JP2010154788A

JP2010154788A - スフィンゴ脂質富化麹とその製造方法

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Publication number: JP2010154788A
Application number: JP2008334205A
Authority: JP
Inventors: Masaru Kato; 優加藤; Toshiko Kutsukake; 登志子沓掛
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Priority date: 2008-12-26
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2010-07-15

Abstract

【課題】製麹により、簡便かつ効率的にスフィンゴ脂質が富化された麹を製造する方法、及び該方法により製造されたスフィンゴ脂質富化麹を提供する。
【解決手段】蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、精米歩合又は精麦歩合が４０％以上である米又は麦類を製麹原料として使用することを特徴とする、スフィンゴ脂質富化麹の製造方法を提供する。
【選択図】なし

Description

スフィンゴ脂質とは、スフィンゴイド塩基（長鎖塩基）を構造骨格としてもつ複合脂質の総称である。動物細胞のスフィンゴ脂質の骨格はスフィンゴシンであるが、植物や真菌では主にフィトスフィンゴシンである（非特許文献１）。

スフィンゴ脂質には、スフィンゴイド塩基のアミノ基にアシル基がアミド結合したセラミドや、セラミドに糖、リン、硫黄、アミノ酸など様々な極性基が付加した複合スフィンゴ脂質などがある。なかでも糖が結合したスフィンゴ糖脂質は、真核生物やバクテリアの一部などに普遍的に存在しており、糖鎖部分の構造は様々であることが知られている。グルコースが結合したグルコシルセラミドは、セレブロシドとも呼ばれ植物、真菌、動物に共通してみられる代表的なスフィンゴ糖脂質である（非特許文献２）。

セラミドはヒトの皮膚の角質層の細胞間脂質の主成分として約５０％を占め、皮膚の保湿性や柔軟性にかかわっていると言われている。加齢により減少し、しわ、ドライスキン、肌荒れの原因となるほか、アトピー性皮膚炎にも関与していると考えられている。従来はセラミドを補充する方法として、安価な供給源である牛脳由来のスフィンゴ脂質が用いられていたが、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）発症の原因であるプリオンが脳幹部位に蓄積していることが明らかとなって以来、食品・化粧品用途での利用は不可能となっている。また、合成セラミドは安全性の観点から食品素材としては利用の制限がある。

牛脳の代替供給源として、現在では主に農産加工副産物である大豆油さいやビール粕、米や小麦などの穀類の胚芽、コンニャク芋などが利用されているが、含有量が微量であり、食品としてそのまま利用しにくいことから、有機溶媒などによる抽出・濃縮が行なわれている。このため製造に多大なコストがかり、製品が非常に高価であるという問題があった（特許文献１、２）。

また、酵母、キノコなどの真菌類からもセレブロシドの抽出が行われている。酵母においてはセレブロシドが存在する種は限られているため（非特許文献３）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）やクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）といったセレブロシド生産菌を用い、液体培養下で様々な環境ストレス付与や培地への塩類添加を行い、生産量、蓄積量を高める製造方法も検討されている（特許文献３、４）。

例えば環境ストレスの付与として、培地への食塩添加についての報告があり、これにより菌体重量あたりのセレブロシド含量が増加している（特許文献３）。また、窒素源として培地中へ硫酸アンモニウムを添加する方法や、あるいはナトリウム源として各種ナトリウム化合物を添加する方法も検討されており、いずれも菌体あたりのセレブロシド量が増加するという報告がある（特許文献４）。したがって、酵母においては培地中への塩類添加により、環境ストレスの付与、あるいは栄養源の補給がなされ、これによりセレブロシドが菌体内に蓄積すると考えられる。

このように、酵母においては、培養条件の違いによって菌体量あたりのスフィンゴ脂質量は変動することから、様々な高生産法についての検討がなされてきた。しかしながら、こうしたスフィンゴ脂質を富化した酵母においても、菌体からのセレブロシドの回収のため、有機溶媒抽出や冷凍処理などが用いられており、工程が煩雑であり、多大なコストがかかるほか、環境への負荷も懸念されるなどの問題があった。

また、国内で伝統的な発酵食品の製造に利用されてきた麹菌についても、液体培養時にセラミドやセレブロシドといったスフィンゴ脂質を生産するという報告がある（非特許文献４、５）。しかし、仮に麹菌の液体培養において培養条件の検討を行い、麹菌のスフィンゴ脂質含量を増加させたとしても、菌体だけをろ過回収して食するような食経験が無いため、有機溶媒抽出等の処理が必要となり、前述のような問題点が生じる。

一方で、麹菌の固体培養物については、伝統的に「麹」として丸ごと食する食習慣がある。このため食品として麹菌スフィンゴ脂質を利用するには非常に適している。

現在、麹菌の固体培養（すなわち製麹）は、主に酵素生産や種麹としての胞子着生等を目的として行われている。その際、培地となる穀類の種類やその前処理法は、菌の増殖や酵素生産性を左右するものであり、特に重要であると考えられる。このため、穀類の精米（麦）歩合はいずれも、麹の利用目的によって異なっている。

例えば清酒醸造においては、全国の酒造用米の平均精米歩合が平成４年度６８．１％、５年度６８．５％、６年度６７．７％である（非特許文献６）。玄米の外表部にはタンパク質・脂肪・無機質・ビタミン類が多く、清酒の香味、色沢を劣化させるため、米の外表部を除いてこれらの成分を減少させるのが目的である。

一方、味噌麹製造においては、精米歩合は味噌の種類によって異なるが、一般に９０％前後のものが使用されている。精麦歩合については、裸麦で７０〜８５％、大麦で６０〜７０％である（非特許文献７）。

しかしながら固体培養時、すなわち麹にした際のスフィンゴ脂質の生産能力や分子種についての報告は無く、高生産のための培養条件の検討はもちろん、麹をスフィンゴ脂質供給源として利用するための検討さえ行なわれてきていない。

特開平４−２８２３１７号公報特開平１１−２７９５８６号公報特開２００５−１８５１２６公報特開２００６−５５０７０公報Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，５，６−４３（１９７０）ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，６０，９１９−９４１（２００３）ＦＥＭＳＹｅａｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ，２，５３３−５３８（２００２）日本農芸化学誌，第４９巻，第４号，２０５−２１２（１９７５）ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，４８６，１６１−１７１（１９７７）最新酒造講本、財団法人日本醸造協会（平成１６年）麹学、日本醸造協会発酵，村上英也編著（１９８６）

上記の通り、スフィンゴ脂質を効率的に取得するためには、真菌類などの微生物を供給源とすることが適しているが、酵母やキノコ類を供給源とした場合、その形態や香味ゆえにいずれも食品としてはそのまま使用しづらく、有機溶媒等による濃縮が必須となるために、食品としては極めて高価なものになることから利用の制限があった。また麹菌は液体培養においてスフィンゴ脂質を生産することが知られるが、食用産業利用上有利な固体培養でスフィンゴ脂質を高生産するための最適な方法がなかった。

そこで本発明は、麹菌の固体培養を利用する製麹により、簡便かつ効率的にスフィンゴ脂質が富化された麹を製造する方法、及び該方法により製造されたスフィンゴ脂質富化麹を提供することを目的とする。

本発明者らによるこれまでの知見から、無機塩類の存在下で製麹を行うことで麹中のスフィンゴ脂質が富化できることがわかっている（特願２００８−２０９０２１）。一方、製麹に使用されている米又は麦類中（例えば米の糠部分、麦の麦粒表面近くなど）に無機成分が多く存在することが知られている。

そこで本発明者らは、これらの無機成分をスフィンゴ脂質の富化に利用できるのではないかと考え、製麹に供する米又は麦類の精米歩合又は精麦歩合と製造される麹中のスフィンゴ脂質の収量との関連を調べたところ、特定の精米歩合又は精麦歩合の米又は麦類を製麹原料として製麹に用いた際に、製造される麹中のスフィンゴ脂質の収量が増加していることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
(1) 蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、精米歩合又は精麦歩合が４０％以上である米又は麦類を製麹原料として使用することを特徴とする、スフィンゴ脂質富化麹の製造方法。
(2) 米は丸米である上記(1)記載の方法。
(3) 麦類は大麦である上記(1)記載の方法。
(4) 精米歩合は４０〜９５％の範囲であることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(5) 精米歩合は７０〜９５％の範囲であることを特徴とする上記(4)記載の方法。
(6) 精麦歩合は５０〜９０％の範囲であることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(7) 精麦歩合は６０〜８０％の範囲であることを特徴とする上記(6)記載の方法。
(8) 麹菌はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）であることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(9) 蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(10) 製麹時間は４８時間以上であることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(11) 盛り以降の工程を７５％以上の湿度条件にて行うことを特徴とする上記(10)記載の方法。
(12) スフィンゴ脂質はセレブロシドであることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(13) 上記(1)〜(12)のいずれか記載の方法で製造されたスフィンゴ脂質富化麹。
(14) 上記(13)記載のスフィンゴ脂質富化麹を含有する飲食品。
(15) 蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、精米歩合又は精麦歩合が４０％以上である米又は麦類を製麹原料として使用することを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。

本明細書で使用する「製麹」とは、蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養する、当業者に公知の製麹方法（例えば、蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法など）を指す。これらの製麹方法は、蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌した後に培養する工程を含み、その間、一般的に「引き込み」、「盛り」、「仲仕事」、「仕舞仕事」といった処理を含んでいる。

「盛り」とは、「床もみ」（すなわち種麹植菌）後、麹菌の生育が旺盛になりかけたものを小区分に分けて品温管理をしやすくする作業を指す。一般的に製麹において、盛りまでを「床時代」、盛り以降を「棚時代」と呼ぶ。床時代とは床もみを行った後、蒸した製麹原料を堆積し、布などで包むなどして湿度を維持し、乾燥を防ぐ工程であり、乾燥が進む原因となる手入れをほとんど行わず、切り返しを行うのみで培養を行う。

床時代における製麹温度は、使用する麹菌の菌体生育の至適温度に応じて、一般的には２８〜４２℃、例えば３０〜３７℃とされる。ただし、床時代の製麹温度をおよそ３８℃以上の比較的高温とする場合、麹菌が生育阻害を受ける虞がある。なお、製麹温度とは、麹の品温を意味する。製麹温度は、麹菌の生育に伴う発酵熱を制御することによって、又は製麹における周囲温度を制御することによって調節することができる。

床時代の所要時間は、一般的には１８時間〜２０時間である。生育が旺盛になった状態のまま長時間放置すると発酵熱を除くことができず、品温が制御できなくなるうえに、原料が密集しているため製麹の生育が抑制されてしまうため、この時点で盛りを行い、棚時代に移行する。

一方、棚時代は、麹を薄く盛り、麹の水分蒸発を進める工程であり、この培養工程の中で、「仲仕事」、「仕舞仕事」と呼ばれる手入れ作業が行われる。上記非特許文献７によれば、出麹までに蒸発する総水分量の７５％が仲仕事までの間に蒸発することが記載されている。棚時代は、一般的には、仲仕事の時点で３４〜３６℃、仕舞仕事の時点で３８〜３９℃、仕舞仕事以降を４０℃〜４２℃の製麹温度とし、４３〜４８時間（醤油麹の場合は２〜３日間）の製麹時間で行われる。

製麹の詳細については、例えば上記非特許文献７及び発酵ハンドブック（（財）バイオインダストリー協会発酵と代謝研究会編，２００１年）などを参照されたい。

本発明のスフィンゴ脂質富化麹の製造方法又は麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法（以下、これらを「本発明の方法」という）において、下記で特に規定されない限り、製麹を上記のような当業者に公知の製麹と同様にして行うことができること、当業者は適宜上記条件を変更できることに留意すべきである。

具体的に、本発明の方法は、製麹において、精米歩合又は精麦歩合が４０％以上である米又は麦類を製麹原料として使用することを特徴とする。

本明細書で使用する用語「精米又は精麦」とは、米又は麦類の種子から果皮、種皮、胚芽などを除去する処理をいい、原料穀類に応じて米の場合は精米、麦類の場合は精麦と称する。精米又は精麦は、一般的な穀類搗精機、例えば、精米機や、石臼のように表面を削り取る原理を有している機器によって行うことができる。

本明細書で使用する用語「精米歩合又は精麦歩合」とは、「精米又は精麦」の程度を表す用語である。ここで、例えば「精米歩合又は精麦歩合が６０％である」とは、精米又は精麦によって原料穀類から除去される部分が４０％であり、その他製麹原料として使用される部分が６０％であることをいう。例えば、精米歩合は、玄米量と精米後の白米量から式：精米歩合％＝白米ｋｇ/玄米ｋｇ×１００によって計算することができる（上記非特許文献６参照）。

本発明の方法で使用される麦類は、麹菌を生やして麹にできるものであれば特に制限されず、例えば大麦、小麦などを使用することができる。特に大麦を使用することが好ましい。

本発明の方法において、好ましい精米歩合又は精麦歩合は、使用する穀類原料の種類に応じて変化し得る。例えば、穀類原料として米を使用する場合には、精米歩合は４０％以上１００％未満の範囲、例えば４０％〜９５％、４５％〜９５％、５０％〜９５％、５５％〜９５％、６０％〜９５％、６５％〜９５％、７０％〜９５％、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０〜９５％である。精米歩合が９０％程度であることが最も好ましい。但し、玄米は澱粉が露出していないため、麹菌が中に入り込みにくく、一般的には使用に好ましくない。また穀類原料として麦類を使用する場合には、精麦歩合は５０％以上９０％未満の範囲、例えば５５％〜８５％、６０％〜８０％、６５％〜７５％である。精麦歩合が７０％程度であることが最も好ましい。

本発明の方法において、穀類原料として米を使用する場合には、丸米を使用することが好ましい。これは製麹原料として破米よりも丸米を使用した方が製造される麹中のスフィンゴ脂質含量が顕著に高いという本発明者らの今回の知見に基づいている（例えば実施例６参照）。

本発明の方法に用いることができる麹菌は、スフィンゴ脂質を生産できるものであれば特に限定されないが、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）や、その近縁のアスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）などを挙げることができる。Ａ．オリゼとして具体的には市販の種麹や、登録番号ＲＩＢ４０、ＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８又はＡＴＣＣ３６２６１で指定される特定の菌株などを用いることができる。また、Ａ．ソーエとしては、市販の種麹や、登録番号ＪＣＭ２２２６、ＮＢＲＣ４２３９又はＮＢＲＣ５２４１で指定される特定の菌株などを用いることができる。Ａ．オリゼとしてＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８が、そしてＡ．ソーエとしてＪＣＭ２２２６が米、大麦の両方の麹においてセレブロシド生産量が高いことから、本発明で使用するのに特に適している。また、上記麹菌以外の麹菌として、大麦麹の場合にＡ．オリゼ登録番号ＮＢＲＣ４２５５、ＡＴＣＣ１１４９４、ＡＴＣＣ１６８６８、ＮＢＲＣ５７８６、ＪＣＭ２２４５、ＮＢＲＣ５２４０などを、米麹の場合にＡ．オリゼ登録番号ＪＣＭ２２２７、ＪＣＭ２１７３、ＪＣＭ２２２９、ＮＢＲＣ４２６１などを使用することができる。

本発明の方法において、蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることが好ましい。蒸きょう後の製麹原料の水分量が３０％以下であるか又は３６％以上であると、麹菌の立ち上がりが抑制されてしまう虞があるからである。

本発明の方法において、製麹時間は４８時間以上であることが好ましい。これは一般的な製麹時間である４３〜４８時間（上記非特許文献７参照）経過後のさらなる継続的な培養により、スフィンゴ脂質量がさらに増加するという本発明者らの知見に基づいている（例えば実施例６参照）。本発明の方法における製麹時間の上限は特に制限されず、スフィンゴ脂質の量が経時的に増加する限り培養を継続することができ、例えば７２時間、１６０時間まで培養を継続することができる。なお、製麹時間とは、種麹の植菌後から製麹終了までの時間をいう。

また製麹を４８時間以上継続する場合には、製麹における盛り以降の工程を高湿度にて実施することが好ましい。一般的な製麹においては、酵素生産量の増加及び保存性を高めるために盛り以降の工程で湿度を低下させて麹の水分含量を低下させるが、本発明においては、盛り以降の工程を高湿度を維持したまま継続して麹水分の蒸散を抑制することによってスフィンゴ脂質の生産を増加できる（下記実施例６参照）。また本願出願人による先の出願（特願2008-187747号）には、そのような高湿度条件下での長期培養により、製造される麹中のスフィンゴ脂質を、一般的な製麹条件にて製造された麹に比較して、約１．７倍〜約６．７倍まで高めることができる旨が開示されている。なおここでいう「高湿度」とは、７５％以上、好ましくは８５％以上の湿度をいう。

上記のようにして製造される麹は、スフィンゴ脂質（特にセレブロシド）を豊富に含むものである。具体的には、本発明の方法により製造されるスフィンゴ脂質富化麹は、乾燥重量１ｇ当たり少なくとも８０μg以上、好ましくは１３６μg以上のスフィンゴ脂質を含むことができる。なお、麹中のスフィンゴ脂質の量は、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどを使用することによって測定することができる（実施例２参照）。

製麹において、精米(麦)歩合は直ちに麹菌の繁殖に仕方に影響し、精米(麦)歩合が高いと灰分やタンパク質、ビタミンが多く、菌の繁殖が盛んになることが知られているが（非特許文献７）、本発明者らが各種液体培地における麹菌のスフィンゴ脂質含量を測定したところ、酵母での報告と同様に、培地成分の違いによって菌体量あたりの含量が異なるという結果が得られており（比較例１）、これはスフィンゴ脂質の増加が単に菌体量の増加によるものではないことを示唆している。本発明の方法による麹中のスフィンゴ脂質の増加は、菌体量の増加と菌体量当たりのスフィンゴ脂質の増加により相乗的に高められた結果であると考えられる。

このように、本発明の方法は、煩雑な条件でストレスをかける工程などを必要とせず、製造されるスフィンゴ脂質富化麹も、有機溶媒を用いた抽出や、濃縮をすることなく、そのまま飲食品として提供することができるため、労力とコストを低減でき、なおかつ安全性が高いといった利点を有する。
したがって、本発明は、本発明に係るスフィンゴ脂質富化麹を含有する飲食品を包含する。

本発明に係る飲食品は、飲食品原料の一部として用いたり、或いは飲食品の製造工程又は製造後に添加又は配合することにより得ることができる。本発明に係る飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などとして提供することもできる。

本発明に係る飲食品の形態は特に制限されず、例えばこれに制限されるものではないが、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類（アルコール性飲料）、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、サラダ、スープ等の各種総菜などを例示することができる。

また、飲食品中の有効成分としてのスフィンゴ脂質富化麹の摂取量は、通常、４．４〜８．８ｇ／日、好ましくは７．５〜１５．０ｇ／日程度とすることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[実施例１] 米麹セレブロシド標準品の精製と構造解析
米麹セレブロシド標準品の調製法を以下に示した。Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）を使用して製麹した米麹５．４ｋｇを粉砕し、５倍量のクロロホルム−メタノール（２：１）で２回抽出、濾過して得られた抽出液を濃縮、乾固後、０．２ＭＫＯＨ−メタノール溶液にて３７℃で２時間振盪し、グリセロ脂質を分解しアルカリ安定脂質を得た。中和後、濃縮、乾固し、クロロホルム−メタノール−０．８％ＮａＣｌ（８：４：３）に再溶解した。振盪混合し、遠心分離後、下層を濃縮した。

これをケイ酸カラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノールを用いて遊離脂肪酸等を除いた。再度ケイ酸カラムクロマトグラフィーに供した後、セレブロシド画分として白色の固形油脂状物４０７．９ｍｇを得た。その後、わずかに混在する遊離脂肪酸を除去するため、さらにＨＰＬＣ−示差屈折検出器（（株）島津製作所製）を用いて精製を行なった。カラムはＹＭＣＰａｃｋＯＤＳ−Ａ；２０×２５０ｍｍ、カラムオーブンは４０℃、移動相にはメタノールを用いて、アイソクラティック溶出を行い、流速６ｍｌ／ｍｉｎとした。得られた精製品は、薄層クロマトに供したところ単一スポットとなり、また以下に示すように主要分子がグルコシルセラミドと同定されたため、これを標準
品としてセレブロシドの定量を行った。

主要分子種の構造解析を行った。すなわち、ＨＰＬＣ−示差屈折検出器（（株）島津製作所製）を用いて、前述の条件で、精製セレブロシドに含まれる主要分子を分取した。得られた主要３分子（保持時間２８．７分、３２．１分、３７．４分）について、構造解析を実施した。

保持時間２８．７分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ７７６．５７４５６に（Ｍ＋Ｎａ）^＋イオンが観測され、分子式はＣ_４３Ｈ_７９ＮＯ_９（Ｃ_４３Ｈ_７９ＮＯ_９Ｎａｃａｌｄ７７６．５６５２５（Δ＋４．５７ｍｍｕ））と決定した。

次にこの分子を重ピリジン（Ｃ_６Ｄ_５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析を行った。^１Ｈ及び^１３ＣＮＭＲスペクトルの特徴からこの分子がセレブロシドであると同定された。まず糖部分の^１Ｈ、^１３Ｃ化学シフト値及びＪ_ＨＨ値から、構成糖はグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。

脂肪酸については^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−２’（δ５．１０）−Ｈ−３’（δ６．１０、Ｊ３’，４’＝１５．７Ｈｚ）−Ｈ−４’（δ６．１６）というｖｉｃｉｎａｌｓｐｉｎ結合が観測されること、また^１ＨＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ、３−トランス脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするために、この分子をメタノール性０．９ＮＨＣｌを用いて１００℃、１８時間還流することで分解（メタノリシス）し、脂肪酸メチルエステルとした。ヘキサン抽出で脂肪酸メチルエステルを精製後、これをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ３６９に（Ｍ−１５）^＋のピークが観測され、この分子を構成する脂肪酸炭素数はＣ１８と決定した。

長鎖塩基については^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−１（δ ４．２３、δ４．６９）−Ｈ−２（δ４．７９）−Ｈ−３（δ ４．７４）−Ｈ−４（δ５．９９、Ｊ４，５＝１５．８Ｈｚ）−Ｈ−５（δ５．９２）−Ｈ−６（δ２．１４）−Ｈ−７（δ ２．１４）−Ｈ−８（δ５．２４）というｖｉｃｉｎａｌｓｐｉｎｎｅｔｗｏｒｋが観測されること及びＨＭＢＣスペクトルで９−ＣＨ_３（δ１．６０）からＣ−８（δ１２３．３）、Ｃ−９（δ１３．５）に^１Ｈ−１３Ｃ遠隔スピン結合が観測されることから、９−メチル−４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また^１ＨＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分は直鎖であることも明らかであった。この時点で既に脂肪酸の炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ１８）の炭素数を引いたＣ１８であると決定された。その結果、この分子の構造は図１に示すように１８ｈ：１−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類に特徴的な構造であった（上記非特許文献２）。

保持時間３２．１分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ７７８．５８４０３に（Ｍ＋Ｎａ）^＋イオンが観測され、分子式はＣ_４３Ｈ_８１ＮＯ_９（Ｃ_４３Ｈ_８１ＮＯ_９Ｎａｃａｌｄ７７８．５８０９０（Δ＋３．１３ｍｍｕ））と決定した。

次にこの分子を重ピリジン（Ｃ_６Ｄ_５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析を行った。^１Ｈ及び^１３ＣＮＭＲスペクトルは１８ｈ：１−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃ（保持時間２８．７分）によく類似していた。糖部分の^１Ｈ、^１３Ｃ化学シフト値及びＪ_ＨＨ値はほぼ同一であることから、構成糖はグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。

脂肪酸については^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−２’（δ４．５６）−Ｈ−３’（δ２．１２）というｖｉｃｉｎａｌｓｐｉｎ結合が観測されたこと、また^１ＨＮＭＲで末端メチルがδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするためにメタノリシスを行い、脂肪酸メチルエステルとした。ヘキサン抽出で脂肪酸メチルエステルを精製後、これをトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を
実施した。この結果、ｍ／ｚ３７１に（Ｍ−１５）^＋のピークが観測され、この分子を構成する脂肪酸炭素数はＣ１８と決定した（＝２−ヒドロキシステアリン酸）。

長鎖塩基については^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトル及びＨＭＢＣスペクトルにおいて１８ｈ：１−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃとまったく同じ相関が認められることから、この分子の長鎖塩基も９−メチル−４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また^１ＨＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分も直鎖であることも明らかであった。既に脂肪酸の炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ１８）の炭素数を引いたＣ１８あると決定された。その結果、この分子の構造は図１に示すように１８ｈ：０−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類に特徴的な構造であった（上記非特許文献２）。

保持時間３７．４分の分子をメタノールに溶解し、ＨＲＥＳＩ−ＭＳ（＋）を測定した。この結果、ｍ／ｚ７９２．６０１５８に（Ｍ＋Ｎａ）^＋イオンが観測され、Ｆ５の分子式はＣ_４４Ｈ_８３ＮＯ_９（Ｃ_４４Ｈ_８３ＮＯ_９Ｎａｃａｌｄ７９２．５９６５５（Δ＋０．９４ｍｍｕ））と決定した。

次にこの分子を重ピリジン（Ｃ_６Ｄ_５Ｎ）に溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ解析）を行った。^１Ｈ及び^１３ＣＮＭＲスペクトルは１８ｈ：０−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃ（保持時間３２．１分）によく類似していた。糖部分の^１Ｈ、^１３Ｃ化学シフト値及びＪ_ＨＨ値についても１８ｈ：０−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃと同一であることから、構成糖もグルコースであり、これがβ−結合（Ｊ１”，２”＝７．８Ｈｚ）で長鎖塩基と結合していること（＝β−グルコシルセラミド）が判明した。次に^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトルを測定し、脂肪酸及び長鎖塩基部分の構造について解析を行った。

脂肪酸については^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトルにおいて１８ｈ：０−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃと同様にＨ−２’（δ４．５６）−Ｈ−３’（δ２．１２）というｖｉｃｉｎａｌｓｐｉｎ結合が観測されること、また^１ＨＮＭＲで末端メチルがδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されることから、直鎖の２−ヒドロキシ脂肪酸であることが明らかとなった。次に脂肪酸の炭素数を明らかにするために、メタノリシスを行い、脂肪酸メチルエステルとした。精製後トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体化し、ＧＣ／ＭＳ解析を実施した。この結果、ｍ／ｚ３９９に（Ｍ−１５）^＋のピークが観測され、Ｆ５を構成する脂肪酸炭素数はＣ２０と決定した（＝２−ヒドロキシアラキジン酸）。

長鎖塩基については^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹスペクトルでＨ−１（δ４．２３、δ４．６９）−Ｈ−２（δ４．７９）−Ｈ−３（δ４．７４）−Ｈ−４（δ５．９９、Ｊ４，５＝１５．８Ｈｚ）−Ｈ−５（δ５．９２）−Ｈ−６（δ２．１６）−Ｈ−７（δ２．１６）−Ｈ−８（δ５．４６）−Ｈ−９（δ５．４６）というｖｉｃｉｎａｌｓｐｉｎｎｅｔｗｏｒｋが観測されること及び１８ｈ：０−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃで観測された９−ＣＨ_３の信号が観測されないことから、４トランス、８−トランス−スフィンガジエニン構造を有していることが明らかとなった。また^１ＨＮＭＲで末端メチルはδ０．８５にｔｒｉｐｌｅｔとして観測されるため、アルキル鎖部分は直鎖であることも明らかであった。既に脂肪酸炭素数は明らかとなっているため、長鎖塩基を構成する炭素数は分子式から糖（Ｃ６）及び脂肪酸（Ｃ２０）の炭素数を引いたＣ１８であると決定され、この結果、この分子の構造は図１に示すように２０ｈ：０ｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃであることが一義的に決定された。また、この構造は真菌類及び植物に特徴的な構造であり（上記非特許文献２）、米由来のセレブロシドも含まれていると考えられる。

続いて、セレブロシドの精製品をＬＣ／ＭＳ（ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ島津製作所）によって分析し、主要３分子の量比を調べた。イオン化モードはＥＳＩ（−）、カラムはＣａｄｅｎｚａＣＤ−Ｃ１８１５０×２ｍｍ、移動相はＴＨＦ／メタノール（１／９ｖ／ｖ）を用いてアイソクラティック溶出を行い、流速は０．２ｍｌ／ｍｌとした。その結果、それぞれの分子種の量比は、以下のとおりであることが示唆された。このことから、真菌に特徴的な分子である１８ｈ：０−９Ｍｅｄ１８：２４ｔ，８ｔ−Ｇｌｃが、米麹中のセレブロシドの大半を占めることが示された。

[実施例２] 米麹、大麦麹中のセレブロシド含量の測定法
下記実施例３〜６におけるセレブロシドの定量は、各検体から有機溶剤を用いて抽出後、実施例１で得られたセレブロシドを標準品として用い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行った。ＴＬＣとＨＰＬＣのどちらの測定法においても、定量値がほぼ一致していることを確認した（図２）。

また、麹からのセレブロシドの抽出は以下に示すように単回、又は繰り返し抽出により行った。単回抽出は、より簡便な方法によって、各実験区におけるセレブロシド含量の比較を行うために実施し、繰り返し抽出は実際に麹に含まれるセレブロシド含量を定量する目的で実施した。各抽出法で得られる定量値について、比較データの一例を図２に示した。検討の結果、麹中のセレブロシド含量によって、単回抽出の抽出効率は変動し、繰り返し抽出で得られる米麹中のセレブロシド含量は、単回抽出で得られる定量値の約１．５〜２倍程度に相当する事が示された。

単回抽出によるセレブロシド量の測定法を以下に示す。麹を凍結乾燥後、粉砕物１ｇに対してクロロホルム−メタノール溶液（２：１）３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間超音波処理を行った。これを遠心分離して得られた上清１ｍｌに対し、０．８％ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加後、振盪混合した。これを遠心分離して得られた下層を回収し、一定量を測定に用いた。

繰り返し抽出による総セレブロシド含量の測定法を以下に示す。米麹を凍結乾燥後、粉砕物１ｇに対し、クロロホルム−メタノール溶液（２：１）３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間超音波処理を行い、遠心分離後に上清を得た。計３回の抽出を行った後、上清全量に１／４量の０．８％ＮａＣｌ溶液を添加し、振盪混合した。これを遠心分離して得られた下層を回収した。上清にクロロホルムを添加して、さらに２回の抽出を行った。下層全量を一定量に合わせ測定を行い、乾燥麹１ｇあたりに含まれる総セレブロシド量を算出した。

ＴＬＣ−デンシトメトリー法によるセレブロシド定量法を以下に示す。抽出した試料をケイ酸薄層クロマトグラフィー（メルク社製、商品名：ＨＰＴＬＣｓｉｌｉｃａ−６０Ｆ２５４）にかけた。クロロホルム−メタノール（９５：１５）で展開後、オルシノール硫酸試薬（オルシノール：０．２％ｗ／ｖ、硫酸：１１．４％ｖ／ｖ）を噴霧し、加熱後に出現する赤紫色のセレブロシドのスポットについて、デンシトメトリーを用いて定量を行った。

ＨＰＬＣ−コロナＣＡＤ検出器によるセレブロシド定量法を以下に示す。定量法は、ＨＰＬＣ−蒸発光散乱検出器法（Ｊ．ＯｌｅｏＳｃｉ．，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．３，ｐ．１２７−１３３，２００４）を基に、より検出感度を上げるために検出部分を改良して行った。すなわち移動相は、Ａ液：クロロホルム、Ｂ液：９５％メタノール、を用いて、グラジエント溶出を行った（表２）。カラムは、シリカカラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＳＩＬ−１００Ａ（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）を用い、カラムオーブン：４０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎとした。また、検出器については蒸発光散乱検出器よりも感度、定量範囲、再現性が優れているとされるコロナＣＡＤ検出器を用いた。コロナＣＡＤ検出器は、ガス：窒素ガス、操作時ガス圧：３５ｐｓｉとした。

[実施例３] 各種麹菌のセレブロシド生産量
蒸米および蒸大麦に対し、各種市販種麹１０株及び菌株保存機関より入手した各種麹菌５５株（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８０％以上とし、４６時間製麹した。得られた麹を凍結乾燥し、粉砕後に乾燥麹中のセレブロシド量を実施例２の単回抽出及びＴＬＣ分析によって測定した。

図３に、大麦麹及び米麹に含まれる各種麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ）のセレブロシド生産量を示した。原料が米の場合においても、大麦の場合においても、セレブロシド含量が高い株について、菌株名と入手元の菌株保存機関における識別番号を記した。Ａ．ｏｒｙｚａｅにおいてはＮＢＲＣ４２１４、ＪＣＭ２２２８、ＡＴＣＣ３６２６１を、Ａ．ｓｏｊａｅとしてはＪＣＭ２２２６が、米、大麦、いずれの培地においてもセレブロシド生産量が特に高いことが示された。また、全ての菌株において原料を大麦にした場合の方が、米の場合より生産量が高く（１．１倍〜４倍程度）なった。

[実施例４] 米麹のラボスケールにおける精米歩合の検討
米麹について、ラボスケール製麹時の精米歩合とスフィンゴ脂質生産量の関係を調べた。すなわち、精米歩合が４０、５０、７０、９０％の丸米を用いて水分量３３％の蒸米を調製後、市販の粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：秋田今野社「強力酒母仕込用」種麹）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８５％以上として、３２時間後に品温を４０℃として４６時間製麹した。調製した米麹及び原料米を用い、実施例２の単回抽出及びＴＬＣ分析によって総セレブロシド含量を測定した。結果を図４に示したが、精米歩合が高いほど麹重量あたりのセレブロシド量は高くなる傾向がみられ、精米歩合９０％の時に最も高くなった。

さらに精米歩合が８０、９０％の丸米を用いて４８時間、７２時間の製麹も行い、それぞれ実施例２の繰り返し抽出及びＨＰＬＣ分析によってセレブロシド含量を測定した。結果を図５に示したが、精米歩合９０％で７２時間培養したものでは、セレブロシド含量が最も高くなり、３３６．５μg/gにも達した。

[実施例５] 大麦麹のラボスケールにおける精麦歩合の検討
大麦麹について、ラボスケール製麹時の精麦歩合とスフィンゴ脂質生産量の関係を調べた。すなわち、精麦歩合が５０、６０、７０、８０、９０％の大麦を用いて水分量３３％の蒸麦を調製後、市販の粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：秋田今野社「強力酒母仕込用」種麹）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、相対湿度８５％以上として、３２時間後に品温を４０℃として４８時間製麹した。調製した大麦麹を用い、実施例２の単回抽出及びＴＬＣによって総セレブロシド含量を測定した。結果を図６に示したが、精麦歩合７０％までは精麦歩合が高い方がセレブロシド含量も高くなり、逆に８０％、９０％では含量が低下した。このように大麦麹においては、精麦歩合が高すぎると逆にセレブロシド含量が低下する事が示された。大麦麹においては、精麦歩合が高すぎると、菌糸が穀粒内への入り込めず、菌糸が生育しにくくなると考えられる。

[実施例６] 米麹の実製造スケールにおける精米歩合の検討
米麹について、実製造スケール製麹時の精米歩合とスフィンゴ脂質生産量の関係を調べた。すなわち、精米歩合が６０、７０、８０、９０％の丸米および９０％の破米を用いて水分量３３〜３５％の蒸米を調製後、市販の粉末型麹菌（ハイ・Ｇ樋口松の助商店）を０．１％の割合で接種し、３〜４ｔスケールの無通風型多段式製麹機を用いて常法に従って製麹を行った。すなわち、初発品温３５℃、相対湿度８５％以上として床培養を行った。およそ１日後に棚に盛り、相対湿度７５％前後、品温を３５〜４２℃として４８時間製麹した。また、別の実製造試験として、精米歩合が８０％、９０％の丸米を用いて同様に蒸米を調製後、粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を０．１％の割合で接種し、相対湿度を床、棚培養ともに９５％以上とした以外は同様の条件にて、無通風型多段式製麹機を用いて７２時間製麹した。調製した米麹から、総セレブロシド含量を、実施例２の繰り返し抽出及びＨＰＬＣによって測定した。結果を図７に示したが、４８時間製麹において、丸米では精米歩合が高くなるほど麹重量あたりのセレブロシド量が高くなる傾向がみられ、精米歩合９０％の時に最も高く、約８０μｇ/ｇとなった。また、破米については、精米歩合９０％であってもセレブロシド含量が最も低かった。

さらに、NBRC４２１４株による７２時間製麹においても、セレブロシド含量は精米歩合８０％より９０％の方が高く、約１６０μｇ/ｇとなった。この事から、実製造スケールにおいても、丸米を使用した場合はラボスケールと同様に、精米歩合が高いほどセレブロシド含量が高くなる事が示された。また、盛り以降の湿度を高く維持すると、セレブロシド含量はより高まる上に、精米歩合の最適化による効果がより顕著に現れることが確認された。

[比較例１]
各種液体培地における菌体あたりのセレブロシド量培地条件の違いが菌体あたりのセレブロシド量に及ぼす影響を評価するために、ＣＺＡＰＥＫＤＯＸ培地（２％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ＮａＮＯ_３、０．２％ＫＣｌ、０．１％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、デキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ペプトン、０．５％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％ＮａＮＯ_３、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、麦芽エキス培地（２％モルトエキス）及びポテトデキストロース培地（２．４％ポテトデキストロース）に対し、胞子数が１０５／ｍｌとなるように粉末型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ：ＮＢＲＣ４２１４）を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２ｈｒ培養した。培養後、菌体を回収・洗浄後、凍結乾燥し、実施例２の単回抽出及びＴＬＣによって乾燥菌体あたりのセレブロシド量を求めた。

各培地における乾燥菌体当たりのセレブロシド量を図８に示す。図８から分かるとおり、酵母における報告と同様に、麹菌においても培養条件の違いによって菌体量あたりのスフィンゴ脂質量は変動することがわかった。これは、単純に菌体量が増えればスフィンゴ脂質も増大するというものではないことを示唆している。

図１は、米麹由来のグルコシルセラミド主要分子種の構造を示す。図２は、セレブロシドの測定における薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との比較を示す。図３は、各種麹菌のセレブロシド生産量を示す。図４は、製麹に使用した精米歩合と製造された米麹中のセレブロシド量との関係を示す。図５は、製麹時間４８時間及び７２時間における米麹中のセレブロシド量の比較を示す。図６は、製麹に使用した精麦歩合と製造された大麦麹中のセレブロシド量との関係を示す。図７は、製麹時間４８時間及び７２時間における米麹中のセレブロシド量の比較と、製麹原料として丸米及び破米を使用した際の麹中のセレブロシド量の比較を示す。図８は、各種液体培地における乾燥菌体当たりのセレブロシド量を示す。

Claims

蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、精米歩合又は精麦歩合が４０％以上である米又は麦類を製麹原料として使用することを特徴とする、スフィンゴ脂質富化麹の製造方法。
米は丸米である請求項１記載の方法。
麦類は大麦である請求項１記載の方法。
精米歩合は４０〜９５％の範囲であることを特徴とする請求項１記載の方法。
精米歩合は７０〜９５％の範囲であることを特徴とする請求項４記載の方法。
精麦歩合は５０〜９０％の範囲であることを特徴とする請求項１記載の方法。
精麦歩合は６０〜８０％の範囲であることを特徴とする請求項６記載の方法。
麹菌はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
蒸きょうした製麹原料の水分量が３０〜３６重量％であることを特徴とする請求項１記載の方法。
製麹時間は４８時間以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
盛り以降の工程を７５％以上の湿度条件にて行うことを特徴とする請求項１０記載の方法。
スフィンゴ脂質はセレブロシドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法で製造されたスフィンゴ脂質富化麹。
請求項１３記載のスフィンゴ脂質富化麹を含有する飲食品。
蒸きょうした製麹原料に麹菌を植菌して培養を行う製麹において、精米歩合又は精麦歩合が４０％以上である米又は麦類を製麹原料として使用することを特徴とする、麹中のスフィンゴ脂質を富化する方法。