグラフ媒体に判定部位を形成する。
（２）一方、被検出物質と特異的に結合する抗体を第二試薬とし、この第二試薬を酵素等の標識物質により標識、又は、当該第二試薬を不溶性担体等の標識物質に感作することにより、標識試薬を調製する。
（３）移動相を構成する展開液を、被検出物質を含む試料及び標識試薬と共に、固定相であるクロマトグラフ媒体上で展開する。
以上の操作により、試料中に被検出物質が存在する場合には、クロマトグラフ媒体に形成した判定部位において、被検出物質である抗原が、判定部位に固定した第一試薬である抗体と結合することにより捕捉されると共に、この抗原と、標識試薬を構成する抗体とによって抗原−抗体反応が生ずる結果、当該判定部位においては第一試薬（固定化された抗体）−被検出物質（抗原）−標識試薬（標識化された抗体）の三者のサンドイッチ型複合体が生成する。その結果、判定部位に間接的に標識物質が結合することによって所定のシグナルが現れ、これによって被検出物質の検出を行うことができる。
For example, the following operation is performed when detecting a substance to be detected comprising an antigen in a sample by immunochromatography.
(1) An antibody that specifically binds to an antigen, which is a substance to be detected, is used as a first reagent, and this first reagent is applied to a predetermined part of the chromatographic medium in a predetermined form, etc., and is thus determined as a chromatographic medium. Form a site.
(2) On the other hand, an antibody that specifically binds to the substance to be detected is used as a second reagent, and this second reagent is labeled with a labeling substance such as an enzyme, or the second reagent is sensitized to a labeling substance such as an insoluble carrier. By doing so, a labeling reagent is prepared.
(3) The developing solution constituting the mobile phase is developed on the chromatographic medium as the stationary phase together with the sample containing the detection target substance and the labeling reagent.
By the above operation, when a substance to be detected is present in the sample, the antigen that is the substance to be detected binds to the antibody that is the first reagent immobilized at the determination part at the determination part formed on the chromatographic medium. As a result of the antigen-antibody reaction caused by this antigen and the antibody constituting the labeling reagent, the first reagent (immobilized antibody) -detected substance (antigen)- A tripartite sandwich complex of labeling reagent (labeled antibody) is produced. As a result, a predetermined signal appears when the labeling substance indirectly binds to the determination site, and thus the detection target substance can be detected.
このようなイムノクロマトグラフ法は、特別な装置を必要とせず、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、臨床検査や研究室における測定試験等で広く利用されている。さらに、近年においては、その簡便な検出方法としての利用価値のみならず、より高感度で信頼性の高い測定データの取得が希求されるに至っている。 Such an immunochromatographic method does not require a special apparatus, is easy to operate, and can be measured in a short time. Therefore, the immunochromatographic method is widely used in clinical examinations and measurement tests in laboratories. Furthermore, in recent years, not only the utility value as a simple detection method but also the acquisition of measurement data with higher sensitivity and reliability has been demanded.
イムノクロマトグラフ法において高感度な測定を可能とするためには、測定により得られるシグナル／ノイズ比（以下、Ｓ／Ｎともいう）に着目し、それがより大きな値となるよう改良する必要がある。シグナルとは、試料中に被検出物質を含む陽性検体を測定した際に得られる測定値であり、ノイズとは、試料中に被検出物質を含まない陰性検体を測定した際に得られる測定値をいう。シグナル／ノイズ比を改良するためには、標識試薬が被検出物質を介して判定部位に結合することにより得られるシグナルを増強するとともに、標識試薬が被検出物質を介さずに判定部位に非特異的に吸着することによるノイズを抑制しなければならない。シグナルが小さいことにより十分なシグナル／ノイズ比が得られない場合には、特に低濃度の被検出物質が検出できないという問題があり、ノイズが大きいことによりシグナル／ノイズ比が小さくなっている場合には、目的とする被検出物質が存在しないにも関わらず陽性と判定してしまうおそれを生じ、測定系の信頼性が著しく損なわれるからである。しかし、イムノクロマトグラフ法による免疫測定においては、高感度で信頼性の高い測定系の開発が求められているにも関わらず、シグナルを増強しつつノイズを低下させることが可能な簡便な手段は提供されておらず、現在の測定系が示すシグナル／ノイズ比は実用上必ずしも満足できるものではなかった。 In order to enable highly sensitive measurement in the immunochromatography method, it is necessary to pay attention to the signal / noise ratio (hereinafter also referred to as S / N) obtained by the measurement and improve it so that it becomes a larger value. . The signal is a measurement value obtained when measuring a positive sample containing a detected substance in the sample, and the noise is a measurement value obtained when measuring a negative sample not containing the detected substance in the sample. Say. In order to improve the signal / noise ratio, the labeling reagent enhances the signal obtained by binding to the determination site via the detected substance, and the labeling reagent is not specific to the determination site without passing through the detected substance. Noise due to mechanical adsorption must be suppressed. When a sufficient signal / noise ratio cannot be obtained due to a small signal, there is a problem that a low-concentration target substance cannot be detected, especially when the signal / noise ratio is small due to a large noise. This is because there is a possibility that the target substance to be detected is determined to be positive even though the target substance to be detected does not exist, and the reliability of the measurement system is significantly impaired. However, in immunoassay by immunochromatography, there is a need for the development of a highly sensitive and reliable measurement system, but a simple means that can reduce noise while enhancing the signal is provided. The signal / noise ratio exhibited by the current measurement system was not always satisfactory in practice.
イムノクロマトグラフ法において、測定系のシグナル／ノイズ比をより大きな値に改良しようという試みは、主にノイズの低下という点に着目して行われてきた。クロマトグラフ媒体に設けられた判定部位にノイズが観測される原因の一つとしては、標識試薬が被検出物質を介さずに直接、又は被検出物質以外の何らかの因子（非特異因子）を介して判定部位に非特異的に結合することが挙げられる。このようにして生じるノイズを低下させる手段としては、ブロッキング剤の使用が広く知られている（例えば、特許文献１参照）。この技術では、クロマトグラフ媒体に被検出物質と特異的に結合する第一試薬を固定化して判定部位を形成した後、クロマトグラフ媒体全体を、ブロッキング剤を含む緩衝液に浸漬し、さらに乾燥させることにより、クロマトグラフ媒体の製造を行う。ブロッキング剤を用いて判定部位を予め被覆してしまうことにより、標識試薬や非特異因子の非特異的な吸着を防止し、ノイズの発生を抑制するものである。
このようなブロッキング剤の使用は、陰性検体測定時に観察されるノイズを低下させる点で一応の効果は認められるものの、ブロッキング剤がクロマトグラフ媒体全体を被覆してしまうことにより移動相の展開効率に影響を与える、長期保存によりクロマトグラフ媒体全体を被覆するブロッキング剤自体が変性し測定結果に影響を与える等の問題を有していた。そこで、近年では、クロマトグラフ媒体全体にブロッキング剤を作用させるのではなく、測定結果の解析に必要な判定部位の領域にのみブロッキング剤を塗布する技術も提案されている（特許文献２参照）。
In the immunochromatography method, attempts to improve the signal / noise ratio of the measurement system to a larger value have been made mainly focusing on the reduction of noise. One of the causes of noise observed at the determination site provided in the chromatographic medium is that the labeling reagent does not pass through the detected substance directly or through some factor other than the detected substance (non-specific factor). Non-specific binding to the determination site can be mentioned. As a means for reducing the noise generated in this way, the use of a blocking agent is widely known (see, for example, Patent Document 1). In this technique, a first reagent that specifically binds to a substance to be detected is immobilized on a chromatographic medium to form a determination site, and then the entire chromatographic medium is immersed in a buffer containing a blocking agent and further dried. Thus, the chromatographic medium is manufactured. By covering the determination site in advance with a blocking agent, nonspecific adsorption of the labeling reagent and nonspecific factor is prevented, and noise generation is suppressed.
Although the use of such a blocking agent has a temporary effect in terms of reducing the noise observed when measuring a negative sample, the blocking agent covers the entire chromatographic medium, thereby improving the mobile phase development efficiency. The blocking agent itself, which affects the entire chromatographic medium due to long-term storage, is denatured and affects the measurement results. Therefore, in recent years, a technique has been proposed in which the blocking agent is not applied to the entire chromatographic medium, but is applied only to the region of the determination site necessary for analysis of the measurement result (see Patent Document 2).
ブロッキング剤の使用は、ノイズの低下という点に着目した場合に一定の効果を有しているが、それは必ずしもイムノクロマトグラフ法による高感度な測定系の開発には結びついていない。ブロッキング剤は、判定部位を被覆することにより標識試薬等の非特異的吸着を抑制するが、判定部位を被覆することにより当該部位に固定された第一試薬と被検出物質の特異的な結合も一部抑制してしまうため、陽性検体を測定した際に得られるシグナルの低下も招くからである。ブロッキング剤の使用により、陰性検体測定時に観察されるノイズが大幅に低下しシグナル／ノイズ比が増加して一見改良したように見えても、陽性検体のシグナルが低下してしまう場合には、特に低濃度域で被検出物質の検出が困難となるため、実際の測定を行う上で大きな問題となっていた。 The use of a blocking agent has a certain effect when focusing on the reduction of noise, but it does not necessarily lead to the development of a highly sensitive measurement system by immunochromatography. The blocking agent suppresses non-specific adsorption of the labeling reagent and the like by covering the determination site, but also the specific binding between the first reagent immobilized on the site and the substance to be detected by covering the determination site. This is because a part of the signal is suppressed, resulting in a decrease in the signal obtained when a positive sample is measured. Especially when the signal of the positive sample is reduced by using a blocking agent, although the noise observed at the time of negative sample measurement is greatly reduced and the signal / noise ratio is increased and it seems to be improved at first glance. Since it becomes difficult to detect a substance to be detected in a low concentration range, it has been a big problem in actual measurement.
本発明は、イムノクロマトグラフ法による測定において、高感度で信頼性の高い測定データの取得を達成するために、測定系が示すシグナル／ノイズ比を改良する手段を提供する。より詳細には、陰性検体を測定した際に観察されるノイズを抑制することができる一方、陽性検体を測定した際に得られるシグナルは増強することができる、新規なクロマトグラフ媒体の提供を目的とする。 The present invention provides means for improving the signal / noise ratio exhibited by the measurement system in order to achieve highly sensitive and reliable acquisition of measurement data in measurement by immunochromatography. More specifically, the object is to provide a novel chromatographic medium that can suppress noise observed when measuring a negative sample, while enhancing the signal obtained when measuring a positive sample. And
本発明者らは、鋭意研究した結果、被検出物質と特異的に結合する第一試薬及び第四級アンモニウム塩を用いて、イムノクロマトグラフ法に用いられるクロマトグラフ媒体の判定部位を形成させることにより、陰性検体を測定した際に観察されるノイズを抑制することができる一方、陽性検体を測定した際に得られるシグナルは増強することができることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have formed a determination site of a chromatographic medium used in an immunochromatographic method using a first reagent and a quaternary ammonium salt that specifically bind to a substance to be detected. The present inventors have found that the noise observed when measuring a negative sample can be suppressed, while the signal obtained when measuring a positive sample can be enhanced, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、判定部位に第四級アンモニウム塩が付着することを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体及び該クロマトグラフ媒体を含有する測定キットに関する。また、本発明は、判定部位に第四級アンモニウム塩が付着したクロマトグラフ媒体を用いたイムノクロマトグラフ法による測定方法に関する。さらに、本発明は、判定部位に第四級アンモニウム塩が付着したクロマトグラフ媒体の製造方法に関する。 That is, the present invention relates to a chromatographic medium for immunochromatography and a measurement kit containing the chromatographic medium, characterized in that a quaternary ammonium salt adheres to a determination site. The present invention also relates to a measurement method by an immunochromatographic method using a chromatographic medium having a quaternary ammonium salt attached to a determination site. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a chromatographic medium in which a quaternary ammonium salt is attached to a determination site.
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）被検出物質と特異的に結合する第一試薬が固定化された判定部位を有するクロマトグラフ媒体において、前記判定部位に第四級アンモニウム塩が付着していることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。
（２）被検出物質と特異的に結合する第一試薬が固定化された判定部位を有するクロマトグラフ媒体において、前記判定部位に第四級アンモニウム塩及びブロッキング剤が付着していることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。
（３）判定部位のみにブロッキング剤が付着していることを特徴とする、（２）に記載のクロマトグラフ媒体。
（４）第四級アンモニウム塩が、次の一般式（Ｉ）
［Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ］＋Ｘ− （Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して置換基を有してもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有してもよいアルコキシアルキル基、Ｘは、ハロゲンイオンを示す）で表される化合物である、（１）から（３）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
（５）第四級アンモニウム塩が、ハロゲン化コリン又はハロゲン化テトラアルキルアンモニウムである、（４）に記載のクロマトグラフ媒体。
（６）第四級アンモニウム塩に含まれるハロゲンイオンが、塩素イオン、臭素イオン又はヨウ素イオンである、（４）又は（５）に記載のクロマトグラフ媒体。
（７）第四級アンモニウム塩が、塩化コリン又は塩化テトラエチルアンモニウムである、（６）に記載のクロマトグラフ媒体。
（８）（１）から（７）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体を含有してなる、イムノクロマトグラフ法のための測定キット。
（９）さらに、被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなる標識試薬を含有することを特徴とする、（８）に記載の測定キット。
（１０）（１）から（７）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体を用いることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法による測定方法。
（１１）さらに、被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなる標識試薬を用いることを特徴とする、（１０）に記載の測定方法。
（１２）第四級アンモニウム塩を含有する溶液に、被検出物質と特異的に結合する第一試薬を混合し、前記混合液をクロマトグラフ媒体に塗布することにより判定部位を形成させることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１３）第四級アンモニウム塩を含有する溶液に、被検出物質と特異的に結合する第一試薬及びブロッキング剤を混合し、前記混合液をクロマトグラフ媒体に塗布することにより判定部位を形成させることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１４）被検出物質と特異的に結合する第一試薬を固定化し、前記固定化部位に第四級アンモニウム塩を含有する溶液を塗布することにより判定部位を形成させることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１５）被検出物質と特異的に結合する第一試薬を固定化し、前記固定化部位に第四級アンモニウム塩及びブロッキング剤を含有する混合液をクロマトグラフ媒体に塗布することにより判定部位を形成させることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１６）第四級アンモニウム塩が、次の一般式（Ｉ）
［Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ］＋Ｘ− （Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して置換基を有してもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有してもよいアルコキシアルキル基、Ｘは、ハロゲンイオンを示す）で表される化合物である、（１２）から（１５）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１７）第四級アンモニウム塩が、ハロゲン化コリン又はハロゲン化テトラアルキルアンモニウムである、（１６）に記載のクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１８）第四級アンモニウム塩に含まれるハロゲンイオンが、塩素イオン、臭素イオン又はヨウ素イオンである、（１６）又は（１７）に記載のクロマトグラフ媒体の製造方法。
（１９）第四級アンモニウム塩が、塩化コリン又は塩化テトラエチルアンモニウムである、（１８）に記載のクロマトグラフ媒体の製造方法。
The present invention will be described in detail as follows.
(1) In a chromatographic medium having a determination site on which a first reagent that specifically binds to a substance to be detected is immobilized, a quaternary ammonium salt is attached to the determination site. A chromatographic medium for graphing.
(2) A chromatographic medium having a determination site on which a first reagent that specifically binds to a substance to be detected is immobilized, wherein a quaternary ammonium salt and a blocking agent are attached to the determination site. A chromatographic medium for immunochromatography.
(3) The chromatographic medium according to (2), wherein the blocking agent is attached only to the determination site.
(4) A quaternary ammonium salt is represented by the following general formula (I)
[R 1 R 2 R 3 R 4 N] + X − (I)
(Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent or an alkoxyalkyl group which may have a substituent, The chromatographic medium according to any one of (1) to (3), wherein X represents a halogen ion.
(5) The chromatographic medium according to (4), wherein the quaternary ammonium salt is choline halide or tetraalkylammonium halide.
(6) The chromatographic medium according to (4) or (5), wherein the halogen ion contained in the quaternary ammonium salt is chlorine ion, bromine ion or iodine ion.
(7) The chromatographic medium according to (6), wherein the quaternary ammonium salt is choline chloride or tetraethylammonium chloride.
(8) A measurement kit for immunochromatography, comprising the chromatographic medium according to any one of (1) to (7).
(9) The measurement kit according to (8), further comprising a second reagent that specifically binds to the substance to be detected and a labeling reagent comprising a labeling substance.
(10) A measuring method using an immunochromatographic method, wherein the chromatographic medium according to any one of (1) to (7) is used.
(11) The measuring method according to (10), further comprising a labeling reagent comprising a second reagent and a labeling substance that specifically binds to the substance to be detected.
(12) A determination site is formed by mixing a first reagent that specifically binds to a substance to be detected with a solution containing a quaternary ammonium salt, and applying the mixture to a chromatographic medium. A method for producing a chromatographic medium for an immunochromatographic method.
(13) A solution containing a quaternary ammonium salt is mixed with a first reagent that specifically binds to the substance to be detected and a blocking agent, and the mixture is applied to a chromatographic medium to form a determination site. A method for producing a chromatographic medium for an immunochromatographic method.
(14) An immunochromatography characterized in that a first reagent that specifically binds to a substance to be detected is immobilized, and a determination site is formed by applying a solution containing a quaternary ammonium salt to the immobilized site. A method for producing a chromatographic medium for a graph method.
(15) Immobilize a first reagent that specifically binds to the substance to be detected, and form a determination site by applying a mixed liquid containing a quaternary ammonium salt and a blocking agent to the immobilized site on a chromatographic medium. A method for producing a chromatographic medium for immunochromatography, characterized by comprising:
(16) A quaternary ammonium salt is represented by the following general formula (I)
[R 1 R 2 R 3 R 4 N] + X − (I)
(Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent or an alkoxyalkyl group which may have a substituent, (X is a halogen ion) The manufacturing method of the chromatographic medium in any one of (12) to (15) which is a compound represented.
(17) The method for producing a chromatographic medium according to (16), wherein the quaternary ammonium salt is choline halide or tetraalkylammonium halide.
(18) The method for producing a chromatographic medium according to (16) or (17), wherein the halogen ion contained in the quaternary ammonium salt is chlorine ion, bromine ion or iodine ion.
(19) The method for producing a chromatographic medium according to (18), wherein the quaternary ammonium salt is choline chloride or tetraethylammonium chloride.
本発明者らは、イムノクロマトグラフ法において、判定部位において効率よく非特異反応を抑制する物質を探索するために、被検出物質に特異的に反応する第一試薬とともに、種々の物質を用いて判定部位を形成し、検討を行った。イムノクロマトグラフ法による測定の例として、豚肉抽出液、すなわち主に豚の筋肉組織からなる部分の抽出液に存在する豚肉に特異的な抗原を被検出物質として、肉の由来する動物種を識別する測定系を用いて詳細な検討を行った。測定系には、豚肉抽出液を免疫原として得られたポリクローナル抗体を第一試薬及び第二試薬として用い、第二試薬をコロイド金粒子に結合したものを標識試薬として用いた。種々の物質について検討したところ、以下の表１に示すように、第四級アンモニウム塩を判定部位の形成に使用した場合に、効率よく非特異反応を抑制できるばかりでなく、陽性検体を測定時に得られるシグナルの増強が見られ、良好なシグナル／ノイズ比が得られることが明らかとなった。 In the immunochromatography method, the present inventors use various substances together with a first reagent that specifically reacts with a substance to be detected in order to search for substances that efficiently suppress nonspecific reactions at the determination site. Sites were formed and examined. As an example of measurement by immunochromatography, the animal species from which meat is derived is identified by using the pork extract, that is, the antigen specific to pork present in the extract of the porcine muscle tissue. A detailed study was conducted using a measurement system. In the measurement system, a polyclonal antibody obtained using pork extract as an immunogen was used as the first reagent and the second reagent, and the second reagent bound to colloidal gold particles was used as the labeling reagent. When various substances were examined, as shown in Table 1 below, when a quaternary ammonium salt was used to form a determination site, not only a nonspecific reaction could be efficiently suppressed, but a positive sample was measured at the time of measurement. It was revealed that the obtained signal was enhanced and a good signal / noise ratio was obtained.
表1に示す結果は、第四級アンモニウム塩として塩化コリン、ブロッキング剤としてBlocking Peptide Fragment（TOYOBO）を例として用い、第一試薬と共に判定部位を形成した場合の、陽性検体及び陰性検体の測定値を示す。豚肉に特異的な抗原を被検出物質として含む陽性検体として豚肉抽出液を、被検出物質を含まない陰性検体として牛肉抽出液を試料として測定を行った。判定部位に現れた標識試薬に由来する発色をデンシトメーターで測定することにより数値化した。 The results shown in Table 1 show the measured values of positive and negative samples when the determination site is formed with the first reagent using choline chloride as the quaternary ammonium salt and Blocking Peptide Fragment (TOYOBO) as the blocking agent as an example. Indicates. The measurement was performed using a pork extract as a positive sample containing an antigen specific to pork as a detected substance and a beef extract as a negative sample containing no detected substance. The color development derived from the labeling reagent that appeared at the determination site was quantified by measuring with a densitometer.
炭酸緩衝液中に溶解した抗豚肉ポリクローナル抗体のみを固定化し判定部位を形成した場合（比較例１）と比較して、第一試薬である抗体とともにブロッキング剤を塗布した場合（比較例２）には、陰性検体を測定した際に判定部位に観察される発色が顕著に低下した。従来の技術では、このように判定部位における非特異的な吸着を抑制しノイズを低下させることで、Ｓ／Ｎが大きくなるよう改良を図っていた。しかし、この方法では、ノイズの低下とともに、陽性検体を測定した際に観察されるシグナルも大幅に低下してしまうという問題を有していた。一方、塩化コリン等の第四級アンモニウム塩を用いて判定部位を形成した場合（実施例１）には、陰性検体を測定した際に観察されるノイズを低下させることができるとともに、陽性検体を測定した際に得られるシグナルを増強することが可能であった。第四級アンモニウム塩を判定部位に用いる本発明は、ノイズを低下させシグナルを増強するという２つの利点を兼ね備えており、結果として得られるＳ／Ｎにおいて顕著な改良効果が見られた。また、同じ測定時間で同程度のＳ／Ｎが得られる測定系を比較する場合（例えば、実施例１の０．１％塩化コリン（Ｓ／Ｎ＝４２．８）と比較例２の０．０１％ＢＰＦ（Ｓ／Ｎ＝４５．４））、より高いシグナルを示す測定系（実施例１）の方が、より迅速に判定ができるという点で優れている。すなわち、陽性検体を測定した場合、実施例１で構築した測定系の方が、より短い時間で、比較例２の測定系と同程度の発色が得られるので、測定結果の判定が早期に可能となるからである。さらに、興味深いことに、塩化コリンとブロッキング剤を併用した場合（実施例２）には、第四級アンモニウム塩によるシグナル増強効果を妨げることなく、ブロッキング剤により効率的にノイズの発生が抑制された。 Compared with the case where only the anti-pork polyclonal antibody dissolved in the carbonate buffer is immobilized and the determination site is formed (Comparative Example 1), when the blocking agent is applied together with the antibody as the first reagent (Comparative Example 2) When the negative sample was measured, the color development observed at the determination site was significantly reduced. In the conventional technique, the non-specific adsorption at the determination site is suppressed and noise is reduced in this way, so that the S / N is improved. However, this method has a problem that a signal observed when a positive sample is measured is significantly reduced along with a reduction in noise. On the other hand, when the determination site is formed using a quaternary ammonium salt such as choline chloride (Example 1), noise observed when a negative sample is measured can be reduced, and a positive sample can be reduced. It was possible to enhance the signal obtained when measured. The present invention using a quaternary ammonium salt as a determination site has two advantages of reducing noise and enhancing signal, and a remarkable improvement effect was observed in the resulting S / N. Further, when comparing measurement systems in which the same S / N can be obtained at the same measurement time (for example, 0.1% choline chloride (S / N = 42.8) in Example 1 and 0.2 in Comparative Example 2). 01% BPF (S / N = 45.4)), the measurement system showing a higher signal (Example 1) is superior in that it can be determined more quickly. That is, when a positive sample is measured, the measurement system constructed in Example 1 can produce the same color development as the measurement system of Comparative Example 2 in a shorter time, so the determination of the measurement result is possible early. Because it becomes. Furthermore, interestingly, when choline chloride and a blocking agent were used in combination (Example 2), generation of noise was efficiently suppressed by the blocking agent without interfering with the signal enhancement effect by the quaternary ammonium salt. .
塩化コリン等の第四級アンモニウム塩は、ラテックス粒子の自然凝集を防止することができるので、免疫測定の分野、特にラテックス受身凝集反応による測定において、非特異反応抑制剤としてしばしば反応溶液中に添加される。イムノクロマトグラフ法による測定では、標識試薬を構成する不溶性担体としてラテックス粒子が用いられる場合に、塩化コリンを展開液に添加する例が知られている（特開２００１−２１５６０号公報、特開２００７−３１５８８３号公報）。本発明である、判定部位に第四級アンモニウム塩を存在させたクロマトグラフ媒体の奏する効果が、第四級アンモニウム塩を展開液に添加した場合の効果とは異なることを明確にするために、以下の実験を行った。 Quaternary ammonium salts such as choline chloride can prevent spontaneous aggregation of latex particles, so they are often added to reaction solutions as non-specific reaction inhibitors in the field of immunoassay, particularly in measurements using passive latex agglutination. Is done. In the measurement by the immunochromatography method, when latex particles are used as the insoluble carrier constituting the labeling reagent, examples in which choline chloride is added to the developing solution are known (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2001-21560 and 2007-). No. 315883). In order to clarify that the effect of the chromatographic medium in which the quaternary ammonium salt is present in the determination site according to the present invention is different from the effect when the quaternary ammonium salt is added to the developing solution, The following experiment was conducted.
比較例３では、炭酸緩衝液中に溶解した抗豚肉ポリクローナル抗体のみを用いて判定部位を形成した。そして、展開液に塩化コリンを添加したものを用いて、試料及び標識試薬をクロマトグラフ媒体に展開した。比較例３のＳ／Ｎは、展開液に塩化コリンを含有しない比較例１の結果と比べてほとんど変化はなく、陰性検体を測定した際に観察されるノイズを低下させることも、陽性検体を測定した際に得られるシグナルを増強することもなかった。また、展開液に塩化コリン及びブロッキング剤を添加した場合には（比較例４）、陰性検体を測定した際のノイズがわずかに低下したが、陽性検体を測定した際のシグナルも同様に低下し、塩化コリンによるシグナルの増強効果は見られなかった。比較例５では、第一試薬である抗体とともにブロッキング剤を塗布して判定部位を形成し、塩化コリンを含む展開液を測定に用いた。ブロッキング剤を判定部位に塗布することにより、陰性検体を測定した際のノイズ、陽性検体を測定した際のシグナルはともに低下する（比較例２）が、展開液に塩化コリンを添加しても、陽性検体からのシグナルが増強されることはなく、Ｓ／Ｎの改良効果は見られなかった。これらの結果から、塩化コリン等の第四級アンモニウム塩は、展開液への添加ではなく、クロマトグラフ媒体の判定部位に付着させることにより、ノイズの抑制効果とシグナルの増強効果という顕著な効果を奏することが明らかとなった。 In Comparative Example 3, the determination site was formed using only the anti-pork polyclonal antibody dissolved in the carbonate buffer. Then, the sample and the labeling reagent were developed on a chromatographic medium using a developing solution to which choline chloride was added. The S / N of Comparative Example 3 has almost no change compared to the result of Comparative Example 1 in which the developing solution does not contain choline chloride, and can reduce the noise observed when a negative sample is measured. It did not enhance the signal obtained when measured. In addition, when choline chloride and a blocking agent were added to the developing solution (Comparative Example 4), the noise when measuring a negative sample was slightly reduced, but the signal when measuring a positive sample was also similarly reduced. The signal enhancement effect by choline chloride was not observed. In Comparative Example 5, a blocking agent was applied together with the antibody as the first reagent to form a determination site, and a developing solution containing choline chloride was used for the measurement. By applying a blocking agent to the determination site, both the noise when measuring a negative sample and the signal when measuring a positive sample are reduced (Comparative Example 2), but even if choline chloride is added to the developing solution, The signal from the positive specimen was not enhanced, and the S / N improvement effect was not observed. From these results, quaternary ammonium salts such as choline chloride are not added to the developing solution, but attached to the determination site of the chromatographic medium, so that remarkable effects such as noise suppression effect and signal enhancement effect are obtained. It became clear to play.
次に、塩化コリンに代えて、第四級アンモニウム塩として、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）（実施例３）又はヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＨＤＴＡＣ）（比較例６）を用いてクロマトグラフ媒体の判定部位を形成し、陽性検体である豚肉抽出液及び陰性検体である牛肉抽出液の測定を行った。 Next, instead of choline chloride, the determination site of the chromatographic medium using tetraethylammonium chloride (TEAC) (Example 3) or hexadecyltrimethylammonium chloride (HDTAC) (Comparative Example 6) as a quaternary ammonium salt. The pork extract as a positive sample and the beef extract as a negative sample were measured.
テトラエチルアンモニウムクロリドをクロマトグラフ媒体の判定部位に付着した場合には、塩化コリンの場合と同様に、陰性検体を測定した際にノイズの低下が観察されるとともに、陽性検体の測定においてシグナルの増強効果が見られた。一方、陽イオン性界面活性剤としても知られるヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドを判定部位に付着した場合には、ノイズの発生が抑制されたが、陽性検体を測定した際のシグナルも大幅に低下し、Ｓ／Ｎの改良効果は得られなかった。 When tetraethylammonium chloride is attached to the determination site of the chromatographic medium, as with choline chloride, noise reduction is observed when negative samples are measured, and signal enhancement effects are obtained when measuring positive samples. It was observed. On the other hand, when hexadecyltrimethylammonium chloride, also known as a cationic surfactant, was attached to the determination site, the generation of noise was suppressed, but the signal when measuring a positive sample was significantly reduced, The improvement effect of S / N was not obtained.
本発明において、第四級アンモニウム塩は、被検出物質に特異的に反応する第一試薬とともに、クロマトグラフ媒体に付着し判定部位を形成する。判定部位に、第四級アンモニウム塩が存在することで、イムノクロマトグラフ法による測定の際に、ノイズを抑制し、シグナルを増強するので、良好なＳ／Ｎを得ることができる。本発明で用いることのできる第四級アンモニウム塩は、次の一般式（Ｉ）で表すことができる。
［Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ］＋Ｘ− （Ｉ）
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して置換基を有してもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有してもよい炭素数１〜４のアルコキシアルキル基を示す。アルキル基及びアルコキシアルキル基における置換基としては、水酸基、ハロゲン、カルボニル基などが挙げられる。好ましい置換基としては、水酸基が挙げられる。さらに、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち、３つ又は４つが同じアルキル基であることが好ましい。式（Ｉ）中のＸは、ハロゲンイオンを表す。好ましくは、塩素イオン、臭素イオン又はヨウ素イオンであり、より好ましくは、塩素イオンである。好ましい第四級アンモニウム塩としては、塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、ヨウ化テトラエチルアンモニウム、塩化コリン、臭化コリン、ヨウ化コリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、塩酸ベタイン等が挙げられるが、これらに限定されない。
In the present invention, the quaternary ammonium salt adheres to the chromatographic medium together with the first reagent that reacts specifically with the substance to be detected to form a determination site. The presence of the quaternary ammonium salt at the determination site suppresses noise and enhances the signal during measurement by the immunochromatographic method, so that a good S / N can be obtained. The quaternary ammonium salt that can be used in the present invention can be represented by the following general formula (I).
[R 1 R 2 R 3 R 4 N] + X − (I)
Here, R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent. An alkoxyalkyl group is shown. Examples of the substituent in the alkyl group and alkoxyalkyl group include a hydroxyl group, a halogen, and a carbonyl group. A preferred substituent is a hydroxyl group. Furthermore, it is preferable that three or four of R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same alkyl group. X in the formula (I) represents a halogen ion. Chlorine ion, bromine ion or iodine ion is preferable, and chlorine ion is more preferable. Preferred quaternary ammonium salts include tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium bromide, tetramethylammonium iodide, tetraethylammonium chloride, tetraethylammonium bromide, tetraethylammonium iodide, choline chloride, choline bromide and choline iodide. , Acetylcholine chloride, acetylcholine bromide, betaine hydrochloride and the like, but are not limited thereto.
本発明においては、被検出物質と特異的に結合する第一試薬と第四級アンモニウム塩を用いて、被検出物質−標識試薬からなる複合体を捕捉する判定部位をクロマトグラフ媒体に形成する。第一試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、第一試薬をクロマトグラフ媒体に物理吸着等の物理的手段又は共有結合等の化学的手段により直接固定化する方法等が挙げられる。第四級アンモニウム塩は、第一試薬をクロマトグラフ媒体に固定化した後に、固定化した部位に第四級アンモニウム塩を含む溶液をさらに塗布し乾燥することにより判定部位に存在させることができる。あるいは、第四級アンモニウム塩を含む溶液に第一試薬を混合し、かかる混合液を用いて物理吸着等の手段により第一試薬を判定部位に固定化することで、同時に第四級アンモニウム塩を判定部位に付着することもできる。工程数が少なく、判定部位の形成が容易となることから、好ましくは、予め第一試薬と第四級アンモニウム塩を混合した溶液を、クロマトグラフ媒体の任意の位置に塗布することで判定部位を形成する。判定部位を形成するのに用いられる溶液中に含まれる第四級アンモニウム塩の濃度は、０．０００１重量％から０．１重量％、好ましくは０．０００５重量％から０．０５重量％、より好ましくは０．００１重量％から０．０１重量％である。
さらに、非特異的な吸着により陰性検体測定時に主に観察されるノイズの発生を抑制するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、ブロッキング処理を行うこともできる。ブロッキング処理に用いることのできるブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質の他、Blocking Peptide Fragment（TOYOBO）や親水性高分子ポリマー等の市販のブロッキング剤が挙げられる。ブロッキング処理は、第一試薬及び第四級アンモニウム塩を用いてクロマトグラフ媒体に判定部位を形成した後に、クロマトグラフ媒体全体をブロッキング剤を含む緩衝液に浸漬すること、又は、判定部位にのみブロッキング剤を含む溶液を塗布し乾燥させることで行うことができる。あるいは、第四級アンモニウム塩を含む溶液にブロッキング剤を添加して、この混合液を塗布することにより判定部位の形成と同時にブロッキング処理を行うこともできる。
In the present invention, a determination site for capturing a complex composed of a substance to be detected and a labeling reagent is formed in a chromatographic medium using a first reagent that specifically binds to the substance to be detected and a quaternary ammonium salt. Examples of the method of immobilizing the first reagent on the chromatographic medium include a method of directly immobilizing the first reagent on the chromatographic medium by physical means such as physical adsorption or chemical means such as covalent bond. The quaternary ammonium salt can be present at the determination site by further applying a solution containing the quaternary ammonium salt to the immobilized site after the first reagent is immobilized on the chromatographic medium and drying. Alternatively, the first reagent is mixed with a solution containing the quaternary ammonium salt, and the first reagent is immobilized on the determination site by means of physical adsorption or the like using the mixed solution, so that the quaternary ammonium salt is simultaneously added. It can also adhere to the determination site. Since the number of steps is small and the formation of the determination site is facilitated, the determination site is preferably applied by applying a solution in which the first reagent and the quaternary ammonium salt are mixed in advance to any position of the chromatographic medium. Form. The concentration of the quaternary ammonium salt contained in the solution used to form the determination site is 0.0001 wt% to 0.1 wt%, preferably 0.0005 wt% to 0.05 wt%, more Preferably it is 0.001 to 0.01 weight%.
Furthermore, in order to suppress the generation of noise mainly observed during negative sample measurement due to non-specific adsorption, a blocking process can be performed on the chromatographic medium as necessary. Examples of blocking agents that can be used for the blocking treatment include proteins such as bovine serum albumin, skim milk, casein, and gelatin, as well as commercially available blocking agents such as Blocking Peptide Fragment (TOYOBO) and hydrophilic polymer polymers. In the blocking treatment, the determination site is formed in the chromatographic medium using the first reagent and the quaternary ammonium salt, and then the entire chromatographic medium is immersed in a buffer solution containing a blocking agent, or the determination site is blocked only. It can be carried out by applying a solution containing an agent and drying it. Alternatively, a blocking agent can be added to a solution containing a quaternary ammonium salt, and a blocking treatment can be performed simultaneously with the formation of the determination site by applying this mixed solution.
本発明のクロマトグラフ媒体は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、標識試薬、被検出物質等と反応しないものであれば、特にその素材が限定されるものではない。具体的には、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。
クロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、判定部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチック等からなる支持体を設けることもできる。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
The chromatographic medium of the present invention is an inert material composed of a microporous material exhibiting capillary action, and the material is not particularly limited as long as it does not react with a labeling reagent, a detected material or the like. Absent. Specifically, fibrous or non-woven fibrous matrix composed of polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, cellulose derivatives such as nitrocellulose or cellulose acetate, membrane, filter paper, glass fiber Examples include filter paper, cloth, and cotton. Preferred are cellulose derivatives and nylon membranes, filter papers, glass fiber filter papers, and more preferred are nitrocellulose membranes, mixed nitrocellulose ester (mixtures of nitrocellulose and cellulose acetate) membranes, nylon membranes, and filter papers.
The form and size of the chromatographic medium are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of results. In order to make the operation easier, a support made of plastic or the like can be provided on the back surface of the chromatographic medium having the determination site formed on the surface. The properties of the support are not particularly limited, but when the measurement result is observed by visual judgment, the support preferably has a color that is not similar to the color caused by the labeling substance. Usually, it is preferably colorless or white.
本発明のクロマトグラフ媒体を用いて検出することのできる被検出物質としては、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されず、蛋白質、ペプチド、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等）、複合糖質などを例示することができる。本明細書において「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合が代表的なものであり、免疫測定法で広く利用されるが、このような結合のみならず、本発明では、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、核酸と核酸結合蛋白質との結合なども利用できる。具体的な被検出物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン、及び、花粉、ダニ、室内塵、食品などのアレルゲン、アレルゲン特異的ＩｇＥ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記被検出物質を含む試料としては、例えば、生体試料、即ち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等の他、牛乳、卵、小麦、豆、牛肉、豚肉、鶏肉などやそれらを含む食品等の抽出液等が挙げられるがこれらに限定されない。
The substance to be detected that can be detected using the chromatographic medium of the present invention is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the substance is present. Proteins, peptides, sugars (especially sugars of glycoproteins) Part, sugar part of glycolipid, etc.), complex carbohydrates and the like. In the present specification, “specifically binds” means binding based on the affinity of a biomolecule. As such a binding based on affinity, the binding between an antigen and an antibody is typical and widely used in immunoassays. In addition to such binding, in the present invention, a sugar and a lectin , A hormone-receptor bond, an enzyme-inhibitor bond, a nucleic acid-nucleic acid-binding protein bond, and the like. Specific examples of the substance to be detected include carcinoembryonic antigen (CEA), HER2 protein, prostate specific antigen (PSA), CA19-9, α-fetoprotein (AFP), immunosuppressive acidic protein (IPA), CA15- 3, CA125, estrogen receptor, progesterone receptor, fecal occult blood, troponin I, troponin T, CK-MB, CRP, human chorionic gonadotropin (HCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), syphilis antibody, Examples include influenza virus, chlamydia antigen, group A β-streptococcal antigen, HBs antibody, HBs antigen, rotavirus, adenovirus, albumin, glycated albumin, and allergens such as pollen, mites, indoor dust, foods, and allergen-specific IgE. But not limited to these Absent.
Examples of the sample containing the substance to be detected include biological samples, that is, whole blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, nasal cavity or throat swab, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, nipple discharge, tears, sweat, skin Examples include, but are not limited to, extract from milk, egg, wheat, bean, beef, pork, chicken, etc. and foods containing them, etc.
本発明のクロマトグラフ媒体は、イムノクロマトグラフ法において、被検出物質を含む試料及び標識試薬を展開液で展開するための媒体として使用することができる。クロマトグラフ媒体に設けられた判定部位において、固定化された第一試薬が被検出物質−標識試薬複合体と結合するので、間接的に判定部位に捕捉された標識物質の存在を検出又は定量することにより、イムノクロマトグラフ法による測定を行うことができる。
本発明のクロマトグラフ媒体による測定で用いられる第一試薬及び標識試薬を構成する第二試薬は、被検出物質に特異的に結合し得る物質である。すなわち、被検出物質が抗原性を有する物質である場合、第一試薬又は第二試薬として用いることができる物質は、被検出物質に対するポリクローナル抗体モノクローナル抗体又はそれらの断片等である。また、被検出物質が抗体、すなわち特定の抗原に対する免疫グロブリン分子である場合には、第一試薬又は第二試薬として用いることができる物質は、抗体が認識する抗原又は免疫グロブリン分子に対する抗体等である。さらに、被検出物質が糖の場合、第一試薬又は第二試薬としては糖に対する抗体の他、レクチンタンパク質等を用いることもできる。
The chromatographic medium of the present invention can be used as a medium for developing a sample containing a substance to be detected and a labeling reagent with a developing solution in an immunochromatographic method. Since the immobilized first reagent binds to the detected substance-labeling reagent complex at the determination site provided in the chromatographic medium, the presence or absence of the labeled substance captured at the determination site is indirectly detected or quantified. Thus, measurement by an immunochromatographic method can be performed.
The second reagent constituting the first reagent and the labeling reagent used in the measurement with the chromatographic medium of the present invention is a substance that can specifically bind to the substance to be detected. That is, when the substance to be detected is an antigenic substance, the substance that can be used as the first reagent or the second reagent is a polyclonal antibody monoclonal antibody against the substance to be detected or a fragment thereof. When the substance to be detected is an antibody, that is, an immunoglobulin molecule against a specific antigen, the substance that can be used as the first reagent or the second reagent is an antigen recognized by the antibody or an antibody against the immunoglobulin molecule. is there. Furthermore, when the substance to be detected is a saccharide, a lectin protein or the like can be used as the first reagent or the second reagent in addition to an antibody against saccharide.
標識試薬を構成する第二試薬は、標識物質と結合して用いられる。第二試薬の標識化に使用できる標識物質としては、酵素又は不溶性担体が挙げられる。酵素としては、アルカリフホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等があり、それぞれの酵素に対応する公知の発色基質と共に用いることができる。不溶性担体としては、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、その他を用いることができる。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子には、例えば、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、コロイド状白金粒子、コロイド状酸化鉄粒子、コロイド状水酸化アルミニウム粒子などが挙げられる。特に、コロイド状金粒子とコロイド状銀粒子が適当な粒径において、コロイド状金粒子は赤色、コロイド状銀粒子は黄色を示す点で好ましい。これらのコロイド状金属粒子の平均粒径は１〜５００ｎｍ、特に強い色調が得られる１０ｎｍ〜１５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは４０〜１００ｎｍの範囲内である。ラテックス粒子としては、例えばスチレンとメタクリル酸との共重合体、スチレンとイタコン酸との共重合体などを挙げることができる。これらのラテックス粒子の平均粒径は５０〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
本発明で使用する第二試薬を標識物質で標識化する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、第二試薬としての抗体をコロイド状金粒子に感作した標識試薬は、緩衝液等で希釈し金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、前述の市販ブロッキング剤を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製する。緩衝液としては、標識化される物質の種類に応じた各種緩衝液が用いられ、測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。ｐＨは、好ましくは６．０〜１０．０である。
The second reagent constituting the labeling reagent is used in combination with the labeling substance. Examples of the labeling substance that can be used for labeling the second reagent include enzymes and insoluble carriers. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase, urease, glucose oxidase and the like, which can be used together with known chromogenic substrates corresponding to the respective enzymes. As insoluble carriers, colloidal metal particles such as gold, silver and platinum, colloidal metal oxide particles such as iron oxide, colloidal nonmetal particles such as sulfur, latex particles composed of synthetic polymers, and others are used. be able to. Examples of colloidal metal particles and colloidal metal oxide particles include colloidal gold particles, colloidal silver particles, colloidal platinum particles, colloidal iron oxide particles, and colloidal aluminum hydroxide particles. In particular, the colloidal gold particles and the colloidal silver particles are preferable in that the colloidal gold particles are red and the colloidal silver particles are yellow in an appropriate particle size. These colloidal metal particles have an average particle diameter of 1 to 500 nm, preferably 10 nm to 150 nm, and more preferably 40 to 100 nm, at which a particularly strong color tone can be obtained. Examples of latex particles include a copolymer of styrene and methacrylic acid, and a copolymer of styrene and itaconic acid. The average particle diameter of these latex particles is preferably in the range of 50 to 500 nm.
As a method for labeling the second reagent used in the present invention with a labeling substance, known methods such as physical adsorption and chemical bonding can be used. For example, a labeling reagent in which an antibody as a second reagent is sensitized to colloidal gold particles is diluted with a buffer solution or the like, and added to a solution in which the gold particles are colloidally dispersed and physically adsorbed. It is prepared by adding a blocking agent to block the particle surface to which the antibody is not bound. As the buffer, various buffers according to the type of the substance to be labeled are used, and any buffer having a pH that does not inactivate the measurement substance and does not inhibit the antigen-antibody reaction may be used. Examples thereof include phosphate buffer, Tris-HCl buffer, carbonate buffer, glycine buffer, Good buffer, and the like. The pH is preferably 6.0 to 10.0.
本発明のクロマトグラフ媒体を用いたイムノクロマトグラフ法による測定で使用できる展開液としては、通常、水を溶媒とし、上記の緩衝剤あるいは塩化ナトリウムなどの無機塩を含有することが好ましい。さらに、必要に応じて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質成分（含有量は通常０．０１重量％〜１０重量％）、非イオン性界面活性剤等の添加剤を含んでいてもよい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキンエチレンp−t−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンp−t−ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、等のポリオキシエチレン系界面活性剤やポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）アルキルエーテルなどの共重合体を好ましく用いることができる。非イオン性界面活性剤の含有量は、好ましくは０．０５重量％〜０．５重量％、より好ましくは０．０８重量％〜０．２５重量％の範囲内である。 As a developing solution that can be used in the measurement by the immunochromatography method using the chromatographic medium of the present invention, it is usually preferable to use water as a solvent and the above-mentioned buffering agent or an inorganic salt such as sodium chloride. Furthermore, protein components such as bovine serum albumin (BSA) (content is usually 0.01% to 10% by weight) and additives such as nonionic surfactants may be included as necessary. Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (trade name “Tween” series), polyoxyethylene p-t-octylphenyl ether (trade name “Triton” series), poly Copolymers such as polyoxyethylene surfactants such as oxyethylene p-t-nonylphenyl ether (trade name “Triton N” series) and poly (oxyethylene / oxypropylene) alkyl ether can be preferably used. The content of the nonionic surfactant is preferably 0.05% to 0.5% by weight, more preferably 0.08% to 0.25% by weight.
本発明のクロマトグラフ媒体には、任意で、被検出物質を含む試料を添加するための試料添加部位（サンプルパッド等）、試料中の固形成分を除去する部位（固形成分分離部位等）、展開液を添加するための展開液添加部位、判定部位に捕捉されなかった標識試薬や展開液を吸い取る吸収部位（吸収パッド等）、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により試料溶液や展開液が移動できれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、第一試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置することができる。 In the chromatographic medium of the present invention, a sample addition site (sample pad, etc.) for adding a sample containing the substance to be detected, a site for removing solid components in the sample (solid component separation site, etc.), development, etc. Incorporating a developing solution addition site for adding a solution, an absorption site (such as an absorption pad) that absorbs a labeling reagent or a developing solution that has not been captured by the determination site, a control site that indicates that the measurement has been performed normally, etc. Good. The members of these parts are not particularly limited as long as the sample solution and the developing solution can move by capillary action, and generally, a plurality of porous materials such as nitrocellulose membranes, filter papers, and glass fiber filter papers are used according to the purpose. One can be selected and used so that the first reagent is connected to the chromatographic medium on which the first reagent is immobilized by a capillary.
本発明のクロマトグラフ媒体を用いた免疫測定の態様の１つとしては、被検出物質を含む試料溶液を、予め標識試薬と混合し、液相中で被検出物質−標識試薬複合体を形成した後、クロマトグラフ媒体と接触することにより行われる。試料溶液と共に又は遅れて、展開液がクロマトグラフ媒体と接触し、移動相を構成して、被検出物質−標識試薬複合体と共に移動する。複合体が、クロマトグラフ媒体の判定部位を移動する際に、固定化された第一試薬により捕捉され、標識物質が間接的に判定部位に結合することにより、標識物質を検出又は定量することができる。標識物質が不溶性担体である場合には直接、標識物質が酵素である場合には基質を作用させ反応産物について、目視又はデンシトメーター等により、その存在の確認又は定量化を行うことができる。
免疫測定のさらなる態様としては、標識試薬を、クロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわち展開液が適用される端部と判定部位との間の領域に存在させて適用することもできる。クロマトグラフ媒体に存在させる場合、標識試薬が展開液に速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように、それらの試薬を支持させるのが好ましい。支持させる部位には、それらの試薬の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしたりしておくこともできる。標識試薬を塗布し乾燥することによりクロマトグラフ媒体に存在させる場合には、クロマトグラフ媒体に直接行うこともできるし、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布に塗布、乾燥し標識試薬保持部材を形成した後、第一試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置してもよい。
As one aspect of immunoassay using the chromatographic medium of the present invention, a sample solution containing a substance to be detected is previously mixed with a labeling reagent to form a substance to be detected-labeling reagent complex in a liquid phase. Thereafter, the contact is made with a chromatographic medium. With or after the sample solution, the developing solution contacts the chromatographic medium, forms a mobile phase, and moves with the detected substance-labeling reagent complex. When the complex moves through the determination site of the chromatographic medium, it is captured by the immobilized first reagent, and the labeling substance indirectly binds to the determination site, thereby detecting or quantifying the labeling substance. it can. When the labeling substance is an insoluble carrier, when the labeling substance is an enzyme, the presence of the reaction product can be confirmed or quantified visually or by a densitometer or the like by allowing the substrate to act.
As a further aspect of the immunoassay, the labeling reagent can be applied by being present on the development movement path of the mobile phase in the chromatographic medium, that is, in the region between the end portion to which the development solution is applied and the determination site. . When present in the chromatographic medium, it is preferred to support the reagents so that the labeling reagents dissolve quickly in the developing solution and can be freely moved by capillary action. In order to improve the re-solubility of these reagents, sugars such as saccharose, maltose and lactose and sugar alcohols such as mannitol are added to the site to be supported, or these substances are pre-coated. You can also keep it. When the labeling reagent is applied and dried to be present in the chromatographic medium, it can be applied directly to the chromatographic medium, or applied to another porous material such as cellulose filter paper, glass fiber filter paper, nylon nonwoven fabric, and dried. After forming the labeling reagent holding member, the labeling reagent holding member may be arranged so as to be connected to the chromatographic medium on which the first reagent is immobilized by a capillary.
本発明は、イムノクロマトグラフ法において、陰性検体を測定した際に観察されるノイズを抑制することができる一方、陽性検体を測定した際に得られるシグナルを増強することができる、良好なシグナル／ノイズ比を示すクロマトグラフ媒体を提供する。本発明のクロマトグラフ媒体を測定に用いることにより、低濃度の被検出物質の測定が可能となる一方、非特異的な吸着が抑制されるので、高感度で信頼性の高い測定データの取得が可能となる。さらに、本発明のクロマトグラフ媒体は、判定部位にのみ第四級アンモニウム塩及びブロッキング剤を有するので、試料を展開した際の展開効率にも影響を与えず、長期の保存安定性にも優れているという利点を有する。 In the immunochromatography method, the present invention can suppress noise observed when measuring a negative sample, while enhancing the signal obtained when measuring a positive sample. A chromatographic medium that exhibits the ratio is provided. By using the chromatographic medium of the present invention for measurement, it is possible to measure a low concentration of a substance to be detected, while non-specific adsorption is suppressed, so that highly sensitive and reliable measurement data can be acquired. It becomes possible. Furthermore, since the chromatographic medium of the present invention has a quaternary ammonium salt and a blocking agent only at the determination site, it does not affect the development efficiency when the sample is developed, and is excellent in long-term storage stability. Has the advantage of being.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
（実施例１）
１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製
25×2.5cmのニトロセルロース膜に、抗体塗布機（BioDot社製）を用いて、0.001〜0.1重量％塩化コリン及び5重量％のイソプロピルアルコールを含む炭酸緩衝液（pH7.5）で1.5mg/mLの濃度になるように希釈した抗豚肉ポリクローナル抗体を塗布し、42℃で60分間乾燥させた後、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体上の判定部位を作製した。
Example 1
1. Preparation of judgment sites on chromatographic media
Using an antibody coater (manufactured by BioDot) on a 25 × 2.5 cm nitrocellulose membrane, a carbonate buffer solution (pH 7.5) containing 0.001 to 0.1 wt% choline chloride and 5 wt% isopropyl alcohol is 1.5 mg / An anti-pork polyclonal antibody diluted to a concentration of mL was applied, dried at 42 ° C. for 60 minutes, and then dried overnight at room temperature to prepare a determination site on the chromatographic medium.
２．標識物質溶液の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：平均粒子径60nm）0.5mLにリン酸緩衝液（pH10.0）で0.02mg/mLの濃度になるように希釈した抗豚肉ポリクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、1重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（pH7.4）を0.1mL加え、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（pH7.4）0.1mLを加え、標識物質溶液とした。
2. Preparation of labeling substance solution Colloidal gold suspension (Tanaka Kikinzoku Kogyo Co., Ltd .: average particle size 60nm) 0.5ml anti-pork polyclonal diluted with phosphate buffer (pH 10.0) to a concentration of 0.02mg / mL 0.1 mL of antibody was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Next, 0.1 mL of a phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% by weight of bovine serum albumin was added and stirred sufficiently, followed by centrifugation at 8000 × g for 15 minutes. After removing the supernatant, 0.1 mL of a phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% by weight of bovine serum albumin was added to obtain a labeling substance solution.
３．クロマトグラフ媒体の作製
上記作製した標識物質溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフ媒体、標識試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料、不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体を作製した。
3. Preparation of chromatographic medium After the labeling substance solution prepared above was uniformly added to a glass fiber pad, it was dried with a vacuum dryer to obtain a labeling reagent holding member. Next, the above-prepared chromatographic medium, the labeling reagent holding member, the sample pad used for the portion to which the sample is added, and the developed sample and the absorption pad for absorbing the insoluble carrier were bonded to the base material composed of the backing sheet. . Finally, it was cut with a cutting machine so that the width was 5 mm, and a chromatographic medium was produced.
４．試料の作製
豚肉あるいは豚以外の動物種に由来する肉10ｇに対して500mM塩化ナトリウム溶液を10mL加え、割り箸等で2分間、ホモジナイズした。次いで濾紙を用いてホモジナイズした試料を濾過し、抽出液を被検検体とした。
4). Preparation of sample 10 mL of 500 mM sodium chloride solution was added to 10 g of pork or meat derived from animal species other than pigs, and homogenized with a split chopstick or the like for 2 minutes. Next, the homogenized sample was filtered using filter paper, and the extract was used as a test sample.
５．測定
上記作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中の豚肉に特異的な抗原の存在の有無を測定した。すなわち、0.20重量％Tween20を含む150mM塩化ナトリウム溶液からなる展開液を作製し、上記のように作製した豚肉が含まれる試料を展開液で4倍希釈したものを陽性検体、また上記作製した豚以外の動物種由来の肉が含まれる試料を展開液で4倍希釈したものを陰性検体とし、各々120μLをクロマトグラフ媒体のサンプルパッド上に載せて展開させ、20分後にデンシトメーター（浜松ホトニクス）で数値を算出し、判定した。
表１に結果を示す。
5). Measurement Using the chromatographic medium prepared above, the presence or absence of an antigen specific to pork in the sample was measured by the following method. That is, a developing solution consisting of a 150 mM sodium chloride solution containing 0.20% by weight Tween20 was prepared, and a sample containing pork prepared as described above was diluted 4-fold with a developing solution as a positive sample, and other than the prepared porcine Samples containing meat derived from different species were diluted four-fold with a developing solution as negative samples, and each 120 μL was developed on a chromatographic medium sample pad. After 20 minutes, the densitometer (Hamamatsu Photonics) The numerical value was calculated and judged.
Table 1 shows the results.
（実施例２）
実施例１の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において、塩化コリンとともに0.01重量％BPF（Blocking Peptide Fragment, TOYOBO）を用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を表1に示す。
（実施例３）
実施例２の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において塩化コリンの代わりに0.01重量％塩化テトラエチルアンモニウムを用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を表３に示す。
（実施例４）
実施例３の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において塩化テトラエチルアンモニウムの代わりにテトラブチルアンモニウム塩を用いても塩化テトラエチルアンモニウムと同様にＳ／Ｎの改良効果が得られる。
(Example 2)
Example 1 Table 1 shows the results of measurement performed in the same manner as in Example 1 below using 0.01 wt% BPF (Blocking Peptide Fragment, TOYOBO) together with choline chloride in the preparation of the determination site on the chromatographic medium.
(Example 3)
Example 1 Table 3 shows the measurement results obtained in the same manner as in Example 1 below by using 0.01 wt% tetraethylammonium chloride in place of choline chloride in the preparation of the determination site on the chromatographic medium.
Example 4
Example 1 Even when a tetrabutylammonium salt is used in place of tetraethylammonium chloride in the production of the determination site on the chromatographic medium, the S / N improvement effect can be obtained as in the case of tetraethylammonium chloride.
（比較例１）
実施例１の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において塩化コリンを用いず以下、実施例1と同様に測定した結果を表1に示す。
（比較例２）
実施例１の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において塩化コリンの代わりに0.001〜0.025重量％BPF（Blocking Peptide Fragment, TOYOBO）を用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を表1に示す。
（比較例３）
実施例１の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において塩化コリンを用いず、５．測定において0.1重量％塩化コリンを含む展開液を用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を表２に示す。
（比較例４）
比較例３の５．測定において更に0.1重量％BPF（Blocking Peptide Fragment, TOYOBO）含む展開液を用いて以下、比較例３と同様に測定した結果を表２に示す。
（比較例５）
比較例３の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において、0.01重量％BPF（Blocking Peptide Fragment, TOYOBO）を用いて以下、比較例３と同様に測定した結果を表２に示す。
（比較例６）
実施例３の１．クロマトグラフ媒体上への判定部位の作製において塩化テトラエチルアンモニウムの代わりに0.01重量％塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を表３に示す。
(Comparative Example 1)
Example 1 Table 1 shows the results measured in the same manner as in Example 1 below without using choline chloride in the preparation of the determination site on the chromatographic medium.
(Comparative Example 2)
Example 1 Table 1 shows the results measured in the same manner as in Example 1 below by using 0.001 to 0.025 wt% BPF (Blocking Peptide Fragment, TOYOBO) instead of choline chloride in the preparation of the determination site on the chromatographic medium.
(Comparative Example 3)
Example 1 4. Choline chloride is not used in the preparation of the determination site on the chromatographic medium. Table 2 shows the results of measurement performed in the same manner as in Example 1 below using a developing solution containing 0.1 wt% choline chloride.
(Comparative Example 4)
4. Comparative Example 3 Table 2 shows the results obtained by measuring in the same manner as in Comparative Example 3 below using a developing solution further containing 0.1 wt% BPF (Blocking Peptide Fragment, TOYOBO) in the measurement.
(Comparative Example 5)
Comparative Example 3 Table 2 shows the results measured in the same manner as in Comparative Example 3 below using 0.01 wt% BPF (Blocking Peptide Fragment, TOYOBO) in the preparation of the determination site on the chromatographic medium.
(Comparative Example 6)
Example 1 Table 3 shows the results measured in the same manner as in Example 1 below by using 0.01 wt% hexadecyltrimethylammonium chloride in place of tetraethylammonium chloride in the production of the determination site on the chromatographic medium.
本発明のクロマトグラフ媒体は、イムノクロマトグラフ法に用いた場合、陰性検体を測定した際に発生するノイズを効率的に抑制する一方、陽性検体を測定した際に得られるシグナルを増強することができるので、良好なシグナル／ノイズ比を示し、高感度で信頼性の高い臨床検査の実施を可能にするという、産業上の利用可能性を有する。 The chromatographic medium of the present invention, when used in an immunochromatography method, can effectively suppress noise generated when measuring a negative sample, while enhancing the signal obtained when measuring a positive sample. Therefore, it has an industrial applicability of showing a good signal / noise ratio and enabling a highly sensitive and reliable clinical test.
Claims (19)
［Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ］＋Ｘ− （Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して置換基を有してもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有してもよいアルコキシアルキル基、Ｘは、ハロゲンイオンを示す）
で表される化合物である、請求項１から３のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。 A quaternary ammonium salt is represented by the following general formula (I)
[R 1 R 2 R 3 R 4 N] + X − (I)
(Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent or an alkoxyalkyl group which may have a substituent, X represents a halogen ion)
The chromatographic medium according to claim 1, which is a compound represented by the formula:
［Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ］＋Ｘ− （Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して置換基を有してもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有してもよいアルコキシアルキル基、Ｘは、ハロゲンイオンを示す）
で表される化合物である、請求項１２から１５のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体の製造方法。 A quaternary ammonium salt is represented by the following general formula (I)
[R 1 R 2 R 3 R 4 N] + X − (I)
(Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent or an alkoxyalkyl group which may have a substituent, X represents a halogen ion)
The method for producing a chromatographic medium according to claim 12, which is a compound represented by the formula:
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