JP2010151828A - Substrate, manufacturing method, diagnostic system, and detecting method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高度に分枝された巨大分子(macromolecule)に関するものである。本発明は、前記巨大分子が表面に固定された官能基化されたサブストレートに関するものである。また、本発明は、デンドロン(dendron)の一側面には官能的なサブストレートが結合されていて、他側面には標的特異的リガンドが結合されている、分子の大きさが制御されたデンドリマー(size−controlled dendrimer)及びデンドロンに関するものである。また、本発明は、プローブ生体分子が結合されている高度に分枝された高分子が結合された官能基化されたサブストレートを利用した組合わせ化学(combinatorial chemistry)分野、特定蛋白質検出方法、特定核酸混成化、または核酸/ペプチド混成化検出方法に関するものである。 The present invention relates to highly branched macromolecules. The present invention relates to a functionalized substrate in which the macromolecule is immobilized on the surface. The present invention also provides a dendrimer with a controlled molecular size in which a functional substrate is bound to one side of a dendron and a target-specific ligand is bound to the other side. size-controlled dendrimer) and dendrons. The present invention also relates to the field of combinatorial chemistry using a functionalized substrate to which a highly branched macromolecule to which a probe biomolecule is bound, a specific protein detection method, The present invention relates to a method for detecting specific nucleic acid hybridization or nucleic acid / peptide hybridization.
DNA序列、遺伝的変異、及び遺伝子発現に対する大量分析を可能にするため、DNAマイクロアレイ(DNA microarray)は、最初の報告[Fodor et al.,Nature 364,555−556(1993);Saiki et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6230−6234(1986)]以来、多大な関心が持たれている。前記の標準化及びヒト遺伝子分析への応用のために、必須の正確度、再生産性、及び点均質性(spot homogeneity)の側面で改善が必要であると言われている[Hackett et al.,Nature Biotechnology 21,742−743(2003)]。このような側面は、主に理想的な形状とは異なる表面及び分子の中間層構造(molecular interlayer structure)の性質に起因する。類似して、大量標的検出システム分野は、固定された生体活性分子及び生体分子を利用した生物学的分析を含む。 In order to enable large-scale analysis of DNA order, genetic variation, and gene expression, DNA microarrays were first reported [Fodor et al. , Nature 364, 555-556 (1993); Saiki et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230-6234 (1986)] has been of great interest. It is said that due to the aforementioned standardization and application to human genetic analysis, improvements are required in terms of essential accuracy, reproducibility, and spot homogeneity [Hackett et al. , Nature Biotechnology 21, 742-743 (2003)]. Such aspects are mainly due to the nature of the surface and molecular interlayer structure that is different from the ideal shape. Similarly, the mass target detection system field includes immobilized bioactive molecules and biological analysis utilizing biomolecules.
本明細書によるナノサイズに調節された表面に製作されたDNAマイクロアレイは、溶液状態のDNAと同一な程度に、単一塩基で間違えて組合わされた対を識別することができる。このような接近は、最小限の立体障害(steric hindrance)を有して、各々のプローブDNA筋(probe DNA strand)に標的DNAと相互作用することができる十分な空間が与えられる理想的なDNAマイクロアレイを提供する。顕著に増加した識別効率(discrimination efficiency)によって、非常に信頼することができるヒト遺伝子分析を提供することができる。さらに、このような接近は、固定された生体活性分子や生体分子を利用した多様な生物学的分析に応用できるほど一般的である。 A DNA microarray fabricated on a nano-sized surface according to the present specification can discriminate pairs mistakenly combined with a single base to the same extent as DNA in solution. Such access is ideal DNA with minimal steric hindrance, giving each probe DNA strand enough space to interact with the target DNA. Providing a microarray. The significantly increased discrimination efficiency can provide a highly reliable human genetic analysis. Furthermore, such an approach is so general that it can be applied to various biological analyzes using immobilized bioactive molecules and biomolecules.
親和性精製(Affinity purification)は、リガンド結合蛋白質の分離及び同定のための周知の技術である[Cuatrecasas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1968,61,636−643]。不溶性サブストレートに共有的に結合されたリガンド及び相補的な標的蛋白質の特異的相互作用は、複雑な混合物から生体分子を分離するのに要求される特異性を供給する。しかし、前記技術の多様な利用は、伝統的なサブストレートの制約的選択及び不安定性のために、制限がある。多くの固体支持体に対する蛋白質の注目すべき非特異的結合は、新たなサブストレートを確立するのにいつでも問題となってきた(Cuatrecasas,P.J.Biol.Chem.1970,245,3059−3065)。したがって、環境変化による安定性及び正確に定義されて簡便なリガンド結合を示す特異さの観点で、伝統的なサブストレートと比較されるほどの新たなサブストレートを見つけることが要求されてきた。 Affinity purification is a well-known technique for the separation and identification of ligand binding proteins [Cuatrecasas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1968, 61, 636-643]. The specific interaction of the ligand covalently bound to the insoluble substrate and the complementary target protein provides the specificity required to separate biomolecules from complex mixtures. However, the various uses of the technique are limited due to the constrained choice and instability of traditional substrates. The remarkable non-specific binding of proteins to many solid supports has always been a problem in establishing new substrates (Cuatrecasas, PJ. Biol. Chem. 1970, 245, 3059-3065). ). Accordingly, it has been required to find new substrates that are comparable to traditional substrates in terms of stability due to environmental changes and specificity that is precisely defined and exhibits convenient ligand binding.
固体ペプチド合成のために伝統的に使用されてきたAMPCPG(aminopropyl−controlled pore glass)は、多くの好ましい点を有していることが明らかになっている。しかし、CPG(controlled pore glass)の表面は、極性で、コーティングされた時さえも部分的な負の電荷が維持された(Hudson,D.J.Comb.Chem.1999,1,403−457)。蛋白質の注目すべき非特異的結合と関連して、形態は最も重要な役割を果たす。したがって、親和性クロマトグラフィー及び固体ペプチド合成に対する応用は制限されてきた。このような短所が克服される時、前記物質の多様な利用が期待されるはずである。 It has been shown that AMPCPG (aminopropyl-controlled pore glass), which has been traditionally used for solid peptide synthesis, has many favorable points. However, the surface of the CPG (controlled pore glass) was polar and maintained a partial negative charge even when coated (Hudson, DJ Comb. Chem. 1999, 1, 403-457). . In conjunction with the remarkable non-specific binding of proteins, morphology plays the most important role. Thus, applications for affinity chromatography and solid peptide synthesis have been limited. When these shortcomings are overcome, various uses of the material should be expected.
リガンドの接近性は、結合能力を決定する際に重要な要素となる。スペーサ物質(spacer molecule)の導入及びリガンドの濃度の増加が、表面にリガンドをよりよく露出させるために使用される伝統的な方法であった(Rusin,et al.,Biosensors & Bioelectronics 1992,7,367−373;Suen et al.,Ind.Eng.Chem.Res.2000,39,478−487;Penzol et al.,Biotechnol and Bioeng.1998,60,518−523;Spinke et al.,J.Chem.Phys.1993,99,7012−7019)。前記方法は、一定程度の効果はあるが、リガンド間の不適切な間隔及び表面に対する捕獲物質(capture molecule)の無秩序な分布が、未だ解決されていない問題点である(Hearn et al.,J.Chromatogr.A.1990,512,23−39;Murza et al.,J.Chromatogr.B.2000,740,211−218;Xiao et al.,Langmuir 2002,18,7728−7739)。最近、このような問題点を改善するための二つの方法が提供されている。一つの方法は、位置固定のための物質として蛋白質のような巨大物質を利用するものである。前記蛋白質はサブストレートに結合されて、前記位置固定のための物質が除去されて洗浄される。このような方式で、サブストレート上に残留した連結物質間の特定距離が確保される。それにもかかわらず、位置固定のための物質の選択及びこれを除去するための経路は、全ての他の状況に対して精巧に最適化されなければならない(Hahn et al.,Anal.Chem.2003,75,543−548)。他の方法としては、正確に整列された自己組立て単一層(self−assembled monolayer)を提供して、デンドロンの最頂点に活性化された機能基を使用する円錐型のデンドロン(cone−shape dendron)を使用するものである(Xiao et al.,Langmuir 2002,18,7728−7739;Whitesell et al.,Langmuir 2003,19,2357−2365)。 Ligand accessibility is an important factor in determining binding capacity. The introduction of spacer molecules and increasing the concentration of ligand was the traditional method used to better expose the ligand to the surface (Rusin, et al., Biosensors & Bioelectronics 1992, 7, Suen et al., Ind. Eng.Chem.Res.2000, 39, 478-487; Penzol et al., Biotechnol and Bioeng.1998, 60, 518-523; Spinke et al., J. Chem. Phys. 1993, 99, 7012-7019). Although the method is effective to a certain extent, inappropriate spacing between ligands and disordered distribution of capture molecules on the surface are still unsolved problems (Hearn et al., J Chromatogr. A. 1990, 512, 23-39; Murza et al., J. Chromatogr.B.2000,740, 211-218; Xiao et al., Langmuir 2002, 18, 7728-7739). Recently, two methods for improving such problems have been provided. One method uses a giant substance such as a protein as a substance for fixing the position. The protein is bound to the substrate, and the substance for fixing the position is removed and washed. In this manner, a specific distance between the connected substances remaining on the substrate is ensured. Nevertheless, the selection of the substance for position fixing and the route for removing it must be finely optimized for all other situations (Hahn et al., Anal. Chem. 2003). 75, 543-548). Another approach is to provide a self-assembled monolayer that is precisely aligned, and a cone-shaped dendron that uses an activated functional group at the top of the dendron. (Xiao et al., Langmuir 2002, 18, 7728-7739; Whitesell et al., Langmuir 2003, 19, 2357-2365).
本発明は、デンドロンを使用したAMPCPGの改質、デンドロンの最頂点にGSHの追加的結合、及びGST蛋白質の結合による表面物質の特性を提示する。末端に3乃至9つのカルボキシ酸及び最頂点に一つのアミン基を有するデンドロンをマトリクスに導入した。前記カルボキシ酸は固体表面に共有的に結合されている。GST(glutathione S−transferase)遺伝子融合システムに対する理解及び幅広い使用
によって、グルタチオン(glutathione)をデンドロンで処理したサブストレートに対するリガンドとして選択した。前記サブストレートのリガンド結合程度をGST及び2種類の融合蛋白質リガンド(GST−PXP47、GST−Munc−18)を利用して測定した(Smith et al.,Gene 1988,67,31−40;Sebastian et al.,Chromatogr.B.2003,786,343−355;Wu et al.,Chromatogr.B.2003,786,177−185;DeCarlos et al.,J.Chromatogr.B.2003,786,7−15)。
The present invention presents the properties of surface materials by modification of AMPCPG using dendron, additional binding of GSH at the top of the dendron, and binding of GST protein. A dendron having 3 to 9 carboxylic acids at the ends and one amine group at the top was introduced into the matrix. The carboxylic acid is covalently bound to the solid surface. With the understanding and widespread use of the GST (glutathione S-transfer) gene fusion system, glutathione was selected as a ligand for dendron-treated substrates. The degree of ligand binding of the substrate was measured using GST and two types of fusion protein ligands (GST-PX P47 , GST-Munc-18) (Smith et al., Gene 1988, 67, 31-40; Sebastian). et al., Chromatogr.B. 2003,786,343-355; Wu et al., Chromatogr.B.2003,786,177-185; DeCarlos et al., J.Chromatogr.B.2003,786,7- 15).
本発明は、リガンドに結合された分子の大きさが制御された、好ましくは円錐型の化合物が結合されたサブストレートを提供する。 The present invention provides a substrate in which the size of the molecule bound to the ligand is controlled, preferably to which a conical compound is bound.
本発明は、分枝された部位の多数の末端はサブストレートに共有結合されていて、線状の部位の末端は有機モイアティー(organic moiety)に結合することができる官能基を有する分枝された部位及び線状の部位を含むデンドロン(dendron)を含む、規則的に分布する分子の大きさが制御された円錐型の巨大分子の分子層を含むサブストレートに関するものである。
また、前記線状の部位は、スペーサドメイン(L)及び作用基(W)を含み、前記Lは、NH−(CH2)3C(O)、NH−(CH2CH2O)2CH2C(O)、NH−(cyclohexyl)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)、NH−(CH2)7C(O)、NH−(CH2)6C(O)、NH−(CH2)6NH(CO)、NH−(cyclopropyll)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)CH2、NH−(CH2)5、NH−(cyclopropyl)(CO)、及びNH−(CH2)6C(O)からなる群から選択されたものであり、前記Wは、NH、CH2、及びOからなる群から選択されたものである。
In the present invention, the multiple ends of the branched sites are covalently bonded to the substrate, and the ends of the linear sites are branched with functional groups capable of binding to organic moities. The present invention relates to a substrate including a molecular layer of a conical macromolecule whose molecular size is regularly distributed and includes a dendron including a region and a linear region.
The linear part includes a spacer domain (L) and a functional group (W), and the L is NH— (CH 2 ) 3 C (O), NH— (CH 2 CH 2 O) 2 CH. 2 C (O), NH- ( cyclohexyl) (CO), NH- (CH 2) 6 NHC (O), NH- (CH 2) 7 C (O), NH- (CH 2) 6 C (O) , NH- (CH 2 ) 6 NH (CO), NH- (cyclopropyl) (CO), NH— (CH 2 ) 6 NHC (O) CH 2 , NH— (CH 2 ) 5 , NH- (cyclopropyl) ( CO) and NH— (CH 2 ) 6 C (O), and W is selected from the group consisting of NH, CH 2 , and O.
前記巨大分子は、サブストレート上に規則的な間隔で分布する。
詳しくは、前記巨大分子は、線状の部位の官能基間の間隔が約0.1nm乃至約100nmの規則的な間隔になるように分布する。
より詳しくは、前記巨大分子が約10nmの規則的な間隔で分布する。
The macromolecules are distributed at regular intervals on the substrate.
Specifically, the macromolecules are distributed so that the spacing between the functional groups at the linear sites is a regular spacing of about 0.1 nm to about 100 nm.
More specifically, the macromolecules are distributed at regular intervals of about 10 nm.
前記サブストレートにおいて、分枝された部位の末端は、OH、OMe、NH2、及びOBzlからなる群から選択されたものである。 In the substrate, the end of the branched site is selected from the group consisting of OH, OMe, NH 2 and OBzl.
また、保護基(protecting group)が線状の部位の末端に結合されている。前記保護基は、アントラセンメチル(A)、Boc、Fmoc、及びNsからなる群から選択されたものである。 In addition, a protecting group is bound to the end of the linear site. The protecting group is selected from the group consisting of anthracenemethyl (A), Boc, Fmoc, and Ns.
また、前記サブストレートにおいて、前記デンドロンは、下記式で示される重合体である。
Lは、NH−(CH2)3C(O)、NH−(CH2CH2O)2CH2C(O)、NH−(cyclohexyl)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)、NH−(CH2)7C(O)、NH−(CH2)6C(O)、NH−(CH2)6NH(CO)、NH−(cyclopropyll)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)CH2、NH−(CH2)5、NH−(cyclopropyl)(CO)、及びNH−(CH2)6C(O)からなる群から選択されたものであり、
Wは、NH、CH2、及びOからなる群から選択されたものであり、
Xは、アントラセンメチル(A)、Boc、Fmoc、及びNsからなる群から選択されたものであり、
R1〜3、R11〜13、R21〜23、R31〜33、R111〜113、R121〜123、R131〜133、R211〜213、R221〜223、R231〜233、R311〜313、R321〜323、R331〜333は、CH2O(CH2)2C(O)、(CH2)2−(cyclohexyl)−C(O)、CH2−C=C−CH2C(O)、(CH2)7、(CH2)2C(O)、CH2OCH(CH3)CH2C(O)、(CH2)2、CH2OCH2CH(CH3)C(O)、及びCH2OCH(CH3)CH2C(O)からなる群から選択されたものであり、
Tは、OH、OMe、NH2、及びOBzlからなる群から選択されたものである。
In the substrate, the dendron is a polymer represented by the following formula.
L is, NH- (CH 2) 3 C (O), NH- (CH 2 CH 2 O) 2 CH 2 C (O), NH- (cyclohexyl) (CO), NH- (CH 2) 6 NHC ( O), NH- (CH 2) 7 C (O), NH- (CH 2) 6 C (O), NH- (CH 2) 6 NH (CO), NH- (cyclopropyll) (CO), NH- Selected from the group consisting of (CH 2 ) 6 NHC (O) CH 2 , NH— (CH 2 ) 5 , NH— (cyclopropyl) (CO), and NH— (CH 2 ) 6 C (O). Yes,
W is selected from the group consisting of NH, CH 2 , and O;
X is selected from the group consisting of anthracenemethyl (A), Boc, Fmoc, and Ns;
R 1~3, R 11~13, R 21~23 , R 31~33, R 111~113, R 121~123, R 131~133, R 211~213, R 221~223, R 231~233, R 311~313, R 321~323, R 331~333 is, CH 2 O (CH 2) 2 C (O), (CH 2) 2 - (cyclohexyl) -C (O), CH 2 -C = C -CH 2 C (O), ( CH 2) 7, (CH 2) 2 C (O), CH 2 OCH (CH 3) CH 2 C (O), (CH 2) 2, CH 2 OCH 2 CH ( Selected from the group consisting of CH 3 ) C (O), and CH 2 OCH (CH 3 ) CH 2 C (O),
T is selected from the group consisting of OH, OMe, NH 2 and OBzl.
本発明のまた他の具体的な例で、前記サブストレートは、標的特異的リガンドを前記線状の部位の末端に結合させることができる。より詳しくは、前記標的特異的リガンドは、化合物、DNA、RNA、PNA、アプタマー(aptamer)、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、抗体、抗原、バイオミメティックス(biomimetics)、ヌクレオチド類似体(nucleotide analog)、またはこれらの混合物からなる。また、前記巨大分子の線状の部位に結合されている標的特異的リガンド間の距離は、約0.1nm乃至約100nmである。 In yet another specific example of the present invention, the substrate can bind a target-specific ligand to the end of the linear site. In more detail, the target-specific ligand may be a compound, DNA, RNA, PNA, aptamer, peptide, polypeptide, carbohydrate, antibody, antigen, biomimetics, nucleotide analog, or these A mixture of The distance between target-specific ligands bound to the linear sites of the macromolecule is about 0.1 nm to about 100 nm.
本発明のまた他の具体的な例で、前記サブストレートは、半導体(semiconductor)、合成有機金属(synthetic organic metal)、合成半導体(synthetic semiconductor)、金属(metal)、合金(alloy)、プラスチック(plastic)、シリコン(silicon)、シリケート(silicate)、ガラス(glass)、またはセラミック(ceramic)である。詳しくは、前記サブストレートは、スライド(slide)、粒子(particle)、ビーズ(bead)、マイクロウェル(microwell)、または多孔性物質であるが、これに制限されない。前記多孔性物質は、メンブレイン、ゼラチン(gelatin)、または水和ゲル(hydrogel)である。より詳しくは、前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズ(controlled pore bead)である。 In another specific example of the present invention, the substrate may be a semiconductor, a synthetic organic metal, a synthetic semiconductor, a metal, an alloy, a plastic ( plastic, silicon, silicate, glass, or ceramic. In detail, the substrate may be a slide, a particle, a bead, a microwell, or a porous material, but is not limited thereto. The porous material is a membrane, gelatin, or hydrated gel. More specifically, the bead is a controlled pore bead.
また、本発明は、分枝された部位及び線状の部位を含む重合体を含む、規則的に分布する分子の大きさが制御された円錐型の巨大分子の分子層の製造方法に関するものであって、前記分枝された部位の多数の末端はサブストレートに共有結合されていて、前記線状の部位の末端は有機モイアティーに結合することができる官能基を有していて、前記方法は、(i)巨大分子の末端と反応することができるようにサブストレートを官能基化する段階;及び(ii)前記巨大分子をサブストレートと接触させて、前記巨大分子の末端及び前記サブストレート間の結合を形成する段階;を含む。 The present invention also relates to a method for producing a molecular layer of a conical macromolecule having a controlled size of regularly distributed molecules, including a polymer containing branched sites and linear sites. A plurality of ends of the branched sites are covalently bonded to the substrate, and ends of the linear sites have a functional group capable of binding to organic moiety, and the method includes: (Ii) functionalizing the substrate such that it can react with the end of the macromolecule; and (ii) contacting the macromolecule with the substrate to provide a gap between the end of the macromolecule and the substrate. Forming a bond of:
前記製造方法で、前記サブストレートは、半導体、合成有機金属、合成半導体(synthetic semiconductor)、金属(metal)、合金(alloy)、プラスチック(plastic)、シリコン(silicon)、シリケート(silicate)、ガラス(glass)、またはセラミック(ceramic)からなるが、これに制限されない。前記サブストレートは、スライド、ビーズ、マイクロウェル、または多孔性物質である。前記多孔性物質は、水和ゲル、ゼラチン、またはメンブレインである。前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズである。 In the manufacturing method, the substrate includes a semiconductor, a synthetic organic metal, a synthetic semiconductor, a metal, an alloy, a plastic, a silicon, a silicate, a glass ( glass) or ceramic, but is not limited thereto. The substrate is a slide, a bead, a microwell, or a porous material. The porous material is a hydrated gel, gelatin, or membrane. The beads are beads having controlled pores.
また、前記のような製造方法において、標的特異的リガンドを線状の部位の末端に結合させることができ、前記方法は、(i)前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端から保護基を除去する段階;及び(ii)標的特異的リガンドまたは前記リガンドに連結された同型の両作用性(homobifunctional)リンカーまたは異型の両作用性(heterobifunctional)リンカーからなる群から選択されたリンカー分子を前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端と接触させて、前記リガンドまたはリンカー分子及び前記末端が結合を形成するようにする段階;を含む。 In the production method as described above, the target-specific ligand can be bound to the end of the linear site, and the method comprises (i) from the end of the linear site of the macromolecule on the substrate. Removing a protecting group; and (ii) a linker molecule selected from the group consisting of a target-specific ligand or a homotypic homofunctional linker or a heterobifunctional linker linked to said ligand Contacting the ends of the linear sites of the macromolecule on the substrate such that the ligand or linker molecule and the ends form a bond.
前記製造方法において、前記サブストレート上の前記巨大分子によって、線状の部位の末端及び標的特異的リガンド間の結合における障害を最少化させることができる。また、前記製造方法において、前記サブストレート上の前記巨大分子によって、標的特異的リガンドの特異的な標的を検出する際の障害を最少化させることができる。また、前記製造方法において、前記標的特異的リガンドは規則的な間隔で分布する。また、前記製造方法において、前記標的特異的リガンドは低い密度で前記サブストレート上に位置する。また、前記製造方法において、標的特異的リガンドは、化合物、DNA、RNA、PNA、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、酵素、炭水化物、ポリサッカライド、抗体、抗原、バイオミメティックス、ヌクレオチド類似体、またはこれらの混合物である。 In the production method, the macromolecule on the substrate can minimize the obstacle in the binding between the end of the linear site and the target-specific ligand. Further, in the production method, the macromolecule on the substrate can minimize obstacles in detecting a specific target of a target-specific ligand. In the production method, the target-specific ligands are distributed at regular intervals. In the production method, the target-specific ligand is located on the substrate at a low density. In the production method, the target-specific ligand is a compound, DNA, RNA, PNA, aptamer, peptide, polypeptide, enzyme, carbohydrate, polysaccharide, antibody, antigen, biomimetic, nucleotide analog, or a mixture thereof. is there.
本発明のまた他の具体的な例において、本発明は、前記サブストレートを含む遺伝子変異を検出するための診断システムに関し、前記サブストレートは、線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている。このようなオリゴヌクレオチドは癌関連遺伝子である。特に、前記癌関連遺伝子はp53である。 In another specific example of the present invention, the present invention relates to a diagnostic system for detecting a gene mutation containing the substrate, wherein the substrate has a linear site terminal at a target-specific oligonucleotide. It is fixed. Such oligonucleotides are cancer-related genes. In particular, the cancer-related gene is p53.
本発明のまた他の具体的な例において、本発明は、前記サブストレートを分析対象遺伝子を含む試料と接触させる段階を含み、前記サブストレートは、線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている、遺伝子の変異の存在有無の検出方法に関するものである。本方法において、前記遺伝子は癌関連遺伝子である。また、前記遺伝子はp53である。 In yet another specific example of the present invention, the present invention includes the step of contacting the substrate with a sample containing the gene to be analyzed, wherein the substrate has a linear site at the end of the target-specific oligonucleotide. It is related with the detection method of the presence or absence of the variation | mutation of the gene currently fixed to. In this method, the gene is a cancer-related gene. The gene is p53.
本発明のこのような目的は、下記の発明の詳細な説明、添付した図面、及び添付された請求項によって、より明確に理解される。 Such objects of the invention will be more clearly understood from the following detailed description of the invention, the accompanying drawings, and the appended claims.
本発明によれば、リガンドに結合された分子の大きさが制御された、好ましくは円錐型の化合物が結合されたサブストレートを提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a substrate in which the size of a molecule bound to a ligand is controlled, and preferably a conical compound is bound.
本明細書において、‘a’及び‘an’は単数及び複数の全てを意味するために使用される。 In this specification, 'a' and 'an' are used to mean all singular and plural.
本明細書において、‘アプタマー(aptamer)’とは、ワトソン−クリック塩基対の形成または三重筋形成以外のメカニズムによって選択された非オリゴタイド分子、または分子群を特異的に認識することができる単一筋、部分的に単一筋、部分的に二重筋、または二重筋ヌクレオチド序列、有利に複製可能なヌクレオチド序列などを意味する。 As used herein, “aptamer” refers to a single muscle that can specifically recognize a non-oligotide molecule or a group of molecules selected by a mechanism other than Watson-Crick base pair formation or triple muscle formation. , Means partially single muscle, partially double muscle, or double muscle nucleotide sequence, advantageously replicable nucleotide sequence, and the like.
本明細書において、‘ニ官能性または二作用性(bifunctional)’、‘三官能性または三作用性(trifunctional)’、及び‘多官能性または多作用性(multifunctional)’が合成重合体または多価ホモ重合体またはヘテロ重合体性ハイブリッド構造を示すために使用される場合、二価、三価、または多価を意味したり、二つ、三つ、または複数の特異的認識要素、定義された序列断片、または結合シートを含むことを意味する。 As used herein, 'bifunctional or bifunctional', 'trifunctional or trifunctional', and 'multifunctional or multifunctional' are synthetic polymers or multifunctional. When used to indicate a valent homopolymer or heteropolymeric hybrid structure, it means divalent, trivalent, or multivalent, or two, three, or more specific recognition elements are defined Or containing binding sheets.
本明細書において、‘バイオミメティック(biomimetic)’とは、生物学的分子、分子グループ、または構造を模倣する分子、グループ、多分子構造、または方法を意味する。 As used herein, 'biomimetic' means a molecule, group, multimolecular structure, or method that mimics a biological molecule, molecular group, or structure.
本明細書において、‘デンドリチク分子(dendritic molecule)’とは、中心からまたは中心側に分枝された層の連続的添加または世代添加によって形成された規則的なテンドリチク分子を示す分子を意味する。 In the present specification, the term “dendritic molecule” means a molecule showing a regular tenderic molecule formed by continuous addition or generation addition of a layer branched from the center or toward the center side.
本明細書において、‘デンドリチク重合体(dendritic polymer)’
とは、中心からまたは中心側に分枝された層の連続的添加または世代添加によって形成された規則的なテンドリチク分子を示す重合体を意味する。デンドリチク重合体とは、中心、少なくともひとつ以上の内部分枝層、及び表面分枝層によって特徴づけられる‘デンドリマー(dendrimers)’を含む[see,e.g.,Petar et al.Pages641−645 In Chem.in Britain,(August 1994)]。‘デンドロン(dendron)’とは、焦点から放射された分子を有するデンドリマーの一種で、中心に連結されて、直接または連結モイアティーを通してデンドリマーを形成することができるものを意味する。多くのデンドリマーは、共通の中心に連結された二つまたはそれ以上のデンドロンを含む。しかし、デンドリマーとは、広くは、一つのデンドロンを含む意味で使用されることができる。
As used herein, a 'dendritic polymer'
By a polymer is meant a polymer exhibiting regular tendoric molecules formed by continuous or generational addition of layers branched from the center or toward the center. Dendritic polymers include 'dendrimers' characterized by a center, at least one or more inner branch layers, and a surface branch layer [see, e. g. Petar et al. Pages 641-645 In Chem. in Britain, (August 1994)]. “Dendron” means a type of dendrimer having a molecule emitted from a focal point that can be linked to the center to form a dendrimer, either directly or through a linking moiety. Many dendrimers contain two or more dendrons linked to a common center. However, the dendrimer can be used broadly in the sense of including one dendron.
デンドリチク重合体は、対称または非対称的な分枝型デンドリマー、キャスケート分子、及びアーボロル(arborol)などを含むが、これに限定されない。好ましい具体例として、前記分枝された枝は、同一な長さでありうる。例えば、前記分枝は、通常の続けて形成される分枝上に位置した末端のNH2基の水素原子の制限なしに起こることができる。しかし、非対称的なデンドリマーも使用することができる。例えば、リシン(lysine)起源のデンドリマーは非対称的である。つまり、前記デンドリマーの分枝された枝は、その長さが異なる。ある分枝がライシン分子のエプシロン窒素(epsilonnitrogen)で起こり、他の分枝が前記分子を以前に形成された分枝に結合させる反応性カルボキシ基に隣接したアルファ窒素(alpha nitrogen)で起こることができる。 Dendritic polymers include, but are not limited to, symmetric or asymmetric branched dendrimers, caskates, and arbor. As a preferred embodiment, the branched branches may have the same length. For example, the branching can occur without restriction of the terminal NH 2 group hydrogen atom located on the normal subsequent branching. However, asymmetric dendrimers can also be used. For example, dendrimers of lysine origin are asymmetric. That is, the branched branches of the dendrimer have different lengths. One branch can occur at the epsilon nitrogen of the lysine molecule and another branch can occur at the alpha nitrogen adjacent to the reactive carboxy group that attaches the molecule to the previously formed branch. it can.
また、規則的な連続的な分枝層の添加によって形成されなかったとしても、高度に分枝された重合体、例えば高度に分枝されたポリオール類(polyols)は、デンドリマーの分枝された様式に接近するほどの規則性を有する分枝された様式を示す、デンドリチク重合体と同等なものであることができる。 Also, highly branched polymers, such as highly branched polyols, even if not formed by the addition of a regular continuous branch layer, are branched dendrimers. It can be equivalent to a dendritic polymer that exhibits a branched mode with regularity approaching the mode.
本明細書において、巨大分子またはデンドロン構造を説明するために使用される‘高度に分枝された(hyper branched)’または‘分枝された(branched)’という用語は、共有結合またはイオン結合によってサブストレートに結合することができる複数の末端を有している多数の重合体を意味する。ある具体的な例で、前記分枝されたまたは高度に分枝された構造の巨大分子は、予め製造されて(pre−made)、サブストレートに結合されているものである。したがって、本発明の巨大分子から、米国特許第5,624,711号(Sundberg et al.)に記載されたような重合体交差結合方法は除外される。 As used herein, the term 'hyper branched' or 'branched' used to describe macromolecules or dendron structures is defined by covalent or ionic bonds. By many polymers having multiple ends that can be bonded to the substrate is meant. In one specific example, the branched or highly branched macromolecule is pre-made and bound to a substrate. Thus, the macromolecules of the present invention exclude polymer cross-linking methods such as those described in US Pat. No. 5,624,711 (Sundberg et al.).
本明細書において、‘固定された(immobilized)’という用語は、不溶性化されたものを意味したり、不溶性、部分的に不溶性、コロイド、微粒子、分散、懸濁及び/または脱水された物質、または固体支持体に結合したりこれを含む分子、または固体を含んだりこれに結合したり、操作可能に関連づけられたものを意味する。 As used herein, the term 'immobilized' means insolubilized, insoluble, partially insoluble, colloidal, particulate, dispersed, suspended and / or dehydrated material, Alternatively, it means a molecule that binds to or includes a solid support, or that is operably associated with, including, or bound to a solid.
本明細書において、‘ライブラリー(library)’とは、混合物、分子、材料、表面、構造的形態、表面特徴、または選択的で制限がない多様な化学的存在、単量体、重合体、構造体、前駆体、産物、変異体、誘導体、物質、形態、模様、特徴の無作為的または非無作為的混合、集合、または分類(assortment)を意味する。 As used herein, a “library” is a mixture, molecule, material, surface, structural form, surface feature, or a variety of chemical entities that are selective and non-limiting, monomers, polymers, Means a random or non-random mixture, assembly, or classification of structures, precursors, products, variants, derivatives, substances, forms, patterns, features.
本明細書において、‘リガンド’とは、相補的な塩基対の結合を含む親和性基材の引力によって他の分子と特異的に結合することができる選択された分子を意味する。前記リガンドは、核酸、多様な合成化合物、水溶体作用物質(receptor agonist)、部分的作用物質、混合作用物質、拮抗物質(antagonist)、反応誘発分子(response−inducing molecule)、反応促進分子(response−stimulus molecule)、薬品、ホルモン、フェロモン、神経伝達物質(transmitter)、オータコイド(autacoid)、成長因子(growth factors)、サイトカイン(cytokine)、補欠分子群(prosthetic group)、補助酵素(coenzyme)、補助因子(cofactors)、サブストレート、前駆体(precursors)、ビタミン、毒素(toxins)、調節因子(regulatory factor)、抗原、ハプテン(hapten)、炭水化物、分子模写体(molecular mimic)、構造的分子(structural molecule)、作動分子(effector molecule)、選択分子(selectable molecule)、バイオチン(biotin)、ジゴクシジェニン(digoxigenin)、交差反応物質(crossreactant)、類似体(analog)、競争体(competitor)、及びこれら分子の誘導体だけでなく、選択された標的特異的結合を行うことができるライブラリー選択非オリゴヌクレオチド分子、及びこのような物質が2次反応(second molecule)と結合することによって形成されるコンジュゲートを含むが、これらに制限されない。 As used herein, 'ligand' refers to a selected molecule that can specifically bind to other molecules through the attraction of an affinity substrate that includes complementary base pair binding. The ligand may be a nucleic acid, various synthetic compounds, a receptor agonist, a partial agent, a mixed agent, an antagonist, a response-inducing molecule, or a response promoting molecule. -Stimulus molecule, drugs, hormones, pheromones, neurotransmitters, autocoids, growth factors, cytokines, prosthetic groups, coenzymes, coenzymes Factors, substrates, precursors, vitamins, toxins, regulators regulatory factor, antigen, hapten, carbohydrate, molecular mimic, structural molecule, effector molecule, selectable molecule, biomolecule, injectable molecule library selected non-oligonucleotide molecules capable of performing selected target specific binding as well as digoxigenin, crossreactants, analogs, competitors, and derivatives of these molecules And conjugates formed by the binding of such substances to secondary molecules Including, but not limited to
本明細書において、‘リンカー分子’及び‘リンカー’とは、分枝された/線状の重合体のような分子の大きさが制御された巨大分子の分枝された部分を保護基またはリガンドに結合させる分子を意味する。例えば、リンカーは、リガンドをデンドロンに結合させることができる選択された分子、スペーサ分子などを含むが、これに限定されない。 As used herein, 'linker molecule' and 'linker' refer to a branched portion of a macromolecule with a controlled molecular size, such as a branched / linear polymer, as a protecting group or ligand. Means a molecule that binds to For example, linkers include, but are not limited to, selected molecules, spacer molecules, and the like that can attach a ligand to a dendron.
本明細書において、‘低密度(low density)’とは、プローブの個数が約0.01乃至約0.5個/nm2、好ましくは約0.05乃至約0.2個/nm2、より好ましくは約0.075乃至約0.15個/nm2、最も好ましくは約0.1個/nm2であるものを意味する。 As used herein, “low density” means that the number of probes is about 0.01 to about 0.5 / nm 2 , preferably about 0.05 to about 0.2 / nm 2 , More preferably it means from about 0.075 to about 0.15 / nm 2 , most preferably about 0.1 / nm 2 .
本明細書において、‘分子模写体(molecular memics)’及び‘ミメティクス(mimetics)’とは、例えば天然、生物学的、または選別された分子のような他の分子または分子グループの構造または機能と同等か類似した構造、または機能を有するように設計、選択、製作、改質、またはエンジニアリングされた天然または合成ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子または分子グループを意味する。分子模写体は、天然、合成、選択された、または生物学的分子に対する代替剤、代案剤、機能向上剤、機能改善剤、構造的類似体、または機能的類似体として作用することができる分子または多分子構造体を含む。 As used herein, “molecular mimics” and “mimetics” refer to the structure or function of other molecules or groups of molecules such as, for example, natural, biological, or sorted molecules. A natural or synthetic nucleotide or non-nucleotide molecule or group of molecules designed, selected, fabricated, modified or engineered to have an equivalent or similar structure or function. A molecular replica is a molecule that can act as an alternative, alternative, functional enhancer, functional improver, structural analog, or functional analog to a natural, synthetic, selected, or biological molecule. Or a multimolecular structure.
本明細書において、‘ヌクレオチド類似体(nucleotide analog)’とは、核酸合成及び加工、好ましくは化学的合成及び加工だけでなく、酵素的合成及び加工で自然に存在する塩基の代わりに使用されることができる分子、特に塩基対を形成することが可能な変型されたヌクレオチド、及びアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、または少数塩基を含まない任意に合成された塩基を意味する。このような用語は、変型されたピューリン及びピリミジン、少数塩基、転換可能なヌクレオシド、ピューリン及びピリミジンの構造的類似体、標識化(labeled)、誘導体化、及び変型されたヌクレオシド及びヌクレオチド、コンジュゲーティッドヌクレオシド及びヌクレオチド、序列改質剤(modifier)、末端改質剤、スペーサ改質剤、及び骨格が変型されたヌクレオチドを含むが、これに限定されず、またリボス変型ヌクレオチド、ホスホアミデート、ホスホロチオネート、ホスホンアミデート、メチルホスフェノイト、メチルホスフォアミデート、メチルホストアミデート、5´−β−シアノエチルホスホアミデート、メチレンホスホナート、ホスホジオチオエイト、ペプチド、核酸、非光学選択性(achiral)及び中性ヌクレオチド連結(internucleotidic linkages)、及びポリエチレングリコール、芳香性ポリアマイド及び脂肪のような非ヌクレオチド連結を含むが、これに制限されない。 As used herein, a “nucleotide analog” is used in place of naturally occurring bases in nucleic acid synthesis and processing, preferably not only in chemical synthesis and processing, but also in enzymatic synthesis and processing. Molecules that can be formed, particularly modified nucleotides capable of forming base pairs, and any synthesized bases that do not contain adenine, guanine, cytosine, thymidine, uracil, or minority bases. Such terms include modified purines and pyrimidines, minor bases, convertible nucleosides, structural analogs of purines and pyrimidines, labeled, derivatized, and modified nucleosides and nucleotides, conjugated. Including, but not limited to, nucleosides and nucleotides, sequence modifiers, terminal modifiers, spacer modifiers, and backbone modified nucleotides, and ribose modified nucleotides, phosphoramidates, phosphoro Thionate, Phosphonamidate, Methyl Phosphenate, Methyl Phosphoamidate, Methyl Host Amidate, 5'-β-Cyanoethyl Phosphoamidate, Methylene Phosphonate, Phosphodiothioate, Peptide, Nucleic Acid, Non-Optoselectivity (Achiral) and Including, but not limited to, neutral nucleotide linkages, and non-nucleotide linkages such as polyethylene glycols, aromatic polyamides and fats.
本明細書において、‘重合体またはポリマー(polymer)’または‘分枝された/線状のポリマーまたは重合体’という用語は、分子の一末端で分枝された構造を有し、他の末端には線状の部分を有して、分枝された領域はサブストレートに結合し、線状の領域はリガンド、プローブ、または保護基に結合する分子を意味する。 As used herein, the terms 'polymer or polymer' or 'branched / linear polymer or polymer' have a structure branched at one end of the molecule and the other end. Means a molecule that has a linear portion, where the branched region binds to the substrate and the linear region binds to a ligand, probe, or protecting group.
本明細書において、‘ポリペプチド’、‘ペプチド’、及び‘蛋白質’とは、アミノ酸残基から構成された重合体を意味するもので、互いに混用される。この用語は、自然系に存在するアミノ酸から構成された重合体だけでなく、一つ以上の残基が自然に存在するアミノ酸に相応する任意的に合成された類似体である場合にも適用される。前記用語は、また、ポリペプチドを形成するアミノ酸を連結する典型的なペプチド結合に対する多様な変異体を含むものとして使用される。 In the present specification, “polypeptide”, “peptide”, and “protein” mean a polymer composed of amino acid residues, and are used together. This term applies not only to polymers composed of naturally occurring amino acids, but also to the case where one or more residues are arbitrarily synthesized analogs corresponding to naturally occurring amino acids. The The term is also used to include a variety of variants to typical peptide bonds that link the amino acids that form the polypeptide.
本明細書において、‘保護基(protecting group)’とは、分子の反応基(例えばヒドロキシル基またはアミン基)に結合されたグループを意味する。前記保護基とは、一つ以上の化学反応で特定のラジカルの反応を阻止するために選択されたものを意味する。一般に、特定の保護基は、分子に存在する他の反応基の変化なく特定の反応基を回復するために後に除去されるようにするために選択されるものを意味する。保護基の選択は、保護対象の特定のラジカルの機能及びそれが提示される化合物を考慮して行われる。前記保護基の選択に関する技術は、例えばGreeneなどのProtective Groups in Organic Synthesis[2版、John Wiley&Sons,Inc.Somerset,N.J.(1991)]などによって周知である。 As used herein, 'protecting group' refers to a group attached to a reactive group (eg, a hydroxyl group or an amine group) of a molecule. The protecting group means a group selected to prevent reaction of a specific radical by one or more chemical reactions. In general, a particular protecting group refers to one that is selected for subsequent removal to recover a particular reactive group without altering other reactive groups present in the molecule. The choice of protecting group is made taking into account the function of the particular radical to be protected and the compound on which it is presented. The technology relating to the selection of the protecting group is, for example, Protective Groups in Organic Synthesis [2nd edition, such as Greene, John Wiley & Sons, Inc.]. Somerset, N .; J. et al. (1991)].
本明細書において、‘保護化されたアミン(protected amine)とは、アミノ保護基と反応したアミンを意味する。アミノ保護基は、線状の末端の機能基がアミノ基である場合に、分枝された末端が固体支持体に結合される間にアミド反応が起こるのを防止する。前記アミノ保護基は、前記分子で他の反応基の変化なくアミノ基を維持して、次の段階で除去されるようにする。例えば、前記エクソサイクリックアミン(exocyclic amine)は、ジメチルアミノメチレンアミノ反応を行うために、ジメチルホルムアミドジエチルアセタールと反応することができる。アミノ保護基は、一般に、カバーメイト(carbamate)、ベンジルラジカル(benzyl radical)、イミデート(imidate)、及び関連分野の当業者に周知の他のものを含む。好ましいアミノ保護基としては、p−ニトロフェニルエトキシカルボニル(p−nitrophenylethoxycarbonyl)やジメチルアミノメチレンアミノが含まれるが、これに限定されない。 As used herein, 'protected amine' means an amine that has reacted with an amino protecting group. The amino protecting group prevents the amide reaction from occurring while the branched end is attached to the solid support when the linear end functional group is an amino group. The amino protecting group is removed in the next step while maintaining the amino group in the molecule without change of other reactive groups. For example, the exocyclic amine can be reacted with dimethylformamide diethyl acetal to perform a dimethylaminomethyleneamino reaction. Amino protecting groups generally include carbamates, benzyl radicals, imidates, and others well known to those skilled in the relevant arts. Preferred amino protecting groups include, but are not limited to, p-nitrophenylethoxycarbonyl and dimethylaminomethyleneamino.
本明細書において、‘規則的な間隔(regular interval)’という用語は、前記分子の大きさが制御されたデンドリマー(size−controlled dendrimers)の巨大分子の末端間の空間が規則的であることを意味し、これらの間の距離が実際的な立替障害(steric hindrance)なく、標的特異的リガンド及び標的間の相互作用が起こるための空間である約1nm乃至約100nmであることを意味する。したがって、サブストレート上の巨大分子層は、特異的な分子相互作用が起こるように、密度が高すぎてはならない。 In this specification, the term 'regular interval' means that the space between the ends of macromolecules of size-controlled dendrimers whose size of the molecule is controlled is regular. It means that the distance between them is about 1 nm to about 100 nm, which is the space for interaction between the target specific ligand and the target to occur without any practical hindrance. Therefore, the macromolecular layer on the substrate must not be too dense so that specific molecular interactions can occur.
本明細書において、‘固体支持体(solid support)’とは、固定化されたサブストレートからなる構造を意味する。前記固定化されたサブストレートとは、不溶性物質、固体、表面、サブストレート、層、コーティング(coating)、織物または不織布、マトリクス、結晶、メンブレイン、不溶性重合体、プラスチック、ガラス、生物学的または生物両立性(biocompatible)、生物腐食性(bioerodible)、または生分解が可能な重合体、またはサブストレート、マイクロパーティクル(microparticle)またはナノパーティクル(nanoparticle)を含むが、これに限定されない。固体支持体は、例えば、単一層(monolayers)、二重層(bilayers)、商業的メンブレイン(commercial membranes)、樹脂(resins)、マトリクス、繊維、分離媒質(separation media)、クロマトグラフィー支持体(chromatography support)、重合体、プラスチック、ガラス、雲母、金、ビーズ、マイクロスピア、ナノスピア、シリコン、ガリウム非化物、有機及び無機金属、半導体、絶縁剤、マイクロ構造及びナノ構造を含むが、これに限定されない。マイクロ構造及びナノ構造は、超小型でナノメートル規模であり、超分子の大きさのプローブ、チップ(tip)、バー(bar)、楔、キャップ、棒(rod)、スリーブ(sleeve)、線(wire)、フィラメント、及びチューブを含むが、これに限定されない。 In the present specification, the term “solid support” means a structure composed of an immobilized substrate. Said immobilized substrate is an insoluble material, solid, surface, substrate, layer, coating, woven or non-woven, matrix, crystal, membrane, insoluble polymer, plastic, glass, biological or Includes, but is not limited to, biocompatible, bioerodible, or biodegradable polymers, or substrates, microparticles, or nanoparticulates. Solid supports include, for example, monolayers, bilayers, commercial membranes, resins, matrices, fibers, separation media, chromatographic supports. support), polymers, plastics, glass, mica, gold, beads, microspear, nanospear, silicon, gallium arsenide, organic and inorganic metals, semiconductors, insulators, microstructures and nanostructures, but not limited to . Microstructures and nanostructures are ultra-small and nanometer-scale, supramolecular sized probes, tips, bars, wedges, caps, rods, sleeves, lines ( wire), filaments, and tubes, but are not limited thereto.
本明細書において、‘スペーサ分子’とは、二つのヌクレオチド間またはヌクレオチド及び非ヌクレオチドが結合することができるように選択されたり考案された、一つまたはそれ以上のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子、機能基、スペーサアーム(arm)を意味し、好ましくは、ヌクレオチド間またはヌクレオチド及び非ヌクレオチド間の距離を変化または調整することができるものを意味する。 As used herein, a “spacer molecule” refers to one or more nucleotide or non-nucleotide molecules, functional groups selected or devised so that two nucleotides or nucleotides and non-nucleotides can bind to each other. , Spacer arms, preferably those that can change or adjust the distance between nucleotides or between nucleotides and non-nucleotides.
本明細書において、‘特異的結合’とは、リガンド及びその特異的結合パートナー間、または定義された序列断片及び選択された分子または選択された核酸序列間に、測定可能で再現性がある程度の引力を意味する。引力の程度は最大である必要はない。弱い、中間、または強い引力が多様に適用されることができる。このような相互作用で起こる特異的結合は、本技術分野の専門家に周知である。定義された合成序列断片に関して、それは合成アプタマー、合成ヘテロ重合体に、ヌクレオチドリガンド、ヌクレオチド受容体、形状認識要素、及び特異的に結合可能な表面である。前記‘特異的結合’は、構造的形状及び表面特徴を特異的に認識するものを含む。特異的結合は、化学的同一性(identity)(つまり、一つ以上の同一な化学的グループ)または特異的結合パートナーを有する分子的認識能(つまり、分子的結合特異性)を共有する第3の分子(つまり、競争者)によって競争的に阻害される二つの分子間(つまり、特異的結合パートナー)の特異的で飽和可能で(saturable)非共有的な相互作用を明確に意味する。前記競争者は、例えば交差反応物(cross reactant)、抗体またはその抗原類似体、リガンドまたはその受容体、またはアプタマーまたはその標的である。例えば、抗原抗体間の特異的結合は、交差反応する抗体または抗原により競争的に阻害される。前記‘特異的結合’とは、特異的結合及び構造的形状認識を全て含む特異的認識の部分集合であって、略称または近接した意味で便宜上使用することができる。 As used herein, “specific binding” refers to a measurable and reproducible degree of reproducibility between a ligand and its specific binding partner or between a defined sequence fragment and a selected molecule or selected nucleic acid sequence. It means attraction. The degree of attraction need not be maximal. Weak, medium, or strong attractive forces can be applied in various ways. The specific binding that occurs in such interactions is well known to those skilled in the art. With respect to defined synthetic sequence fragments, it is a synthetic aptamer, synthetic heteropolymer, nucleotide ligand, nucleotide receptor, shape recognition element, and specifically bindable surface. Said 'specific binding' includes those that specifically recognize structural shapes and surface features. Specific binding is a third that shares chemical identity (ie, one or more identical chemical groups) or molecular recognition ability (ie, molecular binding specificity) with a specific binding partner. Clearly means a specific, saturable, non-covalent interaction between two molecules (ie, specific binding partners) that is competitively inhibited by a molecule (ie, a competitor). The competitor is, for example, a cross reactant, an antibody or antigen analog thereof, a ligand or receptor thereof, or an aptamer or target thereof. For example, specific binding between antigen antibodies is competitively inhibited by cross-reacting antibodies or antigens. The “specific binding” is a subset of specific recognition including all of specific binding and structural shape recognition, and can be used for convenience in an abbreviation or close sense.
本明細書において、‘サブストレート’とは、物質(substance)、構造、表面または材料(material)に使用される場合に、非生物学的、合成的、生きていない(nonliving)、平べったい球形の、または平らな表面を含む組成物であって、表面、構造、または材料を含む多様な分子種を超越する複数の認識シート、特異的結合、混成化または触媒的認識シート、または多数の多様な認識シートを含む。前記サブストレートは、例えば半導体、合成(有機)金属、合成半導体、絶縁剤、ドーパント(dopant);金属、合金、元素、化合物、ミネラル;合成、切断、エッチング、リソグラフィ、印刷、機械化されたり微細に製作されたスライド、装置、構造及び表面;産業的重合体、プラスチック、メンブレイン、シリコン、シリケート、ガラス、金属及びセラミック;木、紙、カードボード、綿、毛、服、織物または不織布、材料(material)、ファブリク;分枝された/線状の重合体を利用して、プローブ分子の固定化によって改質されないナノ構造またはマイクロ構造を含むが、これに限定されない。 As used herein, “substrate” refers to a non-biological, synthetic, non-living, flat when used on a substance, structure, surface or material. Composition comprising a spherical or flat surface, multiple recognition sheets transcending various molecular species including surfaces, structures, or materials, specific binding, hybridizing or catalytic recognition sheets, or multiple Including various recognition sheets. The substrate is, for example, a semiconductor, a synthetic (organic) metal, a synthetic semiconductor, an insulating agent, a dopant; a metal, an alloy, an element, a compound, a mineral; a composition, a cutting, an etching, a lithography, a printing, a mechanization, or a fine Manufactured slides, devices, structures and surfaces; industrial polymers, plastics, membranes, silicon, silicates, glass, metals and ceramics; wood, paper, cardboard, cotton, wool, clothing, textiles or nonwovens, materials ( material), fabrics; including but not limited to nanostructures or microstructures that utilize branched / linear polymers and are not modified by immobilization of probe molecules.
本明細書において、‘標的プローブ結合(target−probe binding)’とは、少なくとも一つの選択された分子が特異的方式で他の一つに結合された、二つ以上の分子を意味するものである。一般に、最初に選択された分子は、2番目に選択された分子と間接的に、つまり、例えばスペーサアーム(arm)、スペーサグループ、分子、ブリッジ、運搬体、または特異的認識パートナーの介入によって、または直接的に、例えば、スペーサアーム、グループ、分子、ブリッジ、運搬体、または特異的認識パートナーの介入なく結合することができる。他の非共有的結合は、ヌクレオチド及び非ヌクレオチド分子の結合を意味し、例えばイオン結合、疏水性相互作用、リガンドヌクレオチド結合、キレーティング剤/金属イオン対形成、または特異的結合対、例えばアビジン/バイオチン、ストラップタビジン/バイオチン、アンチ−フルオレセイン/フルオレセイン、アンチ−2,4−ジニトロフェノール(anti−2,4−dinitrophenol)/ジニトロフェノール(DNP)、アンチ−パーオキシダイズ(peroxidase)/パーオキシダイズ、抗ジゴキシジェニン(digoxigenin)/ジゴキシジェニン、またはより一般な収容体/リガンド間の結合を含む。例えば、アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)、ホスラディシュパーオキシダイズ(horseradish peroxidase)、β−カラクトシダーゼ、ウレアーゼ(urease)、ルシフェラーゼ(luciferase)、ロダミン(rhodamine)、フルオレセイン(fluorescein)、フィコエリトリン(phycoerythrin)、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、または、例えば標識の目的で使用された蛍光マイクロスピアなどのリポーター分子が選択した分子または選択された核酸序列にアビジン/ビオチン(avidin/biotin)、ストレプタビジン/ビオチン(streptavidin/biotin)、アンチフルオセイン/フルオセイン、アンチ−ペルオキシダイズ(peroxidase)/ペルオキシダイズ、アンチ−2,4−ジニトロフェノール(anti−2,4−dinitrophenol)/ジニトロフェノール(DNP)、アンチジゴキシジェニン(digoxigenin)/ジゴキシジェニン、または受容体/リガンド間の結合によって(つまり、直接的及び共有結合によって)選択された分子または選択された核酸序列に特異的結合対を通して結合することもできる。 As used herein, 'target-probe binding' refers to two or more molecules in which at least one selected molecule is bound to another one in a specific manner. is there. In general, the first selected molecule is indirectly with the second selected molecule, i.e., for example, by intervention of a spacer arm, spacer group, molecule, bridge, carrier, or specific recognition partner. Or directly, for example, without the intervention of spacer arms, groups, molecules, bridges, carriers, or specific recognition partners. Other non-covalent binding refers to the binding of nucleotides and non-nucleotide molecules such as ionic binding, hydrophobic interaction, ligand nucleotide binding, chelating agent / metal ion pairing, or specific binding pairs such as avidin / Biotin, straptabidine / biotin, anti-fluorescein / fluorescein, anti-2,4-dinitrophenol (anti-2,4-dinitrophenol) / dinitrophenol (DNP), anti-peroxidase / peroxidase , Anti-digoxigenin / digoxigenin, or a more general receptor / ligand binding. For example, alkaline phosphatase, phosphorase peroxydase, β-calactosidase, urease, luciferase, rhodamine, fluorescein, or fluorescein Luminol, isoluminol, acridinium ester, or a molecule selected by a reporter molecule such as a fluorescent microspear used for labeling purposes or a selected nucleic acid sequence, avidin / biotin, streptavidin / biotin (Streptavidin / biotin), anti-fluosei Or fluorescein, anti-peroxydase / peroxysoyde, anti-2,4-dinitrophenol (anti-2,4-dinitrophenol) / dinitrophenol (DNP), anti-digoxigenin / digoxigenin, or It is also possible to bind to a selected molecule or selected nucleic acid sequence through a specific binding pair by receptor / ligand binding (ie, directly and covalently).
[巨大分子重合体の製剤(formulation)]
図1は本発明の重合体の構造式Iを説明するための図である。多様なR、T、W、L、及びX基の変異体が図1に示されている。前記本発明の巨大分子の重合体は、分枝されたり、高度に分枝されたり、または対称か非対称の重合体を含む。前記重合体の分枝された末端は、好ましくは多数の末端を通してサブストレートに結合することができる。前記重合体の線状の末端は、保護基または標的特異的リガンドに結合することができる官能基を有することができる。前記サブストレート上の多数の重合体間のプローブ間の距離は、約0.1nm乃至約100nmであり、好ましくは約1nm乃至約100nm、より好ましくは約2nm乃至約70nm、より好ましくは約2nm乃至約60nm、最も好ましくは約2nm乃至約50nmである。
[Formulation of macromolecular polymer]
FIG. 1 is a view for explaining the structural formula I of the polymer of the present invention. A variety of R, T, W, L, and X group variants are shown in FIG. The macromolecular polymers of the present invention include branched, highly branched, or symmetric or asymmetric polymers. The branched ends of the polymer can be bonded to the substrate, preferably through multiple ends. The linear end of the polymer can have a functional group capable of binding to a protecting group or a target specific ligand. The distance between probes between multiple polymers on the substrate is from about 0.1 nm to about 100 nm, preferably from about 1 nm to about 100 nm, more preferably from about 2 nm to about 70 nm, more preferably from about 2 nm to About 60 nm, most preferably about 2 nm to about 50 nm.
<R作用基>
図1に記載された構造式Iによれば、前記重合体は、一般に分枝された部位を含み、多数の末端が官能基化されてサブストレートに結合する。前記分枝された部位内で、分枝の第1世代作用基Rx(R1、R2、R3)は、官能基Wによって分枝の第2世代作用基Rxx(R11、R12、R13、R21、R22、R23、R31、R32、R33)と連結されている。前記分枝の第2世代作用基は、官能基Wによって分枝の第3世代作用基Rxxx(R111、R112、R113、R121、R122、R123、R131、R132、R133、R211、R212、R213、R221、R222、R223、R231、R232、R233、R311、R312、R313、R321、R322、R323、R331、R332、R333)と連結されている。そして、追加的な第4世代作用基が同一な方式で分枝の第3世代作用基に連結されている。末端のR基は、サブストレートに結合することができるように官能基化されている。
<R working group>
According to Structural Formula I described in FIG. 1, the polymer generally includes a branched site, and multiple ends are functionalized and bonded to the substrate. In sites which are branched the branching, first generation action substituent R x branched (R 1, R 2, R 3) , the second-generation functional group branched by functional group W R xx (R 11, R 12 , R 13 , R 21 , R 22 , R 23 , R 31 , R 32 , R 33 ). The branched second generation functional groups are branched by a functional group W to generate a third generation functional group R xxx (R 111 , R 112 , R 113 , R 121 , R 122 , R 123 , R 131 , R 132 , R 133 , R 211 , R 212 , R 213 , R 221 , R 222 , R 223 , R 231 , R 232 , R 233 , R 311 , R 312 , R 313 , R 321 , R 322 , R 323 , R 331 , R 332 , R 333 ). The additional fourth generation working group is then linked to the branched third generation working group in the same manner. The terminal R group is functionalized so that it can bind to the substrate.
全ての世代のR基は同一であるか相異したものである。通常、R基は、反復単位、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキルなどのような線状または分枝型有機モイアティであるが、これに限定されない。しかし、全てのR基が同一な反復単位であったり、R基の全ての原子の位置(valence position)が反復単位である必要はない。例えば、第1世代の分枝Rx、R1、R2、R3において、前記分枝水準での全てのR基は同一な反復単位でありうる。または、R1は反復単位であり、R2及びR3はHまたは他の全ての化学作用基(chemical entity)でありうる。または、R2は反復単位であり、R1及びR3はHまたは他の全ての化学作用基でありうる。これと類似して、第2世代及び第3世代の分枝の場合には、R基は反復単位、H、または他の全ての化学作用基でありうる。 All generations of R groups are the same or different. Usually, the R group is a linear or branched organic moiety such as, but not limited to, repeating units, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, ether, polyether, ester, aminoalkyl, and the like. However, it is not necessary for all R groups to be the same repeating unit, or for every atom position of the R group to be a repeating unit. For example, in the first generation branches R x , R 1 , R 2 , R 3 , all R groups at the branch level may be the same repeating unit. Alternatively, R 1 can be a repeating unit, and R 2 and R 3 can be H or any other chemical entity. Alternatively, R 2 can be a repeating unit and R 1 and R 3 can be H or all other chemical groups. Analogously, in the case of second and third generation branches, the R group can be a repeating unit, H, or any other chemical group.
したがって、このような方式で多様な形状の重合体を製作することができる。例えば、R1、R11、R111、R112、及びR113が同一な反復単位であり、他の全てのR基がH´または他の多くの中性小分子または原子である場合には、R111、R112、及びR113に対する三つの官能基の末端(termini)を有する分枝を有する非常に長くて薄い重合体が形成される。多様な任意の他の化学的配列が可能である。したがって、サブストレートに結合可能な官能基を有する約3乃至約81個の末端を得ることができる。好ましい末端の個数は、約3個乃至約75個、約3個乃至約70個、約3個乃至約65個、約3個乃至約60個、約3個乃至約55個、約3個乃至約50個、約3個乃至約45個、約3個乃至約40個、約3個乃至約35個、約3個乃至約30個、約3個乃至約27個、約3個乃至約25個、約3個乃至約21個、約3個乃至約18個、約3個乃至約15個、約3個乃至約12個、約3個乃至約9個、または約3個乃至約6個である。 Therefore, polymers having various shapes can be manufactured in this manner. For example, if R 1 , R 11 , R 111 , R 112 , and R 113 are the same repeating unit and all other R groups are H ′ or many other neutral small molecules or atoms A very long and thin polymer is formed having branches with three functional termini for R 111 , R 112 , and R 113 . A wide variety of other chemical sequences are possible. Thus, from about 3 to about 81 termini having functional groups capable of binding to the substrate can be obtained. Preferred terminal numbers are from about 3 to about 75, from about 3 to about 70, from about 3 to about 65, from about 3 to about 60, from about 3 to about 55, from about 3 to About 50, about 3 to about 45, about 3 to about 40, about 3 to about 35, about 3 to about 30, about 3 to about 27, about 3 to about 25 , About 3 to about 21, about 3 to about 18, about 3 to about 15, about 3 to about 12, about 3 to about 9, or about 3 to about 6 It is.
<T末端基>
末端基Tは、添加反応または置換反応が起こるようにするのに十分な反応性がある作用基である。このような作用基の例として、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、アリル、ビニル、イミド、ハルロ、ウレア、オクシラニル、アジリジニル、オキサゾールリニール、イミダゾールリニール、スルホネート、ホスホネート、イソシアネート、イソチオシアネート、シラニル、及びハロゲニルなどを含むが、これに限定されない。
<T terminal group>
The terminal group T is a functional group that is sufficiently reactive to cause an addition or substitution reaction to occur. Examples of such functional groups include amino, hydroxyl, mercapto, carboxyl, alkenyl, allyl, vinyl, imide, halo, urea, ocsilanyl, aziridinyl, oxazole linyl, imidazole linyl, sulfonate, phosphonate, isocyanate, isothiocyanate, Including, but not limited to, silanyl, halogenyl and the like.
<W作用基>
図1の構造式Iにおいて、Wは重合体を他のもの(または他の全ての2価有機モイアティ)に連結させることができる全ての作用基であり、エーテル、エステル、アミド、ケトン、ウレア、ウレタン、イミド、カルボネート、カルボン酸無水物、カルボジイミド、イミン、アゾ基、アミジン、チオカルボニル、有機スルフィド、ジスルフィド、ポリスルフィド、有機スルホキシド、サルファイト、有機スルホン、スルホンアミド、スルホン酸塩、有機スルフェート、アミン、有機ホスホロス基、アルキレン、アルキレンオキシド、アルキレンアミンなどを含むが、これに限定されない。
<W working group>
In Structural Formula I of FIG. 1, W is any functional group that can link the polymer to another (or any other divalent organic moiety), ether, ester, amide, ketone, urea, Urethane, imide, carbonate, carboxylic anhydride, carbodiimide, imine, azo group, amidine, thiocarbonyl, organic sulfide, disulfide, polysulfide, organic sulfoxide, sulfite, organic sulfone, sulfonamide, sulfonate, organic sulfate, amine , Organic phosphoros groups, alkylenes, alkylene oxides, alkylene amines and the like.
<Lスペーサまたはリンカー>
図1において、重合体の線状の部分は、任意に作用基が散在したリンカー部位を含むスペーサドメインを含む。リンカー部位は、多様な重合体から構成される。リンカーの長さは、多様な因子によって決定され、このような因子には、サブストレートに結合する分枝された作用基の数、サブストレートとの結合の長さ、使用されたR基の形態、特に使用された反復単位の形態、重合体の線状の部位の末端に結合する標的特異的リガンドまたは保護基の形態などがある。したがって、前記リンカーは、特定の類型の重合体または特定の長さに制限されないことが分かる。しかし、一般的な基準として、リンカーの長さは約0.5nm乃至約20nmであり、好ましくは約0.5nm乃至約10nm、最も好ましくは約0.5nm乃至約5nmである。
<L spacer or linker>
In FIG. 1, the linear portion of the polymer includes spacer domains that include linker sites optionally interspersed with functional groups. The linker moiety is composed of various polymers. The length of the linker is determined by a variety of factors, such as the number of branched functional groups attached to the substrate, the length of the bond with the substrate, the form of the R group used. In particular, the form of repeating units used, the form of target-specific ligands or protecting groups that bind to the ends of the linear sites of the polymer, etc. Thus, it can be seen that the linker is not limited to a particular type of polymer or a particular length. However, as a general rule, the linker length is from about 0.5 nm to about 20 nm, preferably from about 0.5 nm to about 10 nm, and most preferably from about 0.5 nm to about 5 nm.
リンカーの化学的構造体は、置換されたり置換されていないアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキル、ポリアルケニルグリコールなどのような、しかしこれに制限されない、線状または分枝型有機モイアティを含むことができるが、これに制限されない。前記リンカーは、前記のような作用基を追加的に含むことができ、前記のようにいずれかの特定構造に制限されない。 The chemical structure of the linker may be substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, ether, polyether, ester, aminoalkyl, polyalkenyl glycol, etc. It can include, but is not limited to, linear or branched organic moieties. The linker may additionally contain a functional group as described above, and is not limited to any specific structure as described above.
端部で官能基化されたリンカーは、保護基を含む。したがって、一側面において、本発明は、保護基付きの線状の端部を含む多数の分枝/線状の重合体付きのサブストレートに関するものである。このようなサブストレートは、化学的に反応して、標的特異的リガンドによって代替される保護基を除去することができる。したがって、本発明のシステムの機能的用途において、一端の標的特異的リガンドに連結された分枝型/線状の重合体と結合されたサブストレートが提供される。 A linker functionalized at the end contains a protecting group. Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a substrate with a number of branched / linear polymers that includes a linear end with a protecting group. Such substrates can react chemically to remove protecting groups that are replaced by target-specific ligands. Thus, in a functional application of the system of the present invention, a substrate coupled with a branched / linear polymer linked to a target specific ligand at one end is provided.
<X保護基>
保護基の選択は、好ましい酸反応性または塩基反応性のような多数の因子によって異なる。したがって、本発明は、作用基が他の化学作用基と反応するのを防止する機能を提供し、所望の特定化された条件下で除去されるものである限り、いかなる特定の保護基にも限定されない。前記保護基は、容易に除去されるのが好ましい。本発明で使用されるこのような保護基の例として、下記のものを挙げることができるが、これに限定されない。
<X protecting group>
The choice of protecting group depends on a number of factors such as the preferred acid or base reactivity. Thus, the present invention provides the ability to prevent the functional group from reacting with other chemical functional groups, and to any particular protecting group, so long as it is removed under the desired specialized conditions. It is not limited. The protecting group is preferably easily removed. Examples of such protecting groups used in the present invention include, but are not limited to:
アミノ酸保護基:メチル、ホルミル、エチル、アセチル、t−ブチル、アニシル、ベンジル、トリフルオロアセチル、N−ヒドロキシスクシンイミド、t−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、4−メチルベンジル、チオアニジル、チオクレシル、ベンジルオキシメチル、4−ニトロフェニル、ベンジルオキシカルボニル、2−ニトロベンゾイル、2−ニトロフェニルソルフェニル、4−トルエンスルホニル、ペンタフルオロフェニル、ジフェニルメチル(Dpm)、2−クロロベンジルオキシカルボニル、2,4,5−トリクロロフェニル、2−ブロモベンジルオキシカルボニル、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、2,2,5,7,8−ペンタメチル−クロマン−6−スルホニル、フタルロイル、3−ニトロフタオイルである、4,5−ジクロロフタロイル、テトラブロモフォタロイル、テトラクロロフタロイル。 Amino acid protecting group: methyl, formyl, ethyl, acetyl, t-butyl, anisyl, benzyl, trifluoroacetyl, N-hydroxysuccinimide, t-butyloxycarbonyl, benzoyl, 4-methylbenzyl, thioanidyl, thiocresyl, benzyloxymethyl, 4-nitrophenyl, benzyloxycarbonyl, 2-nitrobenzoyl, 2-nitrophenylsorbyl, 4-toluenesulfonyl, pentafluorophenyl, diphenylmethyl (Dpm), 2-chlorobenzyloxycarbonyl, 2,4,5-tri Chlorophenyl, 2-bromobenzyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, triphenylmethyl, 2,2,5,7,8-pentamethyl-chroman-6-sulfonyl, phthaloyl, 3-ni A Rofutaoiru, 4,5-dichloro-phthaloyl, tetrabromobisphenol follower Taro yl, tetrachloro phthaloyl.
アルコール保護基:p−アニシルオキシメチル(p−AOM)、ベンジルオキシメチル(BOM)、t−ブトキシメチル、2−クロロテトラヒドロフラン(THF)、グアイアコルメチル(Guaiacolmethyl、GUM)、(1R)−メントキシメチル(menthoxymethyl、MM)、p−メトキシベンジルオキシメチル(PMBM)、メトキシエトキシメチル(MEM)、メトキシメチル(MOM)、o−ニトロベンジルオキシメチル、(フェニルジメチルシリル)メトキシメチル(SMOM)、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル(SEM)。 Alcohol protecting groups: p-anisyloxymethyl (p-AOM), benzyloxymethyl (BOM), t-butoxymethyl, 2-chlorotetrahydrofuran (THF), guaiacolmethyl (GUM), (1R) -ment Methoxymethyl (MM), p-methoxybenzyloxymethyl (PMBM), methoxyethoxymethyl (MEM), methoxymethyl (MOM), o-nitrobenzyloxymethyl, (phenyldimethylsilyl) methoxymethyl (SMOM), 2 -(Trimethylsilyl) ethoxymethyl (SEM).
DNA、RNA保護試薬:2´−OMe−Ac−C−CEホスホラミダイト、2´−OMe−Ac−RNA CPG、2´−OMe−I−CEホスホラミダイト、2´−OMe−5−Me−C−CEホスホラミダイト、Ac−C−CEホスホラミダイト、Ac−C−RNA 500、dmf−dG−CEホスホラミダイト、dmf−dG−CPG 500、2−アミノ−dA−CEホスホラミダイト(M.P.Reddy,N.B.Hanna,and F.Farooqui,tetrahedron Lett.,1994,35,4311−4314;B.P.Monia,et al.,J.Biol.Chem.,1993,268,14514−14522)。 DNA, RNA protection reagent: 2'-OMe-Ac-C-CE phosphoramidite, 2'-OMe-Ac-RNA CPG, 2'-OMe-I-CE phosphoramidite, 2'-OMe-5-Me-C-CE Phosphoramidite, Ac-C-CE phosphoramidite, Ac-C-RNA 500, dmf-dG-CE phosphoramidite, dmf-dG-CPG 500, 2-amino-dA-CE phosphoramidite (MP Reddy, NB Hanna) , And F. Farooqui, tetrahedron Lett., 1994, 35, 4311-4314; BP Monia, et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514-14522).
有機合成における一般的な保護試薬:(ジメチル−t−ブチルシリルオキシ)メチルクロライド(SOMCl)、エトキシエチルクロライド(EECl)、−クロロエーテル類、o−ニトロベンジルオキシメチルクロライド、b,b,b−トリクロロエトキシメチルクロライド(TCEMCl)、(−)−メンチル(Menthyl)エステル、(P)−ベンジルエステル、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−フェニル−2−プロピルエーテル、1,1,3,3−テトラメチル−1,3,2−チシラザン、1,2,4−ジチアゾールリジン−3,5−ジオン、1,2−ジブロマイド、1,2−ジクロライド、1,2−ジオールモノ−4−メトキシベンジルエーテル、1,2−ジオールモノ−t−ブチルエーテル、1,2−ジオールモノアセテートエステル、1,2−ジオールモノアリルエーテル、1,2−ジオールモノベンゾエートエステル、1,2−ジオールモノベンジルエーテル、1,2−ジオールモノトシレート、1,3−ベンゾジチオラン、1,3−ベンゾジチオラン−2−イルエーテル、1,3−ジオールモノ−4−メトキシベンジルエーテル、1,3−ジオールモノベンゾエートエステル、1,3−ジオールモノベンジルエーテル、1,3−ジオキサン、1−(2−(トリメトキシシリル)エトキシ)エチルエーテル、1−アダマンチルエステル、1−ベンゾイル−1−プロペン−2−イルアミン、1−エトキシエチルエーテル、1−メトキシエチリデンアセタール、1−メチル−1−メトキシエチルエーテル、1−フェニル−3,5−ジ−t−ブチルシクロヘキサジエン−4−オンイルアミン、1−フェニルエチルエステル、2,2,2−トリクロロエトキシメチルエーテル、2,2,2−トリクロロエチルカーボネート、2,2,2−トリクロロエチルエステル、2,2,2−トリクロロエチルホスフェート、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホンアミド、2,2−ジメチル−4−ペンテノエートエステル、2,3,6−トリメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド、2,4,6−トリメチルベンゼンスルホンアミド、2,4−DNPハイドラゾン、2,5−ジクロロフェニルホスフェート、2,5−ジメチルピロール、2−(2−メトキシエトキシ)エチルエステル、2−(4−ニトロフェニル)エチルエーテル、2−(4−ニトロフェニル)エチルホスフェート、2−(4−トルエンスルホニル)エチルエステル、2−(ジブロモメチル)ベンゾエートエステル、2−(トリメチルシリル)エチルカーボネート、2−(トリメチルシリル)エチルエステル、2−(トリメチルシリル)エチルエーテル、2−ベンゼンスルホニルエチルチオエーテル、2−ブロモエチルエステル、2−クロロエチルエステル、2−クロロフェニルホスフェート、2−シアノエチルホスフェート、2−メトキシエチルエステル、2−ニトロベンゼンスルフェンアミド、2−ニトロベンゼンスルホンアミド、2−オキサゾリン、2−フェニルエチルエステル、2−ピリジルジスルファイド、2−テトラヒドロピラニルアミン、4−クロロベンゾエートエステル、4−クロロブチルエステル、4−メトキシベンズアミド、4−メトキシベンゾエートエステル、4−メトキシベンジルアミン、4−メトキシベンジルエステル、4−メトキシベンジルオキシメチルエーテル、4−ニトロベンズアミド、4−ニトロベンゾエートエステル、4−ニトロベンジルエステル、4−ニトロベンジルエーテル、4−ニトロベンジルホスフェート、4−ニトロフェニルエステル、4−ニトロフェニルハイドラゾン、4−トルエンスルホンアミド、4−トルエンスルホン酸塩、9−フルオレニルメチルカーボネート、9−フルオレニルメチルエステル、アリルカーボネート、アリルエステル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホン酸塩、ベンジルカーボネート、ベンジルエステル、BOMエーテル、DMTrエーテル、MEMエーテル、メタンスルホンアミド、メタンスルホン酸塩、エチルカーボネート、MMTrエーテル、MOMカーボネート、MOMエステル、MOMエーテル、MTHPエーテル、MTMエステル、MTMエーテル、N−4−メトキシベンジルアミド、N−4−トリルアミド、N−ベンゼンスルホニルアミド、N−ベンジルイミン、n−ブチルエステル、n−ブチルエーテル、O−4−メトキシベンジルカバーメイト、O−9−フルオレニルメチルカバーメイト、フェニルチオエーテル、フェニルチオールエステルピペリジンアミド、PMBエーテル、SEMエステル、SEMエーテル、スクシネートエステル、t−ブチルカーボネート、t−ブチルエステル、t−ブチルエーテル、t−ブチルホスフェート、t−ブチルチオエーテル、t−ブチルチオールエステル、TBDMSエステル、TBDMSエーテル、TBDPSエーテル、TESエーテル、THFエーテル、THPエーテル、TIPDSジエーテル、TIPSエーテル、TMSエステル、TMSエーテル、TMSチオエーテル、トシルハイドラゾン、TPSエーテル、トリフルオロアセトアミド。 Common protecting reagents in organic synthesis: (dimethyl-t-butylsilyloxy) methyl chloride (SOMCl), ethoxyethyl chloride (EECl), -chloroethers, o-nitrobenzyloxymethyl chloride, b, b, b- Trichloroethoxymethyl chloride (TCEMCl), (−)-menthyl ester, (P) -benzyl ester, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-phenyl-2-propyl ether, 1 , 1,3,3-tetramethyl-1,3,2-tisilazan, 1,2,4-dithiazolelysine-3,5-dione, 1,2-dibromide, 1,2-dichloride, 1,2 -Diol mono-4-methoxybenzyl ether, 1,2-diol mono-t-butyl ether, 1,2-dioe Monoacetate ester, 1,2-diol monoallyl ether, 1,2-diol monobenzoate ester, 1,2-diol monobenzyl ether, 1,2-diol monotosylate, 1,3-benzodithiolane, 1,3 -Benzodithiolan-2-yl ether, 1,3-diol mono-4-methoxybenzyl ether, 1,3-diol monobenzoate ester, 1,3-diol monobenzyl ether, 1,3-dioxane, 1- (2 -(Trimethoxysilyl) ethoxy) ethyl ether, 1-adamantyl ester, 1-benzoyl-1-propen-2-ylamine, 1-ethoxyethyl ether, 1-methoxyethylidene acetal, 1-methyl-1-methoxyethyl ether, 1-phenyl-3,5-di-t-butyl Lohexadiene-4-oneylamine, 1-phenylethyl ester, 2,2,2-trichloroethoxymethyl ether, 2,2,2-trichloroethyl carbonate, 2,2,2-trichloroethyl ester, 2,2,2- Trichloroethyl phosphate, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonamide, 2,2-dimethyl-4-pentenoate ester, 2,3,6-trimethyl-4-methoxybenzenesulfonamide 2,4,6-trimethylbenzenesulfonamide, 2,4-DNP hydrazone, 2,5-dichlorophenyl phosphate, 2,5-dimethylpyrrole, 2- (2-methoxyethoxy) ethyl ester, 2- (4-nitro Phenyl) ethyl ether, 2- (4-nitrophenyl) ethyl phosphate 2- (4-toluenesulfonyl) ethyl ester, 2- (dibromomethyl) benzoate ester, 2- (trimethylsilyl) ethyl carbonate, 2- (trimethylsilyl) ethyl ester, 2- (trimethylsilyl) ethyl ether, 2-benzenesulfonyl Ethyl thioether, 2-bromoethyl ester, 2-chloroethyl ester, 2-chlorophenyl phosphate, 2-cyanoethyl phosphate, 2-methoxyethyl ester, 2-nitrobenzenesulfenamide, 2-nitrobenzenesulfonamide, 2-oxazoline, 2- Phenylethyl ester, 2-pyridyl disulfide, 2-tetrahydropyranylamine, 4-chlorobenzoate ester, 4-chlorobutyl ester, 4-methoxybenzamide, 4- Toxibenzoate ester, 4-methoxybenzylamine, 4-methoxybenzyl ester, 4-methoxybenzyloxymethyl ether, 4-nitrobenzamide, 4-nitrobenzoate ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-nitrobenzyl ether, 4-nitro Benzyl phosphate, 4-nitrophenyl ester, 4-nitrophenyl hydrazone, 4-toluenesulfonamide, 4-toluenesulfonate, 9-fluorenylmethyl carbonate, 9-fluorenylmethyl ester, allyl carbonate, allyl ester , Benzenesulfonamide, benzenesulfonate, benzyl carbonate, benzyl ester, BOM ether, DMTr ether, MEM ether, methanesulfonamide, methanesulfonic acid , Ethyl carbonate, MMTr ether, MOM carbonate, MOM ester, MOM ether, MTHP ether, MTM ester, MTM ether, N-4-methoxybenzylamide, N-4-tolylamide, N-benzenesulfonylamide, N-benzylimine, n-butyl ester, n-butyl ether, O-4-methoxybenzyl covermate, O-9-fluorenylmethyl covermate, phenylthioether, phenylthiol ester piperidine amide, PMB ether, SEM ester, SEM ether, succinate Ester, t-butyl carbonate, t-butyl ester, t-butyl ether, t-butyl phosphate, t-butyl thioether, t-butyl thiol ester, TBDMS ester, TBDM S ether, TBDPS ether, TES ether, THF ether, THP ether, TIPDS diether, TIPS ether, TMS ester, TMS ether, TMS thioether, tosylhydrazone, TPS ether, trifluoroacetamide.
商業的に入手可能な保護基の目録は、Sigma−Aldrich(2003)カタログから見つけることができ、その内容は、保護基の基材と関連があるため、全体が参考として本明細書に含まれる。 A list of commercially available protecting groups can be found in the Sigma-Aldrich (2003) catalog, the contents of which are related to the protecting group substrate and are hereby incorporated by reference in their entirety. .
一般に、本発明の一側面において、本発明に使用された保護基は、連続する一つ以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の成長中であるペプチド鎖への添加に使用されるものなどである。普通は、第1アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基は、適切な保護基によって保護されたものである。 In general, in one aspect of the present invention, the protecting group used in the present invention is one that is used to add one or more consecutive amino acids or appropriately protected amino acids to a growing peptide chain, etc. is there. Usually, the amino group or carboxyl group of the first amino acid is protected by a suitable protecting group.
特に好ましい方法において、前記アミノ作用基は、酸敏感または塩基敏感作用基によって保護されたものである。このような保護基は、連結形成条件に適し、成長中である分枝型/線状の重合体の破壊なく、容易に除去される特性がなければならない。このような適切な保護基には、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)、非ペニルイソプロピル−オキシカルボニル、t−アミルオキシカルボニル、イソボニルオキシカルボニル、(α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、o−ニトロフェニルスルフェニル、2−シアノ−t−ブチルオキシカルボニルなどがあるが、これに限定されない。 In a particularly preferred way, the amino-functional group is protected by an acid-sensitive or base-sensitive functional group. Such protecting groups must be suitable for linkage formation conditions and have properties that are easily removed without disruption of the growing branched / linear polymer. Such suitable protecting groups include 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Cbz), non-penylisopropyl-oxycarbonyl, t-amyloxy Examples include, but are not limited to, carbonyl, isobornyloxycarbonyl, (α, α-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2-cyano-t-butyloxycarbonyl and the like.
特に好ましい保護基の例は、また、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(pmc)、p−トルエンスルホニル、4−メトキシベンゼンスルホニル、アダマンチルオキシカルボニル、ベンジル、o−ブロモベンジルオキシカルボニル、2,6−ジクロロベンジル、イソプロフィル、t−ブチル(t−Bu)、シクロヘキシル、シクロフェニル及びアセチル(Ac)、1−ブチル、ベンジル及びテトラヒドロピラニル、ベンジル、p−トルエンスルホニル、及び2,4−ジニトロフェニルなどを含む。 Examples of particularly preferred protecting groups are also 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), p-toluenesulfonyl, 4-methoxybenzenesulfonyl, adamantyloxycarbonyl, benzyl, o- Bromobenzyloxycarbonyl, 2,6-dichlorobenzyl, isoprofile, t-butyl (t-Bu), cyclohexyl, cyclophenyl and acetyl (Ac), 1-butyl, benzyl and tetrahydropyranyl, benzyl, p-toluenesulfonyl , And 2,4-dinitrophenyl.
追加的な方法において、線状/分枝型の重合体の分枝の末端を適切な固体支持体に結合させる。前記合成に使用可能な適切な固体支持体は、使用される培地で不溶性であるだけでなく、順次的な縮合−脱保護反応の条件及び試薬に不活性である物質である。 In an additional method, the branch ends of a linear / branched polymer are attached to a suitable solid support. Suitable solid supports that can be used for the synthesis are substances that are not only insoluble in the medium used, but also inert to the conditions and reagents of the sequential condensation-deprotection reaction.
分枝型/線状の重合体の線状の末端からのFmocのような保護基の除去は、二次アミン、好ましくはピペリジンで処理して行うことができる。前記保護された部分を約3倍過量のモル数で導入させることができ、DMF内でカップリングを行うのが好ましいこともある。カップリング剤は、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N´,N´−テトラメチルウロニウムヘクサフルオロホスフェート(HBTU、1当量)及び1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(HOBT、1当量)であるが、これに制限されない。 Removal of protecting groups such as Fmoc from the linear ends of branched / linear polymers can be accomplished by treatment with a secondary amine, preferably piperidine. The protected moiety can be introduced in about a 3-fold excess of moles, and it may be preferred to perform the coupling in DMF. Coupling agents were O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU, 1 equivalent) and 1-hydroxy-benzotriazole (HOBT, 1 equivalent). However, it is not limited to this.
ポリマーは、連続操作または単一操作で脱保護させることができる。ポリペプチドの除去及び脱保護は、サブストレート結合ポリペプチドを切断試薬(cleavage reagent)で処理することによって、単一操作で行うことができ、前記切断試薬には、例えばチアニゾル(thianisole)、水、エタンジチオール、及びトリフルオロ酢酸などを使用することができる。 The polymer can be deprotected in a continuous operation or a single operation. Polypeptide removal and deprotection can be performed in a single operation by treating the substrate binding polypeptide with a cleavage reagent, which includes, for example, thiazole, water, Ethanedithiol, trifluoroacetic acid, and the like can be used.
下記の表1は、多様な類型の例示的化合物を列挙したものである。しかし、X、L、W、R、及びTの変異も本発明に含まれると理解される。
[標的特異的(Target−Specific)リガンドまたはプローブ]
標的特異的リガンドは、プローブともいわれ、前記分枝型/線状の重合体の線状の末端に結合するようになる部分であって、化学物質、生化学物質、生活性化合物などの多様な化合物を含む。これと関連して、前記リガンドは、核酸、オリゴヌクレオチド、RNA、DNA、PNA、またはアプタマー(aptamer)である。前記オリゴヌクレオチドは、天然核酸またはその類似体である。したがって、前記リガンドは、天然アミノ酸または合成アミノ酸からなるポリペプチドである。前記リガンドは、核酸、アミノ酸、炭水化物、または分枝型/線状のポリマーの線状の部分に結合することができる他の全ての化学物質の組合わせである。特に、前記リガンドは、トリアジン骨格などに基づく化学物質であり、これは組合わせ的化学ライブラリー、特にトリアジン標識されたライブラリーの成分として使用されることができる。
[Target-Specific Ligand or Probe]
A target-specific ligand, also called a probe, is a moiety that binds to the linear end of the branched / linear polymer, and includes a variety of chemical substances, biochemical substances, and living compounds. Contains compounds. In this context, the ligand is a nucleic acid, oligonucleotide, RNA, DNA, PNA, or aptamer. The oligonucleotide is a natural nucleic acid or an analog thereof. Therefore, the ligand is a polypeptide consisting of natural amino acids or synthetic amino acids. The ligand is a combination of nucleic acids, amino acids, carbohydrates, or any other chemical that can bind to a linear portion of a branched / linear polymer. In particular, the ligand is a chemical based on a triazine skeleton or the like, which can be used as a component of a combinatorial chemical library, particularly a triazine labeled library.
[サブストレート(Substrate)]
サブストレートは、前記分枝型/線状の重合体が共有結合またはイオン結合によって結合することができる全ての固体表面を意味するものである。前記サブストレートは、前記分枝型/線状の重合体の分枝された末端間に結合が起こるように官能基化されたものである。前記サブストレートの表面は、本発明が属する技術分野における当業者の必要に応じて、多様な表面を有することができる。マイクロアレイまたはバイオチップフォーマットが要求される場合には、通常、酸化されたシリコンウエハー、融合シリカ、またはガラスをサブストレートとして使用することができる。前記サブストレートは、ガラススライドであるのが好ましい。サブストレートの他の例として、ニトロセルロースまたはナイロンのようなメンブレンフィルターを挙げることができるが、これに限定されない。前記サブストレートは、親水性または極性でありえ、コーティング前または後に負の電荷または正の電荷を帯びるものである。
[Substrate]
Substrate means any solid surface to which the branched / linear polymer can be bound by covalent or ionic bonds. The substrate is functionalized such that a bond occurs between the branched ends of the branched / linear polymer. The surface of the substrate may have various surfaces according to the needs of a person skilled in the art to which the present invention belongs. If a microarray or biochip format is required, typically an oxidized silicon wafer, fused silica, or glass can be used as the substrate. The substrate is preferably a glass slide. Other examples of substrates include, but are not limited to, membrane filters such as nitrocellulose or nylon. The substrate can be hydrophilic or polar and is negatively charged or positively charged before or after coating.
[マイクロアレイ(microarray)]
DNAマイクロアレイの性能を向上させるために、プローブ設計、スポッティング間の反応条件、混成化及び洗浄条件、非特異的結合の抑制、生体分子(biomolecule)及び表面間の距離、及び固定化された生体分子間の空間などの因子が考慮されなければならない。これら因子の大部分は、マイクロアレイの表面の性質に関連するものであるため、マイクロアレイの研究において、表面最適化が主な目的になっている。Whitesell及びChangは、固定化されたオリゴペプチドのアルファ螺旋形成が空間制御された(space−controlled)金の表面で促進されることを示した[Whitesell et al.,Science 261,73−76(1993)]。
[Microarray]
To improve the performance of DNA microarrays, probe design, reaction conditions between spotting, hybridization and washing conditions, suppression of non-specific binding, distance between biomolecules and surfaces, and immobilized biomolecules Factors such as the space between them must be considered. Since most of these factors are related to the surface properties of the microarray, surface optimization has become a major objective in microarray research. Whitesell and Chang have shown that the alpha helix formation of immobilized oligopeptides is promoted on a space-controlled gold surface [Whitesell et al. , Science 261, 73-76 (1993)].
本発明では、円錐型デンドロンによって溶解値(1:0.01)に近い単塩基多形成(single nucleotide polymorphism、SNP)識別効率を有し、DNA非特異的結合は減少した、DNAマイクロアレイが提供される。 The present invention provides a DNA microarray having a single nucleotide polymorphism (SNP) discrimination efficiency close to a lysis value (1: 0.01) by a conical dendron and having reduced non-specific binding of DNA. The
図2はデンドロンの合成を示す概略図である。多様な出発物質、中間体化合物、及びデンドロン化合物が示されており、図面における‘X’はアントラセンメチル(A)、Boc、Fmoc、Nsなどのような全ての保護基である。図3aはデンドロンでガラス表面を改質すること(図3b)及び蛍光物質(fluorophore)で標識された標的ヌクレオチドを適切なオリゴヌクレオチドプローブと選択的に混成化させながら、単塩基が間違えて組合わされた対をデンドロン改質された表面で効果的に識別することができることを示す。 FIG. 2 is a schematic diagram showing the synthesis of dendron. A variety of starting materials, intermediate compounds, and dendron compounds are shown, where 'X' in the drawing is all protecting groups such as anthracenemethyl (A), Boc, Fmoc, Ns, etc. FIG. 3a shows a modification of the glass surface with dendron (FIG. 3b) and a single base mistakenly combined while selectively hybridizing a target nucleotide labeled with a fluorophore with an appropriate oligonucleotide probe. We can show that these pairs can be effectively distinguished with dendron-modified surfaces.
分枝の末端に表面反応性作用基を有する第2世代分枝デンドロンを使用することができ、これは自己組立て可能であり、これらの間に適切な空間を提供する。現在までの研究は、ガラスサブストレート上の陽イオン及びデンドロンの末端の陰イオンであるカルボキシレート間の多重イオン結合(multiple ionic attraction)によって良好な動きの(well−behaved)単一層を成功的に生成して、リガンド間の間隔を24Å以上に確保することができることを示した[Hong et al.,Langmuir 19,2357−2365(2003)]。脱保護を容易にし、脱保護した端部のアミンの反応性を増進させるために、本発明者らは、前記構造を図3bに示したように変型させた。また、本発明者は、デンドロンのカルボン酸基及び表面のヒドロキシ基間の共有結合の形成がイオン結合の程度に効果的であり、また末端の安定性を増進させることを観察した。さらに、オリゴエーテル間層(oligoetheral interlayer)が非特異的オリゴヌクレオチド結合を抑制するのに効果的であった。 Second generation branched dendrons having surface reactive functional groups at the ends of the branches can be used, which are self-assembleable and provide adequate space between them. Studies to date have successfully produced a well-behaved monolayer by multiple ionic attraction between the cation on the glass substrate and the carboxylate, the anion at the end of the dendron. It has been shown that the spacing between ligands can be ensured to be 24 cm or more [Hong et al. , Langmuir 19, 2357-2365 (2003)]. In order to facilitate deprotection and enhance the reactivity of the deprotected end amine, we modified the structure as shown in FIG. 3b. The inventor has also observed that the formation of a covalent bond between the carboxylic acid group of the dendron and the hydroxy group on the surface is effective for the degree of ionic bond and promotes terminal stability. In addition, an oligoether interlayer was effective in suppressing non-specific oligonucleotide binding.
既に報告された方法を利用してヒドロキシ化された表面を製作した[Maskis et al.,核酸s Res.20,1679−1684(1992)]。酸化されたシリコンウエハー、融合シリカ、及びガラススライドを含むサブストレートを(3−グリシドオキシプロピル)メチルジエトキシラン(GPDES)及びエチレングリコール(EG)で改質した。4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)の存在下で、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミドヒドロクロライド(EDC)または1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)を使用してデンドロンのカルボン酸基及びサブストレートのヒドロキシ基間を結合反応させることによって、デンドロンをサブストレートに導入した[Boden et al.,J.Org.Chem.50,2394−2395(1985);Dhaon et al.,J.Org.Chem.47,1962−1965(1982)]。デンドロン導入後の厚さの増加値は11±2Åであり、これはイオン結合で観察された既存の値に匹敵する値である[Hong et al.,Langmuir 19,2357−2365(2003)]。固定化後、デンドロンのアントラセンモイアティで発生する吸収ピークは257nmと観察された。分子層は安定し、ジメチルホルムアミドで1日攪拌した時にも厚さ及び吸着特性に変化を示さない(図4)。タッピングモード原子顕微鏡(tapping mode atomic force microscope、TM−AFM)によって得られた局所イメージも、得られた層が凝集または孔なく非常になめらかで均質であることを示した(図5)。 Hydroxylated surfaces were made using previously reported methods [Maskis et al. , Nucleic Acids Res. 20, 1679-1684 (1992)]. A substrate containing oxidized silicon wafer, fused silica, and glass slide was modified with (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxylane (GPDES) and ethylene glycol (EG). The use of 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) or 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in the presence of 4-dimethylaminopyridine (DMAP). Dendron was introduced into the substrate by a binding reaction between the carboxylic acid group and the hydroxy group of the substrate [Boden et al. , J .; Org. Chem. 50, 2394-2395 (1985); Dhaon et al. , J .; Org. Chem. 47, 1962-1965 (1982)]. The increase in thickness after introduction of the dendron is 11 ± 2 mm, which is comparable to the existing value observed for ionic binding [Hong et al. , Langmuir 19, 2357-2365 (2003)]. After immobilization, the absorption peak generated in the dendron anthracene moiety was observed to be 257 nm. The molecular layer is stable and shows no change in thickness and adsorption properties when stirred with dimethylformamide for 1 day (FIG. 4). Local images obtained by a tapping mode atomic force microscope (TM-AFM) also showed that the resulting layer was very smooth and homogeneous without aggregation or pores (FIG. 5).
DNAマイクロアレイを準備するために、固定化されたデンドロンを活性化して脱保護過程を通じて一次アミン基を生成した。1.0Mのトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護化後[Kornblum et al.,J.Org.Chem.42,399−400(1977)]に、257nmでの吸収ピークが、表面特性の他のいかなる有害な変化もなく無くなった(図4a)。このような観察結果は、保護基が層に化学的損傷なく成功的に除去され、前記保護基の除去によって厚さが若干減少するということを示した。 In order to prepare a DNA microarray, the immobilized dendron was activated to generate primary amine groups through a deprotection process. After deprotection with 1.0 M trifluoroacetic acid (TFA) [Kornblum et al. , J .; Org. Chem. 42, 399-400 (1977)], the absorption peak at 257 nm disappeared without any other detrimental changes in surface properties (FIG. 4a). Such observations indicated that the protecting groups were successfully removed without chemical damage to the layer, and that the thickness was slightly reduced upon removal of the protecting groups.
既に確立された方法[Beier et al.,Nucleic Acids Res.27,1970−1977(1999)]によって、ジ(N−スクシンイミジル)カーボネート(DSC)を使用して改質した後、Microsys 5100 Microarrayer(Cartesian Technologies,Inc.)を使用してクラス10,000クリーンルームに適切にアミン結合された(amine−tethered)オリゴヌクレオチド(20μM)の50mMのソジウム非カーボネートバッファー(10% ジメチルスルホキシド(DMSO)、pH8.5)溶液をスポッティングすることによって、プローブオリゴヌクレオチドを活性化したガラススライド表面に固定化させた。通常、反応性アミン基表面を有するサブストレートに、チオール結合された(tethered)オリゴヌクレオチド及びスクシンイミジル4−マレイミドブチレート(SMB)、またはスルホスクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SSMCC)のような異型の両作用性(heterobifunctional)リンカーを使用する[Oh et al.,Langmuir 18,1764−1769(2002);Frutos et al.,Langmuir16,2192−2197(2000)]。これとは対照的に、デンドロン改質された表面によってアミン作用基間の所定の距離が確保されるので、DSCのような同型の両作用性(homobifunctional)リンカーを使用しても何ら問題がない。結果的に、アミン結合された(tethered)オリゴヌクレオチドをスポッティングに使用することができる。費用効率性は別問題として、チオール結合された(tethered)オリゴヌクレオチドが特定条件下で有用であるが、容易に酸化されるチオール結合されたオリゴヌクレオチドの使用を回避することができる。 Already established methods [Beier et al. , Nucleic Acids Res. 27, 1970-1977 (1999)] after modification using di (N-succinimidyl) carbonate (DSC) and then using a Microsys 5100 Microarrayer (Cartesian Technologies, Inc.) to a class 10,000 clean room. Probe oligonucleotides were activated by spotting a 50 mM sodium non-carbonate buffer (10% dimethyl sulfoxide (DMSO), pH 8.5) solution of an appropriately amine-tethered oligonucleotide (20 μM). Immobilized on the glass slide surface. Usually, a substrate having a reactive amine group surface has a thiolated oligonucleotide and succinimidyl 4-maleimidobutyrate (SMB), or sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane- An atypical heterofunctional linker such as 1-carboxylate (SSMCC) is used [Oh et al. Langmuir 18, 1764-1769 (2002); Frutos et al. , Langmuir 16, 2192-2197 (2000)]. In contrast, the dendron-modified surface ensures a certain distance between the amine functional groups, so there is no problem using a homotypic, bifunctional linker such as DSC. . As a result, amine-linked oligonucleotides can be used for spotting. Aside from cost efficiency, the use of thiol-linked oligonucleotides, which are useful under certain conditions, but are readily oxidized, can be avoided.
前記DNAマイクロアレイを製作して、相補的対(A:T)及び3組の内部単塩基が間違えて組合わされた対(T:T、G:T、C:T)の間の識別効率を評価することができる。プローブオリゴヌクレオチドを4/4フォーマットに並べてスポッティングした後、前記マイクロアレイを恒湿器(湿度80%)で12時間インキュベーティングして、アミン結合された(tethered)DNAに十分な反応時間を提供した。その後、スライドを37℃で3時間バッファー溶液(2x SSPEバッファー(pH7.4)、7.0
mMのソジウムドデシルスルフェートを含む)で攪拌して、沸騰した水で5分間攪拌して、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドを除去した。最後に、次の段階のために、DNA機能化されたマイクロアレイを窒素気流下で乾燥させた。適切な比較のために、他の種類のプローブを一つのプレート上にフローティングした。
The DNA microarray is fabricated to evaluate the discrimination efficiency between a complementary pair (A: T) and a pair (T: T, G: T, C: T) in which three internal single bases are mistakenly combined. can do. After spotting the probe oligonucleotides in 4/4 format, the microarray was incubated for 12 hours in a humidity chamber (80% humidity) to provide sufficient reaction time for the amine-conjugated DNA. Thereafter, the slides were buffered at 37 ° C. for 3 hours (2 × SSPE buffer (pH 7.4), 7.0).
non-specifically bound oligonucleotides were removed by stirring for 5 minutes with boiling water and with 5 mM sodium dodecyl sulfate). Finally, the DNA functionalized microarray was dried under a stream of nitrogen for the next step. Other types of probes were floated on one plate for proper comparison.
混成化させるために、15塩基オリゴヌクレオチド(標的1)または45塩基オリゴヌクレオチド(標的2)を使用した(図3c)。Cy3蛍光染料で標識された標的オリゴヌクレオチド(1.0nM)を含む前記洗浄バッファー溶液で50℃で1時間GeneTACTMHybStation(Genomic Solution,Inc.)を使用し
て混成化を行った。過剰の標的オリゴヌクレオチドを除去するために、前記マイクロアレイを37℃でバッファー溶液で4回洗浄して、窒素で乾燥した。各々のスポット上の蛍光信号は、ScanArray Lite(GSI Lumonics)を使用して測定し、Imagene4.0(Biodiscovery)を使用して分析した。
To hybridize, 15 base oligonucleotides (target 1) or 45 base oligonucleotides (target 2) were used (FIG. 3c). Hybridization was performed using GeneTAC ™ HybStation (Genomic Solution, Inc.) for 1 hour at 50 ° C. with the washing buffer solution containing the target oligonucleotide (1.0 nM) labeled with Cy3 fluorescent dye. To remove excess target oligonucleotide, the microarray was washed 4 times with buffer solution at 37 ° C. and dried with nitrogen. The fluorescence signal on each spot was measured using ScanArray Lite (GSI Lumonics) and analyzed using Imagene 4.0 (Biodiscovery).
15塩基標的オリゴヌクレオチドの場合、得られたイメージは、正しく組合わされた対と内部が間違えて組合わされた対との間の強度に顕著な差があることを示した(図6A)。標準化された蛍光信号比率(または完全に組合わされた対に対する単塩基の内部の間違えて組合わされた対の強度の比率、つまりMM/PM)は、0.005、0.008、及び0.006(T:T、G:T、及びC:Tの内部の間違えた組合わせ)(図6A及び表2)であった。観察された選択度は、既存の通常の方法より顕著に向上し、一般的な表面上でのマイクロアレイと比較する時、非常に大きい選択度の増加(20乃至82倍)が記録された(表2)。すでに、本発明者は、また、混合された自己組立て単一層(つまり、混合SAM)を含む多様なアミン表面上に製作されたマイクロアレイの選択度の比率が1:0.19乃至0.57であることを観察した[Oh et al.,Langmuir 18,1764−1769(2002)]。また、他の研究者らによって、表面を改質させてより優れた検出方法を開発して、DNAマイクロアレイの性能を改善させることが報告されたが、蛍光検出方法に関連する限り、これらのうちのいかなるものも、このような改善された比率を示すことはできなかった[Zhao et al.,J.Am.Chem.Soc.125,12531−12540(2003);Chakrabarti et al.,J.Am.Chem.Soc.125,12531−12540(2003);Benters et al.,Nucleic Acids Res.30、e10(2002);Guschin et al.,Analytical Biochemistry250,203−211(1997);Taton et al.,Science289,1757−1760(2000);Wang et al.,Nucleic Acids Res.30,e61(2002)]。例えば、3成分混成化/検出システム(捕獲者/標的/プローブ)において、成功的な識別比率である1:0.07が報告された(Zhao et al.,J.Am.Chem.Soc.125,12531−12540(2003)]。選択度を増加させることができるペプチド核酸(PNAs)を使用する場合にも、金薄膜及び金ナノ粒子上での選択度は各々1:0.14及び1:0.07であった[Chakrabarti et al.,J.Am.Chem.Soc.125,12531−12540(2003)]。
より実際的なシステムを実現するために、45塩基の標的オリゴヌクレオチドを使用した。T:T、G:T、及びC:Tの内部に間違えて組合わされた塩基対に対するMM/PMの比率が0.006、0.009、及び0.009であった(図6B及び表2)。このような結果は、標的オリゴヌクレオチドの長さが長い場合に、明確な選択性(selectivity)を現わすことを示す。前記DNAマイクロアレイの効率は、デンドロン改質表面の特殊性、つまり固定されたDNA−鎖間のmesospacingによるものであると思われる。 To achieve a more practical system, a 45 base target oligonucleotide was used. The ratios of MM / PM to base pairs mistakenly combined inside T: T, G: T, and C: T were 0.006, 0.009, and 0.009 (FIG. 6B and Table 2). ). Such a result indicates that when the length of the target oligonucleotide is long, it exhibits a clear selectivity. The efficiency of the DNA microarray appears to be due to the peculiarities of the dendron modified surface, ie mesospacing between immobilized DNA-strands.
比較のために、(3−アミノプロピル)ジエトキシメチルシラン(APDES)に変型させたサブストレート上にDNAマイクロアレイを製作した(Oh et al.,Langmuir18,1764−1769(2002))。これは、DNAまたは蛋白質マイクロアレイ用に使用される一般的なサブストレートである。1,4−フェニレンジイソチオシアネート(PDITC)リンカーを使用することを除いては、デンドロン改質DNAマイクロアレイの場合と同様に、前記選択性を試験した。アミン処理されたオリゴヌクレオチドは、Guo et al.,nucleic acids Res.22,2121−2125(1994)に記載された方法通りに使用した。T:T、G:T、及びC:Tの場合、測定されたMM/PMの比率は0.41、0.38、及び0.26であった(図6C及び表2)。APDES改質サブストレート上にDSCリンカーを使用した結果、高い変異係数(CV)値(>20%)が示され、これは、スポット当たりの変異程度及び各スポット内で不均一な蛍光強度を示すものである。反面、DSCリンカーがあるデンドロン改質表面のように、PDITCリンカーはより良い変異係数値(CV)(<15%)及び単一スポット内に均一な蛍光強度を示した(図7)。 For comparison, a DNA microarray was fabricated on a substrate modified to (3-aminopropyl) diethoxymethylsilane (APDES) (Oh et al., Langmuir 18, 1764-1769 (2002)). This is a common substrate used for DNA or protein microarrays. The selectivity was tested as in the dendron modified DNA microarray except that a 1,4-phenylene diisothiocyanate (PDITC) linker was used. Amine-treated oligonucleotides are described in Guo et al. Nucleic acids Res. 22, 2121-2125 (1994). For T: T, G: T, and C: T, the measured MM / PM ratios were 0.41, 0.38, and 0.26 (FIG. 6C and Table 2). Using a DSC linker on an APDES modified substrate showed high coefficient of variation (CV) values (> 20%), indicating the degree of variation per spot and non-uniform fluorescence intensity within each spot. Is. On the other hand, like the dendron modified surface with DSC linker, PDITC linker showed better variation coefficient value (CV) (<15%) and uniform fluorescence intensity within a single spot (FIG. 7).
追加的な比較のために、オリゴマーの5´末端に追加的な(T)30スペーサを有するプローブ2 オリゴヌクレオチドをSNP区別実験に使用した。この場合、追加スペーサを有する前記プローブをAPDES改質表面上に固定化させた。T:T、G:T、及びC:Tの場合に対する測定されたMM/PMの比率は、0.17、0.18、及び0.12であった(図6D及び表2)。C6スペーサを有するプローブDNAに比べて、前記選択性が非常に向上したが、依然としてデンドロン改質DNAマイクロアレイより低かった。 For additional comparison, a probe 2 oligonucleotide with an additional (T) 30 spacer at the 5 'end of the oligomer was used for SNP discrimination experiments. In this case, the probe with additional spacers was immobilized on the APDES modified surface. The measured MM / PM ratios for the T: T, G: T, and C: T cases were 0.17, 0.18, and 0.12 (FIG. 6D and Table 2). As compared to a probe DNA having a C 6 spacer, although the selectivity was greatly improved, it was still lower than dendron modified DNA microarray.
表面混成化に多様な問題点を有し、正確なマイクロアレイスクリ−ニングを行う際の調節及び予測を難しくする。二重筋形成に対するGibbs自由エネルギー及び二重筋の熔解温度(Tm、melting temperature)に加えて、洗浄段階で、非特異的結合、立替効果、静電気的効果、及び条件変化などを考慮しなければならない。内部的に間違えて組合わされた塩基対(15−merのうち、T:T、G:T、及びC:Tは内部的に間違えて組合わされた欠陥)及び完全に組合わされた塩基対の間のGibbs自由エネルギーの差は、50℃で2.67、1.75、及び3.05kcal/molである。Gibbs自由エネルギーは、HYTHER TMソフトウェアで計算した(http://ozone2.chem.wayne.edu)。したがって、理論的な蛍光比率(MM/PM)は、各々0.016、0.065、及び0.009であった。また、分子信号を利用した溶液上の研究結果によれば、SNP区別比率は、1:0.01と低かった(Taton et al.,Science289,1757−1760(2000))。これらデータは、本発明のデンドロン改質DNAマイクロアレイが熱力学的限界に到達したり、これを超越する理想的なものであることを説明している。特に、G:Tの場合、マイクロアレイ方式での区別効率性は、溶液上で計算した数値より優れている。前記選択度の増加の主な因子は調査されなかったが、洗浄段階で厳格な条件が重要な役割を果たすものと期待される。 There are various problems in surface hybridization, making adjustment and prediction difficult when performing accurate microarray screening. In addition to Gibbs free energy for double muscle formation and melting temperature (Tm, melting temperature), non-specific binding, replacement effect, electrostatic effect, and condition change must be considered in the washing stage. Don't be. Between internally mispaired base pairs (of 15-mers, T: T, G: T, and C: T are defects miscombined internally) and fully paired base pairs The difference in Gibbs free energy is 2.67, 1.75, and 3.05 kcal / mol at 50 ° C. Gibbs free energy was calculated with H Y T HER ™ software (http://ozone2.chem.wayne.edu). Thus, the theoretical fluorescence ratio (MM / PM) was 0.016, 0.065, and 0.009, respectively. Moreover, according to the research result on the solution using the molecular signal, the SNP discrimination ratio was as low as 1: 0.01 (Tatton et al., Science 289, 1757-1760 (2000)). These data illustrate that the dendron modified DNA microarray of the present invention is ideal for reaching or exceeding the thermodynamic limit. In particular, in the case of G: T, the discrimination efficiency in the microarray method is superior to the numerical value calculated on the solution. Although the main factors for increasing the selectivity were not investigated, strict conditions are expected to play an important role in the washing stage.
[p53SNP探知]
生物界で、p53腫よう抑制遺伝子は、細胞調節、遺伝子転写、ゲノム安定性、DNA修復、及び細胞死滅に重要な役割を果たす(Velculescu et al,1996,Clin.Chem.,42:858−868,Harris et al,1996,88:1442−1455、Sidransky et al,Annu,Rev.Med.,1996,47:285−301)。p53が本来の機能を喪失すると腫ようが誘導され、p53の変異は直腸癌及び肺癌のようなヒトの癌で最もありふれた遺伝的変異である(Greenblatt,1994,54:4855−4878)。
[P53 SNP detection]
In the biological world, p53 tumor suppressor genes play an important role in cell regulation, gene transcription, genome stability, DNA repair, and cell killing (Velculescu et al, 1996, Clin. Chem., 42: 858-868). , Harris et al, 1996, 88: 1442-1455, Sitransky et al, Annu, Rev. Med., 1996, 47: 285-301). Tumors are induced when p53 loses its original function, and mutations in p53 are the most common genetic mutations in human cancers such as rectal and lung cancer (Greenblatt, 1994, 54: 4855-4878).
[9]−酸デンドロン改質サブストレート上のDNAマイクロアレイを利用して、癌細胞株からp53腫よう抑制遺伝子の単一変異を探知しようとする。175コドンを含む標的DNAサンプル(200−400塩基)をゲノムDNA鋳型にレンドンプライマー法で製造し、18個の塩基から構成されたプローブオリゴヌクレオチドが固定されたデンドロン改質表面に混成化させた。A:C、T:C、及びC:Cの内部の間違えた組合わせに対するMM/PMの比率は、0.028、0.031、及び0.007であった(図8a)。このような結果は、実際の標的DNAに対しても明確な選択性があることを示している。 [9]-A DNA microarray on an acid dendron modified substrate is used to detect a single mutation of the p53 tumor suppressor gene from a cancer cell line. A target DNA sample (200-400 bases) containing 175 codons was produced by a Rendon primer method on a genomic DNA template and hybridized to a dendron-modified surface to which a probe oligonucleotide composed of 18 bases was immobilized. . The ratio of MM / PM to the wrong combination of A: C, T: C, and C: C was 0.028, 0.031, and 0.007 (FIG. 8a). Such a result shows that there is a clear selectivity for the actual target DNA.
[27]−酸デンドロン改質サブストレート上のDNAマイクロアレイを前記[9]−酸デンドロンと同様な方法で製造し、p53腫よう抑制遺伝子のうちの175コドンの単一塩基の変異の探知に適用した。A:C、T:C、及びC:Cの内部の間違えて組合わされた塩基に対するMM/PMの比率は、0.066、0.01、及び0.005であった(図8b)。このような結果は、[27]−酸デンドロン改質サブストレート上のDNAマイクロアレイもまた、実際の標的DNAの単一塩基変異に対して明確な選択性があることを示している。 [27] -A DNA microarray on an acid dendron modified substrate is produced by the same method as the above [9] -acid dendron and applied to detection of a single base mutation at 175 codons in the p53 tumor suppressor gene did. The ratios of MM / PM to bases incorrectly combined in A: C, T: C, and C: C were 0.066, 0.01, and 0.005 (FIG. 8b). These results indicate that the DNA microarray on the [27] -acid dendron modified substrate also has a clear selectivity for single base mutations in the actual target DNA.
<デンドロン改質表面を利用したp53遺伝子の7ホットスポット(hot spot)変異の探知>
デンドロン改質サブストレートを使用して癌細胞株にあるp53腫よう抑制遺伝子の単一塩基変異を探知した。7つのホットスポットコドン(175、215、216、239、248、273、及び282)を含む標的DNAサンプル(200−400塩基対)をレンドンプライマ−法で腫よう細胞から抽出したDNAから増幅し、固定された7つのホットスポットに相応するキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチド15〜25mer)と混成化した(図9a及び9b)。その結果、非常に優れたSNP区別効率を得た。
<Detection of 7 hot spot mutations in p53 gene using dendron modified surface>
A dendron modified substrate was used to detect single base mutations in the p53 tumor suppressor gene in cancer cell lines. A target DNA sample (200-400 base pairs) containing seven hot spot codons (175, 215, 216, 239, 248, 273, and 282) is amplified from DNA extracted from tumor cells by the Rendon primer method. Hybridized with capture probes (oligonucleotides 15-25mer) corresponding to the seven immobilized hot spots (Figures 9a and 9b). As a result, very good SNP discrimination efficiency was obtained.
本発明者は、プローブDNA間の空間調節(mesospacing)を通じて最高の再現性を有するDNAマイクロアレイを成功的に製作することができ、SNP区別効率性は溶液での数値よりはるかに向上することができた。測定された区別効率性は、本発明による方法を遺伝子診断で高い信頼性で利用可能にした。本発明の方法が固定化生分子を利用する多様な生物学的分析に適用することができると予想される。 The present inventor can successfully produce a DNA microarray with the highest reproducibility through spatial modulation between probe DNAs, and the efficiency of SNP discrimination can be improved much more than the numerical value in solution. It was. The measured discrimination efficiency made the method according to the invention highly reliable for genetic diagnosis. It is expected that the method of the present invention can be applied to a variety of biological analyzes that utilize immobilized biomolecules.
[調節された気孔を有するガラスビーズ]
親和性クロマトグラフィーで幅広く利用されるクロマトグラフィー担体は、デキストリン及びアガロースのような天然ポリマーである。セファロース6B、4B、及び2Bは非常に低い非特異的結合率を有する架橋されたアガロースから構成されたクロマトグラフィー用物質である。前記物質が幅広く使用されるにもかかわらず、一般的なビーズ形態のアガロースゲルはいくつかの短所がある。例えば、前記物質の柔らかい性質によって流速(流出速度)が低く、著しく収縮して非可逆的であるため、凍結したり乾燥することができず、いくつかの有機溶媒に弱い(Cuatrecasas,P.J.Biol.Chem.1970,245、3059−3065;Kim et al.,Biochemistry2002,41,3414−3421)。これと比較して、調節された気孔を有するガラス(CPG)は、担体として多様な特別な特性を示す:1)機械的安定性、2)固定された3次元構造、つまり環境変化にも膨張したり収縮しない、3)pH1乃至pH14の条件で化学的安定性、4)広い範囲の親核性及び親電子性試薬に対する安定性、5)熱安定性、6)優れた流性(または溶出性)、7)容器表面に対する低い吸着性。追加的に、変型段階以降に洗浄を通して試薬及び副産物を迅速に除去することができる。このような全ての特性により、ゲル透過クロマトグラフィー、固体合成、親和性分離、その他の多様な分野で潜在的な有用性を提供する。
[Glass beads with controlled pores]
Chromatographic carriers that are widely used in affinity chromatography are natural polymers such as dextrin and agarose. Sepharose 6B, 4B, and 2B are chromatographic materials composed of cross-linked agarose with a very low non-specific binding rate. Despite the widespread use of the materials, common beaded agarose gels have several disadvantages. For example, due to the soft nature of the material, the flow rate (flow rate) is low, it shrinks significantly and is irreversible, so it cannot be frozen or dried and is vulnerable to some organic solvents (Cuatrecasas, PJ Biol. Chem. 1970, 245, 3059-3065; Kim et al., Biochemistry 2002, 41, 3414-3421). In comparison, glass with controlled pores (CPG) exhibits a variety of special properties as a carrier: 1) mechanical stability, 2) a fixed three-dimensional structure, that is, it expands with environmental changes 3) Chemical stability under pH 1 to pH 14 conditions, 4) Stability to a wide range of nucleophilic and electrophilic reagents, 5) Thermal stability, 6) Excellent flowability (or elution) 7) Low adsorptivity to the container surface. In addition, reagents and by-products can be rapidly removed through washing after the transformation step. All these properties provide potential utility in gel permeation chromatography, solid state synthesis, affinity separation, and various other fields.
気孔の大きさ:ホスト表面に対するゲスト接近性を利用して、吸着された物質に対するCPGの効果的な気孔性を測定した。最初の接近法として、ゲストに対するCPG接近性は、ゲストの大きさに比べてホストの相対的な大きさに相関性がある幾何学的因子に依存的である。ゲストが内部表面、吸着、及び相互作用を誘導する気孔より大きい分子の大きさは、調査対象気孔物質の内部表面積よりはるかに小さい外部表面を有する場合にだけ可能である(Poschalko et al.,J.Am.Chem.Soc.2003,125,13415−13426;Ottaviani et al.,J.Phys Chem.B.2003,107,2046−2053)。このような事実を考慮してみれば、CPG上のゲストの吸着力及び吸着程度は、下記の因子に依存的であると考えられる:CPGの気孔の大きさ、ホスト全体の表面積、及びホストの接近可能な表面の化学的組成。本発明において、三つ種類のGST融合蛋白質(GST(28kDa)、GST−PXP47(41kDa)、及びGST−Munc18断片(98kDa))を使用した。分子次元のGST−Munc1は、融合GST 100kDa、GST−DREFと類似していなければならない(140×40×93Å)(Hirose et al.,J.Biol.Chem.1996,271,3930−3937;Zhan et al.,Gene2001,218、1−9)。気孔及び表面積間の均衡に達するために、各具体的蛋白質に合うように担体の気孔性を最適化しなければならない。約50nmの気孔を有するCPGは、蛋白質に一般に存在する分子サブユニットの複合体を含むものは周知の事実であるため、50nmのCPGを使用して本研究を行った。同時に、前記蛋白質を使用する限り、より大きい大きさの気孔(300nm)を有するCPGは、50nm CPGの効率性を確認した。(Collins et al.,Anal.Biochem.1973,54,47−53;Haller,W.J.Chromatogr.1973,85,129−131)。 Pore size: The effective porosity of the CPG for the adsorbed material was measured using the guest accessibility to the host surface. As an initial approach, the CPG accessibility to the guest is dependent on geometric factors that are correlated to the relative size of the host relative to the size of the guest. The size of the molecules larger than the pores that induce the internal surface, adsorption, and interaction of the guest is possible only if it has an external surface that is much smaller than the internal surface area of the pore material under investigation (Poscharko et al., J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13415-13426; Ottaviani et al., J. Phys Chem. B. 2003, 107, 2046-2053). Considering these facts, the adsorption force and degree of adsorption of the guest on CPG may depend on the following factors: CPG pore size, overall host surface area, and host The chemical composition of the accessible surface. In the present invention, three types of GST fusion proteins (GST (28 kDa), GST-PX P47 (41 kDa), and GST-Munc18 fragment (98 kDa)) were used. The molecular dimension GST-Munc1 must be similar to the fusion GST 100 kDa, GST-DREF (140 × 40 × 93 cm) (Hirose et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 3930-3937; Zhan et al., Gene 2001, 218, 1-9). In order to reach a balance between porosity and surface area, the porosity of the carrier must be optimized to suit each specific protein. Since it is a well-known fact that CPG having pores of about 50 nm contains a complex of molecular subunits generally present in proteins, this study was conducted using 50 nm CPG. At the same time, as long as the protein was used, CPG with larger pores (300 nm) confirmed the efficiency of 50 nm CPG. (Collins et al., Anal. Biochem. 1973, 54, 47-53; Haller, W. J. Chromatogr. 1973, 85, 129-131).
グルタチオンCPGの変型(サンプルE1、E3、A、CS、及びCL):親和性マトリクスで最も重要な関心事は、非特異的結合(またはNSB)の程度である。これは、親和性分離及び固体合成で非常に独特な問題である。一般に、非特異的結合を抑制するための最も重要な因子は、マトリクスで水素結合供与グループをなくして親水性を高めるものである(Sigal et al,J.Am.Chem.Soc.1998,120,3464−3473;Chapman et al.,Langmuir2000,16,6927−6936;Chapman et al.,J.Am.Chem.Soc.2000,122,8303−8304;Holmlin et al.,Langmuir2001,17,2841−2850;Ostuni et al.,Langmuir2001,17,6336−6343;Chapman et al.,Langmuir2001,17,1225−1233;Ostuni et al.,Langmuir2001,17,5605−5620)。たとえ、アミノアルキル基に変型させた場合でも、CPG表面は極性であり、部分的に負の電荷を有している(Hudson,D.J.Comb.Chem.1999,1,403−457)。スペーサとしてジエポキシドを使用することによって、マトリクスの親水性及び非特異的結合を最少化することができると報告された(Suenetal.,Ind.Eng.Chem.Res.2000,39,478−487;Sundberg et al.,J.Chromatogr.B.1974,90,87−98;Shimizu et al.,Nature Biotechnology2000,18,877−881)。したがって、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル(またはBUDGE)に表面を変型して、サンプルE1及びE3を製造した。BUDGE使用の重要な特性は、加水分解に対して非常に安定的なエーテル結合を生成し、長いスペーサアーム(arm)による向上した柔軟性(flexibility)を有し、ある程度非特異的結合を抑制するということである。前記最後の長所は、ポリエチレングリコールと類似した構造的モチーフで説明される。ジエポキシド(Diepoxide)を使用して分子及び親核性基(例:アミン及びチオール)を有する表面と連結することができる。開環過程で、β−ヒドロキシグループだけでなく、安定した炭素ヘテロ原子間の結合を形成する。デンドロン変型段階前及び後でリンカーを使用することによって、変型されたGSHの柔軟性を保障することができる。変型段階を要約して図10に概括的に表わした。マトリクス表面にデンドロンを結合させるために、EDC及びNHSと呼ばれる一般的な試薬を使用した。デンドロンでサブストレートを変型させた後に、無水酢酸に導入して残っているアミン基を全てキャッピングした。最後に、前記マトリクスを20%のピペリジンで30分間処理して、デンドロンのFmocグループの追加的な変型を解除(deblock)した。BUDGEでもう一度延長反応を行った後に、チオール及びエポキシド間の結合を利用して、GSHを固定した。
対照群として、サンプルAを製造した。デンドロンがないことを除いては、E1及びE3と実質的に同様な方法で、BUDGE、1,3−ジアミノプロパン、及びBUDGE提供表面物質に連続的に変型させた。エポキシド及びチオール間の開環反応を使用して、GSHを固定した。GMBSと呼ばれるヘテロバイオ官能性(heterobiofunctional)リンカーを使用して、また他の対照ビーズ(サンプルCL及びCS)を製造し、GSH及びAMCPGまたはLCAA−CPGと結合させた。AMPCPGは、表面にC3炭化水素から構成された短いアーム(arm)を有し、LCAA−CPGは、C15脂肪族鎖から構成された長いアームを有している。GMBSでアミドを形成した後に、ビーズをGSHで処理した。マレイミドグループにチオール基を添加することによって、炭素及び硫黄原子間に共有結合が形成された。前記二段階処理で共有結合を形成すれば、GSHが結合された、調節された気孔を有するガラスビーズ、つまりCS及びCLが得られた。
Glutathione CPG variants (samples E1, E3, A, CS, and CL): The most important concern in the affinity matrix is the degree of non-specific binding (or NSB). This is a very unique problem in affinity separation and solid state synthesis. In general, the most important factor for suppressing non-specific binding is to eliminate hydrophilic groups in the matrix to increase hydrophilicity (Sigal et al, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, Chapman et al., Langmuir 2000, 16, 6927-6936; Chapman et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8303-8304; Ostuni et al., Langmuir 2001, 17, 6336-6343; Chapman et al., Langmuir 2001, 17, 1225-1233; Ostuni et al., Langmuir 200; , 17,5605-5620). Even when transformed to an aminoalkyl group, the CPG surface is polar and partially negatively charged (Hudson, DJ Comb. Chem. 1999, 1, 403-457). It has been reported that the use of diepoxide as a spacer can minimize matrix hydrophilicity and non-specific binding (Suenetal., Ind. Eng. Chem. Res. 2000, 39, 478-487; Sundberg). et al., J. Chromatogr. B. 1974, 90, 87-98; Shimizu et al., Nature Biotechnology 2000, 18, 877-881). Therefore, samples E1 and E3 were prepared by modifying the surface to 1,4-butanediol diglycidyl ether (or BUDGE). An important property of using BUDGE is that it produces a very stable ether bond against hydrolysis, has improved flexibility due to a long spacer arm, and suppresses non-specific binding to some extent. That's what it means. The last advantage is explained by a structural motif similar to polyethylene glycol. Diepoxides can be used to link molecules and surfaces with nucleophilic groups (eg amines and thiols). In the ring-opening process, not only β-hydroxy groups but also bonds between stable carbon heteroatoms are formed. By using a linker before and after the dendron modification step, the flexibility of the modified GSH can be ensured. The transformation stage is summarized and shown schematically in FIG. Common reagents called EDC and NHS were used to bind the dendron to the matrix surface. After changing the substrate with dendron, it was introduced into acetic anhydride to capping all remaining amine groups. Finally, the matrix was treated with 20% piperidine for 30 minutes to deblock additional variants of the dendron Fmoc group. After another extension reaction with BUDGE, GSH was immobilized using a bond between thiol and epoxide.
Sample A was produced as a control group. A BUDGE, 1,3-diaminopropane, and BUDGE-provided surface material was continuously transformed in a manner substantially similar to E1 and E3, except that there was no dendron. GSH was immobilized using a ring-opening reaction between epoxide and thiol. Other heterogeneous control beads (samples CL and CS) were prepared using a heterobifunctional linker called GMBS and conjugated with GSH and AMCPG or LCAA-CPG. AMPCPG has a short arm composed of C3 hydrocarbons on the surface, and LCAA-CPG has a long arm composed of C15 aliphatic chains. After amide formation with GMBS, the beads were treated with GSH. By adding a thiol group to the maleimide group, a covalent bond was formed between the carbon and sulfur atoms. Forming covalent bonds in the two-step process yielded glass beads with controlled pores, CS and CL, to which GSH was bound.
リガンド密度の測定:固定化されたグルタチオンの量を直接測定することは難しいため、脱保護化段階で放出されるジベンゾフルベンの量を測定して、リガンドの密度を決定する間接的な方法を使用した。デンドロンの頂点に結合された9−フルオロメトキシカルボニル(Fmoc)保護基は、酸に安定的であるか、多様な塩基によって簡単に切断される。本実施例では、DMFのうちの20%のピペリジンを使用してFmocグループを脱保護化した。ピペリジンは、ジベンゾフルベン及び付加物を生成し、前記付加物を301nmで吸光する(Фye et al.,J.Phys.Chem.B.2003,107,3496−3499)。反面、20%のピペリジンによる脱保護化段階で得られた溶液の吸光度が301nmと現れる時、これは意図した通り脱保護が起きていることを意味する。
このような方法で得られたリガンドの密度は、E1に対して8.3μ mol/gであ
り、E3に対して5.6μ mol/gであった。前記密度は、Fmoc(3)酸で変型した場合に11.1倍ほど減少し、前記数値はより大きいデンドロンを使用すると1.5倍ほど追加的に減少する。したがって、本発明の具体的な例で、より小さなデンドロンはより大きなデンドロンより高い密度を得るのにより効果的である。
Ligand density measurement: Since it is difficult to directly measure the amount of immobilized glutathione, use an indirect method to determine the density of the ligand by measuring the amount of dibenzofulvene released in the deprotection step did. The 9-fluoromethoxycarbonyl (Fmoc) protecting group attached to the apex of the dendron is acid stable or easily cleaved by a variety of bases. In this example, 20% piperidine of DMF was used to deprotect the Fmoc group. Piperidine produces dibenzofulvene and an adduct, which absorbs the adduct at 301 nm (, ye et al., J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 3496-3499). On the other hand, when the absorbance of the solution obtained in the deprotection step with 20% piperidine appears at 301 nm, this means that deprotection has occurred as intended.
The density of the ligand obtained by such a method was 8.3 μmol / g for E1 and 5.6 μmol / g for E3. The density is reduced by a factor of 11.1 when modified with Fmoc (3) acid, and the value is additionally reduced by a factor of 1.5 when using larger dendrons. Thus, in a specific example of the present invention, a smaller dendron is more effective at obtaining a higher density than a larger dendron.
GST結合の分析:精製されたGST及び細胞溶解物を使用して、サンプルA、E1、及びE3の結合特性を分析した(図11でレーン2、3、及び4)。レーン1は、成功的に溶解物を製造したことを示す。三つのマトリクスが精製されたGSTに効果的に結合することが明白である。細胞溶解物をビーズに導入した場合に(レーン5、6、及び7)、A及びE1またはE3サンプル間に相当な差が観察された。サンプルAの場合、BUDGEリンカーを導入したにもかかわらず、深刻な非特異的結合が観察された。さらに、マトリクスにデンドロンを導入した場合に、非特異的蛋白質結合が効果的に抑制された。1世代デンドロン及び2世代デンドロンのうちの一つの自己組立てによって固体担体に対する非特異的結合が効果的に抑制されたことは、注目に値する。デンドロン及びGSH間の延長されたスペーサは、結合されたトリペプチドの活性を維持した。
図12で、本発明の一例において、エーテル及びアミドグループが構造の主要骨格を形成し、デンドロンの固定によって再びアミド結合が生成される。また、デンドロンの広い範囲も成功した重要な因子である。
E1のリガンドの密度はE3より1.48倍高い。言い換えれば、E1は148%のリガンド濃度を記録した(表3)。2種類のビーズの結合効率性を試験するために、各サンプルごとに同じ数のGSHを有するようにサンプル質量を調節した。密度測定器によれば、2種類の場合のリガンドの利用度は非常に近接した(29%、31%)。E3のより広い空間化は、GSTの結合効率性を向上させることができず、これは、恐らく実験対象蛋白質がE1及びE3の空間化より大きかったためであろう。
In FIG. 12, in one example of the present invention, the ether and amide groups form the main skeleton of the structure, and the amide bond is again generated by dendron fixation. The wide range of dendrons is also an important factor for success.
The density of E1 ligand is 1.48 times higher than E3. In other words, E1 recorded a ligand concentration of 148% (Table 3). To test the binding efficiency of the two types of beads, the sample mass was adjusted to have the same number of GSH for each sample. According to the density meter, the utilization of the ligands in the two cases was very close (29%, 31%). The wider spatialization of E3 failed to improve the binding efficiency of GST, probably because the experimental protein was larger than the spatialization of E1 and E3.
対照実験:GSH密度はCSに対して14.5μ mol/g、CLに対して11.9μ mol/gであった。GSTの特異的結合の観点でビーズの効率性を比較するために、CS(5.7mg)及びCL(7.0mg)のビーズで捕獲された蛋白質をE1(10.0mg)及びE3(14.8mg)のビーズからのサンプルと共に分析した。おおよそ、GSHも同一な数に利用度を調節した。CS及びCLのビーズは低い結合能を現わすだけでなく、好ましくない選択度を現わすことがクロマトグラフィーに明確に示されている(図13)。このような結果は、固定化GSTに対するGSTの接近性の向上だけでなく、非特異的結合の効果的な抑制を保障するために、デンドロンの重要性を強調的に示すものである。 Control experiment: GSH density was 14.5 μmol / g for CS and 11.9 μmol / g for CL. In order to compare the efficiency of beads in terms of specific binding of GST, proteins captured with CS (5.7 mg) and CL (7.0 mg) beads were labeled E1 (10.0 mg) and E3 (14. Analysis with samples from 8 mg) beads. The utilization was adjusted to approximately the same number of GSH. It is clearly shown by chromatography that CS and CL beads not only exhibit low binding capacity but also unfavorable selectivity (FIG. 13). Such a result highlights the importance of dendrons to ensure effective suppression of non-specific binding as well as improved GST accessibility to immobilized GST.
分子量依存性:デンドロン変型により固定化されたリガンド間に空間が調節された表面を提供するため、多様な分子量を有する蛋白質に対する結合能が複合する。特に、2世代デンドロンを使用する場合、24Å以上の空間を保障することができることが知られている(Cardona et al.,J.Am.Chem.Soc.1998,120,4023−4024)。具体的な実験として、GST蛋白質(28 kDa)、GST−PXp47(41 kDa)、及び野生溶解物から得られたGST−munc−18断片(98 kDa)を製造した。図14に示したように、ビーズの結合能(E1、E3、及びセファロース4B)は、蛋白質の分子量が増加するほど急激に減少する。前記減少程度は三つの場合で全て同一である。興味深いのは、三つの異なる場合において、減少の程度が同一だということである。E1に対する結合能をGSTに対して100%に合わせた場合に、GST−munc18に対してGST−PXp47は相対的結合能が92%及び22%であった。E3ビーズに対してGSTは85%であり、GST−munc18は23%だった。これは、蛋白質の分子量に対する依存性を、グルタチオンセファロース4Bでも観測したことを示す。グルタチオンセファロース4B対してGST−PXp47の結合能は104%であり、GST−munc18は17%であった。唯一の差異点は、市販されるマトリクスに対して、GST及びGST−PXp47は一定の結合能を示すことである。前記差異点は、セファロース4Bの不均一な間隔を反映するものでありうる。これら物質から、GSH間に多様な間隔が存在し、その結果、マトリクスは融合GSTに天然GST程度に結合することができる。はるかに大きい蛋白質、GST−munc18に対して、間隔はより小さくするべきである。このような点から、デンドロンで処理したビーズの結合能が一定に減少することは、表面上のGSHの一定の間隔を裏付ける。
要約すれば、デンドロン改質マトリクスは、市販されるマトリクス(例:セファロース4B)程度の高い敏感度を示し、市販製品とほぼ同一な程度の分子量依存性を示す。AMPCPGマトリクスにデンドロンを導入することによって、非特異的結合を効果的に減少させるだけでなく、GSHの結合力を維持する。蛋白質分子量の増加に比例して、結合力が一定に減少することを観察し、このような現象は、固定化されたGSH間の規則的な間隔と一致すると考えられる。間隔の調節が容易であるだけでなく、機械的安定性、多様な化学的環境との広い両立性、及び予想される多様な応用が容易であるなど、多様な利点がある。
Dependence on molecular weight: In order to provide a surface with a regulated space between ligands immobilized by dendron modification, the binding ability to proteins having various molecular weights is combined. In particular, it is known that a space of 24 cm or more can be secured when using a second-generation dendron (Cardona et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 4023-4024). As a specific experiment, GST protein (28 kDa), GST-PX p47 (41 kDa), and a GST-munc-18 fragment (98 kDa) obtained from a wild lysate were produced. As shown in FIG. 14, the binding ability of the beads (E1, E3, and Sepharose 4B) decreases rapidly as the protein molecular weight increases. The degree of reduction is the same in all three cases. The interesting thing is that the degree of reduction is the same in three different cases. When the binding ability for E1 was adjusted to 100% for GST, GST-PX p47 had a relative binding ability of 92% and 22% for GST-munc18. For E3 beads, GST was 85% and GST-munc18 was 23%. This indicates that the dependence on the molecular weight of the protein was also observed with glutathione sepharose 4B. The binding ability of GST-PX p47 to glutathione sepharose 4B was 104%, and GST-munc18 was 17%. The only difference is that GST and GST-PX p47 show a certain binding capacity against commercially available matrices. The difference may reflect non-uniform spacing of Sepharose 4B. From these materials, there are various spacings between the GSHs, so that the matrix can bind to the fused GST as much as natural GST. For a much larger protein, GST-munc18, the spacing should be smaller. In this respect, the constant decrease in the binding capacity of the dendron-treated beads confirms the constant spacing of GSH on the surface.
In summary, the dendron modified matrix exhibits a sensitivity as high as that of a commercially available matrix (eg Sepharose 4B), and exhibits a molecular weight dependence of the same degree as that of a commercially available product. Introducing dendrons into the AMPCPG matrix not only effectively reduces non-specific binding, but also maintains the binding power of GSH. Observing that the binding force decreases steadily in proportion to the increase in protein molecular weight, this phenomenon is thought to be consistent with the regular spacing between immobilized GSHs. Not only is it easy to adjust the spacing, it has a variety of advantages such as mechanical stability, wide compatibility with various chemical environments, and ease of various anticipated applications.
本発明の保護範囲は、本明細書に記載された具体的な例に限定されず、本明細書に記載された具体的な例以外にも、多様な変更が本発明の詳細な説明及び添付した図面によって本技術分野の専門家には明白であろう。そのような変更も、また、本発明の請求範囲の保護範囲内に属する。以下の実施例は、本発明を例示するためのもので、制約的な意図ではない。 The scope of protection of the present invention is not limited to the specific examples described in the present specification, and various modifications other than the specific examples described in the present specification are described in the detailed description of the present invention and attached. It will be clear to the expert in this technical field from the drawings. Such modifications also fall within the protection scope of the claims of the present invention. The following examples are intended to illustrate the invention and are not intended to be limiting.
下記の実施例で、化合物の番号体系(Numbering scheme)は、化合物1、化合物2、I、II、III、IV、Vなどのように命名された。しかし、化合物の番号体系は、引用される特定の実施例で限定されて一貫して使用される意図である。例えば、実施例2で再び引用された化合物1は、必ずしも実施例3での化合物1と同一である必要はない。 In the following examples, the numbering scheme of compounds was named as Compound 1, Compound 2, I, II, III, IV, V, and the like. However, the compound numbering system is intended to be used consistently, limited in the specific examples cited. For example, Compound 1 cited again in Example 2 is not necessarily the same as Compound 1 in Example 3.
[実施例1:大きさが調節された巨大分子(Size−Controlled Macr
onolecule)を使用したマイクロアレイ製造方法]
実施例1で、図2に示したように、名称(designations)I、II、III、IV、及びVは、図2に示した多様な化合物及び中間体化合物を指すものである。
Example 1: Size-Controlled Macromolecule (Size-Controlled Macr
microarray manufacturing method using
In Example 1, as shown in FIG. 2, the designations I, II, III, IV, and V refer to various compounds and intermediate compounds shown in FIG.
<実施例1.1:材料>
シランカップリング剤である(3−グリシトキシプロピル)メチルジエトキシラン(GPDES)及び(3−アミノプロピル)ジエトキシメチルシラン(APDES)は、ゲレスト社(Gelest,Inc.)から購入し、他の化合物は、シグマ−アルドリッチ社から試薬級で購入した。シリル化(silylation)用反応溶媒は、アルドリッチ社から購入した無水物である(Sure/Seal bottles)。サブストレートに対する全ての洗浄溶媒は、マリンクロッド試薬製造会社(Mallinckrodt Laboratory Chemicals)からHPLC級で購入した。UV級ヒュームドシリカプレート(30mm×10mm×1.5mm)は、CVIレーザー有限会社(CVI Laser Corporation)から購入した。研磨された1級Siウエハー(100)(dopant,phosphorus;resistivity、1.5−2.1Ω.cm)は、MEMC電子材料会社(MEMC Electronic Materials,Inc)から購入した。ガラススライド(2.5×7.5cm)は、コーニング社(Corning Co)から購入した。オリゴヌクレオチドは、全てメタバイオン(Metabion)から購入した。超純水(Ultrapure water)(18MΩ.cm)は、Milli−Q精製システム(Millipore)から得た。
<Example 1.1: Material>
Silane coupling agents (3-glycitoxypropyl) methyldiethoxylane (GPDES) and (3-aminopropyl) diethoxymethylsilane (APDES) were purchased from Gelest, Inc. and others The compounds were purchased in reagent grade from Sigma-Aldrich. The reaction solvent for silylation is an anhydride purchased from Aldrich (Sure / Seal bottles). All wash solvents for the substrate were purchased in HPLC grade from Mallinckrod Laboratories Chemicals. UV grade fumed silica plates (30 mm × 10 mm × 1.5 mm) were purchased from CVI Laser Corporation. Polished primary Si wafers (100) (dopant, phosphorous; resiliency, 1.5-2.1 Ω.cm) were purchased from MEMC Electronic Materials, Inc. Glass slides (2.5 × 7.5 cm) were purchased from Corning Co. All oligonucleotides were purchased from Metabion. Ultrapure water (18 MΩ.cm) was obtained from a Milli-Q purification system (Millipore).
<実施例1.2:装置>
フィルムの厚さは、エリプソメータ(ellipsometer)分光器(J.A.Woollam Co.Model M−44)で測定した。UV−visスペクトルは、ヒューレットパッカード社の分光光度計(Hewlett−Packard diodearray 8453 spectrophotometer)で測定した。タッピングモードAFM実験(Tapping mode AFM experiments)は、‘E’類型スキャナーを有するナノスコープIIIa AFM(Digital Instruments)装備を使用して行った。
<Example 1.2: Apparatus>
Film thickness was measured with an ellipsometer spectrometer (JA Woollam Co. Model M-44). The UV-vis spectrum was measured using a Hewlett-Packard spectrophotometer (Hewlett-Packard diodearray 8453 spectrophotometer). Tapping mode AFM experiments (Tapping mode AFM experiments) were performed using a Nanoscope IIIa AFM (Digital Instruments) instrument with an 'E' type scanner.
<実施例1.3:サブストレートの清浄化>
シリコンウエハー、ヒュームドシリカ、ガラススライドのようなサブストレートはピラニア溶液(Piranha solution、濃度H2SO4:30% H2O2=7:3(v/v))に浸して、前記溶液及びサブストレートを含む反応容器を1時間超音波処理した(注意事項:ピラニア溶液は爆発性の有機物質を酸化させることがある。したがって、酸化性物質の接触は避ける)。超音波処理した後、過量の脱イオン水を使用してプレートを洗浄してすすいだ。洗浄されたサブストレートは、次の段階のために30−40mTorrの真空チャンバで乾燥した。
<Example 1.3: Cleaning of substrate>
Substrates such as silicon wafers, fumed silica and glass slides are immersed in a piranha solution (piranha solution, concentration H 2 SO 4 : 30% H 2 O 2 = 7: 3 (v / v)) The reaction vessel containing the substrate was sonicated for 1 hour (Note: The piranha solution may oxidize explosive organic materials, thus avoiding contact with oxidizing materials). After sonication, the plate was washed and rinsed with an excess of deionized water. The washed substrate was dried in a 30-40 mTorr vacuum chamber for the next step.
<実施例1.4:ヒドロキシル化サブストレートの製造>
前記洗浄されたサブストレートは、1.0mlの3−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン(GPDES)が溶解した160mlのトルエン溶液に10時間浸漬した。自己組立て(self−assembly)反応を行った後、サブストレートをトルエンで簡単に洗浄してから、オーブンに入れて110℃で30分間加熱した。プレートは、トルエン、トルエン−メタノール(1:1(v/v))、及びメタノールで順次に各洗浄段階で3分間超音波処理した。前記洗浄されたプレートは、真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。GPDES改質されたサブストレートは、95%の硫酸を2−3滴添加した純粋なエチレングリコール(EG)溶液に80乃至100℃で8時間浸漬した。冷却した後、前記サブストレートは、エタノール及びメタノールで順次に各々3分間超音波処理した。洗浄されたサブストレートは真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。
Example 1.4: Production of hydroxylated substrate
The washed substrate was immersed in 160 ml of toluene solution in which 1.0 ml of 3-glycidoxypropylmethyldiethoxysilane (GPDES) was dissolved for 10 hours. After performing a self-assembly reaction, the substrate was briefly washed with toluene and then placed in an oven and heated at 110 ° C. for 30 minutes. The plate was sonicated with toluene, toluene-methanol (1: 1 (v / v)), and methanol sequentially for 3 minutes at each wash step. The washed plate was dried in a vacuum chamber (30-40 mTorr). The GPDES modified substrate was immersed in a pure ethylene glycol (EG) solution with 2-3 drops of 95% sulfuric acid at 80-100 ° C. for 8 hours. After cooling, the substrate was sonicated with ethanol and methanol sequentially for 3 minutes each. The cleaned substrate was dried in a vacuum chamber (30-40 mTorr).
<実施例1.5:デンドロン改質サブストレートの製造>
前記水酸化されたサブストレートは、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(0.82mM)存在下でデンドロン(1.2mM)及びカップリング剤である1−[−3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミドヒドロクロライド(EDC)または1,3−ジサイクルロヘキシルカルボジイミド(DCC)(11mM)を溶解したメチレンクロライド溶液に浸した。室温で3日後、前記プレートをメタノール、水、及びメタノールで順次に各々3分間超音波処理した。次の段階のために、前記洗浄されたプレートは真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。
<Example 1.5: Production of dendron modified substrate>
The hydroxylated substrate is dendron (1.2 mM) and 1-[-3- (dimethylamino) propyl]-which is a coupling agent in the presence of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) (0.82 mM). It was immersed in a methylene chloride solution in which 3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) or 1,3-dicyclylcyclohexylcarbodiimide (DCC) (11 mM) was dissolved. After 3 days at room temperature, the plate was sonicated sequentially with methanol, water, and methanol for 3 minutes each. For the next step, the washed plate was dried in a vacuum chamber (30-40 mTorr).
<実施例1.6:NHS改質サブストレートの製造>
前記デンドロン改質サブストレートは、1.0Mのトリフルオロ酢酸(TFA)が含まれているメチレンクロライド溶液に浸した。3時間後、20%(v/v)のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)が含まれているメチレンクロライド溶液に10分間の浸漬した。前記プレートは、メチレンクロライド及びメタノールで各々3分間超音波処理した。その後、真空チャンバで乾燥して、非保護されたサブストレートをジ(N−スクシンイミジル)カーボネート(DSC)(25mM)及びDIPEA(1.0mM)が含まれているアセトニトリル溶液で反応させた。窒素雰囲気下で4時間反応させた後、前記プレートをジメチルホルムアミド溶液で30分間定置して、メタノールで簡単に洗浄した。洗浄されたプレートは、次の段階のために、真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。
<Example 1.6: Production of NHS modified substrate>
The dendron modified substrate was immersed in a methylene chloride solution containing 1.0 M trifluoroacetic acid (TFA). After 3 hours, it was immersed in a methylene chloride solution containing 20% (v / v) diisopropylethylamine (DIPEA) for 10 minutes. The plates were sonicated for 3 minutes each with methylene chloride and methanol. Thereafter, it was dried in a vacuum chamber, and the unprotected substrate was reacted with an acetonitrile solution containing di (N-succinimidyl) carbonate (DSC) (25 mM) and DIPEA (1.0 mM). After reacting for 4 hours under a nitrogen atmosphere, the plate was placed in a dimethylformamide solution for 30 minutes and washed briefly with methanol. The washed plate was dried in a vacuum chamber (30-40 mTorr) for the next step.
<実施例1.7:NHS改質サブストレート上にオリゴヌクレオチドを配列>
50mMのNaHCO3緩衝溶液(pH8.5)に溶解されたプローブオリゴヌクレオチドは、NHS改質サブストレート上に4フォーマットによって4つに並べてスポットした。アミン化されたDNA(the amine−tethered DNA)に十分な反応時間を保障するために、マイクロアレイは、湿度チャンバ(80%湿度)で12時間反応させた。スライドは、混成化(hybridization)緩衝溶液(7.0mMのソジウムドデシルスルフェートを含む2×SSPE緩衝溶液(pH7.4))で37℃で1時間攪拌した後、5分間沸騰した水に攪拌して、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドを除去した。最終的に、DNA官能基化(DNA−functionalized)マイクロアレイは、次の段階のために、窒素雰囲気下で乾燥した。完全な比較のために、多様な種類のプローブを前記単一プレートにスポットした。
<Example 1.7: Sequence oligonucleotide on NHS modified substrate>
Probe oligonucleotides dissolved in 50 mM NaHCO 3 buffer solution (pH 8.5) were spotted in 4 by 4 format on NHS modified substrate. The microarray was reacted for 12 hours in a humidity chamber (80% humidity) to ensure sufficient reaction time for the aminated-thetherized DNA. Slides were agitated in a hybridization buffer solution (2 × SSPE buffer solution containing 7.0 mM sodium dodecyl sulfate (pH 7.4)) at 37 ° C. for 1 hour and then stirred in boiling water for 5 minutes. Then, non-specifically bound oligonucleotides were removed. Finally, the DNA-functionalized microarray was dried under a nitrogen atmosphere for the next step. For complete comparison, various types of probes were spotted on the single plate.
<実施例1.8:混成化>
混成化は、GeneTACTM HybStation(Genomic Solutions,Inc.)を利用して、Cy3蛍光染料を使用した標的オリゴヌクレオチド(1.0nM)標識化を含む混成化緩衝溶液で50℃で1時間行った。マイクロアレイは、混成化緩衝溶液を使用してすすいで標的オリゴヌクレオチドを除去した後、窒素を使用して乾燥させた。各スポット上の蛍光信号はScanArray Lite(GSI Lumonics)を利用して測定し、Imagene4.0(Biodiscovery)で結果を分析した。
<Example 1.8: Hybridization>
Hybridization was performed at 50 ° C. for 1 hour with GeneTAC ™ HybStation (Genomic Solutions, Inc.) in a hybridization buffer solution containing target oligonucleotide (1.0 nM) labeling using Cy3 fluorescent dye. The microarray was rinsed using a hybridized buffer solution to remove the target oligonucleotide and then dried using nitrogen. The fluorescence signal on each spot was measured using ScanArray Lite (GSI Lumonics), and the result was analyzed using Imagene 4.0 (Biodiscovery).
<実施例1.9:デンドロン(dendron)の合成>
≪実施例1.9.1:9−アントリルメチルN−(3−カルボキシルプロピル)カバーメイト(I)(化合物I)の製造≫
4−アミノブチリクサン(0.50g、4.8mmol、1.0equiv)及びトリエチルアミン(TEA)(1.0ml、7.3mmol、1.5equiv)をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解して、50℃で攪拌した。前記溶液に9−アントリルメチルp−ニトロフェニルカーボネート(1.81g、4.8mmol、1.0equiv)を攪拌しながら徐々に添加した。50℃で2時間攪拌した後、溶液を蒸発させて乾燥させて、0.50Nの水酸化ナトリウム溶液(NaOH)で塩基化させた。水溶液は、酢酸エチル(EA)で洗浄して、氷槽で攪拌した後、希薄な塩酸(HCI)で酸性化させた。生成物はEAで抽出し、有機溶液を無水MgSO4で乾燥させてろ過してから、溶媒を蒸発させた。最終の黄色粉末の総量は1.06gであり、収率は65%であった。
1H NMR(CDCl3)
δ 11.00-9.00(br, CH2COOH, 1 H), 8.41 (s, C14H9CH2, 1 H), 8.31 (d, C14H9CH2, 2H), 7.97 (d, C14H9CH2, 2H), 7.51 (t, C14H9CH2, 2H), 7.46(t, C14H9CH2, 2H), 6.08(s, C14H9CH2O, 2H), 5.01 (t, OCONHCH2,1 H), 3.23(q, NHCH2CH2, 2H), 2.34(t, CH2CH2COOH, 2H), 1.77(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ 178.5(CH2COOH), 157.9(OCONH), 132.1 (C14H9CH2), 131.7(C14H9CH2), 129.7(C14H9CH2), 129.7(C14H9CH2), 127.3(C14H9CH2), 126.8(C14H9CH2), 125.8( C14H9CH2), 124.6( C14H9CH2), 60.2(C14H9CH2), 41.0(NHCH2CH2), 31.7(CH2CH2COOH),25.6(CH2CH2CH2).
<Example 1.9: Synthesis of dendron>
«Example 1.9.1: Production of 9-anthrylmethyl N- (3-carboxylpropyl) covermate (I) (Compound I)»
4-Aminobutyricane (0.50 g, 4.8 mmol, 1.0 equiv) and triethylamine (TEA) (1.0 ml, 7.3 mmol, 1.5 equiv) were dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF). And stirred at 50 ° C. 9-Anthrylmethyl p-nitrophenyl carbonate (1.81 g, 4.8 mmol, 1.0 equiv) was gradually added to the solution with stirring. After stirring for 2 hours at 50 ° C., the solution was evaporated to dryness and basified with 0.50 N sodium hydroxide solution (NaOH). The aqueous solution was washed with ethyl acetate (EA), stirred in an ice bath, and acidified with dilute hydrochloric acid (HCI). The product was extracted with EA, the organic solution was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated. The total amount of final yellow powder was 1.06 g, and the yield was 65%.
1 H NMR (CDCl 3 )
δ 11.00-9.00 (br, CH 2 COOH, 1 H), 8.41 (s, C 14 H 9 CH 2 , 1 H), 8.31 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.97 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.51 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.46 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 6.08 (s, C 14 H 9 CH 2 O, 2H) , 5.01 (t, OCONHCH 2 , 1 H), 3.23 (q, NHCH 2 CH 2 , 2H), 2.34 (t, CH 2 CH 2 COOH, 2H), 1.77 (m, CH 2 CH 2 CH 2 , 2H) .
13 C NMR (CDCl 3 )
δ 178.5 (CH 2 COOH), 157.9 (OCONH), 132.1 (C 14 H 9 CH 2 ), 131.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 129.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 129.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 127.3 (C 14 H 9 CH 2 ), 126.8 (C 14 H 9 CH 2 ), 125.8 (C 14 H 9 CH 2 ), 124.6 (C 14 H 9 CH 2 ), 60.2 (C 14 H 9 CH 2 ), 41.0 (NHCH 2 CH 2 ), 31.7 (CH 2 CH 2 COOH), 25.6 (CH 2 CH 2 CH 2 ).
≪実施例1.9.2:9−アントリルメチルN−{[(トリス{[2−(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}プロピルカーボネート(II)(化合物II)の製造≫
9−アントリルメチルN−(3−カルボキシルプロピル)カバーメイト(0.65g、1.93mmol、1.5equiv)、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカーボジイミドヒドロクロライド(EDC)(0.37g、1.93mmol、1.5equiv)、及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート(HOBT)(0.261g、1.93mmol、1.5equiv)をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。アセトニトリルに溶解されたトリス{[(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}アミノメタン(0.49g、1.29mmol、1.0equiv)を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で12時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。粗生成物(crude product)はEAに溶解して、1.0NのHCl及び飽和ソジウムバイカーボネート溶液で洗浄した。無水MgSO4で乾燥させてろ過した後、溶媒を蒸発させ、粗生成物をシリカゲルが充填されたコラムにローディングして、コラムクロマトグラフィー(展開溶媒:エチルアセテート:ヘキサン=5:1(v/v))で精製して、粘性の黄色液体を得た。黄色液体の総量は0.67gであった(収率74%)。
1H NMR(CDCl3)
δ 8.43(s, C14H9CH2, 1 H), 8.36(d, C14H9CH2, 2H), 7.99 (d, C14H9CH2, 2H), 7.53(t, C14H9CH2, 2H), 7.47(t, C14H9CH2, 2H), 6.15(s, CONHC, 1H), 6.08(s, C14H9CH2O,2H), 5.44(t, OCONHCH2,1 H), 3.63-3.55(m, CH2OCH2CH2COOCH3, 21 H), 3.27(q, NHCH2CH2, 2H), 2.46(t, CH2CH2COOCH3, 6H), 2.46(t, CH2CH2CONH, 2H), 1.81 (m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ173.2(CH2CONH), 172.7(CH2COOCH3), 157.4(OCONH), 132.9(C14H9CH2),
131.5(C14H9CH2), 129.5(C14H9CH2), 129.4(C14H9CH2}, 127.5(C14H9CH2), 127.0(C14H9CH2), 125.6(C14H9CH2), 124.7(C14H9CH2), 69.6(NHCCH2O), 67.2(C14H9CH2), 60.1 (OCH2CH2), 59.4(NHCCH2), 52.1(OCH3), 40.8(NHCH2CH2), 35.1 (OCH2CH2), 34.7(CH2CH2CONH), 26.3(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C36H46N2O12 .0.5 H2O: C 61.18, H 6.65, N 4.03; Found: C61.09, H 6.69, N 3.96.
Example 1.9.2: Preparation of 9-anthrylmethyl N-{[(tris {[2- (methoxycarbonyl) ethoxy] methyl} methyl) amino] carbonyl} propyl carbonate (II) (compound II) >>
9-anthrylmethyl N- (3-carboxylpropyl) covermate (0.65 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv), 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC ) (0.37 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv) and 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) (0.261 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv) were dissolved in acetonitrile and stirred at room temperature. . Tris {[(methoxycarbonyl) ethoxy] methyl} aminomethane (0.49 g, 1.29 mmol, 1.0 equiv) dissolved in acetonitrile was added to the solution with stirring. After stirring for 12 hours at room temperature, acetonitrile was evaporated. The crude product was dissolved in EA and washed with 1.0 N HCl and saturated sodium bicarbonate solution. After drying over anhydrous MgSO 4 and filtration, the solvent was evaporated, the crude product was loaded onto a column packed with silica gel, and column chromatography (developing solvent: ethyl acetate: hexane = 5: 1 (v / v )) To give a viscous yellow liquid. The total amount of yellow liquid was 0.67 g (74% yield).
1 H NMR (CDCl 3 )
δ 8.43 (s, C 14 H 9 CH 2 , 1 H), 8.36 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.99 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.53 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.47 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 6.15 (s, CONHC, 1H), 6.08 (s, C 14 H 9 CH 2 O, 2H), 5.44 (t, OCONHCH 2 , 1 H), 3.63-3.55 (m, CH 2 OCH 2 CH 2 COOCH 3 , 21 H), 3.27 (q, NHCH 2 CH 2 , 2H), 2.46 (t, CH 2 CH 2 COOCH 3 , 6H ), 2.46 (t, CH 2 CH 2 CONH, 2H), 1.81 (m, CH 2 CH 2 CH 2 , 2H).
13 C NMR (CDCl 3 )
δ173.2 (CH 2 CONH), 172.7 (CH 2 COOCH 3 ), 157.4 (OCONH), 132.9 (C 14 H 9 CH 2 ),
131.5 (C 14 H 9 CH 2 ), 129.5 (C 14 H 9 CH 2 ), 129.4 (C 14 H 9 CH 2 }, 127.5 (C 14 H 9 CH 2 ), 127.0 (C 14 H 9 CH 2 ), 125.6 (C 14 H 9 CH 2 ), 124.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 69.6 (NHCCH 2 O), 67.2 (C 14 H 9 CH 2 ), 60.1 (OCH 2 CH 2 ), 59.4 (NHCCH 2 ) , 52.1 (OCH 3 ), 40.8 (NHCH 2 CH 2 ), 35.1 (OCH 2 CH 2 ), 34.7 (CH 2 CH 2 CONH), 26.3 (CH 2 CH 2 CH 2 ).
.. Anal Calcd for C 36 H 46 N 2 O 12 0.5 H 2 O: C 61.18, H 6.65, N 4.03; Found: C61.09, H 6.69, N 3.96.
≪実施例1.9.3:9−アントロメチルN−[({トリス[(2−カルボキシエトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]プロピルカバーメイト(III)(化合物III)の製造≫
9−アントリルメチルN−{[(トリス{[2−(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}プロピルカーボネート(0.67g、0.93mmol)をアセトン(30ml)及び0.20 NNaOH(30ml、6mmol)に溶解した。
室温で1日攪拌した後に、アセトンを蒸発させた。得られた水溶液はEAを使用して洗浄して、氷槽で攪拌しながら希薄な塩酸で酸性化させた。生成物はEAを使用して抽出し、有機溶液は無水MgSO4で乾燥してろ過した後、溶媒を蒸発させた。生成物は−20℃でアセトン及びエーテルで固体化して、黄色粉末を得た。得られた薄い黄色粉末の最終量は0.54gであった(収率88%)。
1H NMR(CDCl3)
δ 11.00-9.00(br, CH2COOH, 3H}, 8.61(s, C14H9CH2, 1H}, 8.47(d, C14H9CH2, 2H), 8.11 (d, C14H9CH2, 2H), 7.60(t, C14H9CH2, 2H}, 7.52(t, C14H9CH2, 2H), 6.63(s, CONHC, 1 H), 6.36(t, OCONHCH2, 1 H), 6.12(s, C14H9CH2O, 2H). 3.40-363(m, CH2OCH2CH2COOH, 12H), 3.20(q, NHCH2CH2, 2H), 2.52(t, CH2CH2COOH, 6H), 2.17(t, CH2CH2CONH,2H), 1.75(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ 172.2(CH2COOH), 172.0(CH2CONH), 156.7(OCONH), 131.2(C14H9CH2), 130.7(C14H9CH2), 128.6(C14H9CH2), 128.4(C14H9CH2), 127.3(C14H9CH2), 126.2(C14H9CH2), 124.8(C14H9CH2), 124.0(C14H9CH2), 68.6(NHCCH2O), 66.5(C14H9CH2), 59.5(OCH2CH2), 58.0(NHCCH2), 40.0(NHCH2CH2), 34.0(OCH2CH2), 33.5(CH2CH2CONH), 25.8(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C33H40N2O12 .1.5 H2O: C 57.97, H 6.34, N 4.10; Found: C 57.89,H 6.21, N 4.09.
Example 1.9.3: Preparation of 9-Antromethyl N-[({Tris [(2-carboxyethoxy) methyl] methyl} amino) carbonyl] propyl covermate (III) (Compound III) >>
9-anthrylmethyl N-{[(tris {[2- (methoxycarbonyl) ethoxy] methyl} methyl) amino] carbonyl} propyl carbonate (0.67 g, 0.93 mmol) in acetone (30 ml) and 0.20 NNaOH (30 ml, 6 mmol).
After stirring at room temperature for 1 day, the acetone was evaporated. The resulting aqueous solution was washed with EA and acidified with dilute hydrochloric acid while stirring in an ice bath. The product was extracted using EA, the organic solution was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated. The product was solidified with acetone and ether at −20 ° C. to give a yellow powder. The final amount of light yellow powder obtained was 0.54 g (88% yield).
1 H NMR (CDCl 3 )
δ 11.00-9.00 (br, CH 2 COOH, 3H}, 8.61 (s, C 14 H 9 CH 2 , 1H}, 8.47 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 8.11 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.60 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H}, 7.52 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 6.63 (s, CONHC, 1 H), 6.36 (t, OCONHCH 2 , 1 H), 6.12 (s, C 14 H 9 CH 2 O, 2H). 3.40-363 (m, CH 2 OCH 2 CH 2 COOH, 12H), 3.20 (q, NHCH 2 CH 2 , 2H), 2.52 (t, CH 2 CH 2 COOH, 6H), 2.17 (t, CH 2 CH 2 CONH, 2H), 1.75 (m, CH 2 CH 2 CH 2 , 2H).
13 C NMR (CDCl 3 )
δ 172.2 (CH 2 COOH), 172.0 (CH 2 CONH), 156.7 (OCONH), 131.2 (C 14 H 9 CH 2 ), 130.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 128.6 (C 14 H 9 CH 2 ), 128.4 (C 14 H 9 CH 2 ), 127.3 (C 14 H 9 CH 2 ), 126.2 (C 14 H 9 CH 2 ), 124.8 (C 14 H 9 CH 2 ), 124.0 (C 14 H 9 CH 2 ), 68.6 (NHCCH 2 O), 66.5 (C 14 H 9 CH 2 ), 59.5 (OCH 2 CH 2 ), 58.0 (NHCCH 2 ), 40.0 (NHCH 2 CH 2 ), 34.0 (OCH 2 CH 2 ), 33.5 (CH 2 CH 2 CONH), 25.8 (CH 2 CH 2 CH 2 ).
.. Anal Calcd for C 33 H 40 N 2 O 12 1.5 H 2 O: C 57.97, H 6.34, N 4.10; Found: C 57.89, H 6.21, N 4.09.
≪実施例1.9.4:9−アントリルメチルN−[({トリス[(2−{[(トリス{[2−(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}(メチル)アミノ)カルボニル]エトキシ}メチル)メチル]アミノ}カルボニル)プロピルカバーメイト(IV)(化合物IV)の製造 ≫
9−アントリルメチルN−[({トリス[(2−カルボキシエトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]プロピルカバーメイト(0.54g、0.82mmol、1.0equiv)、EDC(0.55g、2.87mmol、3.5equiv)、及びHOBT(0.39g、2.89mmol、3.5equiv)をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。その後、アセトニトリルに溶解したトリス{[(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}アミノメタン(0.96g、2.53mmol、3.1equiv)を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で36時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。前記粗生成物をEAに溶解して、1.0NのHCLで洗浄して、重炭酸ナトリウム溶液で飽和させた。無水MgSO4で乾燥、ろ過、及び蒸発させた後に、前記粗生成物をシリカゲルが充填されたコラムにローディングした。コラムを利用して精製(展開溶媒:酢酸エチル:メタノール=20:1(v/v))した結果、粘性の黄色液体が得られた。前記黄色液体の総重量は1.26gであった(88%収率)。
1H NMR(CDCl3)
δ 8.47(s, C14H9CH2, 1 H), 8.39(d, C14H9CH2, 2H), 8.02 (d, C14H9CH2, 2H), 7.53(t, C14H9CH2, 2H), 7.47(t, C14H9CH2, 2H), 6.60(s, CH2CH2CH2CONHC, 1 H), 6.13(s, OCH2CH2CONHC, 3H), 6.11 (s, C14H9CH2O, 2H), 5.79(t, OCONHCH2,1 H), 3.65-3.60(m, CH2OCH2CH2CONH, CH2OCH2CH2COOCH3, 75H), 3.29(q, NHCH2CH2, 2H), 2.50(t, CH2CH2COOCH3, 18H), 2.36(t, OCH2CH2CONH, 6H), 2.27(t, CH2CH2CH2CONH, 2H), 1.85(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ 173.3(OCH2CH2CONH), 172.5(CH2CH2CH2CONH), 171.6(CH2COOCH3), 157.2(OCONH), 131.8(C14H9CH2), 131.5(C14H9CH2), 129.4(C14H9CH2), 129.3(C14H9CH2), 127 .6(C14H9CH2), 127.0(C14H9CH2), 125.6(C14H9CH2), 124.7(C14H9CH2), 69.5(NHCCH2OCH2CH2COOCH3), 67.9(NHCCH2OCH2CH2CONH), 67.2(C14H9CH2), 60.3(OCH2CH2CONH), 60.2(OCH2CH2COOCH3), 59.2(NHCCH2OCH2CH2COOCH3, NHCCH2OCH2CH2CONH), 52.1(OCH3), 41.0(NHCH2CH2), 37.6(OCH2CH2CONH), 35.1(OCH2CH2COOCH3), 34.7(CH2CH2CH2CONH), 26.3(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C81H121N5O36 .H2O: C 55.31, H 7.05, N 3.98; Found: C 55.05, H 7.08, N 4.04.
MALDI- TOF-MS: 1763.2 (MNa+), 1779.2 (MK+).
Example 1.9.4: 9-anthrylmethyl N-[({Tris [(2-{[(Tris {[2- (methoxycarbonyl) ethoxy] methyl} (methyl) amino) carbonyl] ethoxy} methyl ) Preparation of methyl] amino} carbonyl) propyl covermate (IV) (compound IV) >>
9-anthrylmethyl N-[({tris [(2-carboxyethoxy) methyl] methyl} amino) carbonyl] propyl covermate (0.54 g, 0.82 mmol, 1.0 equiv), EDC (0.55 g, 2 .87 mmol, 3.5 equiv) and HOBT (0.39 g, 2.89 mmol, 3.5 equiv) were dissolved in acetonitrile and stirred at room temperature. Thereafter, tris {[(methoxycarbonyl) ethoxy] methyl} aminomethane (0.96 g, 2.53 mmol, 3.1 equiv) dissolved in acetonitrile was added to the solution with stirring. After stirring for 36 hours at room temperature, the acetonitrile was evaporated. The crude product was dissolved in EA, washed with 1.0 N HCL and saturated with sodium bicarbonate solution. After drying over anhydrous MgSO4, filtration and evaporation, the crude product was loaded onto a column packed with silica gel. As a result of purification using a column (developing solvent: ethyl acetate: methanol = 20: 1 (v / v)), a viscous yellow liquid was obtained. The total weight of the yellow liquid was 1.26 g (88% yield).
1 H NMR (CDCl 3 )
δ 8.47 (s, C 14 H 9 CH 2 , 1 H), 8.39 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 8.02 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.53 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.47 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 6.60 (s, CH 2 CH 2 CH 2 CONHC, 1 H), 6.13 (s, OCH 2 CH 2 CONHC, 3H) , 6.11 (s, C 14 H 9 CH 2 O, 2H), 5.79 (t, OCONHCH 2 , 1 H), 3.65-3.60 (m, CH 2 OCH 2 CH 2 CONH, CH 2 OCH 2 CH 2 COOCH 3 , 75H), 3.29 (q, NHCH 2 CH 2 , 2H), 2.50 (t, CH 2 CH 2 COOCH 3 , 18H), 2.36 (t, OCH 2 CH 2 CONH, 6H), 2.27 (t, CH 2 CH 2 (CH 2 CONH, 2H), 1.85 (m, CH 2 CH 2 CH 2 , 2H).
13 C NMR (CDCl 3 )
δ 173.3 (OCH 2 CH 2 CONH), 172.5 (CH 2 CH 2 CH 2 CONH), 171.6 (CH 2 COOCH 3 ), 157.2 (OCONH), 131.8 (C 14 H 9 CH 2 ), 131.5 (C 14 H 9 CH 2), 129.4 (C 14 H 9 CH 2), 129.3 (C 14 H 9 CH 2), 127 .6 (C 14 H 9 CH 2), 127.0 (C 14 H 9 CH 2), 125.6 (C 14 H 9 CH 2 ), 124.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 69.5 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 COOCH 3 ), 67.9 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 CONH), 67.2 (C 14 H 9 CH 2 ), 60.3 (OCH 2 CH 2 CONH), 60.2 (OCH 2 CH 2 COOCH 3 ), 59.2 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 COOCH 3 , NHCCH 2 OCH 2 CH 2 CONH), 52.1 (OCH 3 ), 41.0 (NHCH 2 CH 2 ), 37.6 (OCH 2 CH 2 CONH), 35.1 (OCH 2 CH 2 COOCH 3 ), 34.7 (CH 2 CH 2 CH 2 CONH), 26.3 (CH 2 CH 2 CH 2 ).
.. Anal Calcd for C 81 H 121 N 5 O 36 H 2 O: C 55.31, H 7.05, N 3.98; Found: C 55.05, H 7.08, N 4.04.
MALDI- TOF-MS: 1763.2 (MNa +), 1779.2 (MK +).
≪実施例1.9.5:9−アントリルメチルN−({[トリス({2−[({トリス[(2−カルボキシエトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]エトキシ}メチル)メチル]アミノ}カルボニル)プロピルカバーメイト(V)(化合物V)の製造≫
9−アントリルメチルN−[({トリス[(2−{[(トリス{[2−(mエトキシカルボニル)エトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]プロピルカバーメイト(0.60g、0.34mmol)をアセトン(30ml)及び0.20NのNaOH(30ml)に溶解した。室温で1日攪拌した後、アセトンを蒸発させた。得られた水溶液はEAを使用して洗浄して、氷槽で攪拌しながら希薄な塩酸で酸性化させた。生成物はEAを使用して抽出し、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過した後、溶媒を蒸発させた。得られた黄色粉末の最終量は0.37gであった(収率68%)。
1H NMR(DMSO)
δ 13.00-11.00(br, CH2COOH, 9H), 8.66(s, C14H9CH2, 1 H), 8.42(d, C14H9CH2, 2H), 8.13 (d, C14H9CH2, 2H), 7.62(t, C14H9CH2, 2H), 7.54(t, C14H9CH2, 2H), 7.12(t, OCONHCH2, 1H), 7.10(s, OCH2CH2CONHC, 3H), 7.06(s, CH2CH2CH2CONHC, 1 H), 6.06(s, C14H9CH2O, 2H), 3.57-3.55(m, CH2OCH2CH2CONH, CH2OCH2CH2COOH,48H), 3.02(q, NHCH2CH2, 2H), 2.42(t, CH2CH2COOH, 18H), 2.32(t, OCH2CH2CONH, 6H), 2.11(t, CH2CH2CH2CONH, 2H), 1.60(m, CH2CH2CH2, 2H). 13C NMR(DMSO)
δ 172.8(CH2COOH), 172.2(CH2CH2CH2CONH), 170.5(OCH2CH2CONH), 156.5(OCONH), 131.0(C14H9CH2), 130.6(C14H9CH2), 129.0(C14H9CH2), 128.7(C14H9CH2), 127.6(C14H9CH2), 126.7(C14H9CH2), 125.4(C14H9CH2), 124.3(C14H9CH2), 68.3(NHCCH2OCH2CH2COOH), 67.4(NHCCH2OCH2CH2CONH), 66.8(C14H9CH2), 59.8(OCH2CH2COOH), 59.6(OCH2CH2CONH), 57.9(NHCCH2OCH2CH2CONH), 55.9(NHCCH2OCH2CH2COOH), 36.4(NHCH2CH2), 34.6(OCH2CH2COOH), 30.8(OCH2CH2CONH), 29.7(CH2CH2CH2CONH), 25.9(CH2CH2CH2).
Example 1.9.5: 9-anthrylmethyl N-({[tris ({2-[({tris [(2-carboxyethoxy) methyl] methyl} amino) carbonyl] ethoxy} methyl) methyl] amino } Production of Carbonyl) propyl Covermate (V) (Compound V) >>
9-anthrylmethyl N-[({tris [(2-{[(tris {[2- (methoxycarbonyl) ethoxy] methyl} methyl) amino] carbonyl} ethoxy) methyl] methyl} amino) carbonyl] propyl cover Mate (0.60 g, 0.34 mmol) was dissolved in acetone (30 ml) and 0.20 N NaOH (30 ml). After stirring at room temperature for 1 day, acetone was evaporated. The resulting aqueous solution was washed with EA and acidified with dilute hydrochloric acid while stirring in an ice bath. The product was extracted using EA, the organic solution was dried over anhydrous MgSO 4 and filtered, and then the solvent was evaporated. The final amount of the obtained yellow powder was 0.37 g (68% yield).
1 H NMR (DMSO)
δ 13.00-11.00 (br, CH 2 COOH, 9H), 8.66 (s, C 14 H 9 CH2, 1 H), 8.42 (d, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 8.13 (d, C 14 H 9 CH2, 2H), 7.62 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.54 (t, C 14 H 9 CH 2 , 2H), 7.12 (t, OCONHCH 2 , 1H), 7.10 (s, OCH 2 CH 2 CONHC, 3H), 7.06 (s, CH 2 CH 2 CH 2 CONHC, 1 H), 6.06 (s, C 14 H 9 CH 2 O, 2H), 3.57-3.55 (m, CH 2 OCH 2 CH 2 CONH , CH 2 OCH 2 CH 2 COOH, 48H), 3.02 (q, NHCH 2 CH 2 , 2H), 2.42 (t, CH 2 CH 2 COOH, 18H), 2.32 (t, OCH 2 CH 2 CONH, 6H), 2.11 (t, CH 2 CH 2 CH 2 CONH, 2H), 1.60 (m, CH 2 CH 2 CH 2 , 2H). 13 C NMR (DMSO)
δ 172.8 (CH 2 COOH), 172.2 (CH 2 CH 2 CH 2 CONH), 170.5 (OCH 2 CH 2 CONH), 156.5 (OCONH), 131.0 (C 14 H 9 CH 2 ), 130.6 (C 14 H 9 CH 2 ), 129.0 (C 14 H 9 CH 2 ), 128.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 127.6 (C 14 H 9 CH 2 ), 126.7 (C 14 H 9 CH 2 ), 125.4 (C 14 H 9 CH 2 ), 124.3 (C 14 H 9 CH 2 ), 68.3 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 COOH), 67.4 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 CONH), 66.8 (C 14 H 9 CH 2 ), 59.8 (OCH 2 CH 2 COOH), 59.6 (OCH 2 CH 2 CONH), 57.9 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 CONH), 55.9 (NHCCH 2 OCH 2 CH 2 COOH), 36.4 (NHCH 2 CH 2 ), 34.6 (OCH 2 CH 2 COOH ), 30.8 (OCH 2 CH 2 CONH), 29.7 (CH 2 CH 2 CH 2 CONH), 25.9 (CH 2 CH 2 CH 2 ).
[実施例2:代替出発物質であるデンドロン巨大分子の製造方法(Fmoc−Spacer−[9]−酸)]
実施例2で、多様な名称の化合物は、化合物1、2などと命名した。まず、スペーサである6−アジドヘクシルアミン(1)は、1,6−ジブロモヘキサンから下記に示す文献の方法(Lee,J.W.;Jun,S.I.;Kim,K.Tetrahedron Lett.,2001,42,2709)によって合成した。
In Example 2, compounds with various names were named compounds 1, 2 and so on. First, the spacer 6-azidohexylamine (1) was obtained from 1,6-dibromohexane according to the literature method described below (Lee, JW; Jun, SI; Kim, K. Tetrahedron Lett. , 2001, 42, 2709).
前記スペーサは、下記に示すように、非対称ウレア形成(unsymmetric urea formation)及び製作されたN3−スペーサ−[3]エステル(3)を通じて反復単位を添付した。前記反復単位は、tert−ブチルアクリレートを使用したトリスの縮合で合成した(which had been reported in Cardona,C.M.;Gawley,R.E.J.Org.Chem.2002,67,141)。
前記トリエステルは、ペプチドカップリング条件下で加水分解及びトリエステル(2)に組合わせることを通じて、N3−スペーサ−[3]酸(4)に形質転換させた。アジドのアミン基への還元反応、及びFmoc基を有するアミンの保護反応後に、ノナエステル(nona ester)の加水分解はFmoc−spacer−[9]酸(5)を提供した。Fmoc−spacer−[9]酸(5)の構造を下記に示す。
<N−(6−アジドヘキシル)−N−トリス{[2−(tert−ブトキシカルボニル)エトキシ]メチル}−メチルウレア(3)>
トリホスジン(Triphosgene)(1.3g、4.3mmol)を無水CH2Cl2(20mL)に溶解した。無水CH2Cl2(35mL)に溶解された6−アジドヘキシルアミン(1)(1.6g、12mmol)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、2.4mL、13.8mmol)の混合物をシリンジポンプを利用して7時間以上の周期で前記撹拌されたトリホスジン溶液に滴下して添加した。2時間さらに攪拌した後、無水CH2Cl2(20mL)に溶解された前記化合物(2)(6.4g、13mmol)及びDIEA(2.7mL、15.2mmol)の溶液を添加した。反応混合物は窒素雰囲気下で室温で4時間攪拌して、0.5MのHCl及び塩を使用して洗浄した。有機層は無水MgSO4で乾燥した後、溶媒は蒸発させて除去した。コラムクロマトグラフィーを使用した精製(silica,1:1 EtOAc/hexane)で、無色オイルを得た(3.0g、40%)。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.45 (s, (CH3)3C, 27H); 1.36-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2,8H); 2.46 (t, CH2CH2O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.13 (m, CONHCH2, 2H), 3.26 (t, N3CH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.64-3.76 (m, CCH2O and CH2CH2O, 12H); 5.00 (t, CH2NHCO, J=6.7 Hz, 1H), 5.29 (s, CONHC, 1H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.52, 26.54, 28.81, 30.26 (CH2CH2CH2CH2); 28.14((CH3)3C); 36.20 (CH2CH2O); 39.86 (CONHCH2); 51.40 (N3CH2); 58.81 (CCH2O); 67.16 (CH2CH2O); 69.23 (CCH2O); 80.58 ((CH3)3C); 157.96 (NHCONH); 171.26 (COOt-Bu).
FAB-MS: 674.26 (M+).
<N- (6-azidohexyl) -N-tris {[2- (tert-butoxycarbonyl) ethoxy] methyl} -methylurea (3)>
Triphosgene (1.3 g, 4.3 mmol) was dissolved in anhydrous CH 2 Cl 2 (20 mL). Anhydrous CH 2 Cl 2 (35mL), dissolved in 6-azido hexylamine (1) (1.6g, 12mmol) and N, the mixture syringe pump N- diisopropylethylamine (DIEA, 2.4mL, 13.8mmol) Was added dropwise to the stirred triphosphine solution with a period of 7 hours or more. After further stirring for 2 hours, a solution of the compound (2) (6.4 g, 13 mmol) and DIEA (2.7 mL, 15.2 mmol) dissolved in anhydrous CH 2 Cl 2 (20 mL) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 hours under a nitrogen atmosphere and washed using 0.5 M HCl and salt. The organic layer was dried over anhydrous MgSO 4 and the solvent was removed by evaporation. Purification using column chromatography (silica, 1: 1 EtOAc / hexane) gave a colorless oil (3.0 g, 40%).
1 H NMR (CDCl 3 , 300 MHz): δ 1.45 (s, (CH 3 ) 3 C, 27H); 1.36-1.58 (m, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 , 8H); 2.46 (t, CH 2 CH 2 O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.13 (m, CONHCH 2 , 2H), 3.26 (t, N 3 CH 2 , J = 6.9 Hz, 2H), 3.64-3.76 (m, CCH 2 O and CH 2 CH 2 O, 12H); 5.00 (t, CH 2 NHCO, J = 6.7 Hz, 1H), 5.29 (s, CONHC, 1H).
13 C NMR (CDCl 3 , 75 MHz): δ 26.52, 26.54, 28.81, 30.26 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 28.14 ((CH 3 ) 3 C); 36.20 (CH 2 CH 2 O); 39.86 (CONHCH 2 ); 51.40 (N 3 CH 2 ); 58.81 (CCH 2 O); 67.16 (CH 2 CH 2 O); 69.23 (CCH 2 O); 80.58 ((CH 3 ) 3 C); 157.96 (NHCONH) ; 171.26 (COOt-Bu).
FAB-MS: 674.26 (M + ).
<N−(6−アジドヘキシル)−N−トリス{[2−カルボキシエトキシ]メチル}メチルウレア(4)>
N3−スペーサ−[3]エステル(3)(0.36g、0.56mmol)を24時間6.6mLの96%ホルム酸で攪拌した。ホルム酸は、50℃で減圧によって除去して、定量的な(quantitative)収率で無色オイルを製造した。
1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz): δ 1.34-1.60 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.53 (t, CH2CH2O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.07 (t, CONHCH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.32 (t, N3CH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.67-3.73 (m, CCH2O and CH2CH2O, 12H).
13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz): δ 27.21, 29.54, 31.02 (CH2CH2CH2CH2); 35.42 (CH2CH2O); 40.27 (CONHCH2); 52.00 (N3CH2); 59.74 (CCH2O); 67.85 (CH2CH2O); 70.96 (CCH2O); 158.96 (NHCONH); 173.42 (COOH).
FAB-MS: 506.19 (MH+).
<N- (6-azidohexyl) -N-tris {[2-carboxyethoxy] methyl} methylurea (4)>
N 3 -spacer- [3] ester (3) (0.36 g, 0.56 mmol) was stirred with 6.6 mL of 96% formic acid for 24 hours. Formic acid was removed by reduced pressure at 50 ° C. to produce a colorless oil in quantitative yield.
1 H NMR (CD 3 COCD 3 , 300 MHz): δ 1.34-1.60 (m, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 , 8H); 2.53 (t, CH 2 CH 2 O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.07 (t, CONHCH 2 , J = 6.9 Hz, 2H), 3.32 (t, N 3 CH 2 , J = 6.9 Hz, 2H), 3.67-3.73 (m, CCH 2 O and CH 2 CH 2 O, 12H) .
13 C NMR (CD 3 COCD 3 , 75 MHz): δ 27.21, 29.54, 31.02 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 35.42 (CH 2 CH 2 O); 40.27 (CONHCH 2 ); 52.00 (N 3 CH 2 ); 59.74 (CCH 2 O); 67.85 (CH 2 CH 2 O); 70.96 (CCH 2 O); 158.96 (NHCONH); 173.42 (COOH).
FAB-MS: 506.19 (MH + ).
<N−(6−アジドヘキシル)−N´−トリス[(2−{[(トリス{[2−(tert−ブトキシカルボニル)エトキシ]−メチル}メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]メチルウレア(4.1)>
HOBt(0.20g、1.5mmol)、DIEA(0.30mL、1.8mmol)、及びEDC(0.33g、1.8mmol)を乾燥アセトニトリル5.0mLに溶解した前記化合物(4)(0.25g、0.50mmol)に添加した。その後、乾燥アセトニトリル2.5mLに溶解したアミン(2)(1.14g、2.3mmol)を添加して、反応混合物を48時間N2下で攪拌した。溶媒を減圧で除去した後、残余物をMCに溶解して、0.5MのHCl及び塩で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させた後、溶媒を真空で除去して、コラムクロマトグラフィー(SiO2、2:1EtOAc/hexane)で精製して、無色オイルを得た(0.67g、70%)。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.45 (s, (CH3)3C, 81H); 1.36-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2,8H); 2.40-2.47 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H), 3.13 (m, CONHCH2, 2H), 3.26 (t, N3CH2, 6.9 Hz, 2H), 3.62-3.69 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 5.36(t, CH2NHCO, J=6.7 Hz, 1H), 5.68 (br, CONHC, 1H), 6.28 (br, amide NH, 3H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.59, 26.69, 28.91, 30.54 (CH2CH2CH2CH2); 28.22 ((CH3)3C); 36.20 (CH2CH2O gen. 2); 37.43 (CH2CH2O gen. 1); 39.81 (CONHCH2); 51.47(N3CH2); 58.93 (CCH2O gen. 1); 59.89 (CCH2O gen. 2); 67.15 (CH2CH2O gen. 2); 67.68 (CH2CH2O gen. 1); 69.23 (CCH2O gen. 2); 70.12 (CCH2O gen. 1); 80.57 ((CH3)3C); 158.25 (NHCONH); 171.01 (COOt-Bu) 171.41 (CONH amides).
MALDI-MS: 1989.8 (MNa+), 2005.8 (MK+).
<N- (6-azidohexyl) -N'-tris [(2-{[(tris {[2- (tert-butoxycarbonyl) ethoxy] -methyl} methyl) amino] carbonyl} ethoxy) methyl] methylurea (4. 1)>
HOBt (0.20 g, 1.5 mmol), DIEA (0.30 mL, 1.8 mmol), and EDC (0.33 g, 1.8 mmol) dissolved in 5.0 mL of dry acetonitrile (4) (0. 25 g, 0.50 mmol). Thereafter, the amine was dissolved in dry acetonitrile 2.5mL (2) (1.14g, 2.3mmol ) was added and the reaction mixture was stirred under 48 hours N 2. After removing the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in MC and washed with 0.5 M HCl and salt. After the organic layer was dried over MgSO 4 , the solvent was removed in vacuo and purified by column chromatography (SiO 2 , 2: 1 EtOAc / hexane) to give a colorless oil (0.67 g, 70%). .
1 H NMR (CDCl 3 , 300 MHz): δ1.45 (s, (CH 3 ) 3 C, 81H); 1.36-1.58 (m, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 , 8H); 2.40-2.47 (m , CH 2 CH 2 O gen. 1 & 2, 24H), 3.13 (m, CONHCH 2 , 2H), 3.26 (t, N 3 CH 2 , 6.9 Hz, 2H), 3.62-3.69 (m, CCH 2 O gen 1 & 2, CH 2 CH 2 O gen. 1 & 2, 48H); 5.36 (t, CH 2 NHCO, J = 6.7 Hz, 1H), 5.68 (br, CONHC, 1H), 6.28 (br, amide NH , 3H).
13 C NMR (CDCl 3 , 75 MHz): δ 26.59, 26.69, 28.91, 30.54 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 28.22 ((CH 3 ) 3 C); 36.20 (CH 2 CH 2 O gen. 2 ); 37.43 (CH 2 CH 2 O gen. 1); 39.81 (CONHCH 2 ); 51.47 (N 3 CH 2 ); 58.93 (CCH 2 O gen. 1); 59.89 (CCH 2 O gen. 2); 67.15 ( CH 2 CH 2 O gen. 2); 67.68 (CH 2 CH 2 O gen. 1); 69.23 (CCH 2 O gen. 2); 70.12 (CCH 2 O gen. 1); 80.57 ((CH 3 ) 3 C ); 158.25 (NHCONH); 171.01 (COOt-Bu) 171.41 (CONH amides).
MALDI-MS: 1989.8 (MNa + ), 2005.8 (MK + ).
<N−(6−アミノヘキシル)−N´−トリス[(2−{[(トリス{[2−(tert−ブトキシカルボニル)エトキシ]−メチル}メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]メチルウレア(4.2)>
エタノール(20.0mL)に溶解されたノナ−tert−ブチルエステル(4.1)(0.37g、0.20mmol)を10%Pd/C(37.0mg)と共にH2下で室温で12時間攪拌した。TLCで反応の終了を確認した後、混合物を0.2mmのミリポア(Millipore)フィルターでろ過した。ろ過紙をCH2Cl2ですすいだ後、混合された溶媒を真空で除去して、無色オイルを得た。
<N- (6-aminohexyl) -N'-tris [(2-{[(tris {[2- (tert-butoxycarbonyl) ethoxy] -methyl} methyl) amino] carbonyl} ethoxy) methyl] methylurea (4 .2)>
Nona-tert-butyl ester (4.1) (0.37 g, 0.20 mmol) dissolved in ethanol (20.0 mL) with 10% Pd / C (37.0 mg) at room temperature under H 2 for 12 hours. Stir. After confirming the completion of the reaction by TLC, the mixture was filtered through a 0.2 mm Millipore filter. After rinsing the filter paper with CH 2 Cl 2 , the mixed solvent was removed in vacuo to give a colorless oil.
<N−{6−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)アミノヘキシル}−N´−トリス[(2−{[(トリス{[2−(tert−ブトキシカルボニル)エトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]メチルウレア(4.3)>
アミン(4.2)(0.33g、0.17mmol)及びDIEA(33mL、0.19mmol)を5.0mLのCH2Cl2に溶解して、窒素雰囲気下で30分間攪拌した。2.0mLのCH2Cl2に溶解した9−フルオレニルメチルクロロホメイト(48mg、0.19mmol)を添加して、反応混合物を室温で3時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去して、0.5MのHCl及び塩で洗浄した(0.18g、64%)。残余物をコラムクロマトグラフィー(silica、EtOAc)で精製して、無色オイルを得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.45(s, (CH3)3C, 81H); 1.23-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2,8H); 2.37-2.47 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H); 3.10-3.22 (m, CONHCH2, 4H); 3.62- 3.70 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 4.22 (t, CH(fluorenyl)-CH2,J=7.1 Hz, 1H); 4.36 (d, fluorenyl-CH2, J=7.1 Hz, 2H); 5.27-5.35 (m, CH2NHCO, 2H); 5.67 (br, CONHC, 1H); 6.25 (br, amide, 3H); 7.28 -7.77 (fluorenyl, 8H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.85, 27.02, 30.27, 30.88 (CH2CH2CH2CH2); 28.49 ((CH3)3C); 36.48 (CH2CH2O gen. 2); 37.73 (CH2CH2O gen. 1); 40.03, 41.34 (CONHCH2); 47.68 (CH(fluorenyl)-CH2); 59.22 (CCH2O gen. 1); 60.16 (CCH2O gen. 2); 66.87 (fluorenyl-CH2); 67.43 (CH2CH2O gen. 2); 67.98 (CH2CH2O gen. 1); 69.52 (CCH2O gen. 2); 70.42 (CCH2O gen.1); 80.84 ((CH3)3C); 120.28, 125.52, 127.38, 127.98, 141.65, 144.48 (fluorenyl); 156.88 (OCONH); 158.52 (NHCONH); 171.27 (COOt-Bu) 171.65(amide CONH).
MALDI-MS : 2186.8 (MNa+), 2002.8 (MK+).
<N- {6- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminohexyl} -N'-tris [(2-{[(tris {[2- (tert-butoxycarbonyl) ethoxy] methyl} methyl) amino] carbonyl } Ethoxy) methyl] methylurea (4.3)>
Amine (4.2) (0.33 g, 0.17 mmol) and DIEA (33 mL, 0.19 mmol) were dissolved in 5.0 mL of CH 2 Cl 2 and stirred for 30 minutes under a nitrogen atmosphere. 9-Fluorenylmethyl chloroformate (48 mg, 0.19 mmol) dissolved in 2.0 mL of CH 2 Cl 2 was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The solvent was removed under reduced pressure and washed with 0.5 M HCl and salt (0.18 g, 64%). The residue was purified by column chromatography (silica, EtOAc) to give a colorless oil.
1 H NMR (CDCl 3 , 300 MHz): δ 1.45 (s, (CH 3 ) 3 C, 81H); 1.23-1.58 (m, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 , 8H); 2.37-2.47 (m, CH 2 CH 2 O gen. 1 & 2, 24H); 3.10-3.22 (m, CONHCH 2 , 4H); 3.62- 3.70 (m, CCH 2 O gen. 1 & 2, CH 2 CH 2 O gen. 1 & 4.22 (t, CH (fluorenyl) -CH 2 , J = 7.1 Hz, 1H); 4.36 (d, fluorenyl-CH 2 , J = 7.1 Hz, 2H); 5.27-5.35 (m, CH 2 NHCO, 2H); 5.67 (br, CONHC, 1H); 6.25 (br, amide, 3H); 7.28 -7.77 (fluorenyl, 8H).
13 C NMR (CDCl 3 , 75 MHz): δ 26.85, 27.02, 30.27, 30.88 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 28.49 ((CH 3 ) 3 C); 36.48 (CH 2 CH 2 O gen. 2 ); 37.73 (CH 2 CH 2 O gen. 1); 40.03, 41.34 (CONHCH 2 ); 47.68 (CH (fluorenyl) -CH 2 ); 59.22 (CCH 2 O gen. 1); 60.16 (CCH 2 O gen. 2); 66.87 (fluorenyl-CH 2 ); 67.43 (CH 2 CH 2 O gen. 2); 67.98 (CH 2 CH 2 O gen. 1); 69.52 (CCH 2 O gen. 2); 70.42 (CCH 2 O gen.1); 80.84 ((CH 3 ) 3 C); 120.28, 125.52, 127.38, 127.98, 141.65, 144.48 (fluorenyl); 156.88 (OCONH); 158.52 (NHCONH); 171.27 (COOt-Bu) 171.65 (amide CONH ).
MALDI-MS: 2186.8 (MNa + ), 2002.8 (MK + ).
<N−{6−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)アミノヘキシル}−N´−トリス[(2−{[(トリス{[2−カルボキシエトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]−メチルウレア(5)>
保護基を有するノナ−tert−ブチルエステル(4.3)(0.12g、72mmol)を18時間10mLの96%ホルム酸で攪拌した。ホルム酸は、50℃で減圧して除去して、定量的な(quantitative)収率で無色オイルを製造した。
1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz): δ 1.23-1.51 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.44-2.58 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H); 3.15-3.18 (m, CONHCH2, 4H); 3.61-3.75 (m, CCH2O gen. 1& 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 4.23 (t, CH(fluorenyl)-CH2, J=7.0 Hz, 1H); 4.35 (d, fluorenyl-CH2, J=7.0 Hz, 2H); 5.85, 6.09 (br, CH2NHCO, 2H); 6.57 (br, CONHC,1H); 6.88 (br, amide NH, 3H); 7.31-7.88 (fluorenyl, 8H).
13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz): δ 27.21, 27.33, 30.69, 30.98 (CH2CH2CH2CH2); 35.31 (CH2CH2O gen. 2); 37.83 (CH2CH2O gen. 1); 40.56, 41.54 (CONHCH2); 48.10 (CH(fluorenyl)-CH2); 59.93 (CCH2O gen. 1); 61.10 (CCH2O gen. 2); 66.86 (fluorenyl-CH2); 67.81 (CH2CH2O gen. 2); 68.37 (CH2CH2O gen. 1); 69.80 (CCH2O gen. 2); 70.83 (CCH2O gen.1); 120.84, 126.13, 127.98, 128.56, 142.10, 145.16 (fluorenyl); 157.50 (OCONH); 159.82 (NHCONH); 173.20 (amide CONH); 173.93 (COOH).
<N- {6- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminohexyl} -N'-tris [(2-{[(tris {[2-carboxyethoxy] methyl} methyl) amino] carbonyl} ethoxy) methyl] -Methylurea (5)>
Nona-tert-butyl ester with protecting group (4.3) (0.12 g, 72 mmol) was stirred with 10 mL of 96% formic acid for 18 hours. The formic acid was removed at 50 ° C. under reduced pressure to produce a colorless oil in quantitative yield.
1 H NMR (CD 3 COCD 3 , 300 MHz): δ 1.23-1.51 (m, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 , 8H); 2.44-2.58 (m, CH 2 CH 2 O gen. 1 & 2, 24H ); 3.15-3.18 (m, CONHCH 2 , 4H); 3.61-3.75 (m, CCH 2 O gen. 1 & 2, CH 2 CH 2 O gen. 1 & 2, 48H); 4.23 (t, CH (fluorenyl) -CH 2 , J = 7.0 Hz, 1H); 4.35 (d, fluorenyl-CH 2 , J = 7.0 Hz, 2H); 5.85, 6.09 (br, CH 2 NHCO, 2H); 6.57 (br, CONHC, 1H); 6.88 (br , amide NH, 3H); 7.31-7.88 (fluorenyl, 8H).
13 C NMR (CD 3 COCD 3 , 75 MHz): δ 27.21, 27.33, 30.69, 30.98 (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 35.31 (CH 2 CH 2 O gen. 2); 37.83 (CH 2 CH 2 O gen. 1); 40.56, 41.54 (CONHCH 2 ); 48.10 (CH (fluorenyl) -CH 2 ); 59.93 (CCH 2 O gen. 1); 61.10 (CCH 2 O gen. 2); 66.86 (fluorenyl-CH 2 ); 67.81 (CH 2 CH 2 O gen. 2); 68.37 (CH 2 CH 2 O gen. 1); 69.80 (CCH 2 O gen. 2); 70.83 (CCH 2 O gen. 1); 120.84, 126.13 , 127.98, 128.56, 142.10, 145.16 (fluorenyl); 157.50 (OCONH); 159.82 (NHCONH); 173.20 (amide CONH); 173.93 (COOH).
[実施例3:追加デンドロン化合物]
特定保護基を以下に示すが、前記化合物は限定されないことを周知しなければならない。また、多様な鎖及びスペーサが正確な分子構造を示して描写される限り、サブストレート表面上に調節された密度、好ましくは低密度の配列のための改質は容認された化学的改質方法(chemical modification methods)により可能であった。化合物のショートハンド技術(short−hand description)に対する参考として、以下に示す化合物の左側の大部分は保護基を示し;括弧(brackets)の数字は鎖の末端(branched termini)の数を示し;右側の大部分は化学的な本体(entity)の鎖の末端上の化学的作用(chemistry)を示す。
実施例において、‘A−[27]−酸’とは、アントリルメチル保護基;27末端、及び末端が酸性基のものを示す。
Specific protecting groups are shown below, but it should be well known that the compounds are not limited. Also, as long as the various chains and spacers are depicted showing the exact molecular structure, modification for controlled density, preferably low density arrays on the substrate surface is an accepted chemical modification method. (Chemical modification methods). As a reference to the short-hand description of compounds, the majority of the left side of the compounds shown below indicate protecting groups; the numbers in brackets indicate the number of branched termini; Most show chemical chemistry on the end of the chain of the chemical entity.
In the examples, “A- [27] -acid” means an anthrylmethyl protecting group; the terminal 27 and an acid group at the terminal.
[実施例3.1:製造方法]
1.A−[3]−OEt(化合物3)
1. A- [3] -OEt (Compound 3)
2.A−[3]−OMe(化合物5)
3.A−[3]−OTs(化合物7)
4.A−[9]−OEt(化合物8)
5.A−[27]−OH(化合物9)
[実施例3.2]
1.Boc−[2]−OMe(化合物3)
1. Boc- [2] -OMe (Compound 3)
2.Boc−[4]−NH2(化合物5)
3.Boc−[8]−OMe(化合物6)
[実施例3.3]
1.Boc−[2]−OH(化合物3)
化合物2をNaOHで加水分解した。1日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はEAで洗浄して、氷槽で攪拌した後、HClで酸性化させた。EAを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
[Example 3.3]
1. Boc- [2] -OH (compound 3)
Compound 2 was hydrolyzed with NaOH. After stirring for 1 day at room temperature, the organic solution was evaporated. The aqueous solution was washed with EA, stirred in an ice bath and acidified with HCl. After extracting the product using EA, the organic solution was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the solvent evaporated.
2.Boc−[4]−OH(化合物3)
化合物4をNaOHで加水分解した。1日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はEAで洗浄して、氷槽で攪拌した後、HClで酸性化させた。EAを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
2. Boc- [4] -OH (Compound 3)
Compound 4 was hydrolyzed with NaOH. After stirring for 1 day at room temperature, the organic solution was evaporated. The aqueous solution was washed with EA, stirred in an ice bath and acidified with HCl. After extracting the product using EA, the organic solution was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the solvent evaporated.
3.Boc−[8]−OH(化合物3)
化合物6をNaOHで加水分解した。1日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はEAで洗浄して、氷槽で攪拌した後、HClで酸性化させた。EAを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
3. Boc- [8] -OH (Compound 3)
Compound 6 was hydrolyzed with NaOH. After stirring for 1 day at room temperature, the organic solution was evaporated. The aqueous solution was washed with EA, stirred in an ice bath and acidified with HCl. After extracting the product using EA, the organic solution was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the solvent evaporated.
[実施例3.4]
1.Boc−[2]−CN(化合物3)
1. Boc- [2] -CN (compound 3)
2.Boc−[2]−NH2(化合物4)
3.Boc−[4]−CN(化合物5)
4.Boc−[4]−NH2(化合物6)
5.Boc−[8]−CN(化合物7)
6.Boc−[8]−NH2(化合物8)
7.Boc−[16]−CN(化合物9)
8.Boc−[16]−NH2(化合物10)
[実施例3.5]
1.A−[3]−アルケン(化合物3)
1. A- [3] -Alkene (Compound 3)
2.A−[3]−SiCl3(化合物4)
3.A−[9]−アルケン(化合物5)
4.A−[9]−SiCl3(化合物6)
[実施例3.6]
1.[1]−酸−[3]−トリオール(化合物3)
1. [1] -Acid- [3] -triol (Compound 3)
2.A−[3]−トリオール(化合物5)
3.A−[3]−トリブロマイド(化合物6)
4.[1]−CN−[3]−OBzl(化合物8)
5.[1]−OH−[3]−OBzl(化合物11)
6.[1]−アルキン−[3]−OBzl(化合物13)
7.A−[3]−アルキン−[9]−OBzl(化合物14)
[実施例3.7]
1.A−[9]−OH(化合物15)
1. A- [9] -OH (Compound 15)
2.A−[27]−COOH(化合物17)
[実施例3.8]
1)[G1]−(OMe)2(化合物3)
1) [G1]-(OMe) 2 (Compound 3)
2)[G1]−(OH)2(化合物4)
3)[G2]−(OMe)4(化合物5)
4)[G2]−(OH)4(化合物6)
5)[G3]−(OMe)8(化合物7)
6)[G3]−(OH)8(化合物8)
[実施例4:サブストレート上にデンドロンの組立て]
APDESの代わりに、ガラス酸化物(oxide glass)上にTMAC(N−トリメトキシシリルプロピル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド)を自己組立てした。前記TMAC上のデンドリマー層のアミン残基をキャッピングする必要はなかった。
[Example 4: Assembly of dendron on substrate]
Instead of APDES, TMAC (N-trimethoxysilylpropyl-N, N, N-trimethylammonium chloride) was self-assembled on glass oxide. It was not necessary to cap the amine residues of the dendrimer layer on the TMAC.
<TMACによるアミノシリル化>
清潔なサブストレート(スライドガラス)をTMAC(2mL)及びアセトン(100mL)の混合溶液に5時間浸した。自己組立て後に、前記サブストレートをフラスコから取り出して、アセトンで洗浄した。前記サブストレートをオーブンに入れて110℃で40分間加熱した。アセトンに浸漬した後に、前記サブストレートを3分間超音波処理した。洗浄されたサブストレートをテフロン(登録商標)容器に入れ、O−フックに連結された大きなスクリューキャップを有するガラス容器に置いて、前記ガラス容器を真空処理して、前記TMACが自己組立てされたサブストレートを乾燥した。
TMACの化学式構造を以下に示す。
A clean substrate (slide glass) was immersed in a mixed solution of TMAC (2 mL) and acetone (100 mL) for 5 hours. After self-assembly, the substrate was removed from the flask and washed with acetone. The substrate was placed in an oven and heated at 110 ° C. for 40 minutes. After soaking in acetone, the substrate was sonicated for 3 minutes. The cleaned substrate is placed in a Teflon container, placed in a glass container having a large screw cap connected to an O-hook, and the glass container is vacuum processed to allow the TMAC to be self-assembled. Straight dried.
The chemical structure of TMAC is shown below.
無水酢酸でアミン残基をキャッピングすることを除いては、Fmoc−スペーサ−[9]酸をCBz−[9]酸と同一な条件で自己組立てした。 The Fmoc-spacer- [9] acid was self-assembled under the same conditions as the CBz- [9] acid except that the amine residue was capped with acetic anhydride.
<Fmoc−スペーサ−[9]酸(化合物5)の自己組立て>
一定量のFmoc−スペーサ−[9]酸(化合物5)を混合溶媒(DMF:脱イオン水=1:1(v/v))に溶解して、20mLの溶液を製造した。テフロン(登録商標)容器に前記溶液を入れて、前記で製造したアミノシリル化されたスライドガラス片を溶液に浸した。フラスコを常温に置いて、自己組立てするようにして、1日後に各サブストレート片を溶液から取り出した。片を取り出した直後に前記プレートを脱イオン水で洗浄した。各々のサブストレートを脱イオン水、脱イオン水−メタノール混合溶媒(1:1(v/v))、及びメタノールで順次に3分間超音波処理した。超音波処理した後に、テフロン(登録商標)容器に前記サブストレートを浸して、再びO−フックが連結された大きなスクリューギキップを有するガラス容器に入れて、前記ガラス容器を真空にして(30−40mTorr)サブストレートを乾燥した。
<Fmoc-Spacer- [9] Self-assembly of Acid (Compound 5)>
A certain amount of Fmoc-spacer- [9] acid (compound 5) was dissolved in a mixed solvent (DMF: deionized water = 1: 1 (v / v)) to prepare a 20 mL solution. The solution was put in a Teflon (registered trademark) container, and the aminosilylated slide glass piece prepared above was immersed in the solution. Each piece of substrate was removed from the solution after 1 day as the flask was placed at ambient temperature and allowed to self-assemble. The plate was washed with deionized water immediately after removing the strip. Each substrate was sonicated sequentially for 3 minutes with deionized water, deionized water-methanol mixed solvent (1: 1 (v / v)), and methanol. After sonication, the substrate is dipped in a Teflon (registered trademark) container, and again placed in a glass container having a large screw kit with an O-hook connected thereto, and the glass container is evacuated (30- 40 mTorr) The substrate was dried.
<Fmoc−スペーサ−[9]酸(化合物5)のFmoc脱保護化>
DMF中に5%のピペリジンを含むテフロン(登録商標)容器を容易した。前記自己組立てされたサブストレートを前記テフロン(登録商標)容器に浸して20分間攪拌した。各々のサブストレートをアセトン及びメタノールで順次に3分間超音波処理して、真空チャンバで(30−40mTorr)乾燥した。
<Fmoc-Spacer-Fmoc Deprotection of [9] Acid (Compound 5)>
A Teflon container with 5% piperidine in DMF was facilitated. The self-assembled substrate was immersed in the Teflon container and stirred for 20 minutes. Each substrate was sonicated sequentially with acetone and methanol for 3 minutes and dried in a vacuum chamber (30-40 mTorr).
[実施例5:デンドロン(9−酸及び27−酸)]改質表面上のp53マイクロアレイ]
非常に高い頻度で無意味な(missense)変異ホットスポットを有することが分かっている7つのコドン、つまり175、215、216、239、248、273、及び282を選択して、実験に利用した。7つのコドンのうち、コドン175、248、273、及び282は国際P53変異データベース(IARC、http//:www−p53.iarc.fr/p53DataBase.htm)から得て、残りの三つのコドン、つまり215、216、及び239は韓国p53変異ホットスポットデータベースから得た。前記6つのコドンに対するキャプチャープローブ序列(デンドロン改質表面に固定化されたDNA)をソフトウェアで製作し、これらの長さは15−23merと多様にして、Tmは約55℃に合わせた。
[Example 5: dendron (9-acid and 27-acid)] p53 microarray on modified surface]
Seven codons that were found to have a very high frequency of missense mutation hotspots, 175, 215, 216, 239, 248, 273, and 282, were selected and used in the experiments. Of the seven codons, codons 175, 248, 273, and 282 are obtained from the international P53 mutation database (IARC, http: //: www-p53.iarc.fr/p53DataBase.htm) and the remaining three codons, 215, 216, and 239 were obtained from the Korean p53 mutation hotspot database. Capture probe sequences for the six codons (DNA immobilized on the dendron-modified surface) were produced by software, their length varied from 15-23mer, and Tm was adjusted to about 55 ° C.
<実施例5.1:デンドロン改質表面を使用したp53遺伝子の7つのホットスポット変異の探知>
デンドロン改質サブストレートを使用して、癌細胞株のp53遺伝子の単一変異を探知した。7つのホットスポットコドン(175、215、216、239、248、273、及び282)を含む標的DNAサンプル(100−200mer)を、ランダムプライミング法を使用して癌細胞から抽出されたDNAを増幅して製造し(実施例5.8参照)、固定化された7つのホットスポットコドンに相応するキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチドof15−25mer)と混成化させた。各々の混成化されたスポットの蛍光強度を共焦点レーザースキャナで測定し、SNP区別能を計算した。この実施例によれば、デンドロン改質表面を有するDNAマイクロアレイの品質は、実際に標的サンプルに存在する単一変異を探知することができることを示している。
<Example 5.1: Detection of seven hot spot mutations in p53 gene using dendron modified surface>
A dendron modified substrate was used to detect a single mutation in the p53 gene of a cancer cell line. A target DNA sample (100-200 mer) containing 7 hot spot codons (175, 215, 216, 239, 248, 273, and 282) was amplified from DNA extracted from cancer cells using a random priming method. (See Example 5.8) and hybridized with a capture probe (oligonucleotide of 15-25mer) corresponding to 7 immobilized hot spot codons. The fluorescence intensity of each hybridized spot was measured with a confocal laser scanner and the SNP discrimination ability was calculated. According to this example, the quality of a DNA microarray having a dendron modified surface indicates that it can actually detect a single mutation present in the target sample.
<実施例5.2:混成化効率及びSNP区別に及ぼすT30を有するプローブオリゴヌクレオチドの長さの影響>
SNP区別のためのキャプチャープローブの長さの影響をT30を有する多様な長さのキャプチャープローブを使用して試験した。T30を含んでコドン175及び239に相応するキャプチャーオリゴヌクレオチドを5´末端及びデンドロン改質表面の末端の1次アミノ基に連結することによって固定させた後に、p53標的DNAを混成化させて、蛍光強度を測定した。この実施例は、キャプチャープローブの長さに対するSNP区別能及び信号強度の依存性を示した。
<Example 5.2: Effect of length of probe oligonucleotide having T30 on hybridization efficiency and SNP discrimination>
The effect of capture probe length on SNP discrimination was tested using various length capture probes with T30. After fixing the capture oligonucleotide containing T30 and corresponding to codons 175 and 239 to the 5 ′ end and the primary amino group at the end of the dendron modified surface, the p53 target DNA was hybridized and fluorescent The strength was measured. This example showed the dependence of SNP discrimination ability and signal strength on capture probe length.
<実施例5.3:キャプチャープローブ濃度vs強度(intensity);及びキャプチャープローブvsSNP区別>
キャプチャープローブの濃度に対する信号強度及びSNP区別能の依存性を調査した。デンドロン改質表面上のキャプチャープローブを多様な濃度にして標的DNAと混成化して、蛍光強度及びSNP区別能を測定した。p53に対するキャプチャープローブの最適濃度を決定した。
<Example 5.3: Capture probe concentration vs intensity (intensity); and capture probe vs SNP distinction>
The dependence of signal intensity and SNP discrimination ability on capture probe concentration was investigated. The capture probe on the dendron-modified surface was mixed with target DNA at various concentrations, and the fluorescence intensity and SNP discrimination ability were measured. The optimal concentration of capture probe for p53 was determined.
<実施例5.4:プローブ濃度vs強度;及び標的プローブ濃度vsSNP区別>
標的プローブの濃度に対する信号強度及びSNP区別能の依存性を調査した。標的DNAを多様な濃度にして混成化して、蛍光強度及びSNP区別能を測定した。この実施例により、デンドロン改質表面を有するDNAマイクロアレイの多様な範囲を提供した。
<Example 5.4: Probe concentration vs intensity; and target probe concentration vs SNP distinction>
The dependence of signal intensity and SNP discrimination ability on target probe concentration was investigated. The target DNA was hybridized at various concentrations, and the fluorescence intensity and SNP discrimination ability were measured. This example provided a diverse range of DNA microarrays with dendron modified surfaces.
<実施例5.5:混合標的サンプルにある変異の探知>
正常な序列に比べて変異した標的序列が小さい部分に存在する、点突然変異を有する標的サンプル(5または10%)を探知することができる。二種類の標的DNAを含む標的サンプルを異なるモル濃度で製造して混成化して、変異した標的DNAだけでなく、正常な序列の混合物において特定コドンで単一点突然変異を探知するようにした。この実施例は、初期段階の癌を診断するのに大変重要な臨床的意義がある。
<Example 5.5: Detection of mutation in mixed target sample>
Target samples with point mutations (5 or 10%) can be detected, where the mutated target sequence is present in a small part compared to the normal sequence. Target samples containing two types of target DNA were produced and hybridized at different molar concentrations to detect single point mutations at specific codons in a normal ordered mixture as well as mutated target DNA. This example has very important clinical significance in diagnosing early stage cancer.
<実施例5.6:10個の未知の直腸癌細胞株の変異探知>
癌細胞株の未知の変異を探知するために考案したシステムである。
<Example 5.6: Mutation detection of 10 unknown rectal cancer cell lines>
A system designed to detect unknown mutations in cancer cell lines.
≪実施例5.6.1:細胞培養及びゲノムDNA抽出≫
直腸癌細胞株SNU−C1、SNU−C5、COLO 201、COLO 205、DLD−1、LS 513、HCT−15、LS 174T、HCT 116、及びSW 480をKCLB(韓国細胞株バンク、韓国、ソウル)から購入した。10%ウテア血清(FBS)、100μg/mlのストラプトマイシン、及び100Uのペニシリン(GibcoBRL,Carlsbad,CA)が補充されたRPMI 1640に細胞を接種して、5%のCO2、37℃で培養した。直腸癌細胞(2×106細胞)をInvisorb(登録商標)spin cell mini kit(Invitek,Berlin,Germany)の使用者マニュアルに従って得て、ゲノムDNA分析に使用した。これらゲノムDNAからp53標的DNAを製造し(実施例5.8.2参照)、DNAマイクロアレイ実験を前記方法と同様な方法で行った。
<< Example 5.6.1: Cell culture and genomic DNA extraction >>
Rectal cancer cell lines SNU-C1, SNU-C5, COLO 201, COLO 205, DLD-1, LS 513, HCT-15, LS 174T, HCT 116, and SW 480 were KCLB (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) Purchased from. Cells were inoculated into RPMI 1640 supplemented with 10% Utea serum (FBS), 100 μg / ml streptomycin, and 100 U penicillin (GibcoBRL, Carlsbad, CA) and cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 . did. Rectal cancer cells (2 × 10 6 cells) were obtained according to the user manual of Invisorb® spin cell mini kit (Invitek, Berlin, Germany) and used for genomic DNA analysis. P53 target DNA was produced from these genomic DNAs (see Example 5.8.2), and DNA microarray experiments were performed in the same manner as described above.
<実施例5.7:混成化効率及びSNP区別に対する標的プローブの長さの影響>
ランダムプライマ−法、PCR、Dnase分解などの多様な方法で多様な長さを有する標的DNAを製造し、混成化効率及びSNP区別に対する標的プローブの長さの影響を調査した。
<Example 5.7: Effect of target probe length on hybridization efficiency and SNP discrimination>
Target DNAs having various lengths were produced by various methods such as random primer method, PCR, and Dnase degradation, and the influence of target probe length on hybridization efficiency and SNP discrimination was investigated.
<実施例5.8:実験方法>
≪実施例5.8.1:ゲノムDNAサンプル≫
SNU細胞株(SNU−61、216、475、563、601、668、761、及び1040)のゲノムDNAをソウル大学医学部の朴ジェガプ氏から得た。前記SNU細胞株は、韓国の患者から採取したヒト腫よう細胞株である。これら細胞株の特性は以前に記述したものと同一であり、多様な研究で使用された(Bae IS et al.,2000,Park JG et al.,1997,Kang MS et al.,1996,Yuan Y et al.,1997,378−87)。
<Example 5.8: Experimental method>
<< Example 5.8.1: Genomic DNA Sample >>
Genomic DNA of SNU cell lines (SNU-61, 216, 475, 563, 601, 668, 761, and 1040) was obtained from Park Jegap of Seoul National University School of Medicine. The SNU cell line is a human tumor cell line collected from a Korean patient. The characteristics of these cell lines were identical to those previously described and were used in various studies (Bae IS et al., 2000, Park JG et al., 1997, Kang MS et al., 1996, Yuan Y et al., 1997, 378-87).
≪実施例5.8.2:サブクローニング及び序列分析≫
各細胞株に対して、p53遺伝子、特にエクソン5及びエクソン8間に存在するp53遺伝子を2対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した:エクソン5Fwd I、5´−CTG ACT TTC AAC TCT GTC TCC T−3´(SEQ ID NO:5);エクソン5Fwd II、5´−TAC TCC CCT GCC CTCAAC AA−3´(SEQ ID NO:6);エクソン8Rev I、5´−TGC ACC CTT GGT CTC CTC CAC−3´(SEQ ID NO:7);エクソン8Rev II、5´−CTC GCT TAG TGC TCC CGG G−3´(SEQ ID NO:8)(Kang MS et al.,1996)。下記条件により、Multiblock System(Hybaid,UK)全体の反応体積が20μlになるように、1×ThermoPol緩衝液(補充Taqポリメラーゼ)のうち、250μ M dNTPミックス、2.5U Taqポリメラーゼ(NEB)、10pmoleの最初のプライマー対(イントロは4及び8に相応するエクソン5Fwd I及びエクソン8Rev I)、250μ M dNTPミックス、2.5U Taqポリメラーゼ(NEB)にして、各ゲノムDNAを増幅した:ポリメラーゼ初期活性化、95℃で1分;20周期、95℃で30秒;58℃で30秒;72℃で90秒;72℃で5分最終延長した。最初のPCR産物を希釈して2番目のPCRのための鋳型として使用した。ゲノムDNAのPCR増幅産物を20倍に希釈して、PCRプライマ−を10pmolの2番目のプライマー対(エクソン5及び8に相応するエクソン5Fwd II及びエクソン8Rev II)を使用したことを除いては、前記段階と同一な条件下で2番目のnested PCRを行った。増幅周期は25周期に増加させた。最終のnested PCR産物をゲル抽出法で精製した。ゲノムDNAから得られたPCR産物をpGEM T−easyベクトル(Promega)に連結して、DH5a細胞に形質転換させた。サブクローニングされたプラスミドをQIAGEN Plasmid Min kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)で分離して、序列分析に使用した。pUC/M13正方向及び逆方向序列分析を次のプライマー対を使用して行った:M13 FWD 5´−GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG−3´(SEQ ID NO:9)及びM13 REV 5´−TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG−3´(SEQ ID NO:10)。
<< Example 5.8.2: Subcloning and sequence analysis >>
For each cell line, the p53 gene, in particular the p53 gene present between exon 5 and exon 8, was amplified using two pairs of synthetic oligonucleotide primers: exon 5Fwd I, 5′-CTG ACT TTC AAC TCT GTC TCC T-3 ′ (SEQ ID NO: 5); Exon 5Fwd II, 5′-TAC TCC CCT GCC CTCAAC AA-3 ′ (SEQ ID NO: 6); Exon 8 Rev I, 5′-TGC ACC CTT GGT CTC CTC CAC-3 ′ (SEQ ID NO: 7); Exon 8 Rev II, 5′-CTC GCT TAG TGC TCC CGG G-3 ′ (SEQ ID NO: 8) (Kang MS et al., 1996). Under the following conditions, 250 μM dNTP mix, 2.5 U Taq polymerase (NEB), 10 pmole in 1 × ThermoPol buffer (supplemented Taq polymerase) so that the reaction volume of the entire Multiblock System (Hybaid, UK) becomes 20 μl. Each genomic DNA was amplified using the first primer pair (exon 5Fwd I and exon 8 Rev I corresponding to 4 and 8), 250 μM dNTP mix, 2.5 U Taq polymerase (NEB): polymerase initial activation 20 cycles, 95 ° C. for 30 seconds; 58 ° C. for 30 seconds; 72 ° C. for 90 seconds; 72 ° C. for 5 minutes for a final extension. The first PCR product was diluted and used as a template for the second PCR. Except that the PCR amplification product of genomic DNA was diluted 20-fold and the PCR primer was used with 10 pmol of the second primer pair (exon 5 Fwd II and exon 8 Rev II corresponding to exon 5 and 8). A second nested PCR was performed under the same conditions as in the previous step. The amplification period was increased to 25 periods. The final nested PCR product was purified by gel extraction. The PCR product obtained from genomic DNA was ligated to the pGEM T-easy vector (Promega) and transformed into DH5a cells. The subcloned plasmid was isolated with QIAGEN Plasmid Min kit (QIAGEN Inc., Valencia, Calif.) And used for rank analysis. pUC / M13 forward and reverse sequence analysis was performed using the following primer pairs: M13 FWD 5'-GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG-3 '(SEQ ID NO: 9) and M13 REV 5'- TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG-3 ′ (SEQ ID NO: 10).
≪実施例5.8.3:標的プローブの製造≫
SNPシートを含むDNA標的プローブをランダムプライマ−法及び標識化方法で50ngの鋳型DNA、50UのKlenow酵素(NEB)、1×EcoPol緩衝液(Klenow酵素補充)、6μgのランダムオクタマ(Bionics社合成)、低濃度dT dNTPミックス(100μM dA、G、CTP/50μM dTTP)、及び50Cyanine3−dUTP(NEN)を含むMultiblock System(Hybaid,UK)で体積全体を20μlにして、37℃、2時間行った。QIAGENMinElute PCR purification kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)を使用して併合されないヌクレオチドを分離した。UV/Visスペクトロフォトメーターを使用して定量及び定性分析(特異的活性、結合された蛍光染料当たりのヌクレオタイスの数)を行った後に、分析された産物を混成化に利用した。
Example 5.8.3: Production of target probe
50 ng template DNA, 50 U Klenow enzyme (NEB), 1 × EcoPol buffer (Klenow enzyme supplement), 6 μg random octamer (synthesized by Bionics) Then, the whole volume was made 20 μl with Multiblock System (Hybaid, UK) containing low concentration dT dNTP mix (100 μM dA, G, CTP / 50 μM dTTP) and 50 Cyanine3-dUTP (NEN), and this was performed at 37 ° C. for 2 hours. Non-merged nucleotides were isolated using the QIAGENMinElute PCR purification kit (QIAGEN Inc., Valencia, Calif.). After quantitative and qualitative analysis (specific activity, number of nucleotises per bound fluorescent dye) using a UV / Vis spectrophotometer, the analyzed product was used for hybridization.
≪実施例5.8.4:細胞培養及びゲノムDNA抽出≫
直腸癌細胞株SNU−C1、SNU−C5、COLO 201、COLO 205、DLD−1、LS 513、HCT−15、LS 174T、HCT 116、及びSW480をKCLBから購入した。ウテア血清(FBS)、100μg/mlのストラプトマイシン、及び100Uのペニシリン(GibcoBRL,Carlsbad,CA)が補充されたRPMI1640に細胞を接種して、5%のCO2、37℃で反応させた。Invisorb(trademark)spin cell mini kit(Invitek,Berlin,Germany)を使用して使用者マニュアルによる方法で前記直腸癌細胞株(2×106細胞)を収穫して、ゲノムDNA抽出に使用した。
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Rectal cancer cell lines SNU-C1, SNU-C5, COLO 201, COLO 205, DLD-1, LS 513, HCT-15, LS 174T, HCT 116, and SW480 were purchased from KCLB. RPMI 1640 supplemented with Utea serum (FBS), 100 μg / ml streptomycin, and 100 U penicillin (GibcoBRL, Carlsbad, Calif.) Was inoculated and reacted at 37 ° C. with 5% CO 2 . The rectal cancer cell line (2 × 10 6 cells) was harvested by the method according to the user manual using Invisorb (trademark) spin cell mini kit (Invitek, Berlin, Germany) and used for genomic DNA extraction.
[実施例6:デンドロン上に固定された蛋白質プローブ]
<実施例6.1:デンドリマー改質スライドガラス上にNHSバイオチン固定化>
1mLの重炭酸ナトリウム緩衝液50mM及びDMSO(40%v/v)中にスクシンイミジルD−バイオチン(1.0mg)を含むスポッティング溶液を製造した。デンドリマー改質スライドガラス上にNHSバイオチンをMicrosys5100マイクロアレイヤー(Cartesian Technologies,Inc,USA)を使用してクラス10,000の清浄ルームで固定化した。固定化、及び湿潤チャンバー(75%の湿度)で1時間反応させた後に、バイオチンマイクロアレイをDMF(50℃)THF及びMBST(50mM MES、100mM NaCl、0.1% Tween−20、pH6.0)で順次に2時間洗浄した。前記スライドを蒸溜水ですすいで、乾燥させて、直ちに使用したり数日間常温で保存してから使用した。
[Example 6: Protein probe immobilized on dendron]
<Example 6.1: Immobilization of NHS biotin on dendrimer-modified slide glass>
A spotting solution was prepared containing succinimidyl D-biotin (1.0 mg) in 1 mL sodium bicarbonate buffer 50 mM and DMSO (40% v / v). NHS biotin was immobilized on dendrimer-modified glass slides in a Class 10,000 clean room using a Microsys 5100 microarrayer (Cartesian Technologies, Inc, USA). After immobilization and reaction for 1 hour in a humid chamber (75% humidity), the biotin microarray was treated with DMF (50 ° C.) THF and MBST (50 mM MES, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 6.0). ) In order for 2 hours. The slide was rinsed with distilled water, dried and used immediately or stored at room temperature for several days before use.
<実施例6.2:蛋白質/リガンド相互作用の探知>
この実施例は、Hergenrother,P.J.;Depew,K.M.;Schreiber,S.L.J.Am.Chem.Soc.2000,122,7849によって行った。Cy3標識ストラプタビチン溶液を添加する前に、3%ウテア血清補充MBSTで1時間遮断した。若干すすいだ後に、Cy3標識ストラプタビチン溶液に30分間、室温で前記スライドを露出させた。前記溶液は、適切な蛋白質のストック溶液を1%BSA補充MBSTで希釈して、1mg/mLにして製造した。前記反応後に、MBSTで1回スライドを洗浄して、12分間、MBSTを4回交換しながら弱く攪拌した。スライドを乾燥して共焦点スキャナScan Array(登録商標)Lite(GSI Lumonics)を使用してスキャニングした。マイクロアレイ定量分析ソフトウェアImaGene(BioDiscovery,Inc.)を使用してイメージ及び蛍光強度分析を行った。
<Example 6.2: Detection of protein / ligand interaction>
This example is described by Hergenroter, P .; J. et al. Depew, K .; M.M. Schreiber, S .; L. J. et al. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 7849. Blocked with 3% Utea serum supplemented MBST for 1 hour before adding Cy3-labeled streptavitin solution. After a slight rinse, the slides were exposed to a Cy3 labeled streptavitin solution for 30 minutes at room temperature. The solution was prepared to 1 mg / mL by diluting an appropriate protein stock solution with MBST supplemented with 1% BSA. After the reaction, the slide was washed once with MBST, and gently stirred for 12 minutes while changing MBST four times. Slides were dried and scanned using a confocal scanner Scan Array® Lite (GSI Lumonics). Image and fluorescence intensity analysis was performed using the microarray quantitative analysis software ImaGene (BioDiscovery, Inc.).
[実施例7:孔が調節された巨大分子を含む、調節された気孔を有するガラスビーズ]
アミノプロピル基が結合された、気孔が調節されたガラスビーズ(AMPCPG;80−120メッシュ;平均気孔直径、50nmまたは300nm)及び長い鎖状アミノアルキルグループで改質された気孔が調節されたガラスビーズ(LCAA−CPG;80−120mesh;mean pore diameter、50nm)をCPG,Incから購入した。1,4−ブタンジオールジグリジルエーテル、1,3−ジアミノプロパン、還元グルタチオン(GSH)、N−(3−メチルアミノプロピル)−N´−エチルカルボイミド(EDC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、N−(9−フルオロメトキシカルボニルオキシ)クロライド(Fmoc−Cl)、ピペリジン、4−マレイミドブチル酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(GMBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)をSigma−Aldrichから購入した。他の化合物は、分析試薬級で購入し、追加精製なく使用した。Barnstead E−pure 3−Module systemで蒸溜水を処理して、脱イオン水(18MΩ.cm)を製造した。UV−visスペクトルはHewlett−Packard diode−array8453スペクトロフォトメーターで記録した。
Example 7: Glass beads with controlled pores, including macromolecules with controlled pores
Pore-controlled glass beads with attached aminopropyl groups (AMPCPG; 80-120 mesh; average pore diameter, 50 nm or 300 nm) and glass beads with controlled pores modified with long chain aminoalkyl groups (LCAA-CPG; 80-120 mesh; mean pore diameter, 50 nm) was purchased from CPG, Inc. 1,4-butanediol diglycidyl ether, 1,3-diaminopropane, reduced glutathione (GSH), N- (3-methylaminopropyl) -N′-ethylcarbimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) N- (9-fluoromethoxycarbonyloxy) chloride (Fmoc-Cl), piperidine, 4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS), phosphate buffered saline (PBS) were purchased from Sigma-Aldrich. Other compounds were purchased in analytical reagent grade and used without further purification. Distilled water was treated with a Barnstead E-pure 3-Module system to produce deionized water (18 MΩ.cm). UV-vis spectra were recorded on a Hewlett-Packard diode-array 8453 spectrophotometer.
<実施例7.1:デンドロン改質CPG(サンプルE1及びE3)上にグルタチオン固定化>
(i)Fmoc−[3]−酸で改質:AMPCPG(乾燥重量0.70g)をガラスフィルターにアセトンを使用して洗浄した。真空乾燥した後に、1,4−ブタンジルジグリシジルエーテル(1.0mL)及び炭酸塩緩衝液(2.0mL、pH=11)の混合液をAMPCPG(表面能:91.8μ mol/g、表面積:47.9m2/g)に添加した。常温で24時間よく揺らして混ぜた後に、得られたビーズをろ過して脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した。前記サンプルが含まれているバイアル(vial)を1,3−ジアミノプロパン(1.0mL)及び炭酸塩緩衝液(pH=11)の混合液を添加して24時間常温で混ぜた。徹底的に洗浄した後に、2−モルカプトエタノール(1.0mL)及び水溶性重炭酸ナトリウム溶液(2.0mL、pH=8.5)の混合液で表面に残っているエポキシ基の反応を遮断させた。Fmoc−[3]−酸(14mg、21.3μ mol)が溶解されたジメチルホルムアミド(30%DMF(v/v))、N−(3−メチルアミノプロピル)−N´−エチルカルボイミド(15mg、77μ mol)、及びN−ヒドロキシスクシンイミド(9.0mg、77μ mol)をビーズを含むバイアルに添加した。室温で11時間揺らして混ぜた後に、脱イオン水及びアセトンで順次に徹底的に洗浄した。
(ii)遮断段階:無水メチレンクロライド(2.0mL)中に無水酢酸(1.0mL)を使用して常温で一晩残留するアミン基を遮断した。
(iii)脱保護化段階:メチレンクロライド及びアセトンで順次にビーズを洗浄して、DMF(3.0mL)中の20%のピペリジンをビーズを含むバイアルに添加して、30分間バイアルを揺らして混ぜた。
(iv)リガンド固定化段階:1,4−ブタンジルジグリシジルエーテル(1.0mL)及び炭酸塩緩衝液(2.0mL、pH=11)の混合液をバイアールに添加し、常温で24時間混ぜた。脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した後に、重炭酸ナトリウム溶液(3.0mL、pH8.5)及び還元グルタチオン(GSH、5.4mg、17.6μ mol)をビーズを含むバイアルに添加して、常温で24時間揺らして混ぜた。ビーズの洗浄後に、2−モルカプトエタノール(1.0mL)及び水溶性重炭酸ナトリウム溶液(2.0mL、pH=8.5)の混合液をビーズを含むバイアルに添加した。最後に、ビーズを分離して洗浄して、真空で乾燥して窒素雰囲気下で4℃で保管した。Fmoc−[3]−酸の代わりにFmoc−[9]−酸を使用することを除いては同一な段階を、サンプルE3を製造するために行った。
<Example 7.1: Immobilization of glutathione on dendron-modified CPG (samples E1 and E3)>
(I) Modification with Fmoc- [3] -acid: AMPCPG (dry weight 0.70 g) was washed with acetone on a glass filter. After vacuum drying, a mixed solution of 1,4-butanesyldiglycidyl ether (1.0 mL) and carbonate buffer (2.0 mL, pH = 11) was added to AMPCPG (surface capacity: 91.8 μmol / g, surface area). : 47.9 m 2 / g). After thoroughly shaking for 24 hours at room temperature, the resulting beads were filtered and washed sequentially with deionized water and acetone. To the vial containing the sample, a mixture of 1,3-diaminopropane (1.0 mL) and carbonate buffer (pH = 11) was added and mixed at room temperature for 24 hours. After thorough washing, the reaction of the epoxy groups remaining on the surface is blocked with a mixture of 2-molcaptoethanol (1.0 mL) and aqueous sodium bicarbonate solution (2.0 mL, pH = 8.5). I let you. Dimethylformamide (30% DMF (v / v)), N- (3-methylaminopropyl) -N′-ethylcarboimide (15 mg) in which Fmoc- [3] -acid (14 mg, 21.3 μmol) was dissolved , 77 μmol), and N-hydroxysuccinimide (9.0 mg, 77 μmol) were added to the vial containing the beads. The mixture was shaken for 11 hours at room temperature and then thoroughly washed with deionized water and acetone sequentially.
(Ii) Blocking step: Acetic anhydride (1.0 mL) was used in anhydrous methylene chloride (2.0 mL) to block amine groups remaining overnight at room temperature.
(Iii) Deprotection step: Wash the beads sequentially with methylene chloride and acetone, add 20% piperidine in DMF (3.0 mL) to the vial containing the beads, and shake the vial for 30 minutes to mix. It was.
(Iv) Ligand immobilization step: Add a mixture of 1,4-butanesyldiglycidyl ether (1.0 mL) and carbonate buffer (2.0 mL, pH = 11) to the vial and mix at ambient temperature for 24 hours. It was. After sequential washing with deionized water and acetone, sodium bicarbonate solution (3.0 mL, pH 8.5) and reduced glutathione (GSH, 5.4 mg, 17.6 μmol) are added to the vial containing the beads, Shake for 24 hours at room temperature and mix. After washing the beads, a mixture of 2-molcaptoethanol (1.0 mL) and aqueous sodium bicarbonate solution (2.0 mL, pH = 8.5) was added to the vial containing the beads. Finally, the beads were separated and washed, dried in vacuum and stored at 4 ° C. under a nitrogen atmosphere. The same steps were performed to prepare sample E3 except that Fmoc- [9] -acid was used instead of Fmoc- [3] -acid.
<実施例7.2:対照実験のための異なるGSH結合マトリクスの製造(サンプルCS、CL、及びA):>
(i)サンプルCS及びCL:GSHをGMBSリンカーを使用してAMPCPG及びLCAA−CPGに直接固定させた。ビーズ(0.10g)をガラスフィルターを使用してアセトンで洗浄した。真空で乾燥した後に、DMF及び4−マレイミドブチル酸、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(GMBS、3.0mg、11μ mol)が溶解された重炭酸ナトリウム緩衝液(1.0mL、3:7(v/v)、pH=8.5)の混合液をビーズを含むバイアルに添加した。常温で4時間揺らして混ぜた後に、得られたビーズをろ過、及び脱イオン水、アセトン洗浄で分離した。最後に、無水メチレンクロライド(2.0mL)中の無水酢酸(1.0mL)でマトリクスに残っているアミン基を反応させた。洗浄後に、PBS緩衝液(1.0mL)中のGSH(3.4mg、11μ mol)をビーズを含むバイアルに添加して、常温で12時間揺らして混ぜた。2−モルカプトエタノール(1.0mL)に残っているマレイミド基を遮断し、ビーズを分離して、洗浄、真空乾燥を行った。
(ii)サンプルA:E1及びE3と同一な改質方法で、1,4−ブタンジルジグリシジルエーテル及び1,3−ジアミノプロパンでAMPCPGを改質した。2−モルカプトエタノールでキャッピングした後に、1,4−ブタンジルジグリシジルエーテルでエポキシ基を製造した。最後に、クリタチオンを固定させて、2−モルカプトエタノールでビーズ上に残っているエポキシ基の環を開環した。
Example 7.2: Production of different GSH binding matrices for control experiments (samples CS, CL, and A):
(I) Sample CS and CL: GSH was directly immobilized on AMPCPG and LCAA-CPG using GMBS linker. The beads (0.10 g) were washed with acetone using a glass filter. After drying in vacuum, sodium bicarbonate buffer (1.0 mL, 3: 7 (v / v) in which DMF and 4-maleimidobutyric acid, N-hydroxysuccinimide ester (GMBS, 3.0 mg, 11 μmol) were dissolved. ), PH = 8.5) was added to the vial containing the beads. After mixing by shaking at room temperature for 4 hours, the obtained beads were separated by filtration, washing with deionized water and acetone. Finally, the amine groups remaining in the matrix were reacted with acetic anhydride (1.0 mL) in anhydrous methylene chloride (2.0 mL). After washing, GSH (3.4 mg, 11 μmol) in PBS buffer (1.0 mL) was added to the vial containing the beads and mixed by shaking for 12 hours at room temperature. The maleimide group remaining in 2-molcaptoethanol (1.0 mL) was blocked, the beads were separated, washed and vacuum dried.
(Ii) Sample A: AMPCPG was modified with 1,4-butanedyl diglycidyl ether and 1,3-diaminopropane by the same modification method as E1 and E3. After capping with 2-molcaptoethanol, an epoxy group was produced with 1,4-butanesyl diglycidyl ether. Finally, the clithion was fixed, and the ring of the epoxy group remaining on the beads was opened with 2-molcaptoethanol.
<実施例7.3:改質ビーズ上のアミン密度測定>
E1またはE3の改質途中のビーズ、または対照実験用ビーズ(10mg)をeチューブに入れた。同時に、9−フルオロメチルクロロホルメート(Fmoc−Cl、1.75mg)及びNa2CO3(1.45mg)を別途のガラスバイアルに入れて、1,4−ジオキサン及び水の混合溶媒(2:1(v/v))を2.5mL添加して、試薬を溶解した。前記溶液中の1/5を取って、ビーズを含むeチューブに添加した。前記チューブをバイアルに入れて、バイアルを常温で12時間揺らして混ぜた。ガラスフィルターを利用してビーズを分離して、前記多孔性物質を脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した。真空で乾燥した後に、DMF(0.50mL)中の20%のピペリジンをビーズを含むeチューブに入れて、30分間ピペリジンと反応するようにした。残っている溶液をチューブから慎重に新たなeチューブに移動させて、ビーズをDMF(0.25mL)中の20%のピペリジンで二回洗浄した。前記溶液全体を前のeチューブに添加した。溶液を再びメタノールと混合して、最終吸光度を調節した。UV/Visスペクトロメーターを使用して310nmで吸光度を測定し、関連溶媒を背景誤差の訂正をするために使用した。信頼性向上のために、測定は5種類の異なるサンプルに対して行った。
測定のために、一連のDMF中の20%のピペリジン、及びN−Fmoc−エタノールアミン(または9−フルオロメチルN−(2−ヒドロキシエチル)カバーメイト)(30μM−70μ M)を製造した。30分間反応させた後に、ジベンゾフルベンを含む溶液を使用して吸光度を測定し、吸光係数を計算した。
<Example 7.3: Measurement of amine density on modified beads>
Beads undergoing E1 or E3 modification or control experimental beads (10 mg) were placed in an e-tube. At the same time, 9-fluoromethyl chloroformate (Fmoc-Cl, 1.75 mg) and Na 2 CO 3 (1.45 mg) were placed in a separate glass vial, and a mixed solvent of 1,4-dioxane and water (2: 1 (v / v)) was added to dissolve the reagent. One fifth of the solution was taken and added to the e-tube containing the beads. The tube was placed in a vial and the vial was shaken at room temperature for 12 hours to mix. The beads were separated using a glass filter, and the porous material was washed sequentially with deionized water and acetone. After drying in vacuo, 20% piperidine in DMF (0.50 mL) was placed in the e-tube containing the beads to react with piperidine for 30 minutes. The remaining solution was carefully transferred from the tube to a new e-tube and the beads were washed twice with 20% piperidine in DMF (0.25 mL). The entire solution was added to the previous e-tube. The solution was mixed again with methanol to adjust the final absorbance. Absorbance was measured at 310 nm using a UV / Vis spectrometer and the relevant solvent was used to correct for background errors. In order to improve reliability, measurements were performed on five different samples.
For measurement, 20% piperidine in a series of DMF and N-Fmoc-ethanolamine (or 9-fluoromethyl N- (2-hydroxyethyl) covermate) (30 μM-70 μM) were prepared. After reacting for 30 minutes, the absorbance was measured using a solution containing dibenzofulvene, and the extinction coefficient was calculated.
<実施例7.4:GST融合蛋白質溶解物の製造>
GST−融合蛋白質を公知の文献で説明された通りに製造した(Kim,J.H.;Lee,S.;Kim,J.H.;Lee,T.G.;Hirata,M.;Suh,P.G.;Ryu,S.H.;Biochemistry 2002,41,3414−3421で、その全体を本明細書の参考文献として併合する)。大規模培養のためには、再組合わせpGEXプラスミドを含む単一コロニーを200ml 2X YTA培地で培養した。対数増殖期まで培養した後に、IPTGで6時間遺伝子発現を誘導した。次に、遠心分離で細胞を集めて、1X PBSで洗浄した。その後、0.50mM PMSFを含む10mL低浸透圧性緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1.0mM MgCl2、1.0mM EGTA、pH7.4)でE.coliを超音波溶解した。前記不溶性物質を除去して蛋白質を得た。
<Example 7.4: Production of GST fusion protein lysate>
GST-fusion proteins were prepared as described in the known literature (Kim, JH; Lee, S .; Kim, JH; Lee, TG; Hirata, M .; Suh, Ry, SH, Biochemistry 2002, 41, 3414-3421, the entirety of which is incorporated herein by reference). For large scale culture, a single colony containing the recombined pGEX plasmid was cultured in 200 ml 2X YTA medium. After culturing to the logarithmic growth phase, gene expression was induced with IPTG for 6 hours. The cells were then collected by centrifugation and washed with 1X PBS. Thereafter, E. coli was added with 10 mL hypotonic buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1.0 mM MgCl 2 , 1.0 mM EGTA, pH 7.4) containing 0.50 mM PMSF. E. coli was sonicated. The insoluble material was removed to obtain a protein.
<実施例7.5:結合分析>
(i)鎖の長さの効果:前記製造されたビーズCL(5.72mg)、CS(6.97mg)、E1(10.0mg)、及びE3(14.8mg)を0.8mLの反応緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1.0mM MgCl2、1.0mM EGTA、1%TX−100、0.10mM PMSF、pH7.4、0.50mM PMSF)中のGST溶解物を含む混合溶液と別個に1時間、4℃で反応させて、10ベッド体積の反応緩衝液で3回洗浄して、100μL SDSサンプル緩衝液を添加した。前記チューブを5分間95℃に置いた後に、20μLのサンプルを採取して、SDS−PAGE分析に使用し、得られたゲルをCBBG−250染色溶液で染めた。
(ii)デンドロン処理マトリクスの選択度:10mgのサンプルA、E1、及びE3以外に、100μgの精製GSTまたはGST融合蛋白質溶解物を実験に使用した。その他の段階は前記段階と同一である。
<Example 7.5: Binding analysis>
(I) Effect of chain length: 0.8 mL of reaction buffer with the prepared beads CL (5.72 mg), CS (6.97 mg), E1 (10.0 mg), and E3 (14.8 mg) liquid (20mM Tris, 150mM NaCl, 1.0mM MgCl 2, 1.0mM EGTA, 1% TX-100,0.10mM PMSF, pH7.4,0.50mM PMSF) mixed solution and separately containing the GST lysate in And was washed 3 times with 10 bed volumes of reaction buffer and 100 μL SDS sample buffer was added. After the tube was placed at 95 ° C. for 5 minutes, a 20 μL sample was taken and used for SDS-PAGE analysis and the resulting gel was stained with CBBG-250 staining solution.
(Ii) Selectivity of dendron-treated matrix: In addition to 10 mg of samples A, E1, and E3, 100 μg of purified GST or GST fusion protein lysate was used in the experiment. The other steps are the same as the above steps.
<実施例7.6:グルタチオンセファロース−4B、E1、及びE3からGST融合蛋白質溶出>
グルタチオンセファロース−4B、E1、及びE3を前記結合分析項目に記載された方法通りに行った。ビーズに結合された蛋白質の量をImage gauge V3.12(FUJI PHOTO FILM CO.,LTD.)で定量した。p47phoxのPXドメイン及びMunc−18断片溶解物に対しても同一な段階を行った(図13)。
<Example 7.6: GST fusion protein elution from glutathione sepharose-4B, E1, and E3>
Glutathione Sepharose-4B, E1, and E3 were performed as described in the binding analysis item. The amount of protein bound to the beads was quantified with Image gauge V3.12 (FUJI PHOTO FILM CO., LTD.). The same steps were performed on the p47 phox PX domain and the Munc-18 fragment lysate (FIG. 13).
本明細で言及された全ての文献は、その全体が本明細書に併合される。本技術分野で通常の技術を有する者は、単に通常の実験でも本発明の具体的な例と同等な多数の発明を認識して到達することができるであろう。このような等価発明は、請求の範囲の保護範囲に含まれる。 All documents referred to in this specification are incorporated herein in their entirety. Those having ordinary skill in the art will be able to recognize and arrive at numerous inventions that are equivalent to the specific examples of the present invention simply through routine experimentation. Such equivalent invention is included in the protection scope of the claims.
Claims (33)
前記巨大分子は、分枝された部位及び線状の部位を含むデンドロンを含み、
前記分枝された部位の多数の末端は前記サブストレートに共有結合されていて、前記線状の部位の末端は有機モイアティーに結合することができる官能基を有し、
前記線状の部位は、スペーサドメイン(L)及び作用基(W)を含み、
前記Lは、NH−(CH2)3C(O)、NH−(CH2CH2O)2CH2C(O)、NH−(cyclohexyl)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)、NH−(CH2)7C(O)、NH−(CH2)6C(O)、NH−(CH2)6NH(CO)、NH−(cyclopropyll)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)CH2、NH−(CH2)5、NH−(cyclopropyl)(CO)、及びNH−(CH2)6C(O)からなる群から選択されたものであり、
前記Wは、NH、CH2、及びOからなる群から選択されたものであることを特徴とするサブストレート。 A substrate including a molecular layer in which conical macromolecules with controlled molecular size are regularly distributed,
The macromolecule comprises a dendron comprising a branched site and a linear site,
A plurality of ends of the branched site are covalently bonded to the substrate, and a terminal of the linear site has a functional group capable of binding to organic moiety;
The linear portion includes a spacer domain (L) and a functional group (W),
Wherein L is, NH- (CH 2) 3 C (O), NH- (CH 2 CH 2 O) 2 CH 2 C (O), NH- (cyclohexyl) (CO), NH- (CH 2) 6 NHC (O), NH— (CH 2 ) 7 C (O), NH— (CH 2 ) 6 C (O), NH— (CH 2 ) 6 NH (CO), NH— (cyclopropryl) (CO), NH Selected from the group consisting of — (CH 2 ) 6 NHC (O) CH 2 , NH— (CH 2 ) 5 , NH— (cyclopropyl) (CO), and NH— (CH 2 ) 6 C (O) And
The substrate, wherein W is selected from the group consisting of NH, CH 2 and O.
Lは、NH−(CH2)3C(O)、NH−(CH2CH2O)2CH2C(O)、NH−(cyclohexyl)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)、NH−(CH2)7C(O)、NH−(CH2)6C(O)、NH−(CH2)6NH(CO)、NH−(cyclopropyll)(CO)、NH−(CH2)6NHC(O)CH2、NH−(CH2)5、NH−(cyclopropyl)(CO)、及びNH−(CH2)6C(O)からなる群から選択されたものであり、
Wは、NH、CH2、及びOからなる群から選択されたものであり、
Xは、アントラセンメチル(A)、Boc、Fmoc、及びNsからなる群から選択されたものであり、
R1〜3、R11〜13、R21〜23、R31〜33、R111〜113、R121〜123、R131〜133、R211〜213、R221〜223、R231〜233、R311〜313、R321〜323、R331〜333は、CH2O(CH2)2C(O)、(CH2)2−(cyclohexyl)−C(O)、CH2−C=C−CH2C(O)、(CH2)7、(CH2)2C(O)、CH2OCH(CH3)CH2C(O)、(CH2)2、CH2OCH2CH(CH3)C(O)、及びCH2OCH(CH3)CH2C(O)からなる群から選択されたものであり、
Tは、OH、OMe、NH2、及びOBzlからなる群から選択されたものである。 The substrate according to claim 1, wherein the dendron is a polymer represented by the following formula.
L is, NH- (CH 2) 3 C (O), NH- (CH 2 CH 2 O) 2 CH 2 C (O), NH- (cyclohexyl) (CO), NH- (CH 2) 6 NHC ( O), NH- (CH 2) 7 C (O), NH- (CH 2) 6 C (O), NH- (CH 2) 6 NH (CO), NH- (cyclopropyll) (CO), NH- Selected from the group consisting of (CH 2 ) 6 NHC (O) CH 2 , NH— (CH 2 ) 5 , NH— (cyclopropyl) (CO), and NH— (CH 2 ) 6 C (O). Yes,
W is selected from the group consisting of NH, CH 2 , and O;
X is selected from the group consisting of anthracenemethyl (A), Boc, Fmoc, and Ns;
R 1~3, R 11~13, R 21~23 , R 31~33, R 111~113, R 121~123, R 131~133, R 211~213, R 221~223, R 231~233, R 311~313, R 321~323, R 331~333 is, CH 2 O (CH 2) 2 C (O), (CH 2) 2 - (cyclohexyl) -C (O), CH 2 -C = C -CH 2 C (O), ( CH 2) 7, (CH 2) 2 C (O), CH 2 OCH (CH 3) CH 2 C (O), (CH 2) 2, CH 2 OCH 2 CH ( Selected from the group consisting of CH 3 ) C (O), and CH 2 OCH (CH 3 ) CH 2 C (O),
T is selected from the group consisting of OH, OMe, NH 2 and OBzl.
(i)サブストレートを巨大分子の末端と反応することができるように官能基化する段階;及び
(ii)前記巨大分子を前記サブストレートと接触させて、前記巨大分子の末端及び前記サブストレートが結合を形成するようにする段階;を含むことを特徴とする製造方法。 It is a manufacturing method of the substrate according to claim 1, Comprising:
(I) functionalizing the substrate such that it can react with the end of the macromolecule; and (ii) contacting the macromolecule with the substrate so that the end of the macromolecule and the substrate are A method for producing a bond.
(ii)標的特異的リガンド、または前記標的特異的リガンドに連結された同型の両作用性または異型の両作用性のリンカー分子を前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端と接触させて、前記リガンドまたはリンカー分子及び前記末端が結合を形成するようにする段階;を含んで、標的特異的リガンドを線状の部位の末端に固定させることを特徴とする請求項16に記載の製造方法。 (I) removing a protecting group from the end of the linear site of the macromolecule on the substrate; and (ii) a target-specific ligand, or a homotypic amphoteric or linked to the target-specific ligand, or Contacting an atypical amphoteric linker molecule with the end of a linear site of a macromolecule on the substrate, such that the ligand or linker molecule and the end form a bond; The production method according to claim 16, wherein the target-specific ligand is immobilized at the end of the linear site.
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